CN103857785A - 杀菌剂在液态系统中的应用 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了微藻生长的液体培养系统中检测有害生物的方法。本公开内容还提供了在液体系统中处理和控制有害生物的方法，和在液体培养系统中增加微藻产量的方法。提供了用于从液体培养系统中生长、监测、处理和收集微藻的方法。

Description

杀菌剂在液态系统中的应用
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请61/547,473的权利，该申请于2011年10月14日提交，其用于所有目的的全部内容通过参考被引入到本文。
技术领域
本公开内容包括提供在液体系统，如水池、池塘等提高产量的方法。本公开内容还包括在这种系统中检测有害生物的方法。这种系统对于水生生物质的生产是有用的，例如藻类，特别是微藻和蓝藻。用本文所述方法生产的水生生物质可用于生产多种有用的产品。在一个具体实施方式中，生产的生物质被用于油料生产，可以精制成各种产品，包括但不限于运输燃料。
背景技术
微藻是单细胞非维管光合生物，通过光合作用产生氧气。其中一组，微藻，有很多种原因可使其在生物技术中应用，包括他们的高增长率和容忍不同的环境条件。已有报道微藻在商业重要产品的多种工业过程中的应用。例如，微藻已被用于生产营养补充剂、药物、天然染料、鱼类和甲壳类动物的食物原料、农业有害生物的生物控制，生产氧气和去除氮，磷和有毒物质的污水处理和污染控制，如塑料的生物降解或二氧化碳的吸收。
由于燃料产品的生产，微藻日益受到重视。燃料产品的需求日益增加，例如，油类、油类化学品、和对于石油化学品的生产有用的其他物质。
一年中，微藻可以生产陆生植物10倍至100倍的物质。微藻还产生油（脂质），可转化为生物燃料的蛋白质和淀粉。这些微藻几乎能在任何地方生长，但最常见于40N到40S之间的纬度。已有超过100,000种已知的硅藻（一种微藻），40,000种已知的绿色植物样微藻，和较小数量的其他微藻品种，微藻将在几乎任何环境下迅速生长，几乎任何种类的水中，包括具有有限的或较差水质的边缘地区。
微藻可以以油或淀粉的形式储存能量。储存的油可以高达微藻重量的60%。已经证实，特定的种类增强了油或淀粉的生产，以及生长条件已进行了检测。也已经开发了提取和把这些物质转化为燃料的过程。
因此，那里存在迫切需要开发可再生的、可持续的、并且降低对环境危害的燃料产品的替代方法。
发明概述
本公开内容包括减少真菌在液体系统中生长的方法，包括用微藻在液体系统中接种，检测真菌；提供有效浓度的杀真菌剂，相对于未使用杀真菌剂的真菌生长而言抑制真菌的生长，生长微藻。
本公开内容包括减少有害生物在液体系统中生长的方法，包括用微藻在液体系统中接种，检测有害生物；提供有效浓度的杀虫剂，相对于未使用杀虫剂的有害生物生长而言抑制有害生物的生长，生长微藻。
本公开内容还提供了检测真菌在微藻液体系统中存在的方法，包括获得液体系统样品；和检测指示真菌的DNA序列的存在。
本公开内容还提供了检测有害生物在微藻液体系统中存在的方法，包括获得液体系统样品；和检测指示有害生物的DNA序列的存在。
本公开内容提供了在液体系统中增加微藻产量的方法，包括提供含有杀真菌剂的液体系统；和在存在杀真菌剂的液体系统中生长微藻至少10天。
本公开内容提供了在液体系统中增加微藻产量的方法，包括提供液体系统；和在液体系统中生长微藻至少10天，该液体系统依次提供一种或多种杀真菌剂以抑制有害生物生长。
此外，本公开内容提供了在液体微藻培育系统中预防真菌生长的方法，包括提供有效浓度的杀真菌剂，抑制真菌在液体中的生长，而该杀真菌剂并不明显抑制微藻的生长；在经杀真菌剂处理的液体中接种微藻；和生长微藻。
本公开内容还提供了处理液体微藻培育系统的方法，包括检测液体系统中真菌的存在；提供有效浓度杀真菌剂到液体系统中，抑制真菌生长，生长微藻；和至少监测一次所述液体系统中的所述真菌的存在。
本公开内容进一步提供了液体微藻培育系统，含有转基因微藻和杀真菌剂。
本公开内容进一步提供了壶菌的检测方法，包括获取样品，在样品中进行聚合酶链式反应，该聚合酶链式反应使用一对能够扩增核苷酸分子的寡核苷酸引物，该核苷酸分子具有的序列选自由SEQ ID NOs:1至6或其互补组成的组。
序列的简要说明
SEQ ID NO：1给出了内部序列转录间隔区（ITS）域和壶菌FD01的5.8sRNA。
SEQ ID NO：2给出了内部的序列转录间隔区（ITS）域和壶菌FD61的5.8sRNA。
SEQ ID NO：3给出了内部的序列转录间隔区（ITS）域和壶菌FD95的5.8sRNA。
SEQ ID NO：4给出了内部的序列转录间隔区（ITS）域和壶菌FD100的5.8sRNA。
SEQ ID NO：5给出了内部的序列转录间隔区（ITS）域和壶菌FD101的5.8sRNA。
SEQ ID NO：6给出了内部的序列转录间隔区（ITS）域和壶菌FDARG的5.8sRNA。
SEQ ID NO：7给出了肽核酸（PNA）抑制剂序列SE0004-PNA2的序列。
SEQ ID NO：8给出了肽核酸（PNA）抑制剂序列SE0107-PNA2的序列。
SEQ ID NO：9给出了肽核酸（PNA）抑制剂序列SE0087-PNA4的序列。
SEQ ID NO：10-37给出了用于聚合酶链式反应（PCR）检测的寡核苷酸序列。
附图的简要说明
图1是表示分离出的壶菌有害生物的进化分析结果的系谱树。
图2是结合了荧光增白剂（Calcofluor White）的被壶菌感染微藻培育样品的稀释系列的荧光测量结果的曲线图。
图3是被壶菌感染微藻培育样品的稀释系列的叶绿素荧光结果的曲线图。
图4提供了结合荧光增白剂的被壶菌感染的微藻培育图像。
图5是被壶菌感染的微藻样品中的荧光增白剂和叶绿素的荧光比率的曲线图。
图6是具有荧光增白剂荧光的被壶菌感染的微藻培养物的CT值的结果曲线图。
图7是显示了作为鼓藻有害生物的4种不同已知壶菌存在的鼓藻池塘的监测曲线图。
图8是显示了杀真菌剂氟啶胺对于未受污染微藻的生长影响的曲线图。
图9是显示了使用或未使用氟啶胺培养的受污染微藻的生长曲线图。（1ppm=1mg/L）。
图10是显示了杀真菌剂
Figure BDA0000488027060000031
对于未受污染微藻生长的影响曲线图。
图11是使用或未使用杀真菌剂的受污染微藻的生长曲线图。（1ppm=1mg/L）。
图12是
Figure BDA0000488027060000033
对于未受污染微藻培养物的生长影响的曲线图。（1ppm=1mg/L）。
图13是使用或未使用杀真菌剂
Figure BDA0000488027060000041
培养的受污染微藻的生长曲线图。（1ppm=1mg/L）。
图14是杀真菌剂处理对于室外开放池塘中生长的密度微藻P16的影响的曲线图。
图15是显示了使用或未使用杀真菌剂处理培养的微藻生长曲线图。
图16是在室外开放池塘中生长的微藻的生长和收集的图。
图17是显示了室外微藻培养物监测和处理的图。
发明详述
除非另有定义，本文所用的技术和科学术语与本领域技术人员所通常理解的含义相同。本领域技术人员将认识到，许多方法可用在本发明的实践中。实际上，本发明不以任何方式限制所描述的方法和材料。为了本公开的目的，下列术语定义如下。
“环境样品”指的是从微藻正在生长的或可能生长的周边环境中获得的样品。如本文所用，环境样品可能取自上述提到的环境或周边区域中的空气、土壤、植被和水。这些样品是按照用于采集微生物样品的标准采集规程采集的。
如本文所用的“生长微藻”、“生长的微藻”、“微藻生长”和“培养微藻”是指一个或多个步骤，包括微藻在培养液中到当微藻处于收集步骤开始前的悬浮液中。
如本文所用的，术语“有害生物”指的是样品培养液中的任何不需要的生物有机体。有害生物非限定性的例子是细菌和真菌。有害生物可能是不被需要的是因为，其降低了微藻培养的生长率。可替代的，有害生物可能是不被需要的是因为其降低了微藻生长的总体程度或每体积培养液微藻的总产率。有害生物可能是不被需要的是因为其导致微藻培养物的死亡。有害生物可能是不被需要的是因为其改变了培养的微藻的基因表达。有害生物可以是单个有机体的种群或是混合的种群。
“微藻”，如本文所用，指的是非维管光合生物，例如，划分为光合细菌的生物（包括蓝细菌），蓝藻，原绿藻，红藻，绿藻，不等鞭毛类，tribophyta，灰色藻门，chlorarachniophytes，裸藻门，裸藻，定鞭藻门，金藻门，隐藻，淀粉鞭毛藻，甲藻，腰鞭毛目，鼓藻目，pyrmnesiophyta，硅藻门，黄藻，eustigmatophyta，raphidophyta，褐藻和浮游植物。微藻还可以是微藻种，包括但不限于衣藻。莱茵衣藻，盐藻，微绿球藻，微绿球藻occulata，栅藻二形，斜生栅藻，杜氏盐藻，或雨生红球。本文所公开的“微藻”可以是单细胞的非维管光合生物。在其他情况下，微藻可以是多细胞非维管光合生物的一个或多个细胞。
“真菌”如本文所用，是真菌界和芽枝霉门、壶菌门、球囊菌门、微孢子虫门、新丽鞭毛菌门、子囊菌门、担子菌门的一名成员。如本文所述，真菌包括壶菌纲和单毛壶菌纲以及壶菌spp.种或真菌任一组合的成员。如本文所述，真菌包括壶菌种的成员，壶菌种包含于真菌界壶菌门，真菌界含有壶菌目、裂壶菌目、Rhizophydiales、Lobulomycetales、Cladochytriales、集壶菌目和单毛壶菌目。
如本文所述，“减少生长”、“抑制生长”、“生长减速”和“生长抑制”指的是相对于在缺少任何处理的相同或类似条件下的有害生物繁殖数量或分裂数量而言，减少了有害生物的繁殖或分裂。“减少生长”、“抑制生长”、“生长减速”和“生长抑制”也可以指有害生物通过处理而被杀死或死亡。
如本文所述，“收集”指的是在培养系统，包括液体培养系统中去除或分离全部或部分微藻。可以从成长培养液中连续或间歇收集，或者在培养的末尾阶段整体收集微藻。液体，如上清液，可以采用虹吸、流通或其他分离方式返回液体培养系统。相对收集数量指的是余下微藻数量与收集前含在液体培养系统中的数量相比。
如本文所述，“回收的液体”或“返回的液体”指的是从液体培养系统中收集或除去超过50%、60%、70%、80%、90%、95%或所有的微藻后余下的液体。
如本文所述，“培养时间”、或“生长的长度”、或“收集时间”是从液体培养系统用微藻接种的时间开始计算的。
如本文所述，术语“产率”指的是收集时每单位体积的微藻数量，以及可以表述为，例如，每体积培养液的细胞数量，每体积培养液的质量，等。本文所述的产率还可以表述为每培养面积的质量。产率的改变被表述为接受或未接受处理的产率的增加或降低所带来的改变。
如本文所述，术语“液体系统”、“液体培养系统”、或“培养系统”指的是用于培养微藻的系统。液体系统可包括封闭的和开放的培养系统。开放的液体系统可包括，例如开放的或封闭的光生物反应器、半封闭的池塘、开放的池塘，或湖泊。
如本文所述，术语“处理”指的是抑制有害生物生长的方法或组合物。处理可以包括杀死有害生物的方法或组合物。
如本文所述，术语“有效浓度”指的是，当被用于液体系统中生长的微藻培养物的持续生长，或生存时，足以控制有害生物生长或杀死有害生物的杀虫剂或杀真菌剂的浓度。
本公开内容提供了在液体微藻培养物中减少有害生物生长的方法，其中液体系统用微藻接种，该系统被监视有害生物的存在，以及相对于未使用杀真菌剂的有害生物生长，提供有效浓度的杀真菌剂以抑制有害生物的生长，以及养殖微藻。本公开内容进一步提供了液体系统中活的有害生物的减少。
一方面，本公开内容提供了减少有害生物生长的方法，其中该方法测量在抑制剂存在下有害生物生长相对于在相似条件下没有抑制剂的有害生物生长的减少。一方面，有害生物生长的减少是由有害生物死亡实现的。另一方面，有害生物生长的减少是由有害生物分裂抑制来实现的。一方面，有害生物生长减少了99%或更多。另一方面，有害生物生长减少了95%或更多。在又一方面，有害生物生长减少90%或更多。在另一方面，有害生物生长减少至少80%。另一方面，有害生物生长减少至少70%。另一方面，有害生物生长减少至少60%。另一方面，有害生物生长减少至少50%。另一方面。有害生物生长减少至少90-99%，至少95-99%，至少80-95％，至少80-99％，或75-99％。在又一个方面，一种有害生物的生长减少不低于90％，95%或99％。
一方面，有害生物可以是真菌界的成员。另一方面，有害生物可以是壶菌门的成员。另一方面，有害生物可以是壶菌纲的成员。又一方面，有害生物可以是壶菌spp.种的成员。另一方面，有害生物可由选自壶菌的核酸序列识别，该壶菌可用选自由SEQ ID NOs:1-6组成的组的核酸序列来识别。
微藻培养物的有害生物的例子是真菌界的成员，和包括芽枝霉门、壶菌门、球囊菌门、微孢子虫门、新丽鞭毛菌门、子囊菌门、担子菌门。如本文所述，真菌包括壶菌纲和单毛壶菌纲以及壶菌spp.种的成员。一方面，作为真菌界成员的有害生物可由分子系统发育进行鉴别，例如使用James等的方法“有鞭毛真菌（壶菌门）的分子系统发育和一种新的门（芽枝霉门）的说明”，真菌学，98(6):860-71(2006)，其全部内容通过参考引用到本文。
另一方面，有害生物可以是壶菌门罗兹属的成员。一方面，有害生物可以是壶菌门的壶菌目/根生壶菌属的分支的成员。又一方面，有害生物可以是Amoeboaphelidium属的成员。又一方面，有害生物可能与SEQ ID NOs:1-6标示的壶菌最为系统上相关。另一方面，有害生物可能与壶菌门的分支系统上相关，壶菌门包括壶菌目、裂壶菌目、Rhizophydiales、Lobulomycetales、Cladochytriales、集壶菌目和单毛壶菌目。一方面，有害生物可与罗兹spp.系统上相关。
感染微藻培养物的真菌例子有壶菌纲的成员和壶菌spp.的成员。壶菌是原始的真菌，和主要是腐生的（降解几丁质和角蛋白）。有些种是单细胞的。与其他真菌类似，壶菌的细胞壁由几丁质构成。许多壶菌种是水生的（大多在淡水中找到）。有大约1,000个壶菌种，127个属，分布在5个目中。某些壶菌种是寄生的，可能感染植物，包括微藻。
包括在本公开内容中的壶菌特定非限定性例子包括：Achlyogeton、Allochytridium、Allochytridium expandens、Allochytridium luteum、Allomyces、Allomyces(subgenus)、Allomyces attomyces、Allomyces catenoides、Allomyces reticulatus、Amoeboaphelidium protococcarum、Alphamycetaceae、Alphamyces、Alphamyceschaetiferum、Amphicypellus、Amphicypellus elegans、Anaeromyces、Anaeromyces elegans、Anaeromyces mucronatus、Angulomycetaceae、Angulomyces、Angulomyces argentinensis、Aquamycetaceae、Aquamyces、Aquamyces chlorogonii、Arnaudovia、Arnaudoviahyponeustonica、Asterophlyctis irregularis、Asterophlyctis sarcoptoides、Batrachochytrium、Batrachochytrium dendrobatidis、Blastocladia arborata、Blastocladia caduca、Blastocladiacoronata、Blastocladia cristata、Blastocladia didyma、Blastocladia elegans、Blastocladiaexcelsa、Blastocladia filamentosa、Blastocladia fruticosa、Blastocladia fusiformis、Blastocladia globosa var.Minutissima、Blastocladia heterosporangia、Blastocladiamammilata、Blastocladia picaria、Blastocladia pileota、Blastocladia pusilla、Blastocladiasessilis、Blastocladia spiciformis、Blastocladiella、Blastocladiella anabaenae、Blastocladiella britannica、Blastocladiella colombiensis、Blastocladiella nova-zeylandiae、Blastocladiomycota、Blastocladiopsis elegans、Blyttiomyces bartsch、Blyttiomyces aureusbooth、Blyttiomyces conicus、Blyttiomyces exuviae、Blyttiomyces gregarum、Blyttiomycesharderi、Blyttiomyces laevis、Blyttiomyces lenis、Blyttiomyces rhizophlyctidis、Blyttiomycesspinosus、Blyttiomyces vaucheriae、Blyttiomyces verrucosus、Boothiomyces、Boothiomycesmacroporosum、Caecomyces、Caecomyces communis、Caecomyces equi、Caecomycessympodialis、Callimastix frontalis、Canteria、Canteria apophysata、Catenaria auxiliaris、Catenaria indica、Catenaria ramosa、Catenaria spinosa、Catenaria uncinata、Catenariavermicola、Catenaria verrucosa、Catenochytridium hemicysti、Catenochytridium marinum、Catenochytridium oahuense、Catenophlyctis、Catenophlyctis peltata、Catenophlyctisvariabilis、Catenophlyctis variabilis var.Olduvaiensis、Caulochytriaceae subramanium、Caulochytrium、Caulochytrium gloeosporii、Caulochytrium protostelioides、Caulochytriumprotosteloides var.Vulgaris、Chytridiaceae、Chytridiales、Chytridiomycetes、Chytridiomycota、Chytridium、Chytridium adpressum、Chytridium aggregatum、Chytridiumapophysatum、Chytridium brevipes、Chytridium cejpii、Chytridium chlorobotryis、Chytridium citriforme、Chytridium closterii、Chytridium codicola、Chytridiumcoleochaetes、Chytridium confervae、Chytridium corniculatum、Chytridium cresentum、Chytridium deltanum、Chytridium fusiforme、Chytridium gibbosum、Chytridium hemicysta、Chytridium horariumforme、Chytridium hyperparasiticum、Chytridium inflatum、Chytridium isthmiophilum、Chytridium kolianum、Chytridium lagenaria、Chytridiumlatipodium、Chytridium mallomonadis、Chytridium marylandicum、Chytridiummucronatum、Chytridium neopapillatum、Chytridium oedogonii、Chytridium ottariense、Chytridium parasiticum、Chytridium pilosum、Chytridium proliferum、Chytridiumreniforme、Chytridium schenkii、Chytridium schenkii var.Dumontii、Chytridium scherffelii、Chytridium sexuale、Chytridium sparrowii、Chytridium stellatum、Chytridiumtelmatoskenae、Chytridium turbinatum、Chytriomyces、Chytriomyces angularis、Chytriomyces annulatus、Chytriomyces confervae、Chytriomyces cosmarii、Chytriomyceselegans、Chytriomyces gilgaiensis、Chytriomyces heliozoicola、Chytriomyces hyalinus、Chytriomyces hyalinus var.Granulatus、Chytriomyces laevis、Chytriomycesmacro-operculatus、Chytriomyces macro-operculatus var.Hirsutus、Chytriomycesmammilifer、Chytriomyces mortierellae、Chytriomyces multi-operculatus、Chytriomycesnagatoroensis、Chytriomyces poculatus、Chytriomyces reticulatus、Chytriomycesreticulosporus、Chytriomyces rhizidiomycetis、Chytriomyces rotoruaensis、Chytriomycessuburceolatus、Chytriomyces vallesiacus、Chytriomyces verrucosus、Chytriomyceswilloughbyi、Cladochytriales、Cladochytriaceae、Cladochytrium aureum、Cladochytriumgranulatum、Cladochytrium indicum、Cladochytrium novoguineense、Cladochytriumreplicatum、Cladochytrium salsuginosum、Clydea、Clydea vesicula、Coelomomycetaceae、Coelomycidium、Coralloidiomyces、Coralloidiomyces digitatus、Cylindrochytriumendobioticum、Cystocladiella、Dangeardia appendiculata、Dangeardia echinulata、Dangeardia molesta、Dangeardia sporapiculata、Dangeardia sporapiculata var.Minor、Dangeardiana、Dangeardiana apiculata、Dangeardiana eudorinae、Dangeardianaleptorrhiza、Dangeardiana sporapiculata、Dictyomorpha、Dictyomorpha dioica、Dictyomorpha dioica var.Pythiensis、Diplochytridium、Diplochytridium aggregatum、Diplochytridium brevipes、Diplochytridium cejpii、Diplochytridium chlorobotryis、Diplochytridium citriforme、Diplochytridium codicola、Diplochytridium gibbosum、Diplochytridium inflatum、Diplochytridium isthmiophilum、Diplochytridium kolianum、Diplochytridium lagenarium var.Japonense、Diplochytridium lagenarium、Diplochytridiummallomonadis、Diplochytridium mucronatum、Diplochytridium oedogonii、Diplochytridiumschenkii、Diplochytridium scherffelii、Diplochytridium sexuale、Diplochytridium stellatum、Diplochytridium Turbinatum、Diplophlyctis asteroidea、Diplophlyctis buttermerensis、Diplophlyctis chitinophila、Diplophlyctis complicata、Diplophlyctis nephrochytrioides、Diplophlyctis sarcoptoides、Diplophlyctis sexualis、Diplophlyctis versiformis、Endochytriumcystarum、Endochytrium multiguttulatum、Entophlyctis、Entophlyctis apiculata、Entophlyctis bulligera、Entophlyctis bulligera var.Brevis、Entophlyctis caudiformis、Entophlyctis confervae-glomeratae、Entophlyctis crenata、Entophlyctis filamentosa、Entophlyctis helioformis、Entophlyctis lobata、Entophlyctis luteolus、Entophlyctismammilliformis、Entophlyctis molesta、Entophlyctis obscura、Entophlyctis reticulospora、Entophlyctis rhizina、Entophlyctis sphaerioides、Entophlyctis texana、Entophlyctisvariabilis、Entophlyctis variabilis、Entophlyctis vaucheriae、Entophlyctis willoughbyi、Gaertneriomyces、Gaertneriomyces semiglobiferus、Gaertneriomyces tenuis、Globomycetaceae、Globomyces、Globomyces pollinis-pini、Gonopodya terrestris、Gorgonomycetaceae、Gorgonomyces、Gorgonomyces haynaldii、Hapalopera、Hapaloperaachnanthis、Hapalopera difficilis、Hapalopera fragilariae、Hapalopera melosirae、Hapalopera piriformis、Harpochytriaceae、Harpochytriales、Harpochytrium、Harpochytrium adpressum、Harpochytrium apiculatum、Harpochytrium botryococci、Harpochytrium hedenii、Harpochytrium hyalothecae、Harpochytrium intermedium、Harpochytrium monae、Harpochytrium natrophilum、Harpochytrium ornithocephalum、Harpochytrium tenuissimum、Harpochytrium viride、Kappamyces、Kappamycetaceae、Kappamyces laurelensis、Karlingia、Karlingia aurantiaca、Karlingia exo-operculata、Karlingia expandens、Karlingia granulata、Karlingia lacustris、Karlingia lobata var.Microspora、Karlingia polonica、Karlingia spinosa、Karlingiomyces、Karlingiomyceslaevis、Kochiomyces、Kochiomyces dichotomus、Krispiromyces、Krispiromyces discoides、Lacustromyces、Lacustromyces hiemalis、Lobulomycetales、Lobulomycetaceae、Lobulomyces、Lobulomyces angularis、Lobulomyces poculatus、Lyonomyces、Lyonomycespyriformis、Macrochytrium botrydiella、Macrochytrium botrydioides var.Minutum、Maunachytrium、Maunachytrium keaense、Mesochytrium、Mesochytrium penetrans、Microallomyces、Microallomyces dendroideus、Micromyces furcata、Micromyces grandis、Micromycopsidaceae、Milleromyces、Milleromyces rhyniensis、Mitochytridium regale、Monoblepharidomycetes、Monoblepharidales、Monoblepharidaceae、Monoblepharella、Monoblepharis micrandra、Monoblepharis thalassinosus、Monophagus、Monophagusblackmanii、Monophagus bruhlii、Neocallimastigaceae、Neocallimastigales、Neocallimastigomycota、Neocallimastigomycetes、Neocallimastix、Neocallimastix frontalis、Neocallimastix hurleyensis、Neocallimastix joyonii、Neocallimastix patriciarum、Neocallimastix variabilis、Nephrochytrium bipes、Nephrochytrium buttermerense、Nephrochytrium complicatum、Nephrochytrium sexuale、Nowakowskiella crassa、Nowakowskiella delica、Nowakowskiella elegans、Nowakowskiella granulata、Nowakowskiella keratinophila、Nowakowskiella methistemichroma、Nowakowskiellamoubasherana、Nowakowskiella multispora、Nowakowskiella multispora、Nowakowskiellapitcairnensis、Nowakowskiella profusa、Nowakowskiella profusa forma constricta、Nowakowskiella sculptura、Nowakowskiellaceae、Obelidium megarhizum、Oedogoniomycetaceae、Olpidium、Olpidium appendiculatum、Olpidium bornovanus、Olpidium brassicae、Olpidium cucurbitacearum、Olpidium entophlyctoides、Olpidiumfulgens、Olpidium incognitum、Olpidium indicum、Olpidium indicum、Olpidium indum、Olpidium longum、Olpidium nematodae、Olpidium paradoxum、Olpidium poreferum、Olpidium pseudoeuglenae、Olpidium radicale、Olpidium rostriferum var.Indica、Olpidiumsparrowii、Olpidium synchytrii、Olpidium vermicola、Olpidium virulentus、Olpidiumwildemani、Olpidium zopfianus、Orpinomyces、Orpinomyces bovis、Orpinomycesintercalaris、Orpinomyces joyonii、Pateramycetaceae、Pateramyces、Pateramycescorrientinensis、Phlyctidium、Phlyctidium anatropum、Phlyctidium apophysatum、Phlyctidium brevipes var.Marinum、Phlyctidium bumilleriae、Phlyctidium globosum、Phlyctidium keratinophilum、Phlyctidium keratinophilum var.Savulescui、Phlyctidiummarinum、Phlyctidium mycetophagum、Phlyctidium olla、Phlyctidium scenedesmi、Phlyctidium spinulosum、Phlyctidium tenue、Phlyctidium tubulatum、Phlyctochytriumacuminatum、Phlyctochytrium aestuarii、Phlyctochytrium africanum、Phlyctochytriumapophysatum、Phlyctochytrium arcticum、Phlyctochytrium aureliae、Phlyctochytriumcalifornicum、Phlyctochytrium chandleri、Phlyctochytrium circulidentatum、Phlyctochytrium cystoferum、Phlyctochytrium dichotomum、Phlyctochytrium dissolutum、Phlyctochytrium furcatum、Phlyctochytrium hirsutum、Phlyctochytrium incrustans、Phlyctochytrium indicum、Phlyctochytrium irregulare、Phlyctochytrium kniepii、Phlyctochytrium lackeyi、Phlyctochytrium macrosporum、Phlyctochytrium mangrovii、Phlyctochytrium marilandicum、Phlyctochytrium megastomum、Phlyctochytriummucosum、Phlyctochytrium multidentatum、Phlyctochytrium neuhausiae、Phlyctochytriumpalustre、Phlyctochytrium parasitans、Phlyctochytrium peruvianum、Phlyctochytriumplanicorne、Phlyctochytrium plurigibbosum、Phlyctochytrium powhatanense、Phlyctochytrium punctatum、Phlyctochytrium recurvastomum、Phlyctochytriumrhizopenicillium、Phlyctochytrium semiglobiferum、Phlyctochytrium spinosum、Phlyctochytrium variable、Phlyctochytrium vaucheriae、Phlyctochytrium verruculosum、Phlyctorhiza variabilis、Physodermataceae、Piromyces、Piromyces communis、Piromycesdumbonicus、Piromyces mae、Piromyces minutus、Piromyces rhizinflatus、Piromycesspiralis、Pleotrachelus、Pleotrachelus askaulos、Pleotrachelus bornovanus、Pleotrachelusbrassicae、Pleotrachelus virulentus、Pleotrachelus wildemanni、Pleotrachelus zopfianus、Podochytrium chitinophilum、Podochytrium dentatum、Podochytrium ellerbeckense、Polyphagus asymmetricus、Polyphagus elegans、Polyphagus euglenae、Polyphagushyponeustonica、Polyphagus serpentinus、Polyphagus starrii、Polyphlyctis、Polyphlyctiscystofera、Polyphlyctis unispina、Powellomyces、Powellomyces hirtus、Powellomycesvariabilis、Pringsheimiella dioica、Protrudomycetaceae、Protrudomyces、Protrudomyceslaterale、Pseudopileum、Pseudopileum unum、Rhizidium megastomum、Rhizidiumphycophilum、Rhizidium renifore、Rhizidium tomiyamanum、Rhizoclosmatium hyalinum、Rhizophlyctidales、Rhizophlyctidaceae、Rhizophlyctis、Rhizophlyctis aurantiaca、Rhizophlyctis boninensis、Rhizophlyctis bonseyi、Rhizophlyctis columellae、Rhizophlyctiscostatus、Rhizophlyctis fuscus、Rhizophlyctis hirsutus、Rhizophlyctis lovettii、Rhizophlyctisoceanis、Rhizophlyctis oceanis var.Floridaensis、Rhizophlyctis petersenii var.Appendiculata、Rhizophlyctis reynoldsii、Rhizophlyctis rosea、Rhizophlyctis serpentina、Rhizophlyctis sp.、Rhizophlyctis tropicalis、Rhizophlyctis variabilis、Rhizophlyctis variabilisvar.Burmaensis、Rhizophlyctis willoughbyi、Rhizophydium、Rhizophydiales、Rhizophydiaceae、Rhizophydium achnanthis、Rhizophydium algavorum、Rhizophydiumanatropum、Rhizophydium androdioctes、Rhizophydium angulosum、Rhizophydiumannulatum、Rhizophydium aphanomycis、Rhizophydium aureum、Rhizophydiumbiporosum、Rhizophydium blastocladianum、Rhizophydium blyttiomycerum、Rhizophydiumbrevipes var.Marinum、Rhizophydium brooksianum、Rhizophydium bumilleriae、Rhizophydium capillaceum、Rhizophydium clavatum、Rhizophydium coleochaetes、Rhizophydium collapsum、Rhizophydium conchiforme、Rhizophydium condylosum、Rhizophydium contractophilum、Rhizophydium coralloidum、Rhizophydium dentatum、Rhizophydium difficile、Rhizophydium digitatum、Rhizophydium dubium、Rhizophydiumechinocystoides、Rhizophydium ellipsoidium、Rhizophydium fragilariae、Rhizophydiumfugax、Rhizophydium gonapodyanum、Rhizophydium hispidulosum、Rhizophydiumkarlingii、Rhizophydium lagenaria、Rhizophydium laterale、Rhizophydium lenelangeae、Rhizophydium littoreum、Rhizophydium macroporosum、Rhizophydium manoense、Rhizophydium melosirae、Rhizophydium mougeotiae、Rhizophydium nobile、Rhizophydiumnovae-zeylandiensis、Rhizophydium obpyriformis、Rhizophydium olla、Rhizophydiumpatellarium、Rhizophydium pedicellatum、Rhizophydium piriformis、Rhizophydiumplanktonicum、Rhizophydium poculiforme、Rhizophydium polystomum、Rhizophydiumporosum、Rhizophydium proliferum、Rhizophydium punctatum、Rhizophydiumrarotonganensis、Rhizophydium reflexum、Rhizophydium rhizinum、Rhizophydiumrotundum、Rhizophydium scenedesmi、Rhizophydium sibyllinum、Rhizophydium signyense、Rhizophydium skujai、Rhizophydium sparrowii、Rhizophydium sphaerocarpum var.Rhizoclonii、Rhizophydium sphaerocarpum var.Spirogyrae、Rhizophydium sphaerotheca、Rhizophydium spinosum、Rhizophydium spinosum、Rhizophydium spinosum、Rhizophydiumspinulosum、Rhizophydium squamosum、Rhizophydium stellatum、Rhizophydium tenue、Rhizophydium tetragenum、Rhizophydium tubulatum、Rhizophydium ubiquetum、Rhizophydium undatum、Rhizophydium undulatum、Rhizophydium urcelolatum、Rhizophydium venezuelensis、Rhizophydium venustum、Rozella、Rozella blastocladiae、Rozella coleochaetis、Rozella diplophlyctidis、Rozella itersoniliae、Rozella longicollis、Rozella longisporangia、Rozella parva、Ruminomyces、Ruminomyces elegans、Scherffeliomyces appendiculatus、Scherffeliomyces leptorrhizus、Scherffeliomycopsis、Scherffeliomycopsis coleochaetis、Septochytriaceae、Septochytrium willoughbyi、Septosperma、Septosperma anomalum、Septosperma irregulare、Septosperma multiforma、Septosperma rhizophidii、Septosperma spinosa、Siphonaria variabilis、Solutoparies、Sorochytriaceae、Sorochytrium、Sorochytrium milnesiophthora、Sparrowia、Sparrowiaparasitica、Sparrowia subcruciformis、Sparrowmyces、Sparrowmyces sparrowii、Sphaeritadinobryi、Spizellomyces、Spizellomyces acuminatus、Spizellomyces dolichospermus、Spizellomyces kniepii、Spizellomyces lactosolyticus、Spizellomyces palustris、Spizellomycesplurigibbosus、Spizellomyces pseudodichotomus、Spizellomyces punctatus、Spizellomycetaceae、Spizellomycetales、Sporophlyctidium neustonicum、Synchytrium、Terramycetaceae、Terramyces、Terramyces subangulosum、Thallasochytrium、Thallasochytrium gracillariopsidis、Triparticalcar、Triparticalcar arcticum、Urceomyces、Urceomyces sphaerocarpum、Urophlyctaceae、Zygorhizidium affluens、Zygorhizidiumasterionellae、Zygorhizidium chlorophycidis、Zygorhizidium cystogenum、Zygorhizidiummelosirae、Zygorhizidium planktonicum、Zygorhizidium planktonicum、Zygorhizidiumvaucheriae、Zygorhizidium venustum。还可见，Barr，D.J.S.，“壶菌目的再分类，和新的目裂壶菌目的概述”加拿大植物学杂志，58:2380-2394(1980)；Barr，D.J.S.，“In:原生生物界手册,”编著。L.Margulis，J.O.Corliss，M.Melkonian，和D.J.Chapman，Jones&Bartlett出版社，波士顿，马萨诸塞(简称HP)，壶菌门，pp.454-466(1990)；Batko，A.，Zarys Hydromikologii.Panstwowe Wydawnictwo Naukowe，华沙，波兰(简称ZH)(1975)；真菌索引，C.A.B.International，瓦林福德，英国(简称IF)vols.3-6(1960-1995)；Hibbett，D.S.等人，“较高水平的真菌系统分类,”真菌学研究，111:509-547(2007)；James，T.Y.，等人，“壶菌门的分子系统支持超微结构数据在壶菌系统学中的应用,”加拿大植物学杂志，78:336-350(2000)；James，T.Y.等人，“重建六基因系统发育真菌的早期演变,”自然443:818-822(2006)；James，T.Y.等人，“有鞭毛真菌（壶菌门）的分子系统发育和一个新的门（芽枝霉门）的描述,”真菌学，98:860-871(2006)；Karling，J.S.，“Chytridiomycetarum Iconographia(简称CI),”Lubrect&Cramer，蒙蒂塞洛,纽约，(1977)；Letcher，P.M.等人，“壶菌科（壶菌目）的超微结构和分子描述,”加拿大植物学杂志，82:1561-1573(2005)；Letcher，P.M.等人，“Rhizophydiales(壶菌门)，一个新的目的超微结构和系统发育描述”真菌学研究，110:898-915(2006)；Letcher，P.M.等人，“Rhizophyctidales-壶菌门中的一个新的目,”真菌学研究，112:1031-1048(2008)；Li等人，“厌氧chytridiomycetous肠道真菌（Neocallimasticaceae）和壶菌门的系统发育关系。II Neocallimasticaceae的结构数据的支序系统分析和描述ord.nov.”加拿大植物学杂志，71:393-407(1993)；Mozley-Standridge，S.E.等人“Cladochytriales，壶菌门的一个新的目,”真菌学研究，113:498-507(2009)；Simmons，D.R.等人，“Lobulomycetales，壶菌门的一个新的目,”真菌学研究，113:450-460(2009)；Sparrow，F.K.，“水生藻菌目,”2nd rev.ed.，密歇根大学出版社，安阿伯市，密歇根(1960)；和Sparrow，F.K.，“壶菌纲，丝壶菌纲.In:真菌,”IVB Eds.，G.C.Ainsworth，F.K.Sparrow和A.S.Sussman，学术出版社，纽约，pp.85-110(1973)，每篇文献的全部内容通过参考引用到本文。
另一方面，有害生物可以是原生动物。一方面，原生动物可以是变形虫。另一方面，原生动物可以是Vannella danica。又一方面，原生动物可以是纤毛虫。一方面，纤毛虫可以是银灰膜袋虫或小游仆虫。
在本发明的又一方面，有害生物可以是细菌。一方面，细菌可以是盐单胞菌科的成员。一方面，有害生物可以是盐单胞菌属的一个种。一方面，有害生物可以是盐单胞菌campisalis。
一方面，有害生物可以是轮虫动物门的成员。又一方面，轮虫可以是臂尾轮虫科的轮虫。一方面，臂尾轮虫科可以是褶皱臂尾轮虫。
除真菌有害生物外，根据本公开内容的一些其他有害生物已经鉴定了序列，并指定为藻类的有害生物。这些包括真核物种的变形虫，纤毛虫，轮虫以及原核生物，如盐单胞菌。
本公开内容的微藻包括原生生物界的绿藻门的成员。本公开内容的微藻包括单胞藻科的成员。一方面，本公开内容的微藻是莱茵衣藻（C.reinhardtii）。本公开内容的另一方面，C.reinhardtii可以被基因工程改造。又另一方面，绿藻可以是栅藻。另一方面，绿藻可以是小球藻的成员。另一方面，绿藻可以是鼓列藻。本公开内容的绿藻可以被基因工程改造。
能用于本文公开的方法的非维管光合生物体（NVPO）的一般非限制性例子是下述门：绿藻门、蓝藻门（蓝细菌）、以及褐藻植物门、硅藻门、金藻门和定鞭藻门。在一些实例中，微藻是，例如，分类为原绿藻门、红藻门、tribophyta、灰色藻门、chlorarachniophytes、裸藻门、眼虫藻门、隐藻门、隐滴虫门、甲藻门、腰鞭毛目、pyrmnesiophyta、硅藻门、黄藻门、eustigmatophyta、raphidophyta、褐藻门、以及浮游植物的有机体。
绿藻的特定非限定性例子包括纤维藻、葡萄藻、小球藻、绿球藻、杜氏藻、单针藻、卵囊藻、栅藻、链带藻和扁藻。一方面，绿藻可以是小球藻或杜氏藻。蓝藻的特定非限定性例子包括颤藻和聚球藻。金藻的特定例子包括Boekelovia。haptophytes的特定非限定性例子包括等鞭金藻和颗石藻。硅藻的特定非限定性例子包括双肋藻属、双眉藻属、角毛藻属、小环藻属、桥穹藻属、脆杆藻属、菱板藻属、舟形藻属、菱形藻属、褐指藻属和海链藻属。
在某些方面，使用本公开内容方法的NVPO是下列各属之一的成员：微绿球藻、小球藻、杜氏盐藻、栅藻、链带藻，月芽藻、颤藻、席藻属、螺旋藻、念珠藻、双眉藻和棕鞭藻。
东方曲壳藻(Achnanthes orientalis)、阿格门氏藻属（Agmenellum spp.)、透明苗形藻属（Amphiprorahyaline)、咖啡形双眉藻(Amphora coffeiformis)、咖啡形双眉藻线状变种(Amphoracoffeiformis var.linea)、咖啡形双眉藻斑点变种（Amphora coffeiformis var.punctata)、咖啡形双眉藻泰勒氏变种（Amphoracoffeiformis var.taylori)、咖啡形双眉藻细薄变种（Amphora coffeiformis var.tenuis)、优美双眉藻（Amphoradelicatissima)、优美双眉藻头状变种(Amphoradelicatissima var.capitata)、双眉藻属、鱼腥藻属（Anabaena)、纤维藻属（Ankistrodesmus)、镰形纤维藻（Ankistrodesmusfalcatus)、Boekeloviahooglandii、Borodinella sp.、布朗尼葡萄藻(Botryococcusbraunii)、Botryococcussudeticus、小型片球藻(Bracteococcus minor)、Bracteococcusmedionucleatus、四鞭藻属(Carteria)、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、牟勒氏角毛藻（Chaetoceros muelleri)、牟勒氏角毛藻亚盐变种（Chaetoceros muellerivar.subsalsum)、角毛藻属(Chaetoceros sp.)、Chlamydomas perigranulata、无石肖小球藻（Chlorella anitrata)、南极洲小球藻（Chlorella antarctica)、黄绿小球藻(Chlorella aureoviridis)、念球菌小球藻（Chlorella Candida)、囊状小球藻（Chlorellacapsulate)、干燥小球藻(Chlorella desiccate)、捕圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、浮水小球藻（Chlorella emersonii)、淡掲小球藻（Chlorella fusca)、淡掲小球藻空泡变种(Chlorella fusca var.vacuolata)、Chlorella glucotropha、水溪小球藻(Chlorellainfusionum)、Chlorella infusionum var.actophila、Chlorellainfusionum var.auxenophila、凯氏小球藻(Chlorella kessleri)、Chlorellalobophora、Chlorellaluteoviridis、Chlorella luteoviridis var.aureoviridis、Chlorella luteoviridisvar.lutescens、Chlorella miniata、极微小球藻(Chlorellaminutissima)、突变小球藻(Chlorella mutabilis)、夜间小球藻（Chlorellanocturna)、卵圆形小球藻（Chlorellaovalis)、小形小球藻（Chlorella parva)、嗜光小球藻（Chlorella photophila)、Chlorella pringsheimii、原始小球藻（Chlorella protothecoides)、原始小球藻酸居变种(Chlorella protothecoides var.acidicola)、规则小球藻(Chlorella regularis)、规贝1J小球藻极小变种(Chlorellaregularis var.minima)、Chlorella regularis var.umbricata、Chlorella reisiglii、嗜糖小球藻(Chlorella saccharophila)、海洋小球藻捕圆变种（Chlorellasaccharophila var.ellipsoidea)、海水小球藻（Chlorellasalina)、单纯小球藻(Chlorella simplex)、耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)、小球藻属（Chlorellasp.)、球抱小球藻（Chlorella sphaerica)、Chlorellastigmatophora、万尼氏小球藻(Chlorella vanniellii)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、Chlorella vulgaris fo.Tertia、普通小球藻自养变体（Chlorella vulgarisvar.autotrophica)、普通小球藻绿色变种(Chlorella vulgaris var.viridis)、普通小球藻普通变种(Chlorellavulgaris var.vulgaris)、Chlorella vulgaris var.vulgaris fo.Tertia、Chlorellavulgaris var.vulgaris fo.Viridis、Chlorella xanthella、Chlorella zofingiensis、Chlorella trebouxioides、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、水溪绿球藻（Chlorococcum infusionum)、绿球藻属（Chlorococcum sp.)、绿梭藻属（Chlorogonium)、蓝隐藻属（Chroomonas sp.)、金球藻属（Chrysosphaera sp.)、球隹丐板藻属(Cricosphaera sp.)、隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、隐藻属(Cryptomonassp.)、隐秘小环藻（Cyclotella cryptica)、梅尼小环藻（Cyclotellameneghiniana)、小环藻属（Cyclotella sp.)、杜氏藻属、拜尔代维勒杜氏藻（Dunaliella bardawil)、Dunaliella bioculata、颗粒状杜氏藻（Dunaliellagranulate)、海生杜氏藻（Dunaliellamaritime)、微小杜氏藻(Dunaliella minuta)、巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)、Dunaliella peircei、Dunaliella primolecta、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、陆生杜氏藻(Dunaliella terricola)、Dunaliellatertiolecta、绿色杜氏藻(Dunaliellaviridis)、Dunaliella tertiolecta、绿色独球藻(Eremosphaera viridis)、独球藻属(Eremosphaera sp.)、后棘藻属（Ellipsoidonsp.)、裸藻属（Euglena spp.)、披剌藻属(Franceia sp.)、克罗脆杆藻（Fragilariacrotonensis)、脆杆藻属(Fragilaria sp.)、蓝鼓藻属（Gleocapsa sp.)、丝藻属（Gloeothamnion sp.)、雨生红球藻（Haematococcuspluvialis)、膜胞藻属(Hymenomonas sp.)、lsochrysis aff.Galbana、球等鞭金藻(lsochrysis galbana)、鱗孔藻属(Lepocinclis)、微星藻属（Micractinium)、微星藻属（Micractinium)、微小单针藻(Monoraphidium minutum)、单针藻属(Monoraphidiumsp.)、侏囊菌属(Nannochloris sp.)、盐生微绿球藻(Nannochloropsis salina)、微绿球藻属(Nannochloropsis sp.)、截形舟形藻(Navicula acceptata)、Naviculabiskanterae、Navicula pseudotenelloides、具膜舟形藻(Navicula pelliculosa)、腐生舟形藻(Navicula saprophila)、舟形藻属(Navicula sp.)、肾鞭藻属(Nephrochlorissp.)、肾藻属（Nephroselmis sp.)、普通菱形藻（Nitschia communis)、亚历山大菱形藻(Nitzschia alexandrina)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、普通菱形藻(Nitzschiacommunis)、细端菱形藻(Nitzschia dissipata)、碎片菱形藻(Nitzschiafrustulum)、汉氏菱形藻(Nitzschia hantzschiana)、平庸菱形藻(Nitzschiainconspicua)、中型菱形藻(Nitzschia intermedia)、小头菱形藻(Nitzschiamicrocephala)、微小菱形藻(Nitzschia pusilla)、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusillamonoensis、四边形菱形藻(Nitzschia quadrangular)、菱形藻属(Nitzschia sp.)、掠鞭藻属(Ochromonas sp.)、小卵囊藻(Oocystis parva)、卵泡藻(Oocystis pusilla)、卵囊藻属(Oocystis sp.)、沼泽颤藻(Oscillatoria Iimnetica)、颤藻属(Oscillatoriasp.)、亚短亶货藻(Oscillatoria subbrevis)、Parachlorellakessleri、Pascheriaacidophila、巴夫藻属（Pavlova sp.)、三角褐指藻（Phaeodactylum tricomutum)、噬菌体属（Phagus)、席藻属（Phormidium)、扁藻属（Platymonas sp.)、颗石藻（Pleurochrysiscarterae)、Pleurochrysisdentate、颗石藻属（Pleurochrysis sp.)、威克海姆原壁藻(Protothecawickerhamii)、Prototheca stagnora、波多黎各原壁藻(Protothecaportoricensis)、Prototheca moriformis、饶氏原藻（Prototheca zopfii)、水生假小球藻（Pseudochlorella aquatica)、塔胞藻属（Pyramimonas sp.)、桑葚藻属（Pyrobotrys)、不透明红球菌（Rhodococcus opacus)、Sarcinoid chrysophyte、被甲栅藻（Scenedesmusarmatus)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、水绵属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)、裂丝藻属（Stichococcus sp.)、集球藻属（Synechococcus sp.)、集胞藻属（Synechocystisf)、万寿菊(Tagetes erecta)、孔雀草(Tagetes patula)、四角藻属(Tetraedron)、四爿藻属（Tetraselmis sp.)、瑞典四爿藻（Tetraselmis suecica)、威氏海链藻(Thalassiosira weissfIogii)和Viridiella fridericiana。
非维管光合生物体的其他例子是莱茵衣藻（C.reinhardtii）、D.salina、D.tertiolecta、S.dimorphus、或H.pluvialis。该生物体可以是衣藻属、杜氏藻属、栅藻属、链带藻属或绿藻红球藻(hematococcus)的成员，例如，C.reinhardtii、D.salina、D.tertiolecta、S.dimorphus、或H.pluvialis，但是也可以使用其他属的成员。
按照本文所述培养的生物体是常规使用的种莱茵衣藻（C.reinhardtii）。这个种的细胞是单倍体，并且能够在无机盐样品培养基上生长，通过光合作用提供能量。如果醋酸盐被提供作为碳源的话，这个生物体还能在完全黑暗下生长。在标准的荧光灯和室温下，莱茵衣藻（C.reinhardtii）能快速生长。此外，通过将其置于明-暗循环中，细胞能够同步。培养莱茵衣藻（C.reinhardtii）的其他方法是本领域技术人员知晓的。培养本公开内容的生物体的方法是本技术领域已知的，例如，Vonshak,A.钝顶螺旋藻(节旋藻):生理学、细胞生物学和生物技术.1997.CRC出版社,安徒生,A.藻类培养技术.2005.Elsevier Academic出版社,Chen等人(2011)“用于生物柴油生产的微藻的培养、光生物反应器设计和收集:评论性综述,”生物资源技术102:71-81,Rodolfi等人,“用于油的微藻:菌种选育，诱导脂质合成和在一种低成本的光生物反应器室外大规模种植”,生物技术和生物工程102:100-112(2009),和Ugwu等人,“用于大规模培养藻类的光生物反应器,”生物资源技术99:4021-4028(2008),每篇文献的全部内容通过参考引用到本文。
另一方面，本公开内容的微藻包括不等鞭毛门的成员。一方面，不等鞭毛门的微藻可以是微绿球藻属的成员。另一方面，微绿球藻可以被基因工程改造。一方面，本公开内容的微藻可能是原生生物界的绿藻门（chorophyta）的微藻。
另一方面，本公开内容的微藻类可能是蓝藻。一方面，蓝藻可能是螺旋藻属或坑形细鞘丝藻属或念珠藻属的成员。另一方面，微藻可以是鼓藻。
一方面，本公开内容的微藻可以被基因工程改造。一方面，本公开内容的微藻可以根据国际专利申请号PCT/US2010/048828中提供的方法进行基因工程改造，公布为国际公开号WO2011/034863，或根据在国际专利申请号PCT/US2010/048666中提供的方法，公布为国际公开号WO2011/034823，二者的全部内容通过参考引用到本文。
本公开内容的一方面，微藻在液体系统中生长。一方面，微藻接种到液体中，作为微藻的单一品种。一方面，微藻可以是具有一个或多个外源DNA序列的转化的微藻。在不同方面，微藻可具有重组构建体的内源性DNA的序列。另一方面，所述序列可以是重组构建体的外源DNA序列。
另一方面，微藻的单个品种可以是微藻的种群。一方面，微藻的群体可以被一个或多个DNA构建体转换。一方面，微藻的种群可以是具有一个或多个DNA构建体的单一品种的混合物。
一方面，液体系统可以具有微藻多于一个品种。一方面，液体系统可以具有2种微藻。在另一个方面，所述液体的系统可能有3种微藻。在又一个方面中，液体系统可以具有4至6种，6至8种或8到10种微藻。在又一个方面，在液体系统中，多于一种的微藻中的一个或多个可以被遗传转化。所述一个或多个基因转化品种可以含有相同的遗传转化，或者它们可以包含不同的转化。
在本公开内容的一个方面，所述液体系统可以具有选自螺旋藻属中的2种或更多种微藻。另一方面，该液体系统可以具有选自栅藻属中的2种或更多种微藻。又一方面，该液体系统可以具有选自链带藻属中的2种或更多种微藻。一方面，该液体系统可以具有选自坑形细鞘丝藻属中的2种或更多种微藻。一方面，该液体系统可以具有选自念珠藻属中的两2种或更多种微藻。一方面，2种或更多种微藻可以转化。
一方面，液体系统可以具有2种微藻，一种选自一个属，第二种选自第二个属。一方面，第一个属可以是螺旋藻和第二个属可以是生栅藻。一个方面，第一个属可以是螺旋藻和第二个属可以是链带藻属。一方面，第一个属可以是螺旋藻和第二个属可以是坑形细鞘丝藻。一方面，第一个属可以是栅藻和第二个属可以是坑形细鞘丝藻。在本公开内容的又一个方面中，第一个属可以是坑形细鞘丝藻和第二个属可以是链带藻属。
又一方面，液体系统可以具有选自一个属中的3种微藻。在一个方面中，液体系统可以具有选自螺旋藻属的3种微藻。在另一个方面，该液体系统可以具有选自栅藻属的3种微藻。又一个的方面，液体系统可以具有选自链带藻属的3种微藻。一方面，液体系统可以具有选自坑形细鞘丝藻属的3种微藻。一方面，3种微藻可遗传转化。
一方面，所述液体系统可有3种微藻，一种选自一个属，第二种选自第二个属，第三种选自第三个属。一方面，第一个属可以是螺旋藻，第二个属可以是生栅藻，第三个属可以是坑形细鞘丝藻。在一个方面中，第一个属可以是螺旋藻，第二个属可以是链带藻，第三个属可以是坑形细鞘丝藻。一方面，3种微藻可以变换。在一个方面中，液体系统可以包括选自螺旋藻属、栅藻属、链带藻属和坑形细鞘丝藻属中的微藻品种的4、5、6、7、8、9、10或更多种的组合。
本公开内容的液体系统中的液体可以是定义的或未定义的介质。一方面，所述液体可以包括未经处理的水。在一个方面中，未经处理的水可以是获得自天然资源的水，如河流，湖泊，含水层，海洋或池塘。在另一个方面，所述液体可以是具有介于0.5和30克盐每升渗透压的微咸水。在又一个方面中，液体可以是盐水。在一个方面，水可以是获得自污水或废水处理装置的循环水，或从工业过程如电力生产等得到的废水。在本公开内容的一个方面，未经处理的水可以是含水层的水。在又一个方面，未经处理的水可以是不适合用于农业的含水层的水。在又一个方面中，含水层的水可以是具有高的总溶解固体（TDS）的含水层的水。
所述液体系统的液体可以补充有利于微藻生长的营养物质。在一个方面中，所述液体可以补充CO2以促进微藻生长。在一个方面中，CO2可通过用空气或CO2鼓泡引入到液体系统。用CO2鼓泡可以是，例如，在1％至5％的CO2。如本文所描述的CO2可以被传递到液体系统，例如，通过在含有微藻液体的表面下的CO2鼓泡。此外，喷雾可用于CO2注入液体。喷雾器是，例如，多孔盘或管组件，也被称为起泡器、碳酸化器、曝气机、多孔石和扩散器。在一个方面中，CO2可以液态引入到液体系统。
一方面，液体可以补充CO2以提高CO2在液体中的浓度到20份每百万份（ppm），或更多。另一方面，该液体可以补充CO2以提高CO2在液体中的浓度到25ppm，或更多。另一方面，该液体可以补充CO2以提高CO2在液体中的浓度到30ppm，或更多。另一方面，该液体可以补充CO2以提高CO2在液体中的浓度到35ppm，或更多。
一方面，液体系统可补充CO2以维持液体系统的pH值。当微藻光合作用时，他们促使液体系统pH值升高。如果在任何时候pH值超过了阈值上限，CO2被加入到池塘中，直到pH值降低到指定的范围内。在一个方面中，接种绿藻的液体系统补充CO2以维持pH为8.8至9.2。在一个方面中，液体系统接种绿藻和维持pH为8.8至9.2。在一个方面中，液体系统接种栅藻和维持pH为8.8至9.2。在一个方面中，液体系统可以接种二形栅藻和维持pH为8.8至9.2。在另一个方面中，液体系统接种蓝藻门的蓝-绿藻和补充CO2来维持pH为9.8至10.2。在另一个方面，液体系统接种螺旋藻属的蓝-绿藻和补充CO2来维持pH为9.8至10.2。在一个方面中，液体系统接种种钝顶螺旋藻种的蓝-绿藻和补充有CO2来维持pH为9.8至10.2。
在本公开内容的一个方面，对液体系统pH值进行监控，将可用于光合作用的CO2的量作为代表。在一个方面，提供了CO2的液体系统可以具有定义为上限的pH值。当被提供了CO2的液体系统达到上限，提供CO2，以降低pH值。在一个方面中，pH的上限值可以是9.2。在另一个方面，pH的上限值可以是9.4。在另一个方面，pH值的上限可以被设置为9.4。在进一步的方面，pH值的上限可以设定为9.6。在另一个方面，pH值的上限可以设定为9.8在另一个方面，pH值的上限可以设定为10.2、10.4和10.6。
在本公开内容的一个方面，提供了CO2的液体系统可以具有定义为下限的pH值。在一个方面中，当液体系统的pH值下降到低于预定义的阈值时，终止CO2供给以提高pH值。在一个方面中，阈值可以是pH为8.8。在另一个方面，该阈值可以是9.8。在又一个方面中，阈值可以是9.0。在一个方面中，阈值可以是9.2。在又一个的方面，阈值可以是9.4。在又一个方面中，阈值可以是9.6。
应当理解的是，本公开内容提供了增加CO2以维持pH值在阈值的范围内，和根据设定而限制pH值。进一步理解的是，不同种类的微藻具有不同的优选的最佳生长pH值范围。阈值和限制的pH值可以通过实验来确定，以最大限度地提高光合作用和微藻在液体培养系统中的生长。在本公开内容的一个方面，的pH范围内可维持8.8和9.2之间。在另一个方面，所述pH值范围内可保持在8.8和9.4之间。在又一个方面中，pH可保持在8.8和9.6之间。在一个方面中，pH可保持在8.8和9.8之间。在一个方面中，pH范围可以是9.8和10.2之间。在另一个方面，所述pH可以是9.6和10.2之间。在一个方面中，pH可为9.4和10.2之间。
在本发明的一个方面，所述液体系统可补充CO2以提供液体中CO2的浓度为20份每百万份（ppm），或更多。在另一个方面，该液体可以补充CO2，以提高CO2在液体中的浓度到25ppm，或更多。在又一个方面中，该液体可以补充CO2，以提高CO2在液体中的浓度到30ppm，或更多。在另一个方面，该液体可以补充CO2，以提高CO2在液体中的浓度到35ppm，或更多。
本公开内容还提供了用于液体系统的营养物的补充。营养成分，可以在本文所描述的系统中使用，或在本领域中已知，包括，例如，氮、磷和微量金属。在一个方面中，氮可以氨或铵盐的形式加以补充。一方面，铵以硫酸铵或氯化铵来提供。在另一个方面中，氮的补充可以由尿素提供。在一个方面中，氮的补充可由硝酸盐或硝酸提供。在又一个方面中，氮的补充可以由混合物提供，例如，由尿素和硝酸铵的混合物，也被称为URAN。在一个方面中，氮可以由硝酸钾（KNO3）提供。在一个方面中，氮可以由硝酸钠（NaNO3）提供。
本公开内容的液体系统可辅以微量金属。补充的微量金属包括铁盐（Fe）、镁盐（Mg）、钾盐（K）、钙盐（Ca）、钴盐（Co），铜盐（Cu），锰盐（Mn），钼盐（Mo），锌盐（锌），钒盐（V）或硼盐（B）。在一个方面中，微量金属可以硝酸盐（NO3-）或铵（NH4+）的盐的形式提供。在一个方面中，钾可以氯化钾或硫酸钾的形式加入。在另一个方面，钾可由硝酸钾加入到液体系统。营养物质可以，例如，以固体形式或液体形式啊计入。如果营养物质是固体形式，他们可以，例如，在被输送到含有生物体的液体系统之前，或者被递送到培养系统之前，与淡水或海水混合。在一个方面，营养物施加的方式应尽量减少对细胞渗透压的电位。在一个方面，营养物添加在一段较长的时间完成。在一个进一步的方面，营养物可以在应用到一个池塘前进行稀释。
本公开内容的液体系统可以依照微藻而保持在一个优选的pH。一方面，可以维持中性的pH。在一个方面中，可将pH维持在pH为6.5和7.5之间。在另一个方面中，碱性pH值可被维持在，例如，pH值为10。在一个方面，碱性可以保持pH值在8.0至11.0的范围内。在又一个方面中，液体系统的pH可以是酸性的，例如，pH值为6.0。在另一个方面，所述液体系统的酸性pH可以是pH为约4.0至约6.5。
微藻可以培养在本领域中已知的确定的培养基中，如min-70，M-培养基，或三醋酸酯（TAP）培养基。生物体可以生长在一个定义的基本培养基中（例如，高盐介质（HSM），改性人造海水介质（MASM），或F/2培养基）以光作为唯一的能量来源。在其它情况下，生物体可以在培养基（例如，TAP培养基）中生长，并补充有有机碳源。在一个方面中，蓝细菌可以在（例如，BG-11）培养基中生长。
生物体，如微藻，可以在淡水或海水中自然生长。用于淡水微藻的培养基可以是，例如，合成的培养基、富集培养基、土壤水分培养基，和固化培养基，如琼脂。各种培养基已被开发并用于淡水微藻的分离和培养以及在Watanabe，MW（2005）中描述。淡水培养基。在R.A.Andersen(Ed.)藻类培养技术（第13-20页）。Elsevier学术出版社。用于海洋微藻的培养基可以是，例如，人工海水培养基或天然海水培养基。培养基制备的参考描述在Harrison,P.J.和Berges,J.A.（2005）。海洋培养基。在R.A.Andersen(Ed.)藻类培养技术（第13-20页）。Elsevier学术出版社。
在一个方面，鼓藻（例如，栅藻和链带藻）培养基可以是：1.929g/L的碳酸氢钠，0.1g/L尿素，2.3730g/L硫酸钠，0.52g/L氯化钠，0.298g/L的氯化钾0.365g/L的硫酸镁，0.084mmoLg/L的氟化钠，0.035mL/L75％磷酸0.018g/
Figure BDA0000488027060000231
Fe-Lo（BASF），0.3mL/L的20X铁储备液（20X铁储备溶液：1g/L的钠乙二胺四乙酸（EDTA）和3.88g/L的氯化铁）和0.06mL/L100X微量金属储备液（100X微量金属储备溶液：1g/L的钠乙二胺四乙酸，7.2g/L，氯化锰，2.09g/L的氯化锌，1.26g/L，钼酸钠和0.4g/L的氯化钴。在一个方面，螺旋藻培养基可以是：3.675g/L碳酸氢钠，4.766g/L硫酸钠，1.09g/L氯化钠，0.49g/L的氯化钾，0.518g/L的硫酸镁，0.146g/L的氟化钠，0.306mL/L67％的硝酸，0.0173mL/L75％磷酸，0.018g/L的LibreL Fe-Lo，0.3mL/L20X铁储备溶液和0.06mL/L100X微量金属储备溶液。在一个方面，微绿球藻培养基可以是：3.675g/L碳酸氢钠，4.766g/L硫酸钠，1.09g/L氯化钠，1.09g/L的氯化钾，3.018g/L的硫酸镁，0.146g/L氟硅酸钠，0.3g/L的氯化钙，0.293mL/L67％的硝酸，0.0173mL/L75％磷酸，50mL/L的铁20X原液和10mL/L的100X微量金属储备溶液。
生物体可在室外开放水域生长，如池塘、洋、海、河流、水床、沼泽、浅水池、湖泊、水渠和水库。当在水中生长时，生物体可以包含在由积木（LEGO）样颗粒构成的晕状物中。晕状物围绕着生物体，并允许它从水下保持养分，同时保持它在开放的阳光下。
根据本公开内容，微藻可以生长在开放和/或封闭的系统，体积上可以有很大范围变化。封闭系统可包括蓄水池构筑物，诸如池塘、水槽、或管，保护免受外部环境影响，并控制温度、大气压、以及其他条件。封闭的系统可以人为的或自然的得到光合作用需要的光。对于一些实施例中，微藻可以生长在无光照和/或在有机碳源存在的环境。任选地，微藻生长的蓄水池可包括二氧化碳源以及循环机构，其被配置用来循环微藻生长储层内的微藻。封闭生长环境或蓄水池的其他例子包括封闭的生物反应器。
在一个开放的藻类培养系统中，该液体系统中的至少一个方面是向环境开放的。一个开放的液体系统，可以人为的或自然的提供进行光合作用的光。对于一些实施例中，微藻可以生长在无光照和/或在有机碳源存在的环境中。在大型开放式系统，自然光经常被使用。一个开放系统允许营养物和产品的自由交换，例如空气中的氧气和二氧化碳。实现大面积生长区域的一种方法是在大池塘或在圈养的海洋环境。在某些方面，管道池可以用作微藻生长蓄水池，其中微藻生长在浅循环池中，在管道周围连续游动，连续提取或撇去成熟的微藻。作在其中微藻生长在浅池塘循环与周围的轨道恒定运动和恒定萃取或撇去成熟微藻的微藻生长的宿主。在其它方面中，微藻生长在非流通池。
在开放式和封闭式系统，微藻培养可以成为其他生物有机体的宿主，通过竞争养分而降低微藻生产。有害生物是通过微藻高效生产目标商业产品的一个显著问题。在其他情况下，微藻培养的感染可以通过竞争或寄生彻底摧毁生产。有害生物的非限制性例子是细菌和真菌。
在一些情况下，生物体可以在容器中生长，其中每个容器包括一个或两个生物体，或多个生物体。该容器可以被构造为漂浮在水面上。例如，一个容器可以由空气和水的组合来填充，使所述容器和所述生物体（复数）产生浮力。适于在淡水生长的生物体，因而可以生长在盐水（即，海洋），反之亦然。如果容器存在任何损坏，这种机制允许生物体的自动死亡。
微藻培养技术包括所描述的那些，例如，在《淡水培养基》。R.A.Andersen(Ed.)，藻类培养技术。爱思唯尔学术出版社，在此通过引用将其整体并入本文。Elsevier学术出版社，其全部内容通过参考引用到本文。
因为生物体的光合作用，例如，微藻的增长，需要阳光，二氧化碳和水，它们可以被培养在，例如，开放的池塘和湖泊。然而，这些开放的系统比一个封闭的系统更容易受到污染有害生物。使用开放式系统的一个挑战是目标生物体可能没有有害生物生长快。当目标生物体生长的液体环境被有害生物入侵，而入侵有害生物具有较快的生长速度和接管该系统时，这将成为一个问题。
此外，开放系统对于水温，二氧化碳浓度，以及照明条件的控制较少。生物体的生长季节在很大程度上取决于地点和，除了热带地区，仅限于在每年温暖的月份。此外，在开放系统中，能够生长的不同生物体的数量被限制在能够在所选地点生存的那些。但是，一个开放的系统，比一个封闭的系统地设置和/或维持便宜。开放系统一般无法控制某些变量，例如温度、湿度和光照。这些变量将根据在其所处的环境而变化。因此，本领域的普通技术人员应当理解，生长在某个开放体系中的生物体的选择，可能决定在该开放系统的局部气候。在一个方面，在开放系统中，一个季节内的温度可以从低于冰点到高于110°F的范围。
另一种生长的生物体的方法是使用一个半封闭的系统，如用一个结构覆盖在池塘或池上，例如，一个“温室型”结构。虽然这可以导致更小的系统，它解决了许多与开放系统有关的问题。一个半封闭的系统的优点是，它可以允许更多数量的不同生物体中生长的，它允许生物体比入侵的生物体更具优势，通过允许目标生物体在对其生长所需的营养物上胜过入侵生物体，并且其可以延长生物体的生长季节。例如，如果系统被加热，该生物体可以常年生长。
池塘系统的变化是一个人工的池塘，例如，管道水塘。在管道池塘中，生物体、水和营养物质循环围绕一个“管道”。水车提供管道中液体的恒定运动，从而以一个选定的频率允许生物体被循环回液体的表面。水车还提供搅动的来源和充氧系统。这些管道水塘可封闭的，例如，在一个建筑物或一个温室，或可以放置在室外。这对于本领域技术人员是显而易见的，即除了管道水塘外，人工池塘的其他设计也可使用，和除了水车，促动液体的其它方法也可以使用，如泵等。
一些可以在本文所述的液体系统中生长的生物体是嗜盐的。例如，杜氏盐藻可以成长在海水和盐湖（盐度千分之30-300份）和高盐度的媒体（例如，人造海水介质，海水营养琼脂，半咸水水介质，海水介质等）。在一个实施例中，杜氏盐藻可生长在一个3.0摩尔盐的介质中。在另一个实施例中，杜氏盐藻可生长在一个3.2摩尔盐的介质中。在进一步的方面，杜氏盐藻可以生长在一个3.4摩尔盐的介质中。在其他方面，生长杜氏盐藻的介质的摩尔浓度可能是3.6摩尔。在另一个方面，杜氏盐藻可生长在一个3.8摩尔盐的介质中。在一个进一步的方面，杜氏盐藻的生长介质可以是4.0摩尔盐。在一个方面，该盐可以是氯化钠。在另一个方面，所述介质可以是海水或盐湖水以补充氯化钠到期望的摩尔浓度用于杜氏盐藻生长。在一个方面中，介质的摩尔浓度可使用人工海水盐或已知的本领域技术人员在其他盐类增加。在一些实施方式中，藻类可以生长在一个液体环境中是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2,1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3摩尔或更高浓度的氯化钠。一个本领域技术人员将认识到，其它的盐（钠盐、钙盐、钾盐等）也可以存在于液体的环境中。
如果使用嗜盐生物体，它可以被本领域中已知的任何载体转化。例如，杜氏盐藻可与载体转化，其能够插入到核基因组和其中包含的核酸，其编码一个絮凝部分（例如，抗细胞表面蛋白抗体，碳水化合物结合蛋白，等）。转化的嗜盐微生物然后在高盐环境中（例如，盐湖、盐池、高盐介质等）生长，生产目标产品或生物质（例如，类异戊二烯、脂肪酸、生物质降解酶，等）。在一些实例中，絮凝部分在高盐度条件下可以是无功能的进行。在这种实施例中，絮凝可以通过降低盐度（例如，通过稀释所述液体环境中）进行诱导。另外，该絮凝部分可以高盐度条件下是功能性的，和絮凝可以通过增加培养基的盐度来控制。由生物体产生的任何目标产品的提取可包括，在提取产品之前从高盐环境中移除转化的生物体。该产品的任何进一步的处理之前，在其中产物被分泌到周围环境情况下，可能有必要淡化液体环境。
大规模培养可以在光生物反应器、半封闭的池塘、露天池塘、或湖泊中进行。小规模的多步间歇培养可以接种到一个大型培养容器。可以在播种的时候，根据参数例如光密度和小规模培养（复数）的增长率来确定播种量以接接收量的比率。在制备大规模培养介质时，可以执行高压灭菌，添加营养物到再生介质，评价再生介质的条件，和测量介质的pH值，盐度和导电性。在大规模培养过程中，进行质量控制。质量控制标准可以包括取样和筛选污染物、应变差异、生长动力学、氧含量、氮含量、液体盐度，液体介质的pH值，取样生长中的细胞用于油含量测定、干重/湿重比，和培养物的光密度。
本公开内容还提供了具有温度受控的液体系统。在一个方面中，液体系统的温度保持15和32℃之间。在另一个方面，该系统的温度保持在高于15℃。在另一个方面，该系统的温度不允许超过32℃。在一个方面，该系统的温度保持在低于25℃。在一个方面中，温度可以是从0到35℃，从5到35℃，从10到35℃，从15到35℃，从20到35℃，从25到35℃，并从30到35℃。在又一个方面中，温度可保持在高于5℃。在一个方面中，温度可保持在高于10℃。在一个方面中，温度可保持在高于15℃。在一个方面中，温度可保持在高于20℃或高于30℃。本发明还提供了一种具有由环境决定温度的液体系统。
微藻可以生长在不同体积的液体系统中。在一个方面中，微藻可以生长在，例如，小规模的实验室液体系统。小规模的实验室系统是指培养体积少于6升左右。在一个方面中，小规模的实验室培养可以是1升、2升、3升、4升、或5升。在本发明的另一个方面，该小规模的实验室培养可以是小于1升。在一个方面中，小规模的实验室培养可以是100mL或更少。在另一个方面，培养可以是10mL或更少。在另一个方面，液体培养物可以是5mL或更少。在又一个方面中，液体培养可以是1mL或以下。
在本公开内容的另一个方面，液体系统可以是大规模培养，其中大规模培养是指培养物的生长体积超过约6升，或大于约10升，或大于约20升。大规模生长，也可以培养在50升或以上，100升或以上，或200升或更大体积的增长。大规模生长可以是培养生长在，例如，池塘、容器、器皿，或其它区域，那个包含培养物的池塘、容器、器皿或区域是例如，在面积上，至少5平方米，至少10平方米，至少200平方米，至少500平方米，至少1500万平方米，至少2500平方米，或更大。
本公开内容进一步提供了用于超大规模液体系统。在一个方面中，液体培养物的体积可以至少20,000升。在另一个方面，液体的体积可高达40,000升。在另一个方面，液体体积可高达80,000升。在另一个方面，液体体积可高达100000升。在另一个方面，液体体积可高达150000升。在另一个方面，液体体积可高达200000升。在另一个方面，液体体积可高达250000升。在另一个方面，液体体积可高达500000升。在另一个方面，液体体积可高达600000升。在另一个方面，液体体积可高达1000000万升。
在又一个方面中，超大规模液体系统可以是从10,000到20,000升。在一个方面中，超大规模液体系统可以是从10,000至40,000升或从10,000至80,000升。在另一个方面，超大规模液体系统可以是从10,000至100,000升或从10,000至150,000升。在又一个方面中，液体系统可以是从10,000至200,000升或从10,000至250,000升。本公开内容还包括从10,000至500,000升或从10,000至600,000升液体系统。本公开内容进一步提供了用于从10,000至1,000,000升液体系统。
在进一步的方面，液体系统可以是从20,000到40,000升或20,000至80,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从20,000至100,000升。在又一个方面中，液体系统可以是从20,000至150,000升或从20,000至200,000升。在另一个方面，可以从20,000至250,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从20,000至500,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从20,000至600,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从20,000到1,000,000升。
在另一个方面，所述液体系统可以是从40,000至80,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从40,000至100,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从40,000至150,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从40,000至200,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从40,000至250,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从40,000至500,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从40,000至600,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从40,000到1,000,000升。
在另一个方面，所述液体系统可以是从80,000至100,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从80,000至150,000升。在另一个方面，该系液体统可以是从80,000至200,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从80,000至250,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从80,000至500,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从80,000至600,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从80,000到1,000,000升。
在另一个方面，所述液体系统可以是从100,000至150,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从100,000至200,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从100,000至250,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从100,000至500,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从100,000至600,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从10万-100万升。
在另一个方面，所述液体系统可以是从200,000至250,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从200,000至500,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从200,000至600,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从20万-100万升。在另一个方面，该液体系统可以是从250,000至500,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从250,000至600,000升。在另一个方面，该液体系统可以是从25万-100万升。在另一个方面，该液体系统可以是从500,000至600,000升，或50万-100万升。
在本公开内容的一个方面，所述液体系统可以是一个池塘，无论是天然的或人造的。在一个方面，人工池塘可以是管道水塘。在管道水塘中，生物体，水和营养物质围绕一个“管道”循环。水车给管道中的液体提供恒定运动，从而以一个选定的频率使生物体循环回液体的表面。水车还提供搅动来源和充氧系统。CO2可通过一个CO2注入系统被加入到液体系统作为原料进行光合作用。这些管道池塘可封闭的，例如，在一个建筑物或一个温室，或可以放置在室外。在一个方面，一个室外管道液体系统可以用盖封闭，或者露出。
管道池塘通常保持浅水，因为生物体需要被暴露在阳光下，和阳光能穿透池塘水的深度有限。管道水塘的深度可以是，例如，约4至约12英寸。此外，液体可以被包含在管道水塘的体积可以是，例如，约200升以上至约60升。
该管道水塘可以以连续的方式操作以，例如，CO2和营养物被不断地供给到水塘，而含有生物体的水在另一端被移除。
在一个方面，池塘可具有至少0.25英亩的表面积。在另一个方面中，池可以是至少0.5英亩或至少1.0英亩。在又一个方面中，池可以是至少1.5英亩或至少2.0英亩。液体系统可能至少2.5英亩至少为5.0英亩的池塘。在一个可替代的方面，池塘可至少7.5英亩或至少10英亩。在其他实施例中，池塘可能有至少12英亩面积，至少15英亩，至少有18英亩，至少20英亩，至少25英亩，至少有30英亩，至少35英亩，至少40英亩，至少45英亩或50英亩。
在又一个方面，一个池塘的表面区域可以是从0.25至0.5英亩0.25至1.0英亩。在一个方面中，液体系统可以是0.25至1.5英亩0.25至2.0英亩池塘。在另一个方面中，池可以是从0.25至2.5英亩，0.25至5.0英亩0.25至7.5英亩。在又一个方面中，液体系统可以是0.5至1.0英亩，0.5至1.5英亩，0.5至2.0英亩，0.5至2.5英亩，0.5至5.0英亩，0.5至7.5英亩池塘。在一个方面中，液体系统可以覆盖1.0至1.5英亩1.0至2.0英亩。在一个方面中，液体系统可以是1.0至2.5英亩，1.0至5.0英亩池塘。在又一个方面中，液体系统可以是1.0至7.5英亩，2.0至2.5英亩池塘。在另一个方面中，池可以是从2.0至5.0英亩，2.0至7.5英亩。在另一个方面，池塘的范围可以从2.5至5.0万英亩，2.5至7.5万英亩，2.5至10英亩，5至12英亩，5至15英亩，5至18英亩，5至20英亩，10至25英亩，10至30英亩，10至35英亩，10至40英亩，10至45英亩，或10至50英亩面积。
可替代的，生物体，如微藻，可以生长在封闭的结构，如光生物反应器中，其中所述环境比在开放系统或半封闭的系统处于更严格的控制。光生物反应器是一种生物反应器，其中引入了一些类型的光源以提供光能输入到反应器中。术语光生物反应器可以指封闭的环境和不与环境直接交换气体和污染物的系统。光生物反应器可以被描述为一个封闭的、照亮的培养容器，被设计用于控制液体光合细胞悬浮培养的生物质生产。光生物反应器的实例包括，例如，玻璃容器，塑料管，罐，塑料套，袋子等。这可以用来提供维持光合作用所需的能量的光源的实例包括，例如，荧光灯泡，发光二极管，和自然日光。因为这些系统是封闭的，机体生长所需要的（例如，二氧化碳、营养物、水和光）必须被引入到生物反应器中。
尽管建立和维护它们的成本，但是光生物反应器具有一些优势胜过开放系统，他们可以，例如，防止或尽量减少污染，允许单一作物的无菌生物种植（培养仅包括一种生物体），提供更好地控制培养条件（例如，pH值、光、二氧化碳、和温度），防止水分蒸发，由于排气而降低二氧化碳的损失，并允许更高的细胞浓度。
在另一方面，光生物反应器有一定的要求，如冷却、混合、氧积累和生物污染控制，使这些系统比开放系统或半封闭系统的建造和运行更加昂贵。
光生物反应器可以被设置到连续收集（正如大多数的较大体积栽培系统），或一次收集一批（例如，用聚乙烯袋栽培）。一间歇式光生物反应器设置有例如，营养素、生物体（例如微藻），和水，以及允许生物体生长，直到这批收集时。连续式的光生物反应器可以收集，例如，无论是连续的、每天、或在固定的时间间隔。
高密度光生物反应器也可以使用，包括那些在下述内容所描述的，例如，Lee等人，生物技术，生物工程44:1161-1167，1994。其他类型的生物反应器，如用于污水和废水处理，描述于Sawayama等人，Appl.微，生物科技，41:729-731，1994。光生物反应器的其它实例描述于，美国Appl.公布号2005/0260553的美国专利，美国专利号5958761和美国专利号6083740。此外，生物体，如微藻可大规模培养用于除去重金属（例如，描述在Wilkinson，生物信息快报，11:861-864，1989），氢（例如，描述在美国专利申请公开号2003/0162273），并来自水、土壤或其它来源或样品的药物化合物。生物体也可以培养在常规发酵生物反应器中，其中包括，但不限于，间歇式，补料间歇式，细胞再循环和连续发酵。生物体培养的其他方法和本文描述方法的变体对于本领域技术人员是已知的。
本公开内容进一步提供了在该液体系统中生长的微藻的收集。收集可通过本领域技术人员已知的方法之一来完成，包括收集微藻的全部或部分。在本公开内容的一个方面，收集可通过从液体中移除生长培养物的部分，并分离出微藻来完成。在另一个方面中，收集可通过连续流动的方法来完成，例如，使用连续流动离心机。
微藻从液体中的分离可通过本领域技术技术人员已知的一个方法来实现。在一个方面中，微藻可以允许通过重力沉降和除去上覆的液体。在另一个方面中，微藻可以通过离心含有微藻的培养物来收集。在一个方面中，液体培养物的离心可以间歇模式进行，使用固定体积离心机。在不同的方面中，微藻的批量收集可以使用连续流离心机来完成。在另一个方面中，微藻可以用连续流动离心机连续地从生长培养基中收集。
在本公开内容的一个方面，收集在液体系统中生长的微藻可通过絮凝来进行。用于诱导絮凝的方法包括那些可以在美国专利公开号US2011/0159595，申请号13/001027中找到，其全部内容通过参考引入本文。絮凝可以通过重力、离心或本领域技术人员已知的现有技术中的其它物理方法分离，从培养液中分离。在一个特定的实施例中，絮凝物可以通过溶气浮选法（DAF）从培养液中被分离出来。
本公开内容提供了液体培养系统的全部或部分的收集。在一个方面中，收集包括从液体培养基中分离出至少90％的微藻以产生微藻贫化的液体。在另一个方面，至少95％的微藻从液体培养物中移除。在另一个方面中，至少97％的微藻从液体培养物中移除。在另一个方面，至少99％的微藻从液体培养物中移除。在其它方面中，微藻的50％以上被去除。在另一个方面中，75％或更多的微藻是从液体培养物中移除。在另一个方面，80％或更多的微藻从液体培养物中移除。在又一个方面中，收集后，液体培养物可以剩余小于30％的微藻。在一个进一步的方面，收集后，可以剩余小于25％的微藻。在一个进一步的方面，收集后，可以剩余小于5％的微藻。在一个进一步的方面，收集后，可以剩余小于2.5％的微藻。在一个方面中，收集后，剩余小于1％的微藻。
在本发明的另一个方面，收集后，每mL少于105微藻细胞（105细胞/mL）留在液体中。在另一个方面，收集后，少于104个细胞/mL留在液体中。在又一个方面中，收集后，少于103个细胞/mL留在液体。在进一步的方面，收集后，102个细胞/mL留在液体中。
在一个方面中，从生长培养物中收集微藻可以在总培养液的一部分中进行。在一个方面中，液体培养物的一部分被移除，收集微藻。在一个方面中，液体培养物的总体积的至少2％被移除，收集微藻。在另一个方面，将含有生长的微藻培养液的总体积的至少2.5％的被移除，收集微藻。在一个方面，为了收集，将含有生长微藻的培养液的的总体积的至少5％或至少7.5％移除。在又一个方面，为了收集，将含有生长微藻的培养液的总体积的至少10％或至少12.5％移除。在一个进一步的方面，为了收集，将含有生长微藻的培养液的总体积的至少15％或至少20％移除。
在又一个方面，为了收集，将含有生长微藻的培养液的总体积的2至5％、或2到7.5％移除。在另一个方面中，为了收集，将含有生长微藻的培养液的总体积的从2至20％，或从2到12.5％移除。在一个方面中，为了收集而移除的液体量的范围可以是液体培养物总体积的从2至15％，或从2到20％。在又一个方面，为了收集可以移除全部液体培养物的从2.5％至5％或2.5至7.5％。在一个方面中，为了收集而移除的液体量的范围可以是液体培养物总体积的从2.5至10％，或从2.5到12.5％。在一个方面中，移除量的范围可以从2.5至15％，或2.5至20％。在又一个方面，为了收集可以移除培养物体积的从5至7.5％或从5到10％。在一个方面中，为了收集可以移除培养物总体积的从5至12.5％，从5至15％，或甚至5至20％。在另一个方面中，收集培养物的量可以是总培养体积的从7.5至10％或7.5至12.5％。在一个方面中，为了收集而移除的液体量范围可从7.5至15％，或从7.5至20％。在另一个方面，为了收集可以移除培养物体积的10至12.5％，或10至15％。在一个方面，为了收集生长的微藻，可以移除液体培养物总体积的10至20％。
本公开内容的部分进一步提供了收集可以从微藻的生产培养物中连续进行。一方面，微藻的移除保持了微藻生长的培养处于对数生长期。本领域技术人员理解，当在对数生长期生长时，微藻数量在一定时期内倍增增长。微藻倍增增长的时间取决于微藻生长的环境。生长率和微藻生长阶段的测定是本领域所知的。例如，在Sode等人，“基于藻清蛋白荧光的海洋蓝细菌培养的在线监测。”生物技术杂志21:209-217(1991),Torzillo等人，“在线监测叶绿素荧光来评估由高氧浓度和低温诱导的光合作用的光抑制程度，以及评估其在钝顶螺旋藻室外培养的生产能力上的影响（蓝藻细菌），”藻类学杂志34:504-510(1998),Jung和Lee,“使用图像分析原位监测光生物反应器中细胞的浓度：均匀的光分布模型和人工神经网络的比较”生物技术进展22:1443-1450(2006),和Vonshak,A.钝顶螺旋藻节旋藻:生理学,细胞生物学和生物技术1997，CRC出版社,其全部内容通过参考引入到本文。一方面，当微藻处于如本文进一步提供的对数生长期时，可进行收集。
在一个方面中，液体培养物的一部分可以移除用于收集和替换的部分可以使培养液的总体积保持在一个狭窄的范围内。在一个方面中，液体在连续收集移除的量至多为每小时1000加仑。在另一个方面，在此期间连续收集移除的量可以是每小时总体积的1％。在一个方面中，在连续收集中，每天最多可以移除最多5％的量。在一个方面中，在连续收集中，每天最多可以移除最多15％的量。在一个方面中，在连续收集中，每天最多可以移除最多33％的量。
本公开内容进一步提供了回收收集后的液体。在一个方面中，液体可以被返回到液体培养系统和回收。液体的再循环提供了对水的节约，并且可以提高工作效率。介质（例如，实验室介质、池塘水、湖水、生物反应器内容物等）的回收在经济上是有利的，尤其是在大规模操作。例如，在受控制的循环池塘系统中，液体环境可以通过使所述液体的连续流动而循环使用，同时营养物质被连续地添加。在另一个方面，在一个封闭的光生物反应器系统中，介质回收可包括捞出絮凝的NVPO物质。在一个方面，所述液体进行回收，液体的pH值可被测量和调整。在另一个方面中，营养物质的水平可被测量。在另外的方面，测量的营养物质可被调节到最佳或最优水平。在又一个方面中，液体可以通过高压灭菌或用化学处理或由紫外线照射处理来灭菌。在一个方面中，再循环液体可以直接返回到液体培养系统而无需修改或增补。在一个方面中，再循环液体可以处理以除去不利于微藻生长的污染物。在一个方面中，污染物可能是真核或原核有害生物。污染物可以是直接的有害生物，例如壶菌，或间接的有害生物，例如，盐单胞菌物种的细菌。
一方面，再循环液体可以包含微藻。在一个方面中，该液体返回到液体培养系统之前，不需要在收集步骤中除去所有生长的微藻。在一个方面中，不完全移除降低了回收液体所需的时间量。
在另一个方面，将聚合物在收集过程中引入到培养以诱导絮凝。在一个方面中，当液体被返回到液体培养系统时，小于完全去除絮凝的微藻提供了较少的聚合物残余。在池塘培养中，返回进料到液体系统中的残余聚合物可通过诱导低级絮凝而降低生产力。
本公开内容进一步提供了除将再循环液返回到生长微藻培养物以外，微藻贫化液体培养的其他用途。在一个方面中，再循环液体可以被用于农作物灌溉。在另一个方面，再循环液体可以在其他工业过程中使用。在又一个方面，提供一种再循环液体可以排放到现有的水体。在一个方面，再循环液体可以被排出到蒸发池。在一个方面中，再循环液体可以用于其他微生物驱动的过程，如发酵和要求养分的其他方法。
本公开内容提供了用于室内或室外的液体培养系统。室内系统的优点可能是环境可更容易控制。在一个方面，对室内环境的温度可以调节。在另一个方面，所述光的数量和质量可以控制。在一个方面中，室内系统可以是一个温室。在一个方面，温室可以接收自然光。在另一个方面，温室可以人工光照。在另一个方面，自然光可以通过人工光源来补充。
在一个方面，人工光源可以是荧光灯。能量的来源之一是荧光灯，可以放置，例如，在距离有机体大约两英尺到大约1英寸远。荧光灯类型的例子包括，例如，冷白和日光。如果灯被以规则的间隔（例如12/12或14/10小时的光照：黑暗）接通和关断，某些生物体的细胞会变得同步。
微生物生长的通常进程沿着已经的阶段，这对于本公开内容的微藻也是适用的。当液体培养基中接种微藻，经常存在一个“停滞期”，在此期间生物体密度的变化不容易检测到。停滞期以后，生物体进入和早期生长阶段，其特征在于所述微生物的密度增加。
早期生长阶段之后是对数生长期，其间许多微生物都分化（dividing）。对数生长期的特征在于，当密度或细胞数量被绘制在对数标度随时间变化，生物体呈对数线性生长。“倍增”时间是用来表征这个成长阶段。外在环境因素和内在因素都控制生物体的倍增时间。那些本领域技术人员认识到，倍增的速率可以通过启动并完成连续多轮DNA合成和基因组复制的必要性来限制。当所有外源性环境因子是非限制性的，可以观察到这种限制对倍增时间的限制。外在因素在微藻的生长中发挥重要作用，包括营养物的存在、温度、pH值，和对于光合作用的光的可用性。生长和优化微藻生长的方法是本领域已知的，例如在Vonshak，A.螺旋藻节旋藻：生理学，细胞生物学和生物技术。1997CRC出版社和M.Tredici“微藻大规模培养物的光生物学：了解下一场绿色革命的工具”生物燃料1:143（2010），这两者的全部内容通过参考引入本文。
随着密度的增加，倍增率在称为“晚对数期”的时期内减少。成长减小是由于有限的营养物（例如，缺乏二氧化碳，缺乏碳源等），或者是由于生长的生物体（如群体感应）分泌的因素。
在对数期生长结束时，微生物的数量停止增加和培养进入稳定期。在一些方面中，微生物可以发起发育途径导致，例如，一个静止状态。在另一个方面，所述微生物可以具有基因表达的变化，包括表达中的增加和减少。在进入对数生长期之前，在稳定期移除微生物和接种新鲜的培养基通常导致进入滞后期。
在对数生长期生长阶段，倍增时间取决于多种环境条件。在各种因素当中，营养物和介质条件被认为显著影响生长。在本公开内容中，微藻可以是自养的，因此不容易受到基于碳的食物来源存在的影响。一个本领域的普通技术人员应当理解，氮的可用性影响微藻生长。氮的减少导致了较长的倍增时间，或甚至进入稳定期。提高氮的可用性可能会导致减少倍增时间。在一个方面中，生长液体培养物可以监测环境条件的改变，以维持或优化对数期生长。当生长处于对数生产期，微藻的生产得到了优化。
在一方面中，培养物的生长，通过不同的生长阶段进行。在一个方面中，液体培养物接种，并从一个延迟期到对数生长期，再进行到平稳期。在另一个方面中，提供对数生长的微藻使其没有生长延迟期。在另一个方面中，通过收集微藻维持对数期。在进一步的方面，通过补充液体培养系统有限的一个或更多的营养物来维持对数期。
在一个方面，通过收集微藻和补充液体培养系统来维持对数生长期。在一个方面中，收集后的液体可以在返回液体培养系统之前进行监视，并补充养分。在另一个方面，液体培养系统可以用新鲜培养基供给，例如水，来维持对数生长期。在一个方面，新鲜的介质可包含维持微藻对数生长期的必要的营养物质。在进一步的方面，微藻贫化的液体，可以进一步纯化以除去污染物，以维持对数生长。
一方面，液体培养物在对数期用杀真菌剂处理。在本发明的另一个方面，所述液体培养物在滞后期进行处理。在一个方面中，液体培养物在稳定期进行处理。
在一个方面中，在对数生长期间，微藻从液体培养物中收集。在一个方面中，微藻是从液体培养物在晚对数生长期收集。在另一个方面，所述微藻在液体培养过程中的稳定期收集。在一个方面中，藻类生长维持在对数生长的最佳密度。在一个方面中，最佳密度可通过实验测定微藻的张力来确定。
测试有害生物的存在不必在生长的任何特定阶段进行。因此，本公开内容提供一种在微藻培养生长的任何阶段，对液体系统中有害生物存在进行的检测。在一个方面中，对有害生物存在的检测可以在液体系统中接种微藻之前进行。在另一个方面中，检测可在微藻生长的延迟期来执行。在又一个方面中，检测可以在对数生长期或在晚对数生长期进行。在一个方面中，检测可在微藻生长周期的稳定期来进行。在又一个方面中，检测可以在整个微藻生长周期的每个阶段进行。
本公开内容提供了在微藻培养生长的任何阶段和生长的多个阶段对受有害生物污染的液体系统的处理。在一个方面，处理可液体系统接种微藻之前进行。在另一个方面，处理可在微藻生长的延迟期来执行。在另一个方面，处理可在对数生长期或在晚对数生长期进行。在一个方面，处理可在微藻生长周期的稳定期来进行。在另一个方面，处理可在整个微藻生长周期的每个阶段进行。
在一个方面中，液体培养物生长15天或以上。在另一个方面，液体培养物生长30天或以上。在一个方面，液体培养物生长45天或以上。在另一个方面，液体培养物生长60天或更多，或90天或以上。在又一个方面中，生长时间可以是120天或更多，或180天或更多。在一个方面，液体培养可以保持250天以上，或500天或更多。在又一方面，液体培养的生长可接种液体培养物后继续为1000天或更多，1500天或更多，或2000天或更多。培养可以在一个不确定的时间量，维持本公开内容的杀真菌剂处理。
本公开内容提供了一种用于液体系统的处理方法。处理包括物理方法控制生长，或杀死存在于液体系统中的有害生物。物理方法可以包括作为非限制性实例，过滤，加热，冷却和照射。
本公开内容提供了一种用于液体系统的处理方法，包括添加控制生长，或杀死有害生物的组合物。在一个方面中，可以在检测到有害生物的存在时来提供处理。在一个方面中，可以在液体系统中检测到真菌时提供处理。在一个进一步的方面，处理可以是预防性的，和处理可能在微藻生长的任何阶段提供。
本公开内容的处理方法包括将一种或多种杀真菌剂添加到液体培养系统。在一个方面，杀真菌剂可以是一种化学化合物。在一个方面中，所述杀真菌剂还可以含有非活性成分，其有助于溶解或分散活性组分。杀真菌剂可以是在本领域中已知的，或者可以被开发来杀死或抑制有害生物。本公开内容的杀真菌剂的非限制性实例列于表1中。
本公开内容的处理方法包括提供在表1中呈现的一种或多种杀真菌剂。在一个方面，杀真菌剂的第一有效浓度可以在检测到第一有害生物时提供到液体系统。在另一个方面中，第二杀真菌剂的有效浓度可以提供给一个液体系统，其中第一有害生物的生长相对于第一有害生物没有第一杀真菌的生长不受抑制。在另一个方面中，当第一杀真菌剂的有效浓度之后和在检测到有害生物时，可以提供第二杀真菌剂的有效浓度到液体系统中。在一个方面，与第一杀真菌剂相比，选择具有不同作用机制的杀真菌剂。在一个进一步的方面，当有效处理第一和第二杀真菌剂后，可以提供第三杀菌剂来处理液体系统。在又一个方面，第一，第二和第三杀菌剂可以被转换，以确保在液体培养系统中有效地控制有害生物，并避免杀菌剂抗性在液体培养系统的发展。
在本公开内容的一个方面，在检测到第一有害生物时，可以提供两种杀真菌剂的组合。在又一个方面中，当第一和第二杀真菌剂的组合不能控制液体系统的有害生物时，第三杀菌剂可以被提供。
表1杀真菌剂来源和作用机制
Figure BDA0000488027060000371
Figure BDA0000488027060000381
在一个方面，该处理方法可以在一天中的特定时间执行。在一个方面中，处理可以在早晨进行。在另一个方面，处理可在中午进行。在又一个方面中，处理可以在日落或接近日落进行。在另一个方面，处理可在夜间进行。在一个方面中，处理可以在每一天的两个时期进行，例如早晨一次和晚上再一次。在另一个方面，处理可能会发生在白天和，第二监视可能会出现在夜间。
本公开内容提供了一种液体系统的处理，以最小化浓度梯度的形成。在一个方面中，处理的量基于液体系统的体积来计算，按介质（液体系统，例如培养基）的体积来制备浓缩的处理原料。浓缩的处理原料可能会慢慢加入到液体系统。在一个方面中，浓缩的处理原料在管道水塘系统的桨轮后面加入。在另一个方面中，浓缩的处理原料被喷射分散到液体系统。在另一个实施方案中，该浓缩处理原料被加入到循环泵的水返回线路。
在一个方面，可以使用高效液相色谱法（HPLC）分析液体系统的样品，从而获得对液体系统处理的监控。在一个方面，获得样本的时间序列，并过滤以除去颗粒物质（例如，生长的微藻），然后贮存于-20℃直至使用HPLC进行分析。在一个方面，样品每12小时收集。在另一个方面中，样品每24小时收集。在又一个方面中，样品在48小时收集。
本公开内容还提供当液体系统达到一个规定的温度时，提供液体系统的处理。在一个方面，当液体温度是在25℃以下，液体系统的处理可以提供。在另一个方面，当液体温度是在25℃以上，液体系统的处理可以提供。在一方面，当液体温度是在37℃以下，液体系统的处理可以提供。在又一个方面，当液体温度是在25至37℃之间，液体系统的处理可以提供。在一个方面，所述液体的温度可以在0和15℃或15至25℃之间。在又一个方面，所述液体的温度可以是15至37℃之间。在又一个方面，当液体系统的温度低于37℃，可以提供处理。在一个方面，液体系统的温度可能低于32℃。在一个方面中，本发明的液体系统的温度可能低于25℃。在一个方面，液体系统的温度可能低于25℃。本公开内容还提供了最佳温度的测定，其用于提供本公开内容的处理，基于杀虫剂或杀真菌剂的化学性质。
本公开内容提供了一种使用吡啶胺家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面中，吡啶胺可以是氟啶胺（苯基-氨基吡啶或3-氯-N-[3-氯-2,6-二硝基-4-三氟甲基）苯基]-5-（三氟甲基）-2-吡啶胺（CAS号79622-59-6））。在一个方面，氟啶胺可被提供作为液体系统处理的第一杀真菌剂。在另一个方面，氟啶胺可被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，氟啶胺可被设置为第三杀真菌剂处理。在又一个方面，氟啶胺可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，氟啶胺可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，氟啶胺可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用甲氧基-氨基甲酸叔丁酯家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面中，甲氧基-氨基甲酸叔丁酯可以是唑菌胺酯（甲基N-[2-[[[1-（4-氯苯基）-1H-吡唑-3-基]氧基]甲基]苯基]-N-甲氧基氨基甲酸甲酯（CAS号175013-18-0），在一个方面中，唑菌胺酯可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，唑菌胺酯可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，唑菌胺酯可以被提供为第三杀真菌剂处理。在又一个方面中，唑菌胺酯可以被提供作为第四处理或第五处理，在另一个方面中，唑菌胺酯可以被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，唑菌胺酯可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用二硫代氨基甲酸家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面中，二硫代氨基甲酸酯可以是
Figure BDA0000488027060000401
（
Figure BDA0000488027060000402
）（四甲基硫基过氧化二碳酸二酰胺（CAS号137-26-8），在一个方面，
Figure BDA0000488027060000403
可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，
Figure BDA0000488027060000404
可被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，
Figure BDA0000488027060000405
可提供为第三杀真菌剂处理。在又一方面，
Figure BDA0000488027060000406
可以被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，
Figure BDA0000488027060000407
可以提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，
Figure BDA0000488027060000408
可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用苯并噻二唑家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面中，苯并噻二唑可以是噻二唑素（苯并（1,2,3）噻二唑-7-硫代羧酸-S-甲酯（CAS号135158-54-2））。在一个方面中，噻二唑素可被提供作为液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，噻二唑素可被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面中，噻二唑素可被提供为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，噻二唑素可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，噻二唑素可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，噻二唑素可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用N-酰苯胺家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面中，N-酰苯胺可以是麦锈灵（benodanil）（2-碘-N-苯基苯甲酰胺（CAS号15310-01-7））。在一个方面，麦锈灵可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，麦锈灵可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，麦锈灵可提供为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，麦锈灵可提供为第四处理或第五处理。在另一个方面，麦锈灵可以被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，麦锈灵可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用杀真菌剂拌棉醇（bronopol）（2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇（CAS号52-51-7））的液体系统的处理。在一个方面中，拌棉醇可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面中，拌棉醇可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面中，拌棉醇可以被提供作为第三杀真菌剂处理。在又一个方面中，拌棉醇可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面中，拌棉醇可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，拌棉醇可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用杀真菌剂多菌灵（carbendazim）（N-1H-（苯并咪唑D4）吡啶-2-基-氨基甲酸甲酯（CAS号291765-95-2））的液体系统的处理。在一个方面，多菌灵可以被提供作为液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，多菌灵可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，多菌灵可提供为第三杀真菌剂处理。在又一方面，多菌灵可提供为第四处理或第五处理。在另一个方面，多菌灵可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，多菌灵可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本发明还提供了一种使用杀真菌剂控心灵（oxathiins）（萎锈灵-6-甲基-N-苯基-2,3-二氢-1,4-氧硫杂环己-5-甲酰胺）的液体系统的处理。在一个方面，控心灵可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，控心灵可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，控心灵可提供为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，控心灵可提供为第四处理或第五处理。在另一个方面，控心灵可以被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，控心灵可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用腈家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面，腈可以是百菌清（chlorothalonil）（2,4,5,6-四氯苯基-1,3-二腈）。在一个方面，百菌清可被提供作为一种液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，百菌清可被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，百菌清可提供为第三杀真菌剂处理。在又一方面，百菌清可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，百菌清可被提供作为第六处理或第七处理。在一个方面，腈可以是二溴氰基乙酰胺（2,2-二溴-2-氰基乙酰胺）。在一个方面，二溴氰基乙酰胺可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，二溴氰基乙酰胺可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，二溴氰基乙酰胺可提供为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，二溴氰基乙酰胺可提供为第四处理或第五处理。在另一个方面，二溴氰基乙酰胺可以被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，二溴氰基乙酰胺可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用嘧啶家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面中，嘧啶可以是嘧菌环胺（4-环丙基-6-甲基-N-苯基嘧啶-2-胺）。在一个方面，嘧菌环胺可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，嘧菌环胺可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，嘧菌环胺可以被提供作为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，嘧菌环胺可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，嘧菌环胺可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，嘧菌环胺可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用吡啶家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面中，所述吡啶可以是二溴化敌草快（diquat dibromide）（9,10-二氢-8A，10A-菲氮鎓（diazoniaphenanthrene）（1,1'-亚乙基-2,2'-联吡啶鎓）二溴化物）。在一个方面，敌草快二溴化物可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，敌草快二溴化物可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，敌草快二溴化物可以被提供作为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，敌草快二溴化物可以被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，敌草快二溴化物可以被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，敌草快二溴化物可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用蒽醌类家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面中，蒽醌类化合物可被二噻农（dithianon）（5,10-二氧苯并[g][1,4]benzodithiine-2,3-二腈（CAS号347-22-6））。在一个方面，二噻农可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，二噻农可以设置作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，二噻农可提供为第三杀真菌剂处理。在又一个方面，二噻农可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，二噻农可提供为第六处理或第七处理。在其它实施例中，二噻农可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用脂族氮杀真菌剂家族杀真菌剂的液体系统的处理。在一个方面中，脂族氮杀真菌剂可以是多果定（dodine）（十二烷基胍乙酸甲酯（CAS号2439-10-3））。在一个方面，多果定可被提供作为液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，多果定可被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，多果定可提供为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，多果定可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，多果定可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，多果定可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。在另一个方面，可以使用十二烷基胍的氯化物盐（例如，十二烷基胍盐酸盐，CAS号13590-91-1））。
本公开内容提供了一种使用杀真菌剂氯苯嘧啶醇（2-氯苯基）-（4-氯苯基）-嘧啶-5-基甲醇（CAS号60168-88-9）的液体系统的处理。在一个方面，氯苯嘧啶醇可被提供作为液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，氯苯嘧啶醇可被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，氯苯嘧啶醇可被提供作为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，氯苯嘧啶醇可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，氯苯嘧啶醇可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，氯苯嘧啶醇可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用杀真菌剂苯锈啶（1-[3-（4-叔丁基苯基）-2-甲基丙基]哌啶（CAS号67306-00-7））的液体系统的处理。在一个方面中，苯锈啶可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，苯锈啶可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面中，苯锈啶可提供为第三杀真菌剂处理。在又一方面，苯锈啶可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，苯锈啶可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，苯锈啶可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用杀真菌剂丙环唑（1-[[2-（2,4-二氯苯基）-4-丙基-1,3-二氧戊环-2-基]甲基]-1,2,4-三唑（CAS号60207-90-1））的液体系统的处理。在一个方面，丙环唑可以被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面，丙环唑可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，丙环唑可以被提供作为第三杀真菌剂处理。在又一方面，丙环唑可以被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，丙环唑可以被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，丙环唑可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用杀真菌剂甲基托布津处理（甲基N-[[2-（甲氧基羰基氨基甲酰硫基氨基）苯基]硫代氨基甲酰基]氨基甲酸叔丁酯（CAS号23564-05-8））的液体系统的处理。在一个方面，甲基托布津可被提供作为一个液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面中，甲基硫菌灵可被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，甲基托布津可提供为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，甲基托布津可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面中，甲基硫菌灵可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，甲基托布津可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用杀真菌剂对甲抑菌灵（tolylfluanid）（N-[二氯（氟）甲基]硫基-N-（二甲基氨磺酰）-4-甲基苯胺（CAS号731-27-1））的液体系统的处理。在一个方面，对甲抑菌灵可被提供作为液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面对甲抑菌灵可被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，对甲抑菌灵可被设置为第三杀真菌剂处理。在又一个方面，对甲抑菌灵可被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，对甲抑菌灵可被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，对甲抑菌灵可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容提供了一种使用杀真菌剂三唑醇A（处理1-（4-氯苯氧基）-3,3-二甲基-1-（1,2,4-三唑-1-基）丁醇（CAS号89482-17-7））的液体系统的处理。在一个方面，三唑醇A可以被提供为液体系统的第一杀真菌剂处理。在另一个方面三唑醇A可以被提供作为第二杀真菌剂处理。在一个方面，三唑醇A可以被提供作为第三杀真菌剂处理。在另一个方面，三唑醇A可以被提供作为第四处理或第五处理。在另一个方面，三唑醇A可以被提供作为第六处理或第七处理。在其它实施例中，三唑醇可以与所述一种或多种的杀真菌剂组合施用，也可以与所述一种或多种杀真菌剂同时单独施用，或作为杀真菌剂混合物的一部分来施用。
本公开内容进一步提供了一种表1杀真菌剂的液体系统的处理，但不包括杀菌剂嘧菌酯、乐杀螨、啶酰菌胺、克菌丹、氰霜唑、霜脲氰、醚菌胺、敌螨普、十二环吗啉、茵多一水合物、环酰菌胺、三乙膦酸铝（100毫克）、醚菌酯、代森锰锌、甲霜灵、戊菌隆、霜霉威、丙硫菌唑、啶斑肟、sonar、螺环菌胺、戊唑醇、肟菌酯、氟菌唑、嗪氨灵，和苯酰菌胺。
在另一个方面，由于已知的毒性效应和健康危害，处理方法提供了不包括杀真菌剂两性霉素B三水合物、孔雀绿、二碘/五氧化二碘、过碳酸钠、TCC酸、恶霉灵和辛噻酮。
在进一步的方面中，氟啶胺可以单独提供，或与表1中的一种或多种杀真菌剂组合提供。在一个方面，氟啶胺可与唑菌胺酯组合被提供为一种处理。在一个方面，氟啶胺对一个液体系统的处理先于唑菌胺酯。在另一个方面，氟啶胺在唑菌胺酯对一个液体系统的处理之后。在一个方面，氟啶胺对一个液体系统的处理先于
Figure BDA0000488027060000451
。在另一个方面，氟啶胺在
Figure BDA0000488027060000452
对一个液体系统的处理之后。在一个方面，氟啶胺对一个液体系统的处理先于百菌清。在另一个方面，氟啶胺在百菌清对一个液体系统的处理之后。在一个方面，氟啶胺对一个液体系统的处理先于多果定。在另一个方面，氟啶胺在多果定对一个液体系统的处理之后。
在进一步的方面中，唑菌胺酯可以单独提供，或与表1中的一种或多种杀真菌剂组合提供。在一个方面，唑菌胺酯可与氟啶胺组合被提供为一种处理。在一个方面，唑菌胺酯对液体系统的处理先于氟啶胺。在另一个方面，唑菌胺酯在氟啶胺对液体系统的处理之后。在一个方面，唑菌胺酯对液体系统的处理先于
Figure BDA0000488027060000461
。在另一个方面，唑菌胺酯在
Figure BDA0000488027060000462
对一个液体系统的处理之后。在一个方面中，唑菌胺酯可以被提供为与百菌清组合处理。在一个方面，唑菌胺酯对液体系统的处理先于百菌清。在另一个方面，唑菌胺酯在百菌清对一个液体系统的处理之后。在一个方面，唑菌胺酯对液体系统的处理先于多果定。在另一个方面，唑菌胺酯在多果定对液体系统的处理之后。
在进一步的方面中，
Figure BDA0000488027060000463
可以单独提供，或与表1中的一种或多种杀真菌剂组合提供。在一个方面，
Figure BDA0000488027060000464
可与氟啶胺组合被提供为一种处理。在一个方面，
Figure BDA0000488027060000465
对液体系统的处理先于氟啶胺。在另一个方面，
Figure BDA0000488027060000466
在氟啶胺对液体系统的处理之后。在一个方面，
Figure BDA0000488027060000467
对液体系统的处理先于唑菌胺酯。在另一个方面，
Figure BDA0000488027060000468
在唑菌胺酯对一个液体系统的处理之后。在一个方面中，百菌清可以被提供为与
Figure BDA0000488027060000469
组合处理。在一个方面，
Figure BDA00004880270600004610
对液体系统的处理先于百菌清。在另一个方面，
Figure BDA00004880270600004611
在百菌清对一个液体系统的处理之后。在一个方面中，多果定可以被提供为与
Figure BDA00004880270600004612
组合处理。在一个方面，
Figure BDA00004880270600004613
对液体系统的处理先于多果定。在另一个方面，
Figure BDA00004880270600004614
在多果定对液体系统的处理之后。
在进一步的方面中，百菌清可以单独提供，或与表1中的一种或多种杀真菌剂组合提供。在一个方面，百菌清可与氟啶胺组合被提供为一种处理。在一个方面，百菌清对液体系统的处理先于氟啶胺。在一个方面，百菌清可与唑菌胺酯组合被提供为一种处理。在一个方面，百菌清对液体系统的处理先于唑菌胺酯。在另一个方面，百菌清在唑菌胺酯对一个液体系统的处理之后。在一个方面中，百菌清可以被提供为与
Figure BDA00004880270600004615
组合处理。在一个方面，百菌清对液体系统的处理先于
Figure BDA00004880270600004616
。在另一个方面，百菌清在对一个液体系统的处理之后。在一个方面，百菌清对液体系统的处理先于多果定。在另一个方面，百菌清在多果定对液体系统的处理之后。
在进一步的方面中，多果定可以单独提供，或与表1中的一种或多种杀真菌剂组合提供。在一个方面，多果定可与氟啶胺组合被提供为一种处理。在一个方面，多果定对液体系统的处理先于氟啶胺。在一个方面，多果定可与唑菌胺酯组合被提供为一种处理。在一个方面，多果定对液体系统的处理先于唑菌胺酯。在另一个方面，多果定在唑菌胺酯对一个液体系统的处理之后。在一个方面中，多果定可以被提供为与
Figure BDA0000488027060000471
组合处理。在一个方面，多果定对液体系统的处理先于
Figure BDA0000488027060000472
在另一个方面，多果定在
Figure BDA0000488027060000473
对一个液体系统的处理之后。
在本公开内容的一个方面，氟啶胺、唑菌胺酯、百菌清和多果定的组合可用于处理液体系统。具体地，组合可以在较长时间内顺序地提供给一个液体系统，以确保微藻培养物对有害生物的控制。在一个方面，有害生物处理的顺序可以通过选择后续的杀真菌剂来确定，该杀真菌剂基于不同的作用模式。在一个方面，可以提供液体系统的处理方案，其中第二种杀真菌剂不跟随具有相同的作用模式的第一杀真菌剂。在又一个方面中，第一杀真菌剂和第三杀真菌剂有不同的作用模式。在一个方面中，轮转使用氟啶胺、唑菌胺酯、百菌清和多果定作为液体系统对有害生物控制的处理，可以用于避免有害生物抗性株的发展。
本领域技术人员将理解可以选择添加表1的杀真菌剂的组合。在一个方面中，选择第一杀真菌剂来降低微藻培养中有害生物的生长。在另一个方面中，选择第二杀真菌剂，其作用机理不同于第一杀真菌剂。在一个方面中，第一杀真菌剂可以是呼吸的抑制剂和第二杀真菌剂可以是甾醇生物合成抑制剂。在另一个方面中，第一杀真菌剂可以是呼吸的抑制剂即脱开氧化磷酸和第二杀真菌剂可以是醌以外的呼吸抑制剂。在另一个方面中，第一杀真菌剂可以是呼吸的抑制剂即脱开氧化磷酸和第二杀真菌剂可具有多点接触活性。在又一个方面中，第一杀真菌剂可以是脱甲基化抑制剂和第二杀真菌剂可具有多点接触活性。本领域普通技术人员应当理解，基于不同的作用机制选择杀菌剂提供了方法，以避免杀菌剂抗性有害生物菌株的发展。活动抑制方法的任一组合可以连续的或同时的组合施用。
杀真菌剂可以通过本领域中已知的方法引入。在一个方面中，所述杀真菌剂可以引入为固体。在另一个方面，所述杀真菌剂可以溶解在适当的溶剂后引入。在一个方面中，溶剂可以是水。在另一个方面中，所述杀真菌剂可以溶解在醇中。在一个方面中，所述醇可以是甲醇。在另一个方面，所述醇可以是乙醇。在一个方面中，所述杀真菌剂可在乙腈中制备。在又一个方面中，所述杀真菌剂可以在丙酮中制备。在又一个方面的杀真菌剂可以溶解在用于生长的微藻培养液中。在一个方面中，最小化溶剂对生物体或生物体的影响。
本公开内容提供了引入有效浓度的杀菌剂。有效浓度可以根据制造商的说明确定，也可以根据经验来确定。杀真菌剂的有效浓度对于培养在液体系统中的微藻是没有毒性的。确定毒性的方法是本领域已知的，并且包括微藻的生长培养液中的试验杀真菌剂的连续稀释。在表2提供的范围内，杀真菌剂开始显示对微藻生长的影响。本领域技术人员应当理解，不同的微藻可具有不同的毒性范围，可通过将微藻生长在连续稀释的杀真菌剂的存在下来测定。
表2微藻毒性范围
Figure BDA0000488027060000481
根据本公开内容，如果在给定的浓度范围内微藻的生长减少，那么杀真菌剂可以是微藻有毒的。在一个方面，杀真菌剂的有效浓度可能会导致微藻生长的减少，但会引起在有害生物生长的更大的减少。
本公开内容提供了表示效力的比率，该比率是有害生物生长的减少与微藻生长的减少。在一个方面中，有害生物的生长相对于不存在杀真菌剂时的生长减少了10倍（例如0.1X），微藻的生长相对于没有杀真菌剂的存在时减少了50％（例如，0.5X），提供了0.2效力比率。在另一个方面中，有害生物的生长减少10倍和微藻减少20％（例如，0.8X），结果效力比率为0.125。在一个方面，效力比率可以小于0.8。在另一个方面，效力比率可以小于0.4。在另一个方面，效力比率可以小于0.2。在另一个方面，效力比率可以小于0.1。在另一个方面，效力比率可以小于0.05。
在另一个方面，效力被表示为一种有用的处理窗口。有用的处理窗口被定义为杀菌剂对藻类和有害生物的影响的差异。在一个方面，有用的处理窗口是差异处于影响微藻生长的杀真菌剂的浓度和影响有害生物生长的杀真菌剂的浓度之间（例如，杀真菌剂影响微藻生长的浓度减去影响有害生物生长的浓度）。在一个方面中，微藻生长速率的影响开始于2ppm，以及有害生物的生长受到影响时为0.5ppm，提供了1.5ppm处理窗口。在一个方面，处理窗口可能是1ppm。在一个方面，处理窗口可以是1.5或2.0ppm。在另一个方面，所述处理窗口可大于0.5ppm。在另一个方面，所述处理窗口可大于1.0ppm。在另一个方面，处理窗口可大于1.5ppm。在另一个方面，所述处理窗口可大于2.0ppm。在另一个方面，所述处理窗口可大于2.5ppm。在另一个方面，所述处理窗口可大于5.0ppm。
在进一步的方面，所述处理窗口可以是从0.5到1.0ppm。在另一个方面，所述处理窗口可以是从0.5到1.5ppm。在另一个方面，所述处理窗口可以是从0.5到2.0ppm。在一个方面，处理窗口可以是从0.5到2.5ppm。在一个方面，处理窗口可以是从0.5到5.0ppm。在另一个方面，所述处理窗口可以是从1.0到1.5ppm。在另一个方面，所述处理窗口可以是从1.0到2.0ppm。在一个方面，处理窗口可以是从1.0到2.5ppm。在一个方面，处理窗口可以是从1.0到5.0ppm。在另一个方面，所述处理窗口可以是从1.5到2.0ppm。在一个方面，处理窗口可以是从1.5到2.5ppm。在一个方面，处理窗口可以是从1.5到5.0ppm。在一个方面，处理窗口可以是从2.0到2.5ppm。在一个方面，处理窗口可以是从2.0到5.0ppm。
在又一个方面中，所述杀真菌剂的效力提供了一个负的处理窗口。例如，在2ppm藻类的生长速度受到影响，和在2.5ppm有害生物的生长速度受到影响，负的处理窗口为-0.5ppm。具有负的处理窗口的杀真菌剂通常不被认为有效。然而，在一个方面，微藻生长减少可被提供为，其中集成的增长率大于零。降低的微藻生长速度可以接受1或2天。在另一个方面，降低的微藻生长速率可以接受3天。在另一个方面，降低的微藻生长速率可以接受4天。在另一个方面，降低的微藻生长速率可以接受的时间少于1周。
本公开内容还提供了一种效力的表述为，处理的培养物的生长速度与未感染的控制生长速度（“百分比效力”）百分比。在一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有90至100％之间的百分比效力。在另一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有在80和100％之间的百分比效力。在一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有76至100％之间的百分比效力。在一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有76％或更大的百分比效力。在另一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有80％或更大的百分比效力。在一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有90％或更大的百分比效力。
在一个方面，一种有效的杀真菌剂可具有51和75％之间的百分比效力。在另一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有60和75％之间的百分比效力。在另一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有65和75％之间的百分比效力。在又一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有26和50％之间的百分比效力。在一个方面中一种有效的杀真菌剂可具有30到50％之间的百分比效力。在一个方面中一种有效的杀真菌剂可具有40和50％之间的百分比效力。在一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有51％或更大的百分比效力。在另一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有百分比效力60％或更大。在一个方面中，一种有效的杀真菌剂可具有70％或更大的百分比效力。
在一个方面，氟啶胺的有效浓度可以为0.5ppm或以下。在另一个方面中氟啶胺的有效浓度可以为1.0ppm，或更小。在一个方面中氟啶胺的有效浓度可以是2.0ppm，或更小。在又一个方面，氟啶胺的有效浓度可以为5.0ppm，或者更小。在另一个方面中氟啶胺的有效浓度可以为10.0ppm，或更小。在另一个方面中氟啶胺的有效浓度可能超过10.0ppm。在一个方面，氟啶胺的有效浓度的百分比效力为51和75％之间。在另一个方面，氟啶胺的有效浓度的百分比效力为大于50％。
在一个方面，氟啶胺的有效浓度范围可以从0.1至0.5ppm。在另一个方面，氟啶胺的有效浓度可以是从0.5至1ppm的范围。在一个方面，氟啶胺的有效浓度可以是从0.5至2ppm。在一个方面，氟啶胺的有效浓度可以是从0.5至5ppm。在一个方面，氟啶胺的有效浓度可以是从0.5至10ppm。在进一步的方面，氟啶胺的有效浓度可以是从1至2ppm。在一个方面，氟啶胺的有效浓度可以是从1到5ppm以下。在一个方面，氟啶胺的有效浓度可为1至10ppm。在进一步的方面，氟啶胺的有效浓度可以为2至5ppm。在一个方面，氟啶胺的有效浓度可以是从2至10ppm。在又一个方面，氟啶胺的有效浓度可以是从5至10ppm。
在一个方面，唑菌胺酯的有效浓度可以为0.5ppm或以下。在另一个方面唑菌胺酯的有效浓度可以为1.0ppm，或更小。在一个方面唑菌胺酯的有效浓度可以是2.0ppm，或更小。在进一步的方面，唑菌胺酯的有效浓度可以是5.0ppm，或更小。在另一个方面中氟啶胺的一种有效的唑菌胺酯可以是10.0ppm，或更小。在另一个方面唑菌胺酯的有效浓度可能超过10.0ppm。在一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度的百分比效力为51和75％之间。在另一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度的百分比效力为大于50％。
在一个方面，唑菌胺酯的有效浓度范围可以从0.1至0.5ppm。在另一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度可以是一个范围从0.5至1ppm。在一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度可以是从0.5至2ppm。在一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度可以是从0.5至5ppm。在一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度可以是从0.5至10ppm。在进一步的方面，唑菌胺酯的有效浓度可以是从1至2ppm。在一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度可以是从1到5ppm以下。在一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度可为1至10ppm。在进一步的方面，唑菌胺酯的有效浓度可以为2至5ppm。在一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度可以是从2至10ppm。在又一个方面中，唑菌胺酯的有效浓度可以是从5至10ppm。
在一个方面中，的有效浓度可以为0.5ppm或以下。在另一个方面中
Figure BDA0000488027060000512
Figure BDA0000488027060000513
的有效浓度可以为1.0ppm以下，或更小。在一个方面中的有效浓度可以为2.0ppm，或更小。在进一步的方面中，
Figure BDA0000488027060000515
的有效浓度可以为5.0ppm，或者更小。在另一个方面中
Figure BDA0000488027060000516
的有效浓度可以为10.0ppm，或更小。在另一个方面中
Figure BDA0000488027060000517
有效浓度可能超过10.0ppm。在一个方面中，
Figure BDA0000488027060000518
的有效浓度的百分比效力为26和50％之间。在另一个方面，有效浓度的百分比效力为大于26％。
在一个方面中，有效浓度的范围可以从0.1至0.5ppm。在另一个方面，
Figure BDA00004880270600005110
的有效浓度可以是从0.5至1ppm的范围。在一个方面中，
Figure BDA00004880270600005111
的有效浓度可以是从0.5至2ppm。在一个方面中，
Figure BDA00004880270600005112
的有效浓度可以是从0.5至5ppm。在一个方面中，
Figure BDA00004880270600005113
的有效浓度可以是从0.5至10ppm。在进一步的方面中，
Figure BDA00004880270600005114
Figure BDA00004880270600005115
的有效浓度可以是从1至2ppm。在一个方面中，
Figure BDA00004880270600005116
的有效浓度可以是从1到5ppm以下。在一个方面中，
Figure BDA00004880270600005117
有效浓度可为1至10ppm。在进一步的方面中，
Figure BDA0000488027060000521
的有效浓度可以为2至5ppm。在一个方面中，
Figure BDA0000488027060000522
的有效浓度可以是从2至10ppm。在又一个方面中，
Figure BDA0000488027060000523
的有效浓度可以是从5至10ppm。
本公开内容的方法提供用于提高收集微藻的产率。在一个方面，与没有提供有效浓度的杀真菌剂或杀虫剂的微藻产率相比，所述方法提供了收集微藻在液体系统中产量的增加。一方面，提供了一种微藻产率大于0.4克每升（g/L）AFDW（无灰干重）。
产量可以通过每液体培养物体积的微生物的数目来确定。产率可以通过增加总培养物体积或通过优化微藻密度来增加。本公开内容的方法提供了增加微藻密度。在一个方面，在液体培养物系统中的微藻生长后收集的产率可以小于无有害生物存在而未使用杀真菌剂时的微藻生长量，但是会大于存在有害生物而未使用杀真菌剂时的产率。
在一个方面，杀真菌剂处理之后，产率大于0.5g/L。在另一个方面，所述产率大于0.6或大于0.7g/L。在进一步的方面，微藻的产率大于0.8或大于0.9g/L。在又一个方面中，微藻的产率可以是大于1.0g/L。
在一个方面，微藻的产率为，从未感染而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率的至少80％。在另一个方面，微藻的产率为，从未感染而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率的至少85％或90%。在另一个方面，微藻的产率为，从未感染而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率的至少95％或97.5%。在一个进一步的方面，微藻的产率为，从未感染而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率的至少99％或100%。
在进一步的方面，微藻的产率比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率高至少10%以上。在一个方面中，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率高至少15%或至少20%以上。在一个方面中，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率高至少25%以上。在另一个方面，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率高至少50%以上。在另一个方面，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率高至少75%以上。在另一个方面，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率高至少100%以上。在一个方面，更高的产率可以不确定，其中缺少杀真菌剂处理的未处理液体培养物将无法生存。
在另一个方面中，产率可以比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率至少高1.5倍以上。在另一个方面，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率至少高2.0倍以上。在另一个方面，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率高至少2.5或5.0倍以上。在另一个方面，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率至少高7.5倍以上。在一个方面中，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率至少高10倍以上。在一个方面中，比具有有害生物而未使用杀真菌剂的微藻液体培养物中收集的微藻产率至少高15倍以上。
本公开内容提供了一种微藻培养液中有害生物检测的定期监测。在一个方面中，监测可以每天进行。在又一个方面中，监视可以每天进行两次。在又一个方面中，监视可以每天进行三次或更多次。在本发明的又一个方面中，监视可以每隔一天进行。在又一个方面中，监测可以每周进行。
在一个方面中，监视可以在一天中的特定时间执行。在一个方面中，监测可以在早晨进行。在另一个方面，监控可以在中午进行。在又一个方面中，监测可以在日落时或接近日落进行。在另一个方面中，监测可以在夜间进行。在一个方面中，监测可以在每天的两个时段进行，例如早晨一次和晚上再一次。在另一个方面，监测可以发生在白天的和第二监测发生在夜间。
在进一步的方面中，监视可以连续地进行。在一个方面中，连续监测可通过使用连续流动法进行，例如一个
Figure BDA0000488027060000531
（流体成像技术，Yarmouth，ME）。FlowCAM分析结合流式细胞术和显微术，允许在流动相的粒子的高通量分析。稀释的（1:10）培养标本通过FlowCAM用20X物镜（绿藻）或4X物镜（蓝绿藻）运行。该FlowCAM及其集成软件在连续流动中自动形成图像，计数和分析预定数量颗粒（通常3000）。库随后构造，允许粒子通过各种表型属性（例如绿色与透明细胞，大细胞与小细胞等）进行分类。颗粒的排序也可以定制，以特异鉴别目标生物体。
在一个方面中，监视可以检测在液体系统中微藻培养物的荧光变化。在一个方面中，微藻在液体系统中的生长可通过检测叶绿素荧光来监测。叶绿素的天然荧光的测量提供了增长的测量，并且在一个方面，提供了比通过光散射法监测生长更大的敏感性，特别是存在非光合共同存在的生物体时。在另一个方面中，荧光的比率可以使用488的激发波长检查和确定在不同波长下的发射光谱的峰。在一个方面中，发射光谱的峰值最大在710nm和688nm的波长之间。如果激发发射数据随时间降低，这是一个感染存在的象征。
在另一个方面，培养物的荧光可以使用360nm的激发波长测定，测量在440nm、530nm、685nm或740nm的发射。在这些波长下，发射比率的改变是本领域技术人员已知的指示性压力。
在一个方面，鼓藻培养物的叶绿素荧光可使用430nm的激发波长和685nm的发射波长进行测量。在另一个方面，螺旋藻生长可以通过叶绿素荧光监测，使用363nm的激发波长和685nm的发射波长。微藻生长的结果，可用于制备叶绿素荧光对时间的半对数图。这样的图提供了生长曲线。
在又一个方面中，池塘可以使用荧光染料结合测定法进行监测。在荧光染料结合测定法，由于感染的存在，微藻结合荧光染料的量会增加。在一个方面中，染料可以与纤维素中发现的葡聚糖结合。在一个方面，葡聚糖可能是真菌细胞壁中发现的几丁质。在一个方面中，所述荧光染料可以是荧光增白剂（Sigma，目录＃18909）。在另一个方面，所述染料可以是Solaphenyl黄素（AAKASH化学Solophenyl黄素7GFE）。增加的荧光增白剂和Solaphenyl黄素的结合对应于染料与细胞壁污染物的结合，该污染物在未受感染的微藻培养物中不存在。附加染料结合测定法可开发用于任何染料，该染料以低亲和力与微藻结合，以高亲和力与有害生物结合，例如，壶菌。
在一个方面中，1％荧光增白剂溶液的结合（Sigma，目录＃18909）是通过对荧光进行检测来测量的，荧光的激发波长在360nm和发射波长在444nm。在一个方面，荧光增白剂处理的样品可以使用DAPI过滤器进行显微镜检查。在又一个方面中，样品可以使用Solaphenyl黄素荧光染料结合来监测真菌的污染。Solaphenyl黄素染色可在激发波长365nm和发射波长515nm进行测量。在一个方面，结合了Solaphenyl黄素荧光染料的样品的显微镜检测可以使用FITC过滤器来进行。
在另一个方面中，监测可以检测光散射的改变，例如光在795nm处的吸收。连续监测微藻生长的方法是本领域已知的，例如在Sode等人，“基于藻清蛋白荧光的海洋蓝细菌培养的在线监测。”生物技术杂志21:209-217(1991),Torzillo等人，“在线监测叶绿素荧光来评估由高氧浓度和低温诱导的光合作用的光抑制程度，以及评估其在钝顶螺旋藻室外培养的生产能力上的影响（蓝藻细菌），”藻类学杂志34:504-510(1998),Jung和Lee,“使用图像分析原位监测光生物反应器中细胞的浓度：均匀的光分布模型和人工神经网络的比较”生物技术进展22:1443-1450(2006),其全部内容通过参考引入到本文。
微藻池塘可以使用絮凝法进行监测。在一个方面中，絮凝可以通过，在预定的时间期限后，测定剩余微藻的比率来测量。可以通过上述提供的（如T0）光散射或荧光来测定样品中悬浮微藻的含有量。经过一段时间，第二测定可以完成（例如，TN）和比率被确定（例如，Tn/T0）。在一个方面中，该比率可以在40分钟（例如，T40/T0）来测定。在另一个方面，该比率可能在30或60分钟来测定。在一个进一步的方面，可以得到多个时间点，和絮凝表示为悬浮液中藻类量随时间变化的斜率。
根据本公开内容，检测液体系统中的有害生物显示了一种需求，即需要提供有效浓度的杀真菌剂或杀虫剂以抑制有害生物的生长。在一个方面中，与之前检测相比，检测输出的改变可能显示了需要额外的检测。在另一个方面，阳性测试结果可能表明需要有更大的灵敏度的额外检测。
在一个方面，液体系统中有害生物的检测可检测一种或多种有害生物。在一个方面中，一种有害生物可执行两个或多个检测。在另一个方面中，执行三个或更多的检测。在进一步的方面，执行4个或更多或甚至5个或更多的检测。在一个方面，执行1至5个之间的检测。在一个方面中，所执行的检测次数由微藻决定。在一个方面中，执行栅藻属、链带藻属、微绿球藻属和螺旋藻属有害生物的检测。
在一个方面，可以利用聚合酶链式反应（PCR）来检测核糖体序列对有害生物进行检测。在一个方面中，核糖体序列可以包括DNA序列，其选自由以下组成的组：NC_003053根生壶菌属136线粒体、NC_003048Hyaloraphidium curvatum线粒体、NC_003052Spizellomyces毛虫线粒体染色体1、NC_003061Spizellomyces毛虫线粒体染色体2、NC_003060Spizellomyces毛虫线粒体染色体3、NC_004760Harpochytrium属JEL94线粒体、NC_004624Monoblepharella属JEL15线粒体和NC_004623Harpochytrium属JEL105线粒体。在本公开内容的另一个方面，有害生物可以使用PCR检测，其放大选自SEQ ID NO：1-6的序列。
本公开内容的方法包括检测方法，这些方法可以检测有害生物存在于至少105个细胞/mL的水平。在另一个方面中，本公开内容的方法提供了一种有害生物的检测，浓度是104细胞/mL。在进一步的方面，有害生物的浓度可在103个细胞/mL进行检测。在另一个方面，可检测到有害生物存在的浓度是102个细胞/mL的或甚至101个细胞/mL。
聚合酶链反应（PCR）是一种检测样品中生物体存在的灵敏方法。进行PCR的方法是本领域已知的。通过PCR的核酸分析需要样品制备，扩增和产物分析。虽然这些步骤通常是按顺序进行的，扩增和分析也可以同时发生。定量分析与扩增在同一仪器内的同一个管中同时出现。与产品分析相结合的扩增的概念已经成为被称为“实时”PCR或定量PCR（定量PCR）。参见，例如，美国专利号6174670，其全部内容通过参考引入到本文。
在一个方面中，可以使用实时PCR方法来检测在液体系统中（例如，定量PCR）有害生物的存在。在实时PCR测定中，荧光信号在每个扩增循环过程中积累。阳性反应时的荧光信号超过阈值水平，通常是背景荧光。循环阈值（Ct）越过阈值所需的周期数和Ct水平反比于样品中靶核酸的量（即，Ct水平越低则样品中靶核酸的量越大）。实时PCR测定一般进行40个扩增循环。本领域普通技术人员将认识到Ct值可以与标准曲线进行比较，标准曲线从一连续稀释的有害生物制备而来，用来确定样品中有害生物数量/mL。
在一个方面，当Ct值小于35个循环时，在至少一个监测步骤检测有害生物。在另一个方面，当Ct值小于35个循环时，在至少两个连续的监测步骤检测有害生物。在又一个方面中，3个连续的监测步骤的Ct值小于35个循环，表明存在有害生物。
本公开内容进一步提供了当连续两个或多个监测步骤的Ct值持续下降时对有害生物的检测。在一个方面，Ct值从35或更高持续降低到Ct值位30或更少，表明需要作物保护措施。在一个方面中，使用SEQ ID NO：1可识别的壶菌有害生物的Ct值小于30，表明需要作物保护措施。在另一个方面，使用SEQ ID NO：2可识别的壶菌有害生物的Ct值小于30，表明需要作物保护措施。
本公开内容提供有害生物的荧光检测。在一个方面，经过3天的时间，当叶绿素荧光的平均百分比变化为负的时候，检测有害生物。
本公开内容进一步提供了，在有害生物污染检测之后和提供有效浓度的杀虫剂和杀真菌剂之后，持续监测和检测液体系统中的有害生物。本公开内容提供了对处理效果的测定的持续监测，以及对液体系统有害生物污染后续的检测。
本公开内容提供了收集和处理样品用于液体系统的监测。在本发明要求的任意一个或多个监测方案下，收集样品。根据液体系统的尺寸，样品可以随机地或系统地收集。在一个方面中，样品可以从单一位置收集。在另一个方面中，样品可以从多个位置收集。在一个方面中，可收集并分析多个样品。在另一个方面中，多个样品可单独分析。本领域技术人员已知的统计方法可应用于样品的收集和分析。参见，例如，生物统计学：生物研究中的统计原理和实践。Robert R.Sokal,F.James Rohlf.W.H.Freeman1994。
根据本公开内容的方法收集的样品进行处理，以便进一步分析。在一个方面，样品的DNA可根据本领域中已知的方法来提取。在一个方面中，通过煮沸样品中含有十二烷基硫酸钠（SDS）的缓冲液，对获得的DNA进一步分析。在另一个方面中，通过“珠击”离心后的样品可获得样品DNA。在又一方面，用于分析的DNA可以从裂解的样品中获得，该样品从固相上吸附和洗脱得到，例如使用本领域中已知的试剂盒。DNA提取方法的非限制性例子可以发现在，例如，在《当前分子生物学方法》卷1和2，Ausubel F.M.等人，由格林出版协会和Wiley Interscience（1989）公布或在《分子克隆》，T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,1982年，或在Sambrook J和Russell D.，2001，分子克隆：实验室手册（第三版），其全部内容通过参考引入到本文。
本公开内容提供了一种使用有效浓度的杀虫剂和杀真菌剂的液体培养物的处理。不断的监测为本领域技术人员提供了必要的信息，做出处理液体系统的决定，以及确定应用本公开内容的哪种处理方式。在一个方面，对显示有害生物污染进行快速处理，极大提高了微藻产率。在一个方面中，对有害生物处检测的失败处理会导致灾难性后果和损失液体系统中培养的微藻。在另一个方面，延误处理可能导致在液体系统中微藻产量的降低。
本公开内容提供了一种液体培养物的处理方法，当用qPCR（Ct）检测的有害生物检测的阈值循环小于30时，使用有效浓度杀虫剂或杀真菌剂。在一个方面，当Ct小于29时，提示需要进行处理。在另一个方面，当Ct小于28时，提示需要进行处理。
在一个方面，当显示有叶绿素荧光的减少时，处理液体培养物。在一个方面，如果在三天内平均叶绿素荧光不会增加，则提示要使用有效浓度的杀虫剂或杀真菌剂进行处理。在一个方面中，如果在三天内平均叶绿素荧光的百分比变化不会增加，则提示要使用有效浓度的杀虫剂或杀真菌剂进行处理。在一个方面中，如果在三天内平均叶绿素荧光的百分比变化减少，则提示要使用有效浓度的杀虫剂或杀真菌剂进行处理。在另一方面，如果每两天内平均叶绿素荧光的百分比变动减少超过了5％，则提示要使用有效浓度的杀虫剂或杀真菌剂进行处理。
在一个方面，荧光染料结合到叶绿素的比值，即提示有必要对液体培养物进行处理。在一个方面中，所述荧光染料可以是荧光增白剂。在另一个方面中，荧光染料可以是Solaphenyl黄素。在一个方面，当染料的荧光与叶绿素荧光的比率为约1.0时，指示处理。在另一个方面，当染料的荧光与叶绿素荧光的比值是1.0或更低时，指示处理。在一个方面，当染料的荧光与叶绿素荧光的比值是0.9或更低时，指示处理。在一个方面，当染料的荧光与叶绿素荧光的比值是0.8或更低时，指示处理。在一个方面，当染料的荧光与叶绿素荧光的比值是0.7或更低时，指示处理。在另一个方面，当染料比小于0.6时，提示使用有效浓度的杀虫剂或杀真菌剂。
在一个方面，在检测到有害生物污染的数小时内可对液体系统进行处理。在一个方面，在检测到有害生物污染的2小时内可进行处理。在另一个方面，在检测到有害生物污染的4小时内可进行处理。在另一个方面，在检测认为需要对作物提供保护行动的8小时内可以进行处理。在进一步的方面，需要作物保护行动的1天内可以进行处理。在另一个方面，需要作物保护行动的2天内可以进行处理。在一个方面中，对有害生物的监测和检测是连续的。
本公开内容提供了对于液体系统的持续监测，和当有害生物检测提示需要进行作物保护行动时，随后进行处理。根据本公开内容的方法，基于对作物保护行动的提示，液体系统可进行2次或更多次的处理。在另一个方面，需要作物保护行动的液体系统可以处理3次或更多次，或者4次或更多次。在一个方面中，基于作物需要保护行动的提示，连续的液体系统可以进行不定次数的处理。
在一个方面，先前处理5天后，可以进行后续的处理。在另一个方面中，先前处理7天后，可以进行后续的处理。在又一个方面中，先前处理10或14天后，可以进行后续的处理。在一个方面中，随后的处理可以每两周进行。
本公开内容还提供了，在进行第一次或随后的使用有效浓度杀虫剂或杀真菌剂的处理后，在任意时间，一旦提示需要对作物进行保护行动，则进行随后的处理。如在本公开内容中提供，液体培养物的监测和有害生物污染的检测反应了对作物保护行动的需求。在有害生物检测呈阳性提示需要作物保护行动之前，不需要作物保护行动，不必进行处理，微藻在液体系统中的生长可以持续数周。如在本公开内容中提供，杀虫剂和杀真菌剂可以定期或不定期地轮换使用，以防止杀虫剂或杀真菌剂抗性的发展。
前文对本发明进行了一般性描述，下面以说明的方式提供了实施例，通过参考这些实施例将更容易理解，这些实施例不是旨在限制本发明，除非特意说明。
在此引用的每个杂志、专利和其他文件或参考文件的全部内容通过参考引入到本文。
实施例1：有害生物识别
a.有害生物隔离
有害生物采用不同的技术进行分离。为了这个目的，他们指定，有害生物在符合柯赫氏法则后进行验证。具体来说，首先在生长已经出现减少的所有池塘中发现大量的有害生物，而且以可检测的方式（持续Ct值小于35）不能在健康池塘中发现该有害生物。第二，有害生物从被感染的池塘中分离和在纯培养基中生长。第三，当引入到健康的实验池塘后，这些培养出的有害生物的引入导致生产的减少。最后，有害生物从受感染的实验池塘中进行再分离，和确认与原来池塘中分离的原有害生物相同。许多有害生物已分离并以这种方式确认为有害生物。对于分类在Spearophaele分支的微藻，壶菌是一种常见的有害生物。
b.样品制备I：煮沸法
对于有限数目的样本，进行裂解缓冲液煮沸提取。50μL的环境样品与用50μL的0.25X裂解缓冲液混合（1X=50mM的Tris-盐酸，pH值8.0；200mM氯化钠，20mM的EDTA，pH值8.0；1.0％（v/v）SDS）于96孔聚合酶链反应（PCR）板。裂解缓冲液混合物被放置到一个PCR块，加热至95℃保持10分钟，冷却至25℃保持5分钟后，加热至95℃保持10分钟，然后冷却至25℃5分钟。这种方法有效地提取大部分微藻有害生物的DNA。效力是由稀释板提取的DNA量来确定的。
c.样品制备II：珠打浆方法
200μL样品经3,500rpm在Eppendorf离心机（型号5424）离心5分钟，除去上清液。将沉淀物重新悬浮于200μL0.25X DNA的裂解缓冲液（1X=50mM的Tris-盐酸，pH值8.0；200mM氯化钠，20mM的EDTA，pH值8.0；1.0％（v/v）SDS）中，并在200μL为0.7mm的氧化锆珠（BioSpec，11079110zx）存在下进行裂解3分钟珠击处理。裂解的样品在3500rpm再次离心5分钟。澄清的裂解物被转移到干净的试管中。
d.样品制备三：NORGEN工厂/真菌DNA提取分离试剂盒（NORGEN Biotek公司产品编号26200）。
将500μL样品在Eppendorf离心机（型号5424）以3,500rpm离心5分钟，并除去上清液。样品沉淀物随后的裂解是通过400μL0.7毫米氧化锆珠在400μL试剂盒提供的裂解缓冲液中珠击3分钟进行。按照NORGEN试剂盒制造商的方案提取DNA。
e.样品制备IV：MagMAX的DNA多样品提取试剂盒（Applied Biosystems公司）
将500μL样品在Eppendorf离心机（型号5424）以3,500rpm离心5分钟，并除去上清液。样品沉淀物随后的裂解是通过200μL0.7毫米氧化锆珠在200μL试剂盒提供的裂解缓冲液中珠击3分钟进行。按照AB试剂盒制造商的方案从培养细胞的基因组DNA中分离提取DNA。
f.有害生物识别序列
在上述步骤A中分离的有害生物通过对内转录间隔区1区（ITS1），5.8S核糖体RNA，和内转录间隔区2区（ITS2）的测序来鉴别。DNA从分离的样品中提取。有害生物通过空斑或显微操作从非纯性培养物中分离，许多有害生物是专性寄生的，并与他们的宿主共培养（例如，源微藻培养）。使用下述表3中记录的引物来扩增双向培养物中的DNA，肽核酸（PNA）防止宿主的DNA扩增。PNA包括具有SEQ IDNO：7-9的序列的肽核酸。ITS1、ITS2区域区分密切相关的生物体，但不提供有意义的系统发育信息。为了确定生物体的进化关系，并确定其系统发育分支，对18S，5.8S，28S区域进行测序。这些通常是连接在一起的并生成系统进化树。核糖体区域扩增的序列显示于表3。
g.聚合酶链反应（PCR）的条件
在本实施例中用于所有PCR测序的引物汇总在表3中。PCR反应（各50μL）在一个96孔板中进行，如下所示：10.0μL，5X HF缓冲液（New England Biolabs公司（NEB）），Phusion试剂盒目录E0553；2.0μL的10mM的dNTP（NEB，目录E0553）；2.0μL DMSO（Phusion试剂盒）；5.0μL5M甜菜碱；每种引物2.5μL，10μM；2.5μL肽核酸（10μM）。如果肽核酸（PNA）是在反应混合物中，70℃的步骤持续30秒（PNA退火）包括在53℃引物退火步骤之前的PCR程序中；0.4μL Phusion聚合酶；4.0μLDNA模板（按照上所述步骤b至e制备），煮沸并在分子级的水（Invitrogen公司，10977-015）以1:20稀释；添加分子级水（Invitrogen公司，10977-015）至使总体积至50μL。PCR反应按照以下方案进行：98℃30秒，40个循环：98℃变性10秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒，反应将在72℃扩展5分钟，保持4℃直到使用。
h.TOPO克隆
步骤g的PCR反应产品完全由TOPO克隆（Invitrogen Zero Blunt TOPO用于测序）进行克隆。将含有4.0μL的PCR产物，1.0μL盐溶液（由试剂盒提供），1.0μL TOPO载体进行反应，室温孵育10-30分钟。当反应孵育时，每个TOPO克隆反应有一小瓶TOP10感受态细胞（Invitrogen）在冰上解冻。在10至30分钟的孵育期结束时，2μL TOPO克隆反应物的加入到感受态细胞的小瓶中，并通过轻弹用于转化混合。将细胞放回冰中孵育5-30分钟。转化反应通过在42℃的水浴中孵育30秒进行热休克，该反应立即返回到冰上至少2分钟。250μL室温SOC培养基加入到细胞，和试管在37℃振荡培养箱中侧身孵育1小时。将100μL细胞散布在LB/卡那霉素（50微克/mL）板，并在37℃下孵育过夜。菌落PCR是在96孔板上进行50μL的反应，使用以下反应条件：达96菌落：为每个菌落制备主PCR混合物，如下：35.8μL无菌水；5.0μL10XExTaq缓冲液，每个4.0μL2.5mM的dNTP，2.5μL，10μM引物M13Flong；2.5μL，10μM引物M13Rlong；0.2μL，ExTaq酶。50μL母液（master mix）中被适当分配到PCR板的孔。单个菌落用移液管尖端挑起和落入PCR混合物。在PCR反应用以下方案进行：在94℃下进行变性2分钟；25个循环；94℃变性30秒，60℃退火30秒，伸72℃延一分钟，反应在72℃延伸5分钟，并在4℃下保持。
i.ExoSAP清理
从上述步骤h中获得的PCR产物过量引物和dNTP通过用外切核酸酶I和虾碱性磷酸酶（SAP）处理除去。另外，样品用Qiagen离心柱（Qiagen公司，产品编号28104）清理。反应设置如下：ExoSAP母液：每个反应，3.5μL蒸馏水；0.625μL10XSAP缓冲液；0.625μL核酸外切酶I；1.25μL的SAP。该6μL ExoSAP母液被分配到PCR平板相应编号的孔中。上述步骤h的19μL PCR反应物加入到ExoSAP孔，通过移液混合，并在热循环条件下循环45分钟，总如下：37℃30分钟，80℃15分钟，并在10℃保持。
j.测序
ExoSAP清洗的DNA样本使用ABI自动测序仪测序。测序通常是发送给一个两个商业供应商，Eton生物科学（www.etonbio.com）或GENEWIZ（www.genewiz.com）。可替换地，测序在ABI自动测序仪，根据生产商的说明进行。引物列于表3。
k.数据处理和分析
数据得到两个不同的文件格式（AB1和SEQ），和AB1文件导入到DNAstar软件的LASERGENE8套件的SeqMan Pro应用程序。载体序列（pCRIITOPO）的序列被修剪，并且还修剪低质量碱基对（高严格度，相当于16的平均质量分数阈值）。随后，序列组装成基于以下标准的重叠群：匹配长度，12；最小匹配90%，最小序列长度，100；重叠群最大附加的缺口（gap）每kb，70；最大附加每kb的空白序列，70；最大寄存器移的差异，70；laspp.oup考虑，2；空位罚分，0.00；缺口长度罚分，0.7。然后，重叠群导出为单个文件（FASTA格式）。重叠群文件使用MEGABLAST上传和冲击（blasted）在NCBI核苷酸数据库（新台币）。随着对重叠群长度的信息和重叠群序列的数目，通过最大得分随后选出最高点（top hit），以及保藏号的信息，点的描述和最大得分输入到Excel电子表格中。
表3：用于环境DNA和载体PCR扩增的引物列表。
l.分离的有害生物的进化分析
按照实施例1的步骤a至f分离出的有害生物，按照实施例1的步骤g至k的方法进行进一步的序列分析。在实施例1的步骤k中获得的处理过的序列18S，28S和16S使用MUSCLE比对程序生成多序列比对（Edgar RC（2004）“MUSCLE：具有高精度和高吞吐量的多序列比对”。核酸研究32（5）：1792-1797年，3.8.31版）。
18S序列与基因库中下述ID号的序列进行比较：ay635838、ay601707、m62707、dq536481、m62704、dq322625、m62705、m62706、ah009066、ah009067、y17504、af164335、af164337、ay546682、ab016019、af164333、ay635839、af164278、ah009039、ay601711、ah009033、ah009047、ah009046、ah009044、ay546683、ay635844、ah009048、ah009049、ah009043、ay635835、ah009045、dq536475、aj784274、dq536476、dq322623、ay032608、af164253、af051932、ay635826、ay635824、dq536478、af164272、ay601710、af164263、ah009032、ah009051、dq536485、dq536488、dq536492、dq536479、dq322622、ah009034、ay635823、dq536491、af164247、ah009022、af164245、ah009024、m59759、dq536477、dq536490、ay546684、dq536480、ay635830、ah009030、ah009028、ah009027、ay635829、ah009060、ah009053、ah009059、ay635825、dq536482、ay635827、dq536486、ay349035、ay349032、m59758、dq536487、dq536483、ah009063、ah009064、ah009056、dq536473、ah009058、ah009065、ah009055、ah009054、dq536484、ah009057、ay601709、ay349036、ay552524、u23936、ay635842、ah009068、ay635822、af322406、ay635840、dq536472、dq536489、ay601708、dq322624、ay635841、af007533、af113418、ay635820、ay635837、af007540、dq322627、dq322630、ay635832、ay251633和v01335。
28S序列与基因库中下述ID号的序列进行比较：dq273803、dq273766、dq273829、dq273822、ay349059、dq273771、dq273777、ay546687、dq273804、dq273814、ay546686、ay349083、ay546688、dq273816、dq273798、dq273819、dq273820、dq273815、ay546693、dq273784、dq273782、dq273824、dq273775、dq273770、dq273835、dq273837、ay439049、dq273823、dq273781、dq273778、dq273776、dq273821、ay546692、dq273826、dq273789、dq273787、ay349097、dq273783、dq273831、dq273785、dq536493、ay349068、dq273836、dq273832、dq273839、ay442957、ay439071、dq273813、dq273838、ay988517、dq273834、ay349063、dq273769、ay439072、ay552525、dq273808、dq273780、dq273767、dq273805、dq273767、dq273818、dq273807、ay546691、ay546689、dq273772、dq273800、dq273773、dq273797、dq273828、dq273792、z19136、j01355、af356652、ay026374、ay026380、dq273802、ay724688、ay026370和ay026365。
5.8S序列与基因库中下述ID号的序列进行比较：ay997087、ay997086、ay997042、ay997064、ay349112、ay349128、ay997055、ay997061、ay997060、ay997066、ay997056、ay997074、ay349109、ay997037、ay997044、ay997065、ay997094、ay997095、ay997036、ay997031、ay997048、ay997049、dq536494、ay997077、ay997079、dq536497、dq536500、dq536495、ay997084、ay997082、ay997051、ay997075、ay997093、ay997092、ay997096、ay997033、ay997078、ay997035、ay997083、dq536498、ay349119、dq536499、ay349116、ay997070、dq536501、dq536496、ay997076、ay349115、ay997028、ay997032、ay997034、ay997038、ay997059、ay997072、ay997067、ay997030、ay997039、ay997041、ay997047、ay997071、ay997089、ay997097、ay997054、ay997088、v01361、ay130313、ay227753、ay997029、ay363957、aj627184和af484687。
所得到的对准是经手动修整和错误校正的，并串连贝叶斯分析，贝叶斯分析使用从mrbayes.csit.fsu.edu得到的Mr.Bayes版本3.1.2，（Ronquist F等，“Mr.Bayes3：基于混合模型的贝叶斯系统发育推理，“生物信息学19（12）:1572-4（2003））。输出转换为PHYLIP格式，并使用RAxML进行极大似然分析（Stamatakis A，等，“RAxML-III：基于极大似然推论的大型系统进化树的一个快速程序，”生物信息学21（4）：456-63（2005））。由此产生的进化树显示在图1中，指定4个经分离的有害生物的结果，FD01、FD61、FD95、Arg。
实施例2：模具设计和提取的优化
根据实施例1的序列分析结果，设计有害生物序列的特异性qPCR引物和通用qPCR引物，验证所述序列对于质粒DNA和环境中分离的DNA的效力和特异性。qPCR引物被设计用于扩增基因组DNA。对于每个qPCR引物工具，验证提取方案，以确保该分离的有害生物DNA样品是有效的。参见实施例1，上述步骤b至e。为了验证提取方案，制备一系列稀释的环境样品，和对提取方法的效率进行比较。
实施例3：池塘分子监测
使用实施例2中开发的验证分子工具，池塘每天对实施例1中鉴定的所有有害生物进行调查。用于监测的有害生物和序列示于表4。
a.DNA模板的制备：
DNA模板是根据上述实施例1的（b）项所述的沸腾方法制备的。将样品通过加热进行裂解，如下所示：对于栅藻（鼓藻）培养物：2个循环：95℃10分钟，25℃5分钟，保持在4℃下。拟球藻培养物：4个循环：95℃10分钟，25℃5分钟，保持在4℃。蓝藻培养物仅使用沸腾循环不能有效地裂解，需要进行珠击3分钟，以得到有效的裂解。见上述第[00257]段。裂解的样品用无菌水按1:20稀释。加热样品具有以下方案：
b.qPCR反应
10μL的qPCR反应物在96孔板中制备，如下所示：
成分 每个反应的体积
SsoFast EvaGreen SuperMix（Bio-Rad公司，＃172-5201） 5μL
1μM引物混合物（各0.5μM） 2.4μL
DNA模板（1:20稀释） 2.6μL
总量 10μL
在96孔板中的反应物在2500rpm下离心2分钟。qPCR循环在CFX96循环仪（Biorad公司）上进行，使用以下条件。
EVA Green循环条件，熔解曲线
循环 重复 步骤 时间 温度 温度改变 功能
1 1
1 2:00 98℃
2 40
1 0:01 98℃
2 0:02 57℃ 实时
3
1 0:10 65℃ 0.5℃ 熔解曲线
一旦引物得到充分验证，省略熔解曲线而使用以下qPCR循环方案，以节省时间。
循环 重复 步骤 时间 温度 温度改变 功能
1 1
1 2:00 98℃
2 40
1 0:01 98℃
2 0:02 57℃ 实时
选择引物以产生产品，其为约100个碱基对（bp）。筛选每个有害生物的5对引物和选择的以下引物供附加使用。
名称 ID 内部ID 序列 SEQ ID号
未培养的真菌167-40 FD0095 RM-A3.L CACGCGTACGGTTGATTAGA 22
RM-A3.R TGAATGCACTTTGCACTGCT 23
未培养的真菌F1210G FD0001 RM-B3.L CCACAAATCCCTGTTACAATCA 24
RM-B3.R TTACCTGCGTTATGCGTGTG 25
未培养的真菌IVN1-23 FD0061 RM-C2.L GATCAAAACCGCTCACCAAT 26
RM-C2.R TGAATTGCAGAACTCCGTGA 27
未培养的壶菌 FD100 YX-F ATGTCATTGGGATTGCCTCT 28
YX-R CGGGTCCTCCTACCTGATTT 29
甲基转移酶基因 Universal YX-F GGGCGTACCATAATCTGCAT 30
YX-R ATGACACCGTCAGGAAAACG 31
ITS基因 Universal YX-F CGGACCAAGGAGTCTAACA 32
YX-R TTGCACGTCAGAATCGCTAC 33
鼓藻属BR2 SE0004 YX-D1.L TACCCTCACCCCTCTCTCCT 34
YX-D1.R TAAGCTTCAGCCAACCCAAT 35
微绿球藻 SE0087 RM-SE00873L CTGGGATATCGTCGCTCCTA 36
RM-SE00873R ATGGGTATGCGTCCGTTAGA 37
实施例4：池塘非分子监测
池塘每日还接受使用非分子工具的调查，以提供特定池塘的健康或感染水平的指示。对以下一个或多个属性进行评估。
使用荧光增白剂M2R检测微藻培养生长的壶菌感染。
获得1.5mL培养物样品，与荧光增白剂M2R的1％溶液在黑暗中孵育（Sigma，目录＃18909）10分钟。通过20,000g离心15分钟获得沉淀物，并重新悬浮于250μL的水中。在96孔板中制备2倍稀释系列（1:1至1:128）和在上在SpectraMax荧光读板仪测量荧光。在表5中给出的波长同时测量荧光。
表5：壶菌检测的激发光谱和发射光谱
目标 激发(nm) 截断(nm) 发射(nm)
荧光增白剂 360 435 444
叶绿素 430 665 685
荧光增白剂结合测定的结果显示于图2。池塘9具有最高水平的荧光，对应于较高水平的壶菌感染，而池塘21具有较低水平的壶菌感染。池塘24和池塘15的感染水平位于池塘9和池塘21感染水平的中间。
与图2中池塘9、15、21和24所示荧光增白剂荧光的差异相反，叶绿素荧光的测量并没有显著差异，如图3所示。
荧光增白剂处理的样品使用DAPI过滤器进一步的显微镜检查壶菌的存在。荧光增白剂结合测定的例子示于图4。如面板A的左图像所示，对鼓藻叶绿素荧光检测，而右边的图像没有在444nm处荧光发射。在面板的B-D中，对SEQ ID NO：1-3识别的壶菌的存在进行检测，如每个面板右侧图中的荧光所示。
荧光增白剂与叶绿素荧光的比值提供了一个特定的池塘的健康或感染水平的指示。图5给出的四个池塘的荧光比值。可以看到的，池塘9具有较高的比值，对应于壶菌感染具有更高的水平，而池塘21具有较低的比值和对应于壶菌感染处于较低的水平。池塘15和24的荧光比值处于池塘9和21的中间。
荧光增白剂与叶绿素荧光比值和壶菌感染水平之间的相关性通过PCR所证实。在图6中，池塘24和池塘9的较低的Ct值可以看到更高水平的壶菌感染。同样，池塘21和池塘15的较高的Ct值被观察到感染水平的降低。由荧光增白剂和叶绿素荧光的比值测定的，以及由PCR测定的壶菌感染水平的关系是一样的：池塘9>池塘24>池塘15>池塘21。
微藻培养的健康进一步利用絮凝法进行监测。获得5mL培养物并放置于17×100mm的培养管中。在零时（T0）和40分钟（T40）从预定的深度得到样品，并OD750和叶绿素荧光得到测定。沉降速率被确定为T40/T0比值。当该比值低于0.35时，所执行的池塘的深入生物学评价包括，例如，qPCR、染料结合、荧光和上述规定的其他方法。
实施例5：阈值的测定与作物保护行动
根据使用实施例4的方法的日常检测，需要保护行动池塘被识别和处理。对于在实施例1中鉴别和在实施例2中验证的每个有害生物，鉴别阈值以确定特定有害生物。对于使用SEQ ID NO：1-3可识别的壶菌有害生物，Ct下降到小于30表明需要对作物保护行动。监测的结果示于图7。
作物保护行动得到每个连续监测池塘阈值CT的提示。根据该提示，第一杀真菌剂是由许可的施用者在预定的浓度（1ppm，
Figure BDA0000488027060000672
0.5ppm，
Figure BDA0000488027060000673
1ppm）进行添加，和监测继续进行。如果CT阈值再次达到，不同的杀真菌剂（第二杀真菌剂）由许可的杀虫剂施用者在规定浓度（1PPM，
Figure BDA0000488027060000675
为0.5ppm，
Figure BDA0000488027060000676
Figure BDA0000488027060000677
1PPM）添加，和监控继续进行。为避免有害生物抗性的发展，杀真菌剂是根据其作用机制轮换使用。例如，三种杀真菌剂轮换在室外池塘使用：（唑菌胺酯）和
Figure BDA0000488027060000679
（氟啶胺）和
Figure BDA00004880270600006710
-42WP（
Figure BDA00004880270600006711
）。
Figure BDA00004880270600006712
是一种甲氧基丙烯酸酯类，其作用是抑制呼吸链。为吡啶杀真菌剂，其作用是抑制细胞能量的生产。是一种硫化物作用于呼吸途径的多个位点。使用处理后的分子和非分子方法监测处理的效力（图7）。
壶菌数量之一在该图的第六天开始增加，并持续增加。一旦Ct阈值跨越了30的，并显示超过3个循环阈值的持续上升，池塘使用2ppm剂量的
Figure BDA0000488027060000682
进行处理。池塘接受持续的监测和以壶菌活动停止作为处理的结果。
实施例6：识别有效的杀真菌剂
通过制备180mL对数期培养物，根据对化学物质的敏感性对藻类进行筛选。当在750nm（OD750或A750）的吸光度为0.2时，将对数生长期的培养物转移到96孔微量滴定板。20μL介质被提供到最上面一行作为阴性对照，中间6行接收20μL的稀释，每次转移时化学物质进行10倍稀释，化学物质跨越适当的浓度梯度，并且底行接收到20μL溶剂用来溶解农药，作为单独的对照。每孔的总体积为200μL。每一种化学品是一式三份测试。藻类的生长是通过测量A750每日跟踪。8天后，拟合生长曲线到一个对数模型和推导最大生长速率（R）来测量藻类的生长速率。该化学品的影响是通过在农药的各种稀释度比较藻类的r来控制计算。
表6：杀真菌剂在有害生物控制和微藻生长上的效用
Figure BDA0000488027060000683
Figure BDA0000488027060000691
Figure BDA0000488027060000701
N/D=未检出，N/A=不适用，N/T=未测试，（+/-）=不确定，（-）无效
如所显示的，效力是在杀真菌剂的有效浓度下评价的，百分比值是处理过的培养物的生长与未感染的对照组的生长速度相比的百分数。不能有效处理感染培养物导致微藻培养的崩溃和损失。对于一些杀真菌剂，第一次试验的积极效果在第二次试验中没有得到证实（见，例如，麦锈灵、多菌灵、萎锈灵、二溴氰基乙酰胺、氯苯嘧啶醇、苯锈啶、和三唑醇A在列5和6）。试验的杀真菌剂等级量表上为0到3，其中0分表示在0和25％之间的效力，1分表示26和50％之间的效力，2分表示51和75％之间的效力和3分表示76和100％之间的效力。
实施例7：杀真菌剂对微藻生长的影响
a.氟啶胺的影响
鼓藻品系（UTEX1237）在0.15的初始A750下接种到1mL介质中。该介质包括1.929g/L碳酸氢钠，0.1g/L的尿素，2.3730g/L硫酸钠，0.52g/L氯化钠，0.298g/L氯化钾0.365g/L的硫酸镁，0.084mmolg/L氟硅酸钠，0.035mL/L75％磷酸0.018g/Fe-Lo，0.3mL/L的铁20X储备液（20X铁储备溶液：1g/L的钠乙二胺四乙酸和3.88g/L氯化铁）和0.06mL/L100X微量金属溶液（100X微量金属储备溶液：1g/L的钠乙二胺四乙酸，7.2g/L氯化锰，2.09g/L的氯化锌，1.26g/L，钼酸钠和0.4g/L的氯化钴。培养物维持摇动在32℃下在恒定的照明（-200微爱因斯坦）和大约20000ppm的二氧化碳水平，这些培养物通过测量在750nm下培养物的光密度来每天监测生长。如检测到有害生物，在实验的开始和结束，它们的基因组DNA使用上面介绍的方法进行定量。微藻的未受污染的实验室培养物在增量杀真菌剂氟啶胺的存在下进行观察。如图8，氟啶胺浓度达到2ppm的不显著影响未被污染的微藻培养物的生长。
微藻培养物按如上所述制备和进一步接种已知的壶菌感染该品系，生长，并如上述那样进行监测。如示于图9中，微藻生长在没有氟啶胺的受污染的培养物中，其光密度在第4天崩溃，并在光密度没有恢复。与此相反，在250ppb或更高浓度的氟啶胺的存在下，受污染培养物的生长没有受到加入的壶菌的影响。100ppb浓度的氟啶胺导致微藻密度稳定在0.8ODU，是不存在氟啶胺的微藻生长密度的约4倍。
b.的影响
鼓藻品系(UTEX1237)接种到1.0mL的介质IABR6，初始OD(A750)为0.15。培养物维持摇动在32℃下在恒定的照明（-200微爱因斯坦）和大约20000ppm的二氧化碳水平，这些培养物通过测量在750nm下培养物的光密度来每天监测生长。如检测到有害生物，在实验的开始和结束，它们的基因组DNA使用上面介绍的方法进行定量。微藻的未受污染的实验室培养物在增量杀真菌剂
Figure BDA0000488027060000712
的存在下进行观察。如图10，
Figure BDA0000488027060000713
浓度达到2ppm，不显著影响未被污染的微藻培养物的生长。
微藻培养物按如上所述制备和进一步接种已知的壶菌感染该品系，生长，并如上述那样进行监测。如示于图11中，微藻生长在没有
Figure BDA0000488027060000714
的受污染的培养物中，其光密度在第2天崩溃，并在光密度没有恢复。与此相反，在1ppm或更高浓度的的存在下，受污染培养物的生长没有受到加入的壶菌的影响。0.5ppm浓度的
Figure BDA0000488027060000716
导致微藻密度稳定在0.3ODU，是不存在
Figure BDA0000488027060000717
的微藻生长密度的约2倍
c.
Figure BDA0000488027060000718
的影响
鼓藻品系(UTEX1237)接种到1mL的介质，初始OD(A750)为0.15。培养物维持摇动在32℃下在恒定的照明（-200微爱因斯坦）和大约20000ppm的二氧化碳水平，这些培养物通过测量在750nm下培养物的光密度来每天监测生长。如检测到有害生物，在实验的开始和结束，它们的基因组DNA使用上面介绍的方法进行定量。微藻的未受污染的实验室培养物在增量杀真菌剂
Figure BDA0000488027060000719
的存在下进行观察。如图12，浓度达到2ppm，不显著影响未被污染的微藻培养物的生长。
微藻培养物按如上所述制备和进一步接种已知的壶菌感染该品系，生长，并如上述那样进行监测。如示于图13中，微藻生长在没有
Figure BDA00004880270600007111
的受污染的培养物中，其光密度在第2天崩溃，并在光密度没有恢复。与此相反，在2ppm或更高浓度的
Figure BDA00004880270600007112
的存在下，受污染培养物的生长没有受到加入的壶菌的影响。1.0ppm浓度的
Figure BDA0000488027060000721
导致微藻密度稳定在0.8ODU，是不存在
Figure BDA0000488027060000722
的微藻生长密度的约4倍。
实施例7：池塘的监控和处理
位于拉斯克鲁塞斯，新墨西哥州的200000升室外池塘在-0.15（池塘P08）的初始OD（750nm）下接种一种鼓藻品系。该微藻的生长是通过测量培养物的无灰干重来进行每日监测。每日进行PCR监测以检测有害生物的存在。培养物生长监测的结果和使用qPCR引物B7和B8对有害生物的监测结果列于图14。附加的池塘，根据这些方法的监测和处理在表7提供如下。
池塘进一步使用如上实施例4中所述的荧光染料结合测定法进行监测。样品使用相同的方案，还使用Solapehnyl黄素荧光染料染色检测了真菌污染。Solaphenyl黄素染色是使用365nm的激发波长测量的和发射是在515nm波长处进行检测。使用FITC过滤器进行镜检。
样品进一步通过检测叶绿素荧光的来检验微藻的生长。在一个鼓藻培养物中，叶绿素荧光使用430nm的激发波长和685nm的发射波长测量。微藻生长的结果被用来制备叶绿素荧光随时间变化的半对数图，以确定生长阶段，并准备收集时间表。
微藻池塘的健康进一步利用絮凝法评估。样品从生长池塘得到，并放置在17×100mm的培养试管中。200μL的样品均取自试管在T0和40分钟时相同的深度。沉降速率确定为OD750的比值或在T40/T0的叶绿素荧光的比值。使用FlowCAM监测池塘。FlowCAM分析结合流式细胞术和显微术，允许在移动区域的粒子的高通量分析。稀释的（1:10）培养物样品通过FlowCAM用20X物镜（绿藻）或4X物镜（蓝绿藻）运行。该FlowCAM及其集成软件自动图像以连续流动计数和分析预定数量的颗粒（通常3000）。表型属性（如绿色与透明细胞，大细胞与小细胞等）被记录下来。
起初，直到第15天，有害生物的Ct值超过Ct=30时的阈值（参见图14）。有害生物FD100监测观察到的测量的Ct处于低于Ct=30，并表示需要对作物的保护行动。接种后的第18天，氟啶胺以0.5ppm的浓度加入。继续每日监测和有害生物FD100观察的Ct增加超过Ct=30的阈值，直到第38天仍然高于阈值。
培养的成功取决于及时查明有害生物。在第30天，为响应培养物光学密度的降低，加入1ppm的唑菌胺酯溶液。尽管加入第二杀真菌剂，培养仍会崩溃。
微藻生长池塘的监测、处理和收集的其它实施例列于表7。
表7：生长栅藻种系的池塘的监测，处理和收集
Figure BDA0000488027060000731
实施例8：施用或未施用氟啶胺处理的室外池塘微藻的生长
按照上面实施例中所述进行壶菌有害生物和微藻生长的监测。在池塘16（P16）中，针对甲基转移酶基因（SEQ ID NOs：30和31）和ITS基因（SEQ ID NOs：32和33）使用通用引物对，在第8天的开始，检测到壶菌有害生物存在的信号。在这一点上，400升P16被接种到池塘A6（PA6）。对壶菌在池塘P16和A6存在的连续检测表明，需要对作物进行保护和在第11天添加0.5ppm氟啶胺到P16，但不包括PA6。利用有机碳总量（TOC）、OD（750）、荧光、和
Figure BDA0000488027060000732
继续对这两个池塘16和池塘A6的微藻生长进行监测。对数增长继续在氟啶胺处理过的池塘P16中，而池塘A6中的微藻生长则出现崩溃。图15显示了来自PA6池塘样品中被感染细胞的部分如何增加，和在处理后的P16中的稳定或者减少。
实施例9：微藻的收集
位于拉斯克鲁塞斯，新墨西哥州的500000升室外池塘在-0.15（池塘17）的初始OD（750nm）下接种一种鼓藻品系。池塘的生长和健康使用上述实施例中描述的方法进行监测。当池塘达到1g/L AFDW（无灰干重）时，源自壶菌FD100活性感染造成的生长和产量问题变成了一个问题。除了用杀真菌剂处理外，还可启动收集，以维持培养物处于对数生长期，其中目标生物量的OD为0.3至0.4g/L（例如，低于1g/L的AFDW）以减小壶菌有害生物的毒性。连续收集以保持藻类的对数期，提供了一个不易受FD100感染的环境。收集是继续的，以保持微藻培养物在一个最佳的对数生长期。测定每个物种和微藻品系的最优收集策略。
实施例10：在-500000升液体系统中的鼓藻生长。
具有500000升近似体积以及大约250mm深度的液体系统（池塘16，P16）使用实施例7中所述的介质进行制备。
所述的液体系统在第0天（T0）接种鼓藻，和监测生长的下列参数：pH、温度、深度（与蒸发有关）、OD750、PAM（脉冲幅度调制）、电导率、碱度、硝酸盐、磷酸盐、AFDW（无灰干重）、TOC（总有机碳），并通过qPCR监测壶菌。
Figure BDA0000488027060000741
Figure BDA0000488027060000742
和显微镜被用来评估培养物的健康。当HNO3、H3PO4、尿素，铁和微量金属被耗尽，加入它们使得营养物质还原到初始水平。
当OD750达到约0.6时，鼓藻在第14、20、22、27、30、34、35、36、38、42、51、72、78和84天，由溶解气浮设备（DAF）收集。定量PCR针对壶菌FD100使用上述引物进行每日监测。如图17提供，正如qPCR所指出的，P16在第19、31、57、59、70和79天施用
Figure BDA0000488027060000743
或
Figure BDA0000488027060000744
施用指示的杀真菌剂的池塘被提供一定体积的杀真菌剂，该体积的计算是基于施用浓度和待处理池塘的体积。计算后得到的体积的杀真菌剂稀释到1升的介质中，并缓慢加入池塘桨轮的后面。通过从T0开始和至少每24小时收集50mL样品监测杀真菌剂的浓度。样品用0.22μm的针头式过滤器过滤到50mL螺旋盖试管中。样本被立即存储于-20℃，和解冻样品用于杀镇菌剂水平的HPLC分析。
实施例11：雨生红球藻池塘的监测和处理
200000升的室外池塘在初始OD（750nm）为-0.15（池塘P08）时接种雨生红球藻。该微藻的生长是通过测量培养物的无灰干重来进行日常监测的。使用ACCTTCATGCTCTTCACTGAGTGTGATGG（SEQ ID NO：38）和TCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAAC（SEQ ID NO：39）作为引物，每天进行PCR监测以检测壶菌Paraphysoderma sedebokerensis或者其近亲物种的存在。
使用如上实施例4中所述的荧光染料结合测定法，对池塘进一步监测。按照相同的方案，样品还使用Solapehnyl黄素荧光染料染色检测真菌污染。Solaphenyl黄素染色是使用365nm的激发波长测量和发射是在515nm处进行检测。使用FITC过滤器进行镜检。
通过检测叶绿素荧光，样品进一步检验微藻的生长。叶绿素荧光使用430nm的激发波长和685nm的发射波长测量。微藻生长的结果被用来制备叶绿素荧光随时间变化的半对数图，以确定生长阶段，并准备收集时间表。
微藻池塘的健康进一步利用絮凝法评估。样品从生长池塘得到，并放置在17×100mm的培养试管中。200μL的样品取自试管在T0和40分钟时相同的深度。沉降速率确定为OD750的比值或在T40/T0的叶绿素荧光的比值。使用FlowCAM监测池塘。FlowCAM分析结合流式细胞术和显微术，允许在移动区域的粒子的高通量分析。稀释的（1:10）培养物样品通过FlowCAM用20X物镜（绿藻）或4X物镜（蓝绿藻）运行。该FlowCAM及其集成软件自动图像以连续流动计数和分析预定数量的颗粒（通常3000）。表型属性（如绿色与透明细胞，大细胞与小细胞等）被记录下来。
起初，有害生物的Ct值超过Ct=30时的阈值。观察到的P.sedebokerensis的测量Ct处于低于Ct=30，并表示需要对作物的保护行动。一旦检测到Ct<30，百菌清以1ppm的浓度加入。继续每日监测和观察到的P.sedebokerensis的测量Ct增加超过Ct=30的阈值，以及仍然高于阈值。
实施例12：节旋藻池塘的监测和处理
位于拉斯克鲁塞斯，新墨西哥州的200000升室外池塘在初始DW为0.2g/L时，接种节旋藻。该微藻的生长是通过测量培养物的无灰干重来进行日常监测的。使用CCGTGAGGGAAAGATGAAAA(SEQ ID NO.40)和CCTTGCGCTTTTTACTCCAG(SEQ ID NO.41)作为引物，每天进行qPCR监测以检测壶菌Rhizophidiumplanktonicum或者其近亲物种的存在。
使用如上实施例4中所述的荧光染料结合测定法，对池塘进一步监测。按照相同的方案，样品还使用Solapehnyl黄素荧光染料染色检测真菌污染。Solaphenyl黄素染色是使用365nm的激发波长测量和发射是在515nm处进行检测。使用FITC过滤器进行镜检。
通过检测叶绿素荧光，样品进一步检验微藻的生长。蓝藻细菌的叶绿素荧光使用363nm的激发波长和685nm的发射波长测量。微藻生长的结果被用来制备叶绿素荧光随时间变化的半对数图，以确定生长阶段，并准备收集时间表。
使用FlowCAM监测池塘。FlowCAM分析结合流式细胞术和显微术，允许在移动区域的粒子的高通量分析。稀释的（1:10）培养物样品通过FlowCAM用20X物镜（绿藻）或4X物镜（蓝绿藻）运行。该FlowCAM及其集成软件自动图像以连续流动计数和分析预定数量的颗粒（通常3000）。表型属性（如绿色与透明细胞，大细胞与小细胞等）被记录下来。
起初，有害生物的Ct值超过Ct=30时的阈值。观察到的R.planktonicum的测量Ct处于低于Ct=30，并表示需要对作物的保护行动。一旦检测到Ct<30，百菌清以1ppm的浓度加入。继续每日监测，观察到的R.planktonicum的测量Ct增加超过Ct=30的阈值，以及仍然高于阈值。
即使本发明已经进行描述，本领域技术人员将理解为了适应特定的条件可以进行不同的改变，而这些并不脱离本发明的范围。因此，本发明不受这些公开的用于实施本发明的特定实施例的限制，但是本发明将包括落入所附权利要求范围和精神内的所有实施例。
Figure IDA0000488027110000011
Figure IDA0000488027110000041
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Figure IDA0000488027110000081
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Figure IDA0000488027110000121
Figure IDA0000488027110000131

Claims (149)

1.减少液体系统中真菌生长的方法，包括：
在所述液体培养物中接种微藻；
检测所述真菌；
提供有效浓度的杀真菌剂，相对于未使用所述杀真菌剂的所述真菌的生长而言，抑制所述真菌的生长；和
使所述微藻生长。
2.如权利要求1所述方法，其中，所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、福美双、百菌清、二噻农、多果定、和二溴氰基乙酰胺组成的组。
3.如权利要求1所述方法，其中，所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
4.如权利要求1所述方法，进一步提供了第二有效浓度的杀真菌剂，选自由氟啶胺、唑菌胺酯、福美双、百菌清、二噻农、多果定、和二溴氰基乙酰胺组成的组。
5.如权利要求1所述方法，进一步提供了第二有效浓度的杀真菌剂，选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
6.如权利要求1所述方法，其中，所述微藻通常是基因工程改造的。
7.如权利要求1所述方法，其中，所述真菌是真菌界壶菌门的成员。
8.如权利要求7所述方法，其中所述的真菌界壶菌门成员选自由壶菌目、裂壶菌目、Rhizophydiales、Lobulomycetales、Cladochytriales、集壶菌目和单毛壶菌目组成的组。
9.如权利要求2所述方法，其中所述微藻选自由衣藻、微绿球藻、链带藻、栅藻和螺旋藻组成的组。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述液体系统是单培养。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述生长提供的微藻产率大于每升（g/L）0.4克AFDW。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述产率选自由大于0.5g/L、大于0.6g/L、大于0.7g/L、大于0.8g/L、大于0.9g/L和大于1.0g/L组成的组。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述生长提供的微藻产率至少是收集自未感染且未施用杀真菌剂的微藻液体培养物产率的80％。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述产率是选自由收集自未感染且未施用杀真菌剂的微藻液体培养物产率的至少85％，至少90％，至少95％，至少97.5％，至少99％和100％组成的组。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述生长提供的微藻产率至少比收集自具有所述真菌而又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高10%。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述产率选自比收集自未感染而具有所述真菌的又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少75%和100%所组成的组。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述产率选自比收集自未感染而具有所述真菌的又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高至少1.5倍，2.0倍，2.5倍，5.0倍，7.5倍，10倍，15倍所组成的组。
18.如权利要求11所述的方法，其中所述产率当微藻处于对数生长期时进行测量。
19.如权利要求11所述的方法，其中所述产率当微藻处于稳定生长期时进行测量。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述液体系统具有至少10000升的体积。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述液体系统是开放式室外培养系统。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述开放式室外培养系统具有体积至少20,000L,40,000L,80,000L,100,000L,150,000L,200,000L,250,000L,500,000L,600,000L,1,000,000L,10,000至20,000L,10,000至40,000L,10,000至80,000L,10,000至100,000L,10,000至150,000L,10,000至200,000L,10,000至250,000L,10,000至500,000L,10,000至600,000L,10,000至1,000,000L,20,000至40,000L,20,000至80,000L,20,000至100,000L,20,000至150,000L,20,000至200,000L,20,000至250,000L,20,000至500,000L,20,000至600,000L,20,000至1,000,000L,40,000至80,000L,40,000至100,000L,40,000至150,000L,40,000至200,000L,40,000至250,000L,40,000至500,000L,40,000至600,000L,40,000至1,000,000L,80,000至100,000L,80,000至150,000L,80,000至200,000L,80,000至250,000L,80,000至500,000L,80,000至600,000L,80,000至1,000,000L,100,000至150,000L,100,000至200,000L,100,000至250,000L,100,000至500,000L,100,000至600,000L,100,000至1,000,000L,200,000至250,000L,200,000至500,000L,200,000至600,000L,200,000至1,000,000L,250,000至500,000L,250,000至600,000L,250,000至1,000,000L,500,000至600,000L,and500,000至1,000,000L。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述开放式室外培养系统具有表面积选自在面积上至少0.25英亩,至少0.5英亩,至少1.0英亩,至少1.5英亩,至少2.0英亩,至少2.5英亩,至少5.0英亩,7.5或更多英亩,0.25至0.5英亩,0.25至1.0英亩,0.25至1.5英亩,0.25至2.0英亩,0.25至2.5英亩,0.25至5.0英亩,0.25至7.5英亩,0.5至1.0英亩,0.5至1.5英亩,0.5至2.0英亩,0.5至2.5英亩,0.5至5.0英亩,0.5至7.5英亩,1.0至1.5英亩,1.0至2.0英亩,1.0至2.5英亩,1.0至5.0英亩,1.0至7.5英亩,2.0至2.5英亩,2.0至5.0英亩,2.0至7.5英亩,2.5英亩至5.0英亩,2.5至7.5英亩,2.5至10英亩,5至12英亩,5至15英亩,5至18英亩,5至20英亩,10至25英亩,10至30英亩,10至35英亩,10至40英亩,10至45英亩,和10至50英亩。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述液体系统是连续的培养系统。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述连续培养系统提供所述微藻在对数生长期的生长。
26.在微藻液体培养系统中检测真菌存在的方法，包括：
获取所述液体培养系统的样品；和
检测提示所述真菌的DNA序列的存在。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述真菌是真菌界壶菌门的成员。
28.如权利要求27所述方法，其中所述的真菌界壶菌门成员选自由壶菌目、裂壶菌目、Rhizophydiales、Lobulomycetales、Cladochytriales、集壶菌目和单毛壶菌目组成的组。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述核糖体DNA序列选自由以下组成的组：NC_003053根生壶菌属136线粒体、NC_003048Hyaloraphidium curvatum线粒体、NC_003052Spizellomyces毛虫线粒体染色体1、NC_003061Spizellomyces毛虫线粒体染色体2、NC_003060Spizellomyces毛虫线粒体染色体3、NC_004760Harpochytrium属JEL94线粒体、NC_004624Monoblepharella属JEL15线粒体和NC_004623Harpochytrium属JEL105线粒体。在本公开内容的另一个方面，有害生物可以使用PCR检测，其放大选自SEQ ID NO：1-6的序列。
30.微藻在液体系统中生长的方法，包括：
用微藻接种所述液体系统;
接种后在所述液体系统中生长所述微藻至少10天;
针对真菌的存在监测所述液体系统至少一次，其中所述监测可检测所述真菌在为每毫升至少106个细胞的水平（细胞/mL），以及
从所述液体的系统的至少一个部分收集微藻。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述真菌是真菌界壶菌门的成员。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述的真菌界壶菌门成员选自由壶菌目、裂壶菌目、Rhizophydiales、Lobulomycetales、Cladochytriales、集壶菌目和单毛壶菌目组成的组。
33.如权利要求30所述的方法，进一步包括向所述液体系统提供杀真菌剂。
34.如权利要求33所述方法，其中，所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、福美双、百菌清、二噻农、多果定、和二溴氰基乙酰胺组成的组。
35.如权利要求33所述方法，其中，所述杀真菌剂是选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组的有效浓度的杀真菌剂。
36.如权利要求30所述的方法，其中所述生长天数选自以下组成的组，在所述接种后的15天或更多,30天或更多,45天或更多,60天或更多,90天或更多,120天或更多,180天或更多,250天或更多,500天或更多,1000天或更多,1500天或更多和2000天或更多。
37.进一步包括检测所述真菌的存在。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述检测包括荧光增白剂与所述液体培养物样品结合。
39.如权利要求30所述的方法，其中所述监测能够检测所述真菌在由以下组成的组的水平，至少105细胞/mL,104细胞/mL,103细胞/mL,102细胞/mL,和101细胞/mL。
40.如权利要求30所述的方法，其中所述收集包括从所述液体中分离至少90%所述微藻以生成微藻贫液，和所述至少一部分是指所述液体系统总体积的至少2%。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述至少一部分选自由以下组成的组，占所述液体系统总体积的至少2.5％，至少5％，至少7.5％，至少10％，至少12.5％，至少15％，至少20％，从2％至5％，从2至7.5％，从2至20％，从2％至12.5％，从2％至15％，从2％至20％，从2.5％至5％，从2.5至7.5％，从2.5％至10％，从2.5％至12.5％，从2.5％至15％从2.5到20％，从5至7.5％，从5％至10％，从5％至12.5％，从5％至15％，从5％至20％，从7.5％至10％，从7.5％至12.5％，从7.5至15％，从7.5％至20％，从10％至12.5％，从10％至15％，和10至20％。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述移除的液体系统的所述部分在所述微藻收集后返回到所述液体系统中。
43.如权利要求30所述的方法，进一步包括加热所述液体系统至33℃，以杀死或一致所述真菌的生长。
44.如权利要求30所述的方法，进一步包括用CO2所述液体系统。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述CO2的补充是提供CO2的浓度在由20ppm，25ppm，30ppm，35ppm组成的组。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述CO2的补充是提供pH在8.8和9.2之间，和所述微藻是绿藻。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述CO2的补充是提供pH在9.8和10.2之间，和所述微藻是蓝绿藻。
48.如权利要求30所述的方法，进一步包括用营养物质补充所述液体系统，营养物质选自由氮，磷，钾，铁，锌，钙和镁组成的组。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述氮的补充选自由硝酸（HNO3），尿素，硝酸钾（KNO3）和硝酸钠（NaNO3）组成的组。
50.如权利要求30所述的方法，其中所述液体系统具有至少10000升的体积。
51.如权利要求30所述的方法，其中所述液体系统是开放式室外系统。
52.如权利要求30所述的方法，其中所述开放式室外系统的体积至少具有20,000L,40,000L,80,000L,100,000L,150,000L,200,000L,250,000L,500,000L,600,000L,1,000,000L,10,000至20,000L,10,000至40,000L,10,000至80,000L,10,000至100,000L,10,000至150,000L,10,000至200,000L,10,000至250,000L,10,000至500,000L,10,000至600,000L,10,000至1,000,000L，20,000至40,000L,20,000至80,000L,20,000至100,000L,20,000至150,000L,20,000至200,000L,20,000至250,000L,20,000至500,000L,20,000至600,000L,20,000至1,000,000L,40,000至80,000L,40,000至100,000L,40,000至150,000L,40,000至200,000L,40,000至250,000L,40,000至500,000L,40,000至600,000L,40,000至1,000,000L,80,000至100,000L,80,000至150,000L,80,000至200,000L,80,000至250,000L,80,000至500,000L,80,000至600,000L,80,000至1,000,000L,100,000至150,000L,100,000至200,000L,100,000至250,000L,100,000至500,000L,100,000至600,000L,100,000至1,000,000L,200,000至250,000L,200,000至500,000L,200,000至600,000L,200,000至1,000,000L,250,000至500,000L,250,000至600,000L,250,000至1,000,000L,500,000至600,000L,和500,000至1,000,000L。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述开放式室外培养系统具有面积选自在面积上至少0.25英亩,至少0.5英亩,至少1.0英亩,至少1.5英亩,至少2.0英亩,至少2.5英亩,至少5.0英亩,7.5或更多英亩,0.25至0.5英亩,0.25至1.0英亩,0.25至1.5英亩,0.25至2.0英亩,0.25至2.5英亩,0.25至5.0英亩,0.25至7.5英亩,0.5至1.0英亩,0.5至1.5英亩,0.5至2.0英亩,0.5至2.5英亩,0.5至5.0英亩,0.5至7.5英亩,1.0至1.5英亩,1.0至2.0英亩,1.0至2.5英亩,1.0至5.0英亩,1.0至7.5英亩,2.0至2.5英亩,2.0至5.0英亩,2.0至7.5英亩,2.5英亩至5.0英亩,2.5至7.5英亩,2.5至10英亩,5至12英亩,5至15英亩,5至18英亩,5至20英亩,10至25英亩,10至30英亩,10至35英亩,10至40英亩,10至45英亩,和10至50英亩。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述液体系统是连续的培养系统。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述连续培养系统提供所述微藻在对数生长期的生长。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述所述对数生长期的生长用进行监测。
57.如权利要求40所述的方法，进一步包括将所述微藻贫液返回到所述液体系统中。
58.如权利要求30所述的方法，其中所述液体系统维持pH在8-10.5之间。
59.如权利要求30所述的方法，其中所述液体系统维持温度选自以下组成的组，在0至35℃之间，5至35℃之间，10至35℃之间，15至35℃之间，20至35℃之间，25至35℃之间，30至35℃之间，大于5℃，大于10℃，大于15℃，大于20℃和大于30℃。
60.如权利要求30所述的方法，进一步包括提供第一剂量有效浓度的杀真菌剂，所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、福美双、百菌清、二噻农、多果定、和二溴氰基乙酰胺组成的组。
61.如权利要求37所述的方法，进一步包括提供第一剂量有效浓度的杀真菌剂，所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
62.如权利要求60所述的方法，进一步包括添加一种或多种附加剂量的所述杀真菌剂，以维持所述有效浓度。
63.如权利要求60所述的方法，其中所述有效浓度选自由每百万0.5份（ppm），1ppm，2ppm，5ppm，10ppm，和10ppm以上组成的组。
64.如权利要求60所述的方法，进一步包括连续添加所述杀真菌剂以维持所述杀真菌剂的有效浓度。
65.如权利要求30所述的方法，其中所述微藻经过基因工程改造。
66.如权利要求30所述的方法，其中所述微藻选自由衣藻、微绿球藻、链带藻、栅藻和螺旋藻组成的组。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述液体系统是单培养。
68.如权利要求60所述的方法，进一步包括向所述液体系统提供有效数量的第二杀真菌剂，所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
69.如权利要求60所述的方法，进一步包括进一步包括向所述液体系统提供有效数量的第二杀真菌剂，所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
70.如权利要求30所述的方法，其中所述的收集提供了微藻产率大于0.4克每升（g/L）AFDW。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述产率选自由大于0.5g/L、大于0.6g/L、大于0.7g/L、大于0.8g/L、大于0.9g/L和大于1.0g/L组成的组。
72.如权利要求33所述的方法，其中所述生长提供的微藻产率至少是收集自未感染且未施用杀真菌剂的微藻液体培养物产率的80％。
73.如权利要求72所述的方法，其中，所述产率是选自由收集自未感染且未施用杀真菌剂的微藻液体培养物产率的至少85％，至少90％，至少95％，至少97.5％，至少99％和100％组成的组。
74.如权利要求37所述的方法，其中所述收集提供的微藻产率至少比收集自具有所述真菌而又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高10%。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述产率选自比收集自未感染而具有所述真菌的又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少75%和100%所组成的组。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述产率选自比收集自未感染而具有所述真菌的又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高至少1.5倍，2.0倍，2.5倍，5.0倍，7.5倍，10倍，15倍所组成的组。
77.如权利要求30所述的方法，其中所述的收集当微藻处于对数生长期时进行测量。
78.如权利要求30所述的方法，其中所述的收集当微藻处于晚对数生长期时进行测量。
79.如权利要求30所述的方法，其中所述的收集当微藻处于稳定生长期时进行测量。
80.增强微藻液体系统产率的方法，包括：
向所述液体系统提供优先水平的杀真菌剂；和
在所述杀真菌剂存在的情况下，在所述液体系统中生长所述微藻至少10天。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、福美双、百菌清、二噻农、多果定、和二溴氰基乙酰胺组成的组。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
83.如权利要求80所述的方法，其中所述生长天数选自以下组成的组，在所述接种后的15天或更多,30天或更多,45天或更多,60天或更多,90天或更多,120天或更多,180天或更多,250天或更多,500天或更多,1000天或更多,1500天或更多和2000天或更多。
84.如权利要求80所述的方法，其中所述优先水平的杀真菌剂防止真菌的生长，该真菌是壶菌门的一员。
85.如权利要求80所述的方法，其中所述优先水平选自由每百万0.5份（ppm），1.0ppm，2.0ppm，5.0ppm，10ppm，和10ppm以上组成的组。
86.如权利要求80所述的方法，其中所述液体系统是开放式室外培养系统。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述开放式室外系统的体积至少具有20,000L,40,000L,80,000L,100,000L,150,000L,200,000L,250,000L,500,000L,600,000L,1,000,000L,10,000至20,000L,10,000至40,000L,10,000至80,000L,10,000至100,000L,10,000至150,000L,10,000至200,000L,10,000至250,000L,10,000至500,000L,10,000至600,000L,10,000至1,000,000L，20,000至40,000L,20,000至80,000L,20,000至100,000L,20,000至150,000L,20,000至200,000L,20,000至250,000L,20,000至500,000L,20,000至600,000L,20,000至1,000,000L,40,000至80,000L,40,000至100,000L,40,000至150,000L,40,000至200,000L,40,000至250,000L,40,000至500,000L,40,000至600,000L,40,000至1,000,000L,80,000至100,000L,80,000至150,000L,80,000至200,000L,80,000至250,000L,80,000至500,000L,80,000至600,000L,80,000至1,000,000L,100,000至150,000L,100,000至200,000L,100,000至250,000L,100,000至500,000L,100,000至600,000L,100,000至1,000,000L,200,000至250,000L,200,000至500,000L,200,000至600,000L,200,000至1,000,000L,250,000至500,000L,250,000至600,000L,250,000至1,000,000L,500,000至600,000L,和500,000至1,000,000L。
88.如权利要求86所述的方法，其中所述开放式室外培养系统具有面积选自至少0.25英亩,至少0.5英亩,至少1.0英亩,至少1.5英亩,至少2.0英亩,至少2.5英亩,至少5.0英亩,7.5或更多英亩,0.25至0.5英亩,0.25至1.0英亩,0.25至1.5英亩,0.25至2.0英亩,0.25至2.5英亩,0.25至5.0英亩,0.25至7.5英亩,0.5至1.0英亩,0.5至1.5英亩,0.5至2.0英亩,0.5至2.5英亩,0.5至5.0英亩,0.5至7.5英亩,1.0至1.5英亩,1.0至2.0英亩,1.0至2.5英亩,1.0至5.0英亩,1.0至7.5英亩,2.0至2.5英亩,2.0至5.0英亩,2.0至7.5英亩,2.5英亩至5.0英亩,2.5至7.5英亩。
89.如权利要求80所述的方法，其中所述微藻经过基因工程改造。
90.如权利要求80所述的方法，其中所述微藻选自由衣藻、微绿球藻、链带藻、栅藻和螺旋藻组成的组。
91.如权利要求80所述的方法，其中所述液体系统是单培养。
92.如权利要求80所述的方法，其中所述的生长提供了微藻产率大于0.4克每升（g/L）AFDW。
93.如权利要求92所述的方法，其中，所述产率选自由大于0.5g/L、大于0.6g/L、大于0.7g/L、大于0.8g/L、大于0.9g/L和大于1.0g/L组成的组。
94.如权利要求80所述的方法，其中所述生长提供的微藻产率至少比收集自具有所述真菌而又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高10%。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述产率选自比收集自未感染而具有所述真菌的又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少75%和100%所组成的组。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述产率选自比收集自未感染而具有所述真菌的又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高至少1.5倍，2.0倍，2.5倍，5.0倍，7.5倍，10倍，15倍所组成的组。
97.如权利要求90所述的方法，其中所述的产率当微藻处于对数生长期时进行测量。
98.如权利要求90所述的方法，其中所述的产率当微藻处于稳定生长期时进行测量。
99.增强微藻液体系统产率的方法，包括：
提供含有杀真菌剂的液体系统；和
在所述杀真菌剂存在的情况下，在所述液体系统中生长所述微藻至少10天。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、福美双、百菌清、二噻农、多果定、和二溴氰基乙酰胺组成的组。
101.如权利要求99所述的方法，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
102.如权利要求99所述的方法，其中所述微藻经过基因工程改造。
103.如权利要求99所述的方法，其中所述微藻选自由衣藻、微绿球藻、链带藻、栅藻和螺旋藻组成的组。
104.如权利要求99所述的方法，其中所述生长天数选自以下组成的组，在所述接种后的15天或更多,30天或更多,45天或更多,60天或更多,90天或更多,120天或更多,180天或更多,250天或更多,500天或更多,1000天或更多,1500天或更多和2000天或更多。
105.如权利要求99所述的方法，其中所述微藻的所述产率大于缺少所述杀真菌剂的液体系统的90%。
106.如权利要求99所述的方法，其中所述微藻的产率大于0.4克每升（g/L）AFDW，以及所述微藻在对数生长期收集。
107.如权利要求99所述的方法，其中所述的生长提供了微藻产率大于0.4克每升（g/L）AFDW，以及所述微藻在稳定期收集。
108.如权利要求106所述的方法，其中，所述产率选自由大于0.5g/L、大于0.6g/L、大于0.7g/L、大于0.8g/L、大于0.9g/L和大于1.0g/L组成的组。
109.如权利要求99所述的方法，其中所述产率选自比收集自未感染而具有所述真菌的又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高至少15%，至少20%，至少25%，至少50%，至少75%和100%所组成的组。
110.如权利要求99所述的方法，其中所述产率选自比收集自未感染而具有所述真菌的又未施用所述杀真菌剂的微藻液体培养物的微藻产率高至少1.5倍，2.0倍，2.5倍，5.0倍，7.5倍，10倍，15倍所组成的组。
111.如权利要求99所述的方法，其中所述液体系统是开放式室外培养系统。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述开放式室外系统的体积至少具有20,000L,40,000L,80,000L,100,000L,150,000L,200,000L,250,000L,500,000L,600,000L,1,000,000L,10,000至20,000L,10,000至40,000L,10,000至80,000L,10,000至100,000L,10,000至150,000L,10,000至200,000L,10,000至250,000L,10,000至500,000L,10,000至600,000L,10,000至1,000,000L，20,000至40,000L,20,000至80,000L,20,000至100,000L,20,000至150,000L,20,000至200,000L,20,000至250,000L,20,000至500,000L,20,000至600,000L,20,000至1,000,000L,40,000至80,000L,40,000至100,000L,40,000至150,000L,40,000至200,000L,40,000至250,000L,40,000至500,000L,40,000至600,000L,40,000至1,000,000L,80,000至100,000L,80,000至150,000L,80,000至200,000L,80,000至250,000L,80,000至500,000L,80,000至600,000L,80,000至1,000,000L,100,000至150,000L,100,000至200,000L,100,000至250,000L,100,000至500,000L,100,000至600,000L,100,000至1,000,000L,200,000至250,000L,200,000至500,000L,200,000至600,000L,200,000至1,000,000L,250,000至500,000L,250,000至600,000L,250,000至1,000,000L,500,000至600,000L,和500,000至1,000,000L。
113.如权利要求111所述的方法，其中所述开放式室外培养系统具有面积选自至少0.25英亩,至少0.5英亩,至少1.0英亩,至少1.5英亩,至少2.0英亩,至少2.5英亩,至少5.0英亩,7.5或更多英亩,0.25至0.5英亩,0.25至1.0英亩,0.25至1.5英亩,0.25至2.0英亩,0.25至2.5英亩,0.25至5.0英亩,0.25至7.5英亩,0.5至1.0英亩,0.5至1.5英亩,0.5至2.0英亩,0.5至2.5英亩,0.5至5.0英亩,0.5至7.5英亩,1.0至1.5英亩,1.0至2.0英亩,1.0至2.5英亩,1.0至5.0英亩,1.0至7.5英亩,2.0至2.5英亩,2.0至5.0英亩,2.0至7.5英亩,2.5英亩至5.0英亩,2.5至7.5英亩。
114.如权利要求99所述的方法，其中所述微藻经过基因工程改造。
115.如权利要求99所述的方法，其中所述微藻选自由衣藻、微绿球藻、链带藻、栅藻和螺旋藻组成的组。
116.如权利要求99所述的方法，其中所述液体系统是单培养。
117.防止真菌在微藻液体培养系统中生长的方法，包括：向液体提供有效浓度的杀真菌剂以抑制真菌生长，其中所述杀真菌剂没有明显抑制微藻的生长；
用所述微藻接种所述液体；和
使所述微藻生长。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述真菌是真菌界壶菌门的一员。
119.如权利要求117所述的方法，其中所述的真菌界壶菌门成员选自由壶菌目、裂壶菌目、Rhizophydiales、Lobulomycetales、Cladochytriales、集壶菌目和单毛壶菌目组成的组。
120.如权利要求117所述的方法，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、福美双、百菌清、二噻农、多果定、和二溴氰基乙酰胺组成的组。
121.如权利要求117所述的方法，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
122.如权利要求117所述的方法，其中所述生长天数选自以下组成的组，在所述接种后的15天或更多,30天或更多,45天或更多,60天或更多,90天或更多,120天或更多,180天或更多,250天或更多,500天或更多,1000天或更多,1500天或更多和2000天或更多。
123.如权利要求117所述的方法，进一步包括提供一种或多种附加数量的所述杀真菌剂以维持所述杀真菌剂在所述生长过程中的有效浓度。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述有效浓度选自由每百万0.5份（ppm），1.0ppm，2.0ppm，5.0ppm，10ppm，和10ppm以上组成的组。
125.处理液体系统中微藻培养物的方法，包括：
检测所述液体系统中真菌的存在；
向所述液体系统中提供有效浓度的杀真菌剂以抑制所述真菌的生长；使微藻生长；和
所述液体系统对所述真菌的存在至少监测一次。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述真菌是真菌界壶菌门的一员。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述的真菌界壶菌门成员选自由壶菌目、裂壶菌目、Rhizophydiales、Lobulomycetales、Cladochytriales、集壶菌目和单毛壶菌目组成的组。
128.如权利要求125所述的方法，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、福美双、百菌清、二噻农、多果定、和二溴氰基乙酰胺组成的组。
129.如权利要求125所述的方法，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
130.如权利要求125所述的方法，其中所述生长天数选自以下组成的组，在所述接种后的15天或更多,30天或更多,45天或更多,60天或更多,90天或更多,120天或更多,180天或更多,250天或更多,500天或更多,1000天或更多,1500天或更多和2000天或更多。
131.如权利要求125所述的方法，进一步包括提供一种或多种附加数量的所述杀真菌剂以维持所述杀真菌剂在所述生长后的有效浓度。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述有效浓度选自由每百万0.5份（ppm），1.0ppm，2.0ppm，5.0ppm，10ppm，和10ppm以上组成的组。
133.一种含有微藻和杀真菌剂的液体系统，其中所述微藻是转基因微藻。
134.如权利要求133所述的液体系统，其中所述的转基因微藻选自由衣藻、微绿球藻、链带藻、栅藻和螺旋藻组成的组。
135.如权利要求133所述的液体系统，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、福美双、百菌清、二噻农、多果定、和二溴氰基乙酰胺组成的组。
136.如权利要求133所述的液体系统，其中所述杀真菌剂选自由氟啶胺、唑菌胺酯、多果定、和福美双组成的组。
137.如权利要求133所述的液体系统，其中所述系统在使用所述微藻接种所述液体系统后的10天或更多天后，提供所述微藻的生长。
138.如权利要求137所述的液体系统，其中所述系统提供微藻的生长天数选自以下组成的组，在接种后的15天或更多,30天或更多,45天或更多,60天或更多,90天或更多,120天或更多,180天或更多,250天或更多,500天或更多,1000天或更多,1500天或更多和2000天或更多。
139.如权利要求133所述的液体系统，其中所述系统补充CO2。
140.如权利要求131所述的液体系统，其中所述液体系统是开放式室外培养系统。
141.如权利要求140所述的方法，其中所述开放式室外系统的体积至少具有20,000L,40,000L,80,000L,100,000L,150,000L,200,000L,250,000L,500,000L,600,000L,1,000,000L,10,000至20,000L,10,000至40,000L,10,000至80,000L,10,000至100,000L,10,000至150,000L,10,000至200,000L,10,000至250,000L,10,000至500,000L,10,000至600,000L,10,000至1,000,000L，20,000至40,000L,20,000至80,000L,20,000至100,000L,20,000至150,000L,20,000至200,000L,20,000至250,000L,20,000至500,000L,20,000至600,000L,20,000至1,000,000L,40,000至80,000L,40,000至100,000L,40,000至150,000L,40,000至200,000L,40,000至250,000L,40,000至500,000L,40,000至600,000L,40,000至1,000,000L,80,000至100,000L,80,000至150,000L,80,000至200,000L,80,000至250,000L,80,000至500,000L,80,000至600,000L,80,000至1,000,000L,100,000至150,000L,100,000至200,000L,100,000至250,000L,100,000至500,000L,100,000至600,000L,100,000至1,000,000L,200,000至250,000L,200,000至500,000L,200,000至600,000L,200,000至1,000,000L,250,000至500,000L,250,000至600,000L,250,000至1,000,000L,500,000至600,000L,和500,000至1,000,000L。
142.如权利要求140所述的方法，其中所述开放式室外培养系统具有面积选自至少0.25英亩,至少0.5英亩,至少1.0英亩,至少1.5英亩,至少2.0英亩,至少2.5英亩,至少5.0英亩,7.5或更多英亩,0.25至0.5英亩,0.25至1.0英亩,0.25至1.5英亩,0.25至2.0英亩,0.25至2.5英亩,0.25至5.0英亩,0.25至7.5英亩,0.5至1.0英亩,0.5至1.5英亩,0.5至2.0英亩,0.5至2.5英亩,0.5至5.0英亩,0.5至7.5英亩,1.0至1.5英亩,1.0至2.0英亩,1.0至2.5英亩,1.0至5.0英亩,1.0至7.5英亩,2.0至2.5英亩,2.0至5.0英亩,2.0至7.5英亩,2.5英亩至5.0英亩,2.5至7.5英亩。
143.如权利要求140所述的方法，其中所述液体系统是连续培养系统。
144.如权利要求143所述的方法，其中所述连续培养系统提供所述微藻在对数生长期的连续生长。
145.检测壶菌游动孢子FD100的方法，包括：
获取样品；
使用一对寡核苷酸引物在所述样品上进行聚合酶链式反应，该引物能够扩增核酸分子，该核酸分子具有选自由SEQ ID NOs:1-6，或其互补组成的组的序列。
146.如权利要求145所述的方法，其中所述寡核苷酸引物对的一个引物是兼并引物。
147.如权利要求146所述的方法，其中所述寡核苷酸引物对的两个引物都是兼并引物。
148.如权利要求145所述的方法，进一步包括第三寡核苷酸引物。
149.如权利要求145所述的方法，其中所述寡核苷酸引物对包括SEQ ID NOs:28和29的序列，或其互补。
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