CN102617672A - 一种金花茶黄酮苷及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从金花茶花中分离的抗癌化合物金花茶黄酮苷A及其制备方法和用途。本发明从金花茶花95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分离得到的单体化合物和馏分经定性、定量测定表明主要为黄酮类成分，并经现代光谱技术分析确定了该化合物的化学结构，化学名为：槲皮素-7-O-(6″-O-E-咖啡酰基)-β-D-葡萄糖苷。经体外抗肿瘤实验表明，该化合物能明显抑制肿瘤细胞增殖，并具有诱导肿瘤细胞凋亡的活性。该发明产物具备抗肿瘤药物的开发潜力。

Description

一种金花茶黄酮苷及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于对天然植物中具有药用活性的新成分的制备及应用领域，具体涉及一种金花茶黄酮苷A、其制备方法和用途。 

背景技术

金花茶(Camellia chrysantha(Hu)Tuyama)系山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia Linn.)金花茶组(Section chrysantha Chang)植物，主要分布于广西邕宁县。金花茶不仅有较高的观赏价值，而且具有一定的药用价值和营养价值，是传统的壮族民间用药。金花茶茶叶主要用于咽喉炎、痢疾、肾炎、水肿、尿路感染、黄疸性肝炎、肝硬化腹水、高血压、预防肿瘤等；花主要用于便血、月经不调等。早期对金花茶的研究主要集中在植物形态学、植物分类学方面，近年来对金花茶的抗氧化、降血脂、抗肝癌前病变等活性的研究已见报道，另外对金花茶叶化学成分的研究也有报道。 

发明人在对山茶属植物抗肿瘤活性成分的系列研究中发现，金花茶不同植物部位(花、叶、种子)均具有较强的抑制人白血病细胞株U937细胞增殖的活性。为了阐明金花茶花抗肿瘤活性的物质基础及其作用机理，本发明对金花茶花的化学成分及其诱导肿瘤细胞凋亡的活性进行了研究。 

发明内容

本发明对金花茶花的化学成分进行了分离，从金花茶花95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分离得到的单体化合物和馏分经定性、定量测定表明主要为黄酮类成分。由此推测，金花茶花中的黄酮类成分可能是其抗肿瘤活性的重要物质基础。因此，本发明通过对金花茶花中黄酮类成分进行分离鉴定，并以诱导肿瘤细胞凋亡为活性指标，从中寻找和筛选新型抗肿瘤药物。因此，本发明从金花茶花中寻找具有抗肿瘤活性的单体成分——金花茶黄酮苷A，其具有如下结构式： 

其在常温下为黄色结晶，熔点为233～235℃。 

本发明的另一目的，是提供一种上述金花茶黄酮苷A的制备方法，其包括如下步骤， 

A.制备金花茶花95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物的方法： 

将金花茶花以95％工业乙醇加热回流提取，料液比1g∶2～5ml，温度75～85℃，乙醇提取物浓缩成浸膏后，向浸膏中加入水混悬，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯萃取物； 

B.以硅胶柱色谱分离步骤A所得的乙酸乙酯萃取物，分别以氯仿-甲醇的体积比为100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1和5∶1，进行梯度洗脱，将洗脱下来的流分，经硅胶薄层板检识后合并相同流分，收集由氯仿-甲醇10∶1体积比洗脱下的流分备用； 

C.步骤B所得的流分，经ODS反相硅胶柱色谱分离，洗脱液为甲醇∶乙腈∶水的体积比为1∶1∶2，将收集到的各流分经薄层层析铝箔反相硅胶板展开，展开剂是甲醇∶乙腈∶水的体积比为1∶1∶2，流分展开后以显黄色的斑点为主斑点，主斑点R_f值为0.67的流分合并、备用； 

D.步骤C所获得的流分经Sephadex LH-20柱色谱分离，以甲醇洗脱，将收集到的各流分经薄层层析铝箔反相硅胶板展开，展开剂是甲醇∶乙腈∶水的体积比为1∶1∶2，流分展开后以斑点R_f值为0.67的单一流分为终产品。 

具体的，在上述方法中，其步骤A中，向浸膏中加入2～5倍质量的水混悬，并用2倍量乙酸乙酯萃取。 

具体的，在上述方法中，其步骤A中，所述料液比为1g∶3ml。 

具体的，在上述方法中，其步骤A中，所述所述温度为80℃。 

具体的，在上述方法中，其步骤A中，所述加热回流提取的次数为3次，每次2小时。 

本发明的另一方面在于，上述的金花茶黄酮苷A在制备抗肿瘤药物上的用途。 

上述的用途，具体的，是通过将有效剂量的金花茶黄酮苷A作为有效成分与药用辅料混合并制成适当剂型的药物。 

本发明中的实施例里公布了，通过结构式和系统命名在SciFinder Scholar数据库查询，证明所得的上述金花茶黄酮苷A具有新颖的结构，是新化合物。 

实施例中对上述金花茶黄酮苷A的活性进行了检测：用不同浓度的金花茶黄酮苷A干预人白血病U937细胞，采用流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响。 

经考察发现，金花茶黄酮苷A能够抑制U937细胞增殖，采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞早期凋亡率结果表明，经金花茶黄酮苷A处理后，U937细胞早期凋亡率显著升高。 

附图说明

图1.金花茶黄酮苷A对U937细胞存活率的影响： 

用终浓度分别为10、25、50、100、200和400μM的金花茶黄酮苷A处理U937细胞24h，MTT法检测U937细胞存活率，结果以细胞存活率的均值±标准差(n＝6)表示。结果表 明，随着金花茶黄酮苷A浓度增大，U937细胞的存活率明显下降。 

图2.金花茶黄酮苷A诱导U937细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI双染分析：金花茶黄酮苷A处理U937细胞6h，流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率，结果以细胞凋亡率的均值±标准差(n＝6)表示。结果表明，用浓度为100、200μM的金花茶黄酮苷A处理U937细胞后，U937细胞凋亡率明显升高。 

图3金花茶黄酮苷A诱导U937细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI双染分析：金花茶黄酮苷A(200μM)处理U937细胞6h，流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡散点图。结果表明，与对照组相比金花茶黄酮苷A(200μM)处理U937细胞后，U937细胞凋亡率明显升高。 

图4.金花茶黄酮苷A诱导U937细胞凋亡时对Caspase-3活化的影响：金花茶黄酮苷A处理U937细胞6h，使用CaspGLOW^TM活化Caspase-3原位染色试剂盒检测细胞内活化的Caspase-3，结果以Caspase-3活化量的均值±标准差(n＝6)表示。结果表明，用浓度为100、200μM的金花茶黄酮苷A处理U937细胞后，U937细胞内活化的Caspase-3明显增加。 

图5.金花茶黄酮苷A诱导U937细胞凋亡时对Caspase-3活化的影响：以50μM Z-VAD处理U937细胞1h后，再加入200μM金花茶黄酮苷A处理U937细胞6h，然后检测细胞凋亡百分率。结果表明金花茶黄酮苷A诱导U937细胞凋亡的活性显著被抑制。 

图6.金花茶黄酮苷A的¹H-NMR全谱； 

图7.金花茶黄酮苷A的¹³C-NMR全谱； 

图8.金花茶黄酮苷A的HMBC谱； 

图9.金花茶黄酮苷A的高分辨正离子电喷雾质谱。 

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。 

本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明，均通过常规商业途径获得； 

薄层层析铝箔反相硅胶板：RP-18F254，德国Merck公司，No.1.05559.0001； 

XT4A型显微熔点测定仪：北京科仪电光仪器厂； 

Jasco V-560型紫外-可见分光光度计：日本分光株式会社； 

AVANCE500Hz型核磁共振仪：瑞士Bruker公司，TMS为内标； 

UPLC/Q-TOF-MS系统：美国Waters公司； 

人淋巴瘤白血病细胞株U937：Human Sciences Research Resource Bank日本人类科学 基金会，东京，日本； 

实施例1金花茶黄酮苷A的制备 

本发明所述的具有诱导肿瘤细胞凋亡活性的金花茶黄酮苷A的制备方法，该方法包括如下步骤： 

A.制备金花茶花95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物 

金花茶干燥花3kg，粉碎，用9L的95％工业乙醇加热回流提取，温度80℃，提取3次，每次2h，过滤后减压浓缩，得醇提物588g。取醇提物500g用1500mL热蒸馏水混悬后，用2倍量的乙酸乙酯反复萃取，回收溶剂后，得到的乙酸乙酯部分共110g和水层部分共387g。 

B.以硅胶柱色谱分离上述乙酸乙酯萃取物 

用1500g的200-300目硅胶，湿法装柱，将75g的乙酸乙酯部分硅胶拌样，干法上样，以氯仿-甲醇的体积比100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1和5∶1，进行梯度洗脱，收集流分，每份100mL，每份流分别以1^#，2^#，3^#……等顺次编号。其中，以氯仿-甲醇(100∶1)洗脱，得到流分1^#～110^#，以氯仿-甲醇(50∶1)洗脱，得到流分111^#～146^#，以氯仿-甲醇(30∶1)洗脱，得到流分147^#～200^#，以氯仿-甲醇(20∶1)洗脱，得到流分201^#～222^#，以氯仿-甲醇(15∶1)洗脱，得到流分223^#～249^#，以氯仿-甲醇(10∶1)洗脱，得到流分250^#～342^#，以氯仿-甲醇(5∶1)洗脱，得到流分343^#～440^#。收集到的各流分经硅胶薄层板检识后合并相同流分，分别依次命名，其中流分250^#～278^#合并为组分Fr.Ⅰ，流分279^#～300^#合并为组分Fr.Ⅱ，流分301^#～316^#合并为组分Fr.Ⅲ，流分317^#～331^#合并为组分Fr.Ⅳ，流分332^#～342^#合并为组分Fr.Ⅴ，流分343^#～360^#合并为组分Fr.Ⅵ，流分361^#～387^#合并为组分Fr.Ⅶ。 

C.上述由氯仿-甲醇(10∶1)洗脱，并通过硅胶薄层板检识后合并相同流分得到的组分Fr.Ⅲ(472mg)经ODS反相硅胶柱色谱分离，以甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)洗脱，收集流分，收集到的各流分以甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)为展开剂，经薄层层析铝箔反相硅胶板展开，每个流分展开后都可见一个明显的黄色色斑，且紫外灯(254nm)下显暗斑，硫酸乙醇显黄色，但除上述的黄色色斑外还可见另外两个斑点，但均不明显，且与主斑点完全分开。将上述经薄层层析展开后主斑点R_f值为0.67的流分合并为组分1，主斑点R_f值为0.56的流分合并为组分2，主斑点R_f值为0.44的流分合并为组分3，分别依次命名为Fr.Ⅲ-1、Fr.Ⅲ-2、Fr.Ⅲ-3，其中组分Fr.Ⅲ-1共55mg，经Sephadex LH-20柱色谱分离，以甲醇洗脱，收集流分，收集到的各流分以甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)为展开剂，经薄层层析铝箔反相硅胶板展开，可见R_f值为0.67的单一斑点的流分，将上述流分合并得金花茶黄酮苷A(25mg)。 

实施例2金花茶黄酮苷A的结构鉴定 

综合使用质谱分析技术(ESI-MS)、核磁共振分析技术(¹H-NMR、¹³C-NMR、HMBC、HMQC) 等技术对物质结构进行分析。如图6金花茶黄酮苷A的¹H-NMR全谱；如图7金花茶黄酮苷A的¹³C-NMR全谱；如图8金花茶黄酮苷A的HMBC谱；如图9金花茶黄酮苷A的高分辨正离子电喷雾质谱。 

测定结果：金花茶黄酮苷A：黄色结晶(甲醇)，m.p.233-235℃，紫外全波长扫描显示λ_max(甲醇)分别为369、337和254nm，HR-ESI-MS给出准分子离子峰627.1425[M+H]⁺，结合¹H NMR和¹³C NMR推断其分子式为C₃₀H₂₆O₁₅。¹H NMR(500MHz，CD₃OD)和¹³C NMR(125MHz，CD₃OD)数据与文献^[1，2]对照，判断化合物母核为槲皮素，并含有1个咖啡酰基和1个葡萄糖基。 ¹H NMR谱中葡萄糖端基质子信号的偶合常数为7.4Hz，说明该葡萄糖为β构型。在δ6.24(1H，d，J＝15.8)，δ7.47(1H，d，J＝15.8)为2个反式烯烃氢信号^[3]。HMBC谱显示葡萄糖端基氢δ5.08与槲皮素C-7(δ164.2)有远程相关，证明C-7位连接有葡萄糖。葡萄糖的H-6a(δ4.61)、H-6b(δ4.31)与反式咖啡酰基的羰基C-9″′(δ169.1)有远程相关，说明葡萄糖的6″-OH与反式咖啡酰基成酯。利用¹H-NMR和¹³C-NMR谱归属了氢和碳的信号，信号归属见表1。 

表1金花茶黄酮苷A的¹H-和¹³C-NMR数据(CD₃OD) 

通过结构式和系统命名在SciFinder Scholar数据库查询，综上分析该化合物的结构为槲皮素-7-O-(6″-O-E-咖啡酰基)-β-D-葡萄糖苷，为一新化合物，命名为金花茶黄酮苷A。具有如下结构式： 

实施例3金花茶黄酮苷A肿瘤细胞凋亡活性检测 

1细胞培养 

人淋巴瘤白血病细胞株U937从Human Sciences Research Resource Bank(日本人类科学基金会，东京，日本)获得，培养于含有10％热灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃、5％CO₂，饱和湿度条件下培养。 

2金花茶黄酮苷A对U937细胞增殖的影响 

收集对数生长期的U937细胞，稀释成1×10⁵cells/mL单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔180μL，设空白组、对照组、药物处理组，其中药物处理组每组加入不同浓度的金花茶黄酮苷A 20μL，使金花茶黄酮苷A终浓度分别为10、25、50、100、200和400μM，对照组用DMSO代替药物，空白组用培养液代替细胞悬液和药物，各组设6个平行孔，置37℃，5％CO₂条件下培养24h。培养结束前4h每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h，弃上清液，加入200μL DMSO充分溶解结晶物，置酶标仪上测490nm处吸光度值(OD值)。以对照组细胞存活率的均值为100％，按下式计算药物处理组细胞存活率： 

药物处理组细胞存活率＝药物处理组OD值/对照组OD值的均值×100％ 

结果以细胞存活率的均值±标准差(n＝6)表示，结果表明金花茶黄酮苷A对U937细胞增殖具有抑制作用(见图1)，其IC₅₀为140.1μM。 

3Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测金花茶黄酮苷A诱导U937细胞凋亡 

流式细胞分析中采用碘化丙啶(PI)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V(Annexin V)(Immunotech，Marseille，France)来检测早期凋亡终点指示剂磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine)的表达。取对数生长期的U937细胞，稀释成1×10⁶cells/mL单细胞悬液，以不同浓度的药物处理细胞，在37℃培养6h。离心收集细胞，以4℃PBS冲洗后1,200rpm离心3min。离心后细胞用Annexin V-FITC试剂盒带有的结合缓冲液稀释至10⁵cells/mL，加5μL FITC标记的Annexin V和5μL PI至上述细胞悬浮液中，混匀。在4℃避光培养10min后，用流式细胞仪(Epics XL，Beckman-Coulter，Miami，FL)进行分析。 

结果表明，经金花茶黄酮苷A处理后，U937细胞早期凋亡率显著升高(图2、图3) 

4金花茶黄酮苷A对caspase-3的活化作用 

使用CaspGLOW^TM活化Caspase-3原位染色试剂盒(MBL，Nagoya，Japan)检测细胞内 caspase-3活性。以FITC标记的caspase-3抑制性底物多肽DEVD(FITC-DEVD-FMK)作为原位(in situ)的荧光标志。因为FITC-DEVD-FMK的细胞膜通透性很好，在凋亡细胞中可与活化的caspase-3不可逆的结合，结合后FITC所发射的荧光信号可用流式细胞术检测，其荧光量反映活化capase-3的量。加入不同浓度药物处理细胞，在37℃培养6h，收集细胞，然后将细胞溶液(1×10⁶cells/ml)分装到样品管中，每300μL细胞溶液中加入1μLFITC-DEVD-FMK，37℃培养0.5h。在3000rpm离心细胞5min，移去上清液，将细胞重新分散在0.5mL的洗涤缓冲液后离心。再重新将细胞分散在500μL洗涤缓冲液中，在流式细胞仪上用FL-1通道进行分析。 

结果表明，与对照组相比金花茶黄酮苷A能显著激活caspase-3活性(图4)。 

为了确认金花茶黄酮苷A诱导U937细胞凋亡是否经Caspase依赖途径实现的，一种泛Caspase抑制剂Z-VAD与金花茶黄酮苷A同时加入到U937细胞培养液中，以50μM Z-VAD处理U937细胞1h后，再加入200μM金花茶黄酮苷A处理U937细胞6h，然后检测细胞凋亡百分率。结果表明金花茶黄酮苷A诱导U937细胞凋亡的活性显著被抑制(图5)。 

经上述实验证明：金花茶黄酮苷A能够抑制U937细胞增殖，并通过Caspase依赖途径诱导U937细胞凋亡，即该化合物具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的活性。 

金花茶黄酮苷A在制备抗肿瘤药物上的用途 

根据本发明，新化合物金花茶黄酮苷A可以作为原料药或与其他药物组成复方制剂，并制成片剂、胶囊、脂质体及缓、控释制剂等剂型，用于恶性肿瘤治疗药物的开发、研制。 

参考文献： 

[1]S.Bloor，J.Bradley，D.Lewis，K.Davies，Identification of flavonol and anthocyanin metabolites in leaves of Petunia‘Mitchill’and its LC transgenic.，Phytochemistry.49(1998)1427-1430. 

[2]S.Vitalini，A.Braca，G.Fico，Study on secondary metabolite content of Helleborus niger L.leaves，Fitoterapia.82(2011)152-154. 

[3]K.G.Fiasson，J.L.Fiasson，H.Waton，Quercetin glycosides from European aquatic Ranunculus species of subgenus Batrachium，Phytochemistry.45(1997)1063-1067. 

Claims (8)

1.一种金花茶黄酮苷A，其特征在于：具有如下结构式：

其在常温下为黄色结晶，熔点为233～235℃。

2.如权利要求1所述的金花茶黄酮苷A的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，

A.制备金花茶花95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物的方法：

将金花茶花以95％工业乙醇加热回流提取，料液比1g∶2～5ml，温度75～85℃，乙醇提取物浓缩成浸膏后，向浸膏中加入水混悬，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯萃取物；

B.以硅胶柱色谱分离步骤A所得的乙酸乙酯萃取物，分别以氯仿-甲醇的体积比为100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1和5∶1，进行梯度洗脱，将洗脱下来的流分，经硅胶薄层板检识后合并相同流分，收集由氯仿∶甲醇的体积比10∶1洗脱下的流分备用；

C.步骤B所得的流分，经ODS反相硅胶柱色谱分离，洗脱液为甲醇∶乙腈∶水的体积比为1∶1∶2，将收集到的各流分经薄层层析铝箔反相硅胶板展开，展开剂是甲醇∶乙腈∶水的体积比为1∶1∶2，流分展开后以显黄色的斑点为主斑点，主斑点R_f值为0.67的流分合并、备用；

D.步骤C所获得的流分经Sephadex LH-20柱色谱分离，以甲醇洗脱，将收集到的各流分经薄层层析铝箔反相硅胶板展开，展开剂是甲醇∶乙腈∶水的体积比为1∶1∶2，流分展开后以斑点R_f值为0.67的单一流分为终产品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤A中，向浸膏中加入2～5倍质量的水混悬，并用2倍量乙酸乙酯萃取。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤A中，所述料液比为1g∶3ml。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤A中，所述所述温度为80℃。

6.根据权利要求2～5所述的任一方法，其特征在于：步骤A中，所述加热回流提取的次数为3次，每次2小时。

7.如权利要求1所述的金花茶黄酮苷A在制备抗肿瘤药物上的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于：将有效剂量的金花茶黄酮苷A作为有效成分与药用辅料混合并制成适当剂型的药物。

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