CN101972472A - 一种变应原疫苗纯化及其制备的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从含有变应原活性蛋白提取液中去除与变应原不相关的杂质大分子和小分子物质的方法。本发明从传统工艺制备的蛋白提取液中去除了游离小分子色素和与蛋白通过静电和疏水结合的色素分子。这种脱色的提取液制备方法不损坏变应原活性和免疫特异性。本发明能够制备一种去除大分子以及小分子物质高活性蛋白提取液，用该提取液制得的制剂更安全、用于诊断更准确、免疫治疗更有效。这种纯化蛋白的方法从另一角度上意味着从化学本质上改善了原料的质量，扩大了原料的使用范围，同时也制备了免疫治疗的减毒疫苗。

Description

一种变应原疫苗纯化及其制备的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纯化变应原疫苗的方法及制备变应原疫苗的方法。

背景技术

现有变应原疫苗的纯化工艺制备的变应原疫苗，含有变应原活性成分和无变应原活性且与变应原不相关的成分。

“变应原疫苗”，是指通过适当的溶剂从动物或植物的活性成分中提取、纯化得到的变应原制剂。“变应原产品”包括用于变态反应性疾病诊断、治疗、预防的各种变应原提取物的生物制品。在欧洲药典中，变应原产品属于药物制剂，指含有自然界能引起和/或激发过敏性疾病的特殊物质。

自从上世纪初，草、杂草、树及其它植物花粉的水制剂广泛用于枯草热体内和体外的诊断，这种易感人群，也叫做遗传过敏性病人。1911年，Noon和Freman首次提出枯草热这个概念，并且首次利用花粉变应原治疗该花粉引起的过敏性鼻炎取的成功。自此，人们利用引起过敏的物质提取液来治疗这种疾病，通过给病人注射来脱敏、减敏、免疫治疗。

变应原疫苗/提取液是个复合物，它的成分不是单一的，成分中包括蛋白质、碳水化合物、酶、色素，而在组成成分中变应原成分只是一少部分。研究表明，引起变态反应的主要致敏蛋白分子量在20～70KD，而分子量小于10KD的分子确信没有变应原性。文献记载，变应原疫苗中的小分子色素不仅在免疫治疗中会带来局部和全身副作用的风险，而且色素小分子抑制组胺的释放，严重影响变应原疾病诊断的结果。

随着人类社会的发展和坏境的改变，过敏性疾病患者人数也在逐年增多，尤其以欧洲最为明显。过敏疾病患者增多，发展特点以多种类，多区域的特点在蔓延，一些稀有的变应原成为常规变应原，一些局限在某些地区的变应原会蔓延到其它地区。在过去20年，短豚草过敏只局限于北美地区，现在欧洲大陆，短豚草过敏患者逐年上升。所以，以提高变应原疫苗产品的质量来提高变应原疾病诊断的准确性和治疗的安全和有效性是必要的。

现在，在变应原用来诊断和免疫治疗疫苗的生产工艺中，用截留分子量为5～10KD的膜来透析或超滤目的是为了除去分子量在5～10KD与变应原不相关的分子，这样保留了10～100KD的分子，改善了用于临床的变应原提取液的质量。但是还有相当部分杂质存在变应原疫苗中，所以变应原疫苗的纯化方法对于变应原疾病的诊断和免疫治疗至关重要。光谱显示，用于诊断和治疗传统工艺透析后的产品，大量的色素(类黄酮)牢固的结合在蛋白分子上。在变应原提取液中，小分子色素不仅以游离状态存在，并且以和蛋白结合的方式存在。所以，在传统工艺中，透析只能除去一部分色素杂质，还有相当一部分色素杂质存在。

本发明目的在于克服传统变应原疫苗工艺含杂质成分多的缺陷，从而得到一种更安全、有效的标准化变应原。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种变应原疫苗的纯化方法。

本发明的另一目的是提供一种变应原疫苗的制备方法。

本发明提供了一种变应原疫苗的纯化方法，变应原提取液经超滤纯化、超滤脱色、酸处理、透析处理，然后制备成变应原疫苗。

超滤纯化可采用100KD～300KD膜超滤，优选100KD膜。

超滤脱色可采用1KD～5KD膜超滤脱色，优选3KD膜。在超滤的过程中不断补加缓冲液，当滤出液为无色时，用电导率仪测试滤出液电导率和缓冲液相同时，为超滤终点。在变应原提取液中以游离方式存在的色素分子在不断的超滤过程中去除，当滤出液为无色和电导率与缓冲液一致时，说明变应原提取液中游离色素基本去除。

酸处理是超滤脱色后提取液，逐滴加强酸，调节原液的PH值为1.5～2.5，使结合到蛋白质上的色素解离。强酸优选6～8M HCl，优选原液的PH值调节为2。

透析是将酸处理后的提取液用1KD～5KD透析袋透析，优选3KD透析袋。在室温条件下在磁力搅拌器上搅拌10-30min，优选30min；在50-100倍体积PH为6-8.5的注射用水中4℃条件下透析12～36h，优选24h。在透析过程中，将容器放到磁力搅拌器上，让透析袋自由缓慢旋转。

经纯化后的变应原提取液，可采用本领域的常用方法制备成变应原疫苗。

纯化前的变应原提取液，可通过选自树花粉、草花粉、真菌、动物表皮和毛发、昆虫的变应原经脱脂、提取、离心和澄清过滤制得。

脱脂：在变应原原料中以体积比1∶2～1∶10加丙酮或乙醚，在磁力搅拌下室温脱脂，反复操作，直到上清为无色，在通风处干燥。

提取：脱脂后的原料以1∶10～1∶50(重量体积比)比例加缓冲液，缓冲液可以为磷酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液和碳酸氢铵缓冲液，浓度为50～200mM，PH在6～8.5，在2～8℃条件下磁力搅拌或机械搅拌提取2～24h，优选24h。投料比例优选1∶25。

离心：提取混合物在4000～6000rpm，4℃条件下离心15min，然后取上清在6000～8000rpm，4℃条件下离心30min。收集上清，弃去沉淀或沉淀以同样的条件再提取。

澄清过滤：上清通过滤纸、纸板或其它孔径10-0.22um膜采用一步或多个步骤过滤澄清。优选纸板过滤。

本发明变应原疫苗的纯化方法克服了传统工艺的不足，这种变应原疫苗的纯化方法不仅能够去除杂质大分子和游离的色素小分子，而且能够通过破坏静电和疏水作用，去除结合到蛋白上的色素分子。变应原提取液中的色素分子以疏水和静电作用与蛋白结合，所以要去除结合到蛋白上的色素分子，首先要破坏色素分子和结合蛋白的疏水和静电作用。破坏色素和结合蛋白的疏水和静电作用的方式有在提取液中加强酸，强碱，中性盐和以电解的方式。本发明通过在变应原提取液中加强酸使色素和结合蛋白解离，再透析或超滤除去解离的色素分子，能够更彻底的去除色素小分子。本发明提供的纯化工艺，能够去掉变应原提取液中与变应原无关的多余物质，制备一种含有变应原活性成分且杂质含量低的变应原疫苗。这种纯化工艺能够制备一种高纯度高活性的变应原疫苗，降低传统工艺制备变应原疫苗带来的副作用，是变应原免疫治疗的一种减毒疫苗。

本发明中变应原可以是树花粉、草花粉、真菌、动物表皮和毛发、昆虫等变应原。

树花粉包括：海南苏铁(Cycas hainanensis)；银杏(Ginkgo biloba)；云杉(Picea meyeri)；华北落叶松(Larix principis-ruppredhtii)；雪松(Cedrus deodara)；油松(Pinus tabulaeformis)；白皮松(Pinus bungeana)；华山松(Pinus armandii)；杉木(Cunninghamia lanceolata)；柳杉(Cryptomeria foutunei)；日本柳杉(Crytomeria japonica)；池衫(Taxodium ascendens)；侧柏(Platycladus orientalis)；圆柏(Sabina chinensis)；福建柏(Fokienia hodginsis)；柏木(Cupressus funebriis)；竹柏(Podocarpus nagi)；短紫杉(Taxus cuspidata)；粗榧(Cephalotaxus sinensis)；木麻黄(Casuarina equisetifolia)；青杨(Populus cathayana)；加杨(Populus Canadensis)；旱柳(Salix matsudana)；垂柳(Salix babylonica)；红皮柳(Salix purpurea)；棉花柳(Salix linearistipularis)；皂柳(Salix wallichinan)；枫杨(Pterocarya stenoptera)；核桃(Juglans regia)；胡桃楸(Juglans mandshurica)；白桦(Betula platyphylla)；黑桦(Betula dahurica)；红华(Betula albo-sinensis)；坚桦(Betula chinensis)；糙皮桦(Betula utilis)；蒙自桤木(Alnus nepalensis)；榛(Corylus heterophylla)；毛榛(Coypus mandshurica)；桦榛(Corylus chinensis)；虎榛子(Ostryopsis davidiana)；板栗(Castanea mollissima)；栓皮栎(Quercus variabilis)；辽东栎(Qaercus liaotungensis)；蒙古栎(Quercus mongolica)；槲栎(Quercus aliena)；柞栎(Quercus aliena)；海南栲(Castanopsis hainanensis)；家榆(Ulmus pumila)；青檀(Pteroceltis tatarinowii)；家桑(Morus alba)；鸡桑(Morus australis)；构树(Broussonetia papyrifera)；黄杨(Buxus sinica)；杜仲(Eucommia uimoides)；法国梧桐(Platanus acerifolia)；美国梧桐(Platanus occidentalis)；洋白蜡树(Fraxinus pennsylvanica)；白蜡树(Fraxinus chinensis)；大叶白蜡树(Fraxinus rhyohophylla)；暴马丁香(Syringa reticulate)；北京丁香(Syringa pekinensis)；小叶女贞(Ligustrum quihoui)；金叶女贞(Ligustrum ovalifolium Var.aureo-marginatum)；臭椿(Ailanthus altissima)；香椿(Toona sinensis)；楝树(Melia azedarach)；火炬树(Rhus typhina)；元宝槭(Acer truncatum)；怪柳(Tamarix chinensis)；太平花(Philadelphus pekinensis)；东北茶藨(Ribes mandshuricum)；银柴(Aporosa chinensis)；白楸(Mallotus paniculatus)；紫穗槐(Amorpha fruticosa)；合欢(Albizia julibrissin)；金合欢(Acacia farnesiana)；台湾相思(Acacia confusa)；美洲合欢(Calliandra haematocephala)；黄槐(Cassia surattensis)；羊蹄甲(Bauhinia variegata)；卫矛(Euonymus alatus)；大叶黄杨(Euonymus japonicus)；大叶桉(Eucalyptus robusta)；细叶桉(Eucalyptus tereticornis)；红千层(Callistemon rigidus)；白千层(Melaleuca leucadendra)；蒲桃(Syzygium jambos)；小叶椴(Tilia mongolica)；扁担木(Grewia biloba)；扶桑(Hibiscus rosea-sinensis)；珍珠梅(Sorbaria Ririlowii)；水栒子(Cotoneaster multiflorus)；山楂(Crataegus pinnatifida)；白梨(Pyrus bretschneideri)；苹果(Malus pumila)；山桃(Prunus davidiana)；碧桃(Prunus duplex)；梅(Prunus mume)；栾树(Koelreuteria paniculata)；木锦(Gossampinus malabarica)；石榴(Punica granatum)；番木瓜(Carica papaya)；荆条(Vitex negundo)；泡桐(Paulownia tomentosa)；接骨木(Sambucus williamsii)；山茱萸(Macrocarpium officinalis)等。

草花粉包括：大麻(Cannabis sativa)；葎草(Humulus scandens)；蓖麻(Ricinus communis)；油菜(Brassica campestris)；风花菜(Rorippa globosa)；播娘蒿(Descurainia Sophia)；菠菜(Spinacia oleracea)；地肤(KochiaScoparia)；灰菜(Chenopodium album)；灰绿藜(Chenopodium glaucum)；尖头叶藜(Chenopodium acuminatum)；小藜(Chenopodium sertinum)；刺苋(Amaranthus spinosus)；尾穗苋(Amaranthus caudatus)；反枝苋(Amaranthus retroflexus)；凹头苋(Amaranthus lividus)；野苋(Amaranthus viridis)；三色苋(Amaranthus tricolor)；皂荚(GleditsiaSinensis)；洋槐(Robinia pseudoacia)；含羞草(Mimosa pudica)；白车轴草(Trifolium repens)；麻叶荨麻(Urtica cannabina)；荞麦(Fagopyrum esculentum)；红蓼(Polygonum orientale)；酸模叶蓼(Polygonum lapathifolium)；巴天酸模(Rumex patientia)；皱叶酸模(Rumex crispus)；庐山小檗(Berberis virgetorum)；蜀葵(Althaea rosea)；千屈菜(Lythrum salicaria)；五爪金龙(Ipomoea cairica)；狼尾花(Lysimachia barystachys)；黄连花(Lysimachia davurica)；接骨木(Sambucus williamsii)；益母草(Leonurus japonicus)；随意草(Physostegia virginisna)；罗布麻(Apocynum venetum)；小车前(Plantago depressa)；大车前(Plantago major)；南瓜(Cucurbita moscbata)；丝瓜(Luffa cylindrica)；冬瓜(Benincasa hispida)；五叶地锦(Parthenocissus quinquefolia)；凌霄(Campsis grandiflora)；炮仗花(Pyrostegia venusta)；芹(Apium graveolens)；毒芹(Cicuto virosa)；茴香(Foneiculum vulgare)；大籽蒿(Artemisia sieversiana)；黄花蒿(Artemisia annua)；菌陈蒿(Artemisia capillaries)；艾蒿(Artemisia argyi)；野艾蒿(Artemisia lavandulaefolia)；豚草(Ambrosia artemisiifolia)；三裂叶豚草(Ambrosia trifida)；向日葵(Helianthus annuus)；菊芋(Helianthus thberosus)；苍耳(Xanthium sibiricum)；小蓬草(Conyza canadensis)；胜红蓟(Ageratum conyzoides)；旋覆花(Inula japonica)；小蓟(Cirsium segetum)；泥胡菜(Hemistepta lyrata)；蒿子杆(Chrysanthemum carinatum)；香蒲(Typha angustifolia)；小香蒲(Typha minima)；扁杆藨草(Scirpus planiculmis)；三棱藨草(Scirpus tabernaemontani)；太行山藨草(Scirpus schansiensis)；针蔺(Eleocharis valleculosa)；中间型针蔺(Eleocharis intersita)；异穗苔草(Carex heterostachya)；萱草(Hemerocallis fulva)；葱(Allium fistulosum)；韭菜(Allium tuberosum)；马蔺(Iris Lactea)：早熟禾(Poa annue)；臭草(Melica scabrosa)；纤毛鹅冠草(Roegneria ciliaris)；小麦(Triticum aestivum)；黑麦草(Lolium perenne)；多花黑麦草(Lolium multiflorum)；野牛草(Buchloe dactyloides)；菵草(Bechmannia syzigachne)；看麦娘(Alopecurus aequalis)；狗尾草(Setaria viridis)；狼尾草(Pennisetum alopecuroides)；高粱(Sorghum vulgare)；玉米(Zea mays)；蒲葵(Livistona chinensis)；棕榈(Trachycarpus fortunei)；短穗鱼尾葵(Caryota mitis)；软叶刺葵(Phoenix roebelenii)；油棕(Elaeis guineensis)；椰子(Cocos mucifera)；王棕(Roystonea regia)；假槟榔(Archontophoenix dlexandrae)；散尾葵(Chrysalidocarpus lutescens)等。

真菌包括：链格孢菌(Alternaria alternata)、德氏霉(Helminthosporium sorokinanum)、枝孢芽枝菌(Cladosporium cladosporioides)、大孢枝孢菌(Cladosporium macrocarpum)、簇孢匍柄霉(Stemphylium botryosum)、弯孢菌(Curvularia lunata)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)、总状毛霉(Mucor racemosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspregillus niger)、分枝犁头霉(Absidia ramosa)、宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)、丛梗孢霉(Monilia sitophlia)、短帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、粗壮顶套霉(Acrothecium robustum)、球黑孢菌(Nigrospora sphaerica)、专红轮枝孢菌(Verticillium lateritium)、顶孢头孢霉(Cephalosporium chrysogenum)、球形阜孢菌(Papularia sphaerospermanum)、疣蠕孢菌(Heterosporium allii)、球形单头孢霉(Monotospora sphaerocephala)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、麦散黑粉菌(Ustilago nuda)、面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)、灰葡萄孢菌(Botrytis einerea)、黄球瘤孢菌(Sepedonium chrysospermum)、黑附球霉(Epicoccum nigrum)等。

动物表皮和毛发包括：骆驼毛发&皮屑(Camel Hair & Dander)；牛毛发&皮屑(Cattle Hair & Dander)；鹿毛发&皮屑(Deer Hair & Dander)；山羊毛发&皮屑(Goat Hair & Dander)；猪毛发&皮屑(Dog Hair & Dander)；马毛发&皮屑(House Hair & Dander)；狗毛发&皮屑(Dog Hair & Dander)；猫毛发&皮屑(Cat Hair & Dander)；鸡毛(Chicken Feathers)；鸭毛(Duck Feathers)；鹅毛(Goose Feathers)；鸽毛(Pigeon Feathers)；人头屑(Human Dander)；猴毛发&上皮(Monkey Hair & Epithelium)；鼠毛发&上皮(Mouse Hair &Epithelium)；兔毛发&上皮(Monkey Hair & Epithelium)等。

昆虫变应原包括：粉尘螨(Dermatophagoides farina)；屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)；腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)；德国小蠊(Blatella germanica)；美洲大蠊(Peripalanete Americana)；黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)；家蝇(Musca domestica)；蜉蝣蚪(Ephemeridae)；四节蜉科(Baetidae)；微小按蚊(Anophelesnminimus)；淡色库蚊(Culex pipiens pappens)；白纹伊蚊(Aedes albopictus)；小黄家蚁(Monomorium pharaonis)；大头蚁(Pheidole spp)；米象(SitophilusOryzae)；绿豆象(Callosobruchuschinensis)；蚕豆象(Laria rufimanus)；粘虫(Leucania separate)；玉米螟(Pyrausta nubilalis)等。

本发明还提供了一种变应原疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)脱脂：在变应原原料中以体积比1∶2～1∶10加丙酮或乙醚，在磁力搅拌下室温脱脂，反复操作，直到上清为无色，在通风处干燥。变应原原料为选自树花粉、草花粉、真菌、动物表皮和毛发、昆虫的变应原。

(2)提取：脱脂后的原料以1∶10～1∶50(重量体积比)比例加缓冲液，缓冲液可以为磷酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液和碳酸氢铵缓冲液，浓度为50～200mM，PH在6～8.5，在2～8℃条件下磁力搅拌或机械搅拌提取2～24h，优选24h。投料比例优选1∶25。

(3)离心：提取混合物在4000～6000rpm，4℃条件下离心15min，然后取上清在6000～8000rpm，4℃条件下离心30min。收集上清，弃去沉淀或沉淀以同样的条件再提取。

(4)澄清过滤：上清通过滤纸，纸板或其它孔径10-0.22um膜采用一步或多个步骤过滤澄清。优选纸板过滤。

(5)超滤纯化：澄清后的滤液再经100KD～300KD膜超滤，优选100KD膜，收集滤出液，去除大分子量杂质。

(6)超滤脱色：经超滤除去大分子杂质后的提取液经1KD～5KD膜超滤脱色，优选3KD膜。在超滤的过程中不断补加缓冲液，当滤出液为无色时，用电导率仪测试滤出液电导率和缓冲液相同时，为超滤终点。在变应原中提取液中以游离方式存在的色素分子在不断的超滤过程中去除，当滤出液为无色和电导率与缓冲液一致时，说明变应原提取液中游离色素基本去除。

(7)酸处理：经1KD～5KD膜超滤后提取液，逐滴加6～8M HCl，调节原液的PH值为1.5～2.5，优选PH值为2，使结合到蛋白质上的色素解离。

(8)透析：透析是将酸处理后的提取液用1KD～5KD透析袋透析，优选3KD透析袋。将酸处理过后的提取液在在室温条件下在磁力搅拌器上搅拌10-30min，优选30min。在50-100倍体积PH为6-8.5的注射用水中4℃条件下透析24-36h，优选24h。在透析过程中，将容器放到磁力搅拌器上，让透析袋自由缓慢旋转。

(9)pH值调节：在纯化透析后的提取液中逐滴滴加1M NaOH调节PH到6.5～7.5。

(10)添加保护剂：在调节pH值后的提取液中添加1％～3％的甘露醇和0.1％～1％的人血白蛋白，优选2％甘露醇和0.1％的人血白蛋白。

(11)除菌过滤：在百级条件下用0.22μm聚醚砜膜除菌过滤。

(12)冻干：冷冻干燥得到变应原疫苗冻干粉。

本发明的再一目的是提供了新的变应原制剂。本发明的新变应原制剂是依据本发明变应原疫苗制备方法制备的变应原制剂。

本发明变应原制剂可以是任何给予患者治疗过敏性疾病的剂型，包括注射剂、点刺液、片剂、胶囊、舌下含服剂、口服液、气雾剂、鼻腔剂、贴剂、滴丸剂或喷雾等。

变应原注射液的制备：将上述将冻干粉针剂用浸提液等体积的生理盐水稀释，按照所需浓度，稀释成1/100至1/1,000,000范围内的多个浓度的制剂，得脱敏注射剂。

用缓冲液按比例溶解冻干干粉，添加0.4％苯酚和0.5％NaCl配制成脱敏原液或再添加50％甘油配制成点刺液。依据上述方法制备的变应原疫苗原液可以用作皮下注射脱敏、舌下免疫脱敏和皮下注射点刺诊断。

制备的变应原疫苗原液可以添加Al(OH)₃、酪氨酸、MPL佐剂配制成含佐剂变应原注射疫苗。

本发明与传统的变应原疫苗工艺相比，不仅仅去除掉了在变应原提取液中游离方式的大分子、小分子以及色素分子，而且去除了和变应原提取液中蛋白相结合的色素分子，提高变应原产品的有效性和安全性，真正做到了变应原疫苗的减毒疫苗，同时纯化后的变应原疫苗能实现标准化生产。

附图说明

图1为一种纯化及制备变应原疫苗的工艺流程图

图2为黄花蒿花粉变应原提取液在纯化不同阶段蛋白组分SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中M为对照品。

图3为户尘螨变应原提取液在纯化不同阶段蛋白组分SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中M为对照品。

具体实施方式

实施例1黄花蒿花粉变应原疫苗的制备

取经检验合格的黄花蒿花粉，以1∶2(体积比)加丙酮间断反复脱脂，直到静置的上清溶剂为无色，倒掉溶剂，残渣在通风橱干燥，脱脂后的花粉不能残留脱脂溶剂。称取脱脂花粉，以1∶25加缓冲液(PH：8.0200mmolNa₂HPO₄ NaH₂PO₄ 50mmol NaCl 0.4％苯酚)，4℃在磁力搅拌器上搅拌24h，将混合物转到500ml的离心瓶中。4℃6000rpm，离心15min，取上清弃残渣，上清4℃8000rpm离心30min，取上清弃残渣，上清液用普通滤纸过滤澄清。澄清后的提取液经100KD膜超滤，收集滤出液，滤出液再经5KD膜超滤，在超滤过程中不断补加缓冲液，直到滤出液为无色和电导率和缓冲液相同时结束超滤，大概需要4～5体积缓冲液。收集回流液，回流液为浓缩了的提取液，在上述提取液中逐滴滴加6M HCl，调整原液PH为2，在室温在磁力搅拌器上搅拌30min。然后将原液转移到透析袋中，加50～100倍体积的缓冲液(PH7.550mmol NH₄HCO₃)4℃透析24h，透析过程中，在磁力搅拌器上，保持透析袋缓慢的旋转。收集透析袋中的提取液，逐滴加1M NaOH，在磁力搅拌子搅拌下调节PH值到7，即为纯化后的变应原原液，在原液加2％甘露醇和0.1％人血白蛋白，用0.22um膜除菌过滤，然后冻干。

实施例2户尘螨变应原疫苗的制备

经检验合格的户尘螨纯螨体以1∶2比例加丙酮间断搅拌脱脂，直到上清溶剂为无色为止，倒掉脱脂溶剂，残渣在通风厨中干燥，保持脱脂原料中不残留丙酮。称取脱脂后的原料，以1∶25比例加50mmol NH₄HCO₃，4℃在磁力搅拌器上搅拌24h，将混合物转到500ml的离心瓶中。4℃6000rpm，离心15min，取上清弃残渣，上清液用普通滤纸过滤澄清。澄清后的提取液100KD膜超滤，收集滤出液，滤出液再经5KD膜超滤，在超滤过程中不断补加缓冲液，直到滤出液为无色，大概需要4～5体积缓冲液。收集回流液，回流液为浓缩了的提取液，逐滴滴加6M HCl，调整原液PH为2，在室温在磁力搅拌器上搅拌30min。然后将其转移到透析袋中，对50～100倍体积的缓冲液(PH7.550mmol NH₄HCO₃)4℃透析24h。透析过程中，在磁力搅拌器上，保持透析袋缓慢的旋转。收集透析袋中的提取液，逐滴加1M NaOH，在磁力搅拌子搅拌下调节PH值到7.5，即为纯化后的变应原原液，在原液加2％甘露醇和0.1％人血白蛋白，用0.22um膜除菌过滤，然后冻干。

实施例3云杉花粉变应原疫苗的制备

经检验合格的云杉花粉，以1∶2比例加乙醚反复脱脂，直到静置的上清溶剂为无色，倒掉溶剂，残渣在通风橱干燥，脱脂后的花粉不残留脱脂溶剂。称取脱脂花粉，以1∶25加缓冲液(PH：8.0200mmolNa₂HPO₄ NaH₂PO₄50mmol NaCl 0.4％苯酚)，4℃在磁力搅拌器上搅拌24h，将混合物转到500ml的离心瓶中。4℃6000rpm，离心15min，取上清弃残渣，上清4℃8000rpm离心30min，取上清弃残渣，上清液经普通滤纸过滤澄清，然后再经0.45um膜的滤器过滤，澄清后的原液100kKD膜超滤，收集滤出液，滤出液再经5KD膜超滤，在超滤过程中不断补加缓冲液，直到滤出液为无色和电导率和缓冲液相同时结束超滤，大概需要4～5体积缓冲液。收集回流液，回流液为浓缩了的提取液，在上述提取液中逐滴加6M HCl，调整PH为2，在室温在磁力搅拌器上搅拌30min。然后将提取液转移到透析袋中，对50～100倍体积的缓冲液(PH7.550mmol NH₄HCO₃)4℃透析24h，透析过程中，在磁力搅拌器上，保持透析袋缓慢的旋转。收集透析袋中的提取液，逐滴加1M NaOH，在磁力搅拌子搅拌下调节PH值到7.5，即为纯化后的变应原原液，在原液加2％甘露醇和0.1％人血白蛋白，用0.22um膜除菌过滤，然后冻干。

实施例4纯化后变应原疫苗纯度分析

在黄花蒿花粉变应原疫苗和户尘螨变应原疫苗纯化和制备的过程中，过滤澄清后、100KD膜超滤后、5KD膜超滤脱色后，收集三个阶段的样品100ml，通过浓缩调节蛋白浓度都为300ug/ml，通过ELISA竞争抑制的方法计算三个阶段原液50％抑制率的浓度。该方法进行如下：用黄花蒿变应原疫苗和户尘螨变应原疫苗的内部参考品原液包被96孔板(4℃孵育过夜)，洗板后，用1％BSA或10％小牛血清封闭，封闭后洗板，在包被孔中加入以4倍倍加稀释形成稀释度为1∶2、1∶8、1∶32、1∶128、1∶512的样品和等量对应过敏患者的血清，37℃孵育1h，洗去未结合物质，加入辣根过氧化酶偶联的羊抗人IgE二抗，37℃孵育1h，洗板后加入ABTS底物显色系统。37℃孵育30min，用2N硫酸终止反应，在405nm波长下测定吸收值。

根据百分抑制率公式计算出各稀释度的百分抑制率：

百分抑制率(％)＝[F(0)-F_NSB-F(x)]/[F(0)-F_NSB]×100％；

F(x)：不同稀释度(x)的变应原抑制下的检测荧光值；

F(0)：病人血清池无变应原抑制的检测荧光值，空白；

F_NSB：正常人血清池无变应原抑制的检测荧光值，本底；

以稀释度的1/2的对数值为横坐标，相应百分抑制率为纵坐标作图，得出50％抑制率时的稀释度(见下表1和2)；

四个纯化阶段的样品经14％SDS-PAGE胶分离，分析纯化前后在10KD～100KD蛋白成分的变化(见附图2和3)。

表1黄花蒿花粉纯化不同阶段样品50％抑制率的浓度

表2户尘螨纯化不同阶段样品50％抑制率的浓度

Claims (10)

1.一种变应原疫苗的纯化方法，变应原提取液经超滤纯化、超滤脱色、酸处理、透析纯化处理后制备成变应原疫苗。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中：超滤纯化采用100KD～300KD膜超滤；超滤脱色采用1KD～5KD膜超滤脱色；酸处理是超滤脱色后提取液，逐滴加6～8M HCl，调节原液的PH值为1.5～2.5；透析是将酸处理后的提取液用1KD～5KD透析袋透析。

3.根据权利要求2所述的纯化方法，其中：超滤纯化采用100KD膜超滤；超滤脱色采用3KD膜超滤脱色；酸处理调节原液的PH值为2；透析是将酸处理后的提取液用3KD透析袋透析。

4.根据权利要求1-3任一所述的纯化方法，其中变应原提取液通过如下步骤制备：

1)脱脂：在变应原原料中以体积比1∶2～1∶10加丙酮或乙醚，在磁力搅拌下室温脱脂，反复操作，直到上清为无色，在通风处干燥；

2)提取：脱脂后的原料以1∶10～1∶50(重量体积比)比例加缓冲液，缓冲液可以为磷酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液和碳酸氢铵缓冲液，浓度为50～200mM，PH在6～8.5，在2～8℃条件下磁力搅拌或机械搅拌提取2～24h，投料比例优选1∶25；

3)离心：提取混合物在4000～6000rpm，4℃条件下离心15min，然后取上清在6000～8000rpm，4℃条件下离心30min，收集上清，弃去沉淀或沉淀以同样的条件再提取；

4)澄清过滤：上清通过滤纸，纸板或其它孔径10-0.22um膜采用一步或多个步骤过滤澄清。

5.一种变应原疫苗的制备方法，选自树花粉、草花粉、真菌、动物表皮和毛发、昆虫的变应原经过脱脂、提取、离心、澄清过滤、超滤纯化、超滤脱色、酸处理、透析、除菌过滤、稀释分装、冻干制得变应原疫苗。

6.根据权利要求5的制备方法，其中：

脱脂：选自树花粉、草花粉、真菌、动物表皮和毛发、昆虫的变应原原料中以体积比1∶2～1∶10加丙酮或乙醚，在磁力搅拌下室温脱脂，反复操作，直到上清为无色，在通风处干燥；

提取：脱脂后的原料以1∶10～1∶50(重量体积比)比例加缓冲液，缓冲液可以为磷酸盐缓冲液、碳酸氢钠缓冲液和碳酸氢铵缓冲液，浓度为50～200mM，PH在6～8.5，在2～8℃条件下磁力搅拌或机械搅拌提取2～24h，投料比例1∶25；

离心：提取混合物在4000～6000rpm，4℃条件下离心15min，然后取上清在6000～8000rpm，4℃条件下离心30min，收集上清，弃去沉淀或沉淀以同样的条件再提取；

澄清过滤：上清通过滤纸，纸板或其它孔径10-0.22um膜采用一步或多个步骤过滤澄清；

超滤纯化：澄清后的滤液再经100KD～300KD膜超滤，优选100KD膜，收集滤出液，去除大分子量杂质；

超滤脱色：经超滤除去大分子杂质后的提取液经1KD～5KD膜超滤脱色，在超滤的过程中不断补加缓冲液，当滤出液为无色时，用电导率仪测试滤出液电导率和缓冲液相同时，为超滤终点，在变应原中提取液中以游离方式存在的色素分子在不断的超滤过程中去除，当滤出液为无色和电导率和缓冲液一致时，说明变应原提取液中游离色素基本去除；酸处理：经1KD～5KD膜超滤后提取液，逐滴加6～8M HCl，调节原液的PH值为2～3，使结合到蛋白质上的色素解离；

透析：将酸处理过后的提取液在在室温条件下在磁力搅拌器上搅拌10-30min，在50-100倍体积PH为6-8.5的注射用水中4℃条件下透析24-36h，在透析过程中，将容器放到磁力搅拌器上，让透析袋自由缓慢旋转；

调节PH：在纯化透析后的提取液中逐滴滴加1M NaOH调节PH到6.5～7.5；

在调节pH值后的提取液中添加1％～3％的甘露醇和0.1％～1％的人血白蛋白；

冷冻干燥得到变应原疫苗冻干粉。

7.根据权利要求6的制备方法，其中：澄清过滤使用纸板过滤；超滤纯化采用100KD膜；超滤脱色采用3KD膜；酸处理步骤中调节原液的PH值为2；透析步骤中搅拌30分钟，透析24小时。

8.一种变应原制剂，其特征在于依据权利要求6或7的制备方法制备。

9.根据权利要求8所述的变应原来制剂，用缓冲液按比例溶解依据权利要求6或7的制备冻干干粉，添加0.4％苯酚和0.5％NaCl配制成脱敏原液，制备的变应原疫苗原液可以用作皮下注射脱敏、舌下免疫脱敏和皮下注射点刺诊断。

10.根据权利要求9所述的变应原来制剂，其特征在于：添加50％甘油配制成点刺液，或添加Al(OH)3、酪氨酸、MPL佐剂配制成含佐剂变应原注射疫苗。

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