CN104981149B

CN104981149B - 表达ein2的抗真菌植物

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Publication number: CN104981149B
Application number: CN201480006242.XA
Authority: CN
Inventors: H·舒尔塞斯; R·弗拉赫曼; T·门采尔
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: US20190166780A1; CN104981149A; WO2014118018A1; US20150353956A1; AR095008A1; CA2891424A1; US10231397B2; US10925223B2

Abstract

本发明涉及在植物和/或植物细胞中增加对层锈菌科(Phacopsoraceae)的真菌病原体抗性的方法。这通过与野生型植物、野生型植物部分和/或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分和/或植物细胞中EIN2蛋白或其片段的表达来实现。此外，本发明涉及具有对真菌病原体特别是层锈菌科病原体增强抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞，以及包含与EIN2蛋白编码序列相同或同源的序列的重组表达载体。

Description

表达EIN2的抗真菌植物

本申请要求2013年1月29日递交的EP 13152968.7的优先权，EP 13152968.7就其全部内容通过参考引用并入本文。

技术领域

本发明涉及，在植物、植物部分和/或植物细胞中增加对真菌病原体，特别是层锈菌科(Phacopsoraceae)病原体例如大豆锈病，抗性的方法。这通过与野生型植物、野生型植物部分和/或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分和/或植物细胞中EIN2蛋白的表达和/或活性来实现。

此外，本发明涉及对真菌病原体，特别是层锈菌科病原体例如大豆锈病，具有增强抗性的转基因植物、植物部分和/或植物细胞，以及包含与EIN2蛋白编码序列相同或同源的序列的重组表达载体。

发明背景

农作物的栽培主要用于为人类和动物生产食物。特别是目前惯常的单种栽培对病害的流行性传播高度易感。结果是明显降低的产量。迄今，主要通过使用农药(pesticides)来控制致病微生物。如今，人们也可以直接修饰植物或病原体的遗传倾向。

抗性通常指植物防止或至少抑制有害病原体侵染和定植的能力。天然抗性可以被识别为不同的机制，植物利用这些机制抵挡植物病原生物体的定植。病原体和寄主之间的这些特定相互作用决定了感染的过程(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie,Springer Verlag,Ber-lin-Heidelberg,德国)。

关于小种专化抗性，也称为寄主抗性，可以区分为亲和(compatible)与非亲和(incompatible)相互作用。对于亲和互作，相互作用发生在毒性病原体和易感植物之间。病原体存活下来，并可以建立繁殖结构，而寄主大部分相继死亡。另一方面，当病原体感染植物但其生长在出现弱的症状之前或之后即受到抑制(主要通过NBS-LRR家族的R基因，见下文)时，则发生非亲和互作。在后一情况下，植物对相应的病原体具有抗性(Schopfer和Brennicke,见上引文)。然而，这类抗性是特异性针对某一株系或病原体的。

在亲和与非亲和互作中都发生寄主对病原体的防御性和特异性反应。然而，在自然界中，由于病原体快速进化形成新的毒性小种，该抗性常常被克服(Neu等(2003)American Cytopathol.Society,MPMI 16No.7:626-633)。

大多数病原体是植物物种特异性的。这意味着能够诱导某一植物物种发生病害的病原体并不诱导其它植物物种发生病害(Heath(2002)Can.J.Plant Pathol.24:259-264)。某些植物物种中对病原体的抗性被称为非寄主抗性。非寄主抗性提供了对植物病原体强的、广泛的和持久的防护。导致产生非寄主抗性的基因在非寄主植物中提供了对某些病害强的、广泛的和持久的防护的机会。特别地，这样的抗性对病原体的不同株系起作用。

真菌遍布世界各地。迄今，已经知道大约100000种不同的真菌物种。其中锈病非常重要。它们可以具有复杂的发育周期，多达5个不同的孢子阶段(性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子)。

在植物遭受病原性真菌感染期间，通常可以观察到不同的阶段。植物病原性真菌与其潜在的寄主植物之间相互作用的第一个阶段对真菌定植到植物中具有决定作用。在感染的第一个阶段，孢子附着到植物的表面，萌发，真菌侵入植物中。真菌可以通过已有孔口例如气孔、皮孔、水孔(hydatodes)和伤口侵入植物，或者它们可以通过机械压力以及借助细胞壁消化酶直接穿透植物表皮。特定的感染结构被发展出来用于侵入植物。

在识别潜在的病原体后，植物立即开始引发防御反应。病原体的存在大多数通过所谓的PAMP受体感知，PAMP受体是一类识别保守的病原体相关分子(例如，鞭毛蛋白或几丁质)的跨膜受体样激酶。在PAMP受体的下游，植物激素水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)在不同防御反应的调节中起关键作用。根据不同植物激素的比率，寄主细胞诱导出不同的防御反应。通常，SA依赖的防御反应与抗活体营养型病原体抗性相关，而JA/ET依赖的防御反应大多针对死体营养型病原体(以及昆虫)。

另一种更特异的抗性机制基于存在所谓的抗性基因(R基因)。大多数R基因属于核苷酸结合位点-富亮氨酸重复(NBS-LRR)基因家族，在监视病原体效应物蛋白(毒力因子；无毒因子)的存在中起作用。在识别到来源于病原体的蛋白后，诱导出强的防御反应(大多数伴随着程序性细胞死亡)。

大豆锈病豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)直接穿透植物表皮。在跨过表皮细胞后，真菌到达叶肉的细胞间隙，在那里真菌开始通过叶片扩散。为了获得营养，真菌渗入叶肉细胞并在叶肉细胞中形成吸器。在侵入过程中，被侵入的叶肉细胞的质膜保持完整。由此，大豆锈病真菌与大豆建立了活体营养型相互作用。

活体营养型植物致病真菌，例如大豆锈病菌及所有其它锈病真菌，在其营养上依赖于植物活细胞的新陈代谢。这类真菌属于活体营养型真菌类群，如其它锈病真菌，白粉病真菌、或卵菌病原体例如疫霉属(Phytophthora)或霜霉属(Peronospora)。死体营养型植物致病真菌在其营养上依赖于植物的死细胞，例如来自镰孢属(Fusarium)、丝核菌属(Rhizoctonia)或球腔菌属(Mycospaerella)的种。大豆锈病菌处于中间位置，因为其直接渗入到表皮中，被渗入的细胞随后坏死。在渗入后，该真菌变换至专性活体营养型生活方式。主要遵照这样的感染策略的活体营养型真菌病原体亚群是半死体营养型。与半死体营养型病原体相比，半活体营养型病原体以活体营养型方式生活一段短时间，随后开始杀死寄主细胞和/或寄主生物，即其剩下的生命周期变换至死体营养型生活方式。

近来大豆锈病越来越重要。该病可由活体营养型锈病菌豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)引起。它们属于担子菌纲(Basidiomycota)、锈菌目(Uredinales)、层锈菌科(Phakopsoraceae)。这两类锈病菌都感染广谱的豆科植物寄主。豆薯层锈菌(P.pachyrhizi)，也被称为亚洲锈病菌，是对大豆(Glycine max)具有较高侵略性的病原体，由此至少在目前，其在农业上非常重要。可在世界上几乎所有的热带和亚热带大豆种植区发现豆薯层锈菌(P.pachyrhizi)。豆薯层锈菌(P.pachyrhizi)在自然条件下能够感染豆科(Leguminosae)17个科的31个种，在受控条件下还能够在另外60个种中生长(Sinclair等(eds.),Proceedings of the rust workshop(1995),National SoyaResearch Laboratory,Publication No.1(1996)；Rytter J.L.等,Plant Dis.87,818(1984))。山马蝗层锈菌(P.meibomiae)在加勒比海盆地和波多黎各被发现，迄今还没有导致重大的破坏。

目前，只能利用杀真菌剂在大田中控制豆薯层锈菌。还未得到对全部分离菌具有抗性的大豆植物。在寻找抗性大豆登记种(accessions)时，通过筛选数千个大豆品种，发现了NBS-LRR家族的6个显性R基因，命名为Rpp1-5和Rpp？(Hyuuga)，它们介导大豆对豆薯层锈菌(P.pachyrhizi)的抗性。由于R基因来源于寄主(大豆)，当豆薯层锈菌(P.pachyrhizi)产生新的毒性小种时，抗性就会很快失去。因此，亟需找到来源于非寄主植物(例如，拟南芥)的R基因，因为它们被认为更持久。

近年来，真菌病害例如大豆锈病在农业生产中作为病害越来越重要。因此，在本领域需要开发控制真菌和提供抗真菌植物的方法。

在感染植物表皮层的白粉病和霜霉病方面已进行了许多研究。然而，关于感染叶肉的大豆锈病的应对问题仍然未得到解决。

本发明的目的包括，提供增强抗真菌病原体抗性，优选抗锈病病原体(即，锈菌目(Pucciniales)的真菌病原体)，优选抗层锈菌科(Phacopsoraceae)的真菌病原体，更优选抗层锈菌属(Phacopsora)的真菌病原体，最优选抗豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)(也称为大豆锈病)抗性的方法。

令人惊奇的是，我们发现可以通过增加EIN2蛋白的表达来控制真菌病原体，特别是层锈菌科(Phacopsoraceae)的真菌病原体，例如大豆锈病。

因此，本发明提供了，通过过表达一个或多个EIN2核酸，在转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞中增强对真菌病原体的抗性，优选抗锈病病原体(即，锈菌目真菌病原体)，优选抗层锈菌科真菌病原体，更优选抗层锈菌属真菌病原体，最优选抗豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈病)抗性的方法。

另一个目的是，提供抗真菌病原体，优选抗锈病病原体(即，锈菌目真菌病原体)、优选抗层锈菌科真菌病原体、更优选抗层锈菌属真菌病原体，最优选抗豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈病)的转基因植物，用于生产这样的植物的方法以及用于上述方法的载体构建体。

因此，本发明也涉及包含外源EIN2核酸的重组载体构建体和转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。此外，使用本发明的核酸生产转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法也在本发明范围内。此外，本发明的核酸或重组载体用于转化植物、植物部分或植物细胞的用途也在本发明范围中。

如以上所概述的，本发明目的通过主权利要求的主题得以实现。本发明的优选实施方案由从属权利要求的主题定义。

发明概述

本发明目的包括，提供增强抗真菌病原体抗性，优选抗锈病病原体(即，锈菌目(Pucciniales)的真菌病原体)，优选抗层锈菌科(Phacopsoraceae)的真菌病原体，更优选抗层锈菌属(Phacopsora)的真菌病原体，最优选抗豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)(也称为大豆锈病菌)抗性的方法。

令人惊奇的是，我们发现，可以通过增加EIN2蛋白的表达来增强对真菌病原体，特别是层锈菌科(Phacopsoraceae)的真菌病原体(例如大豆锈病)的抗性。

因此，本发明提供，通过过表达一个或多个EIN2核酸，在转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞中增强对真菌病原体的抗性的方法，其中优选抗锈病病原体(即，锈菌目(Pucciniales)的真菌病原体)，优选抗层锈菌科(Phacopsoraceae)的真菌病原体，更优选抗层锈菌属(Phacopsora)的真菌病原体，最优选抗豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)(也称为大豆锈病)的抗性。

因此，本发明也涉及包含外源EIN2核酸的重组载体构建体和转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。此外，使用本发明的核酸生产转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法也在本发明范围中。此外，本发明的核酸或重组载体用于转化植物、植物部分或植物细胞的用途也在本发明范围中。

如以上所概述的，本发明的目的通过主权利要求的主题来实现。本发明的优选实施方案由从属权利要求的主题定义。

附图简述

图1显示，针对锈病真菌豆薯层锈菌(P.pachyrhizi)，用于确定野生型和转基因大豆植物的患病叶面积水平的评分系统(如GODOY,C.V.,KOGA,L.J.&CANTERI,M.G.Diagrammatic scale for assessment of soybean rust severity.FitopatologiaBrasileira 31:063-068.2006中所描述)。

图2显示包含在欧芹泛素启动子控制下的EIN2片段DNA的植物转化载体的示意图。

图3显示实施例中使用的拟南芥EIN2基因组序列(AT5G03280,TAIR登录号4515110756,SEQ ID NO:6)、推定的EIN2 CDS(源自基因组序列；登录号NM_120406,SEQ IDNO:4)、EIN2的C末端片段的CDS(Alonso等(1999)Science 284(5423):2148-52,SEQ ID NO:2)和EIN2片段的序列(SEQ ID NO:1)的比对。

图4显示拟南芥EIN2全长蛋白(登录号NP_195948,SEQ ID NO:5)和EIN2片段蛋白(SEQ ID NO:3)的比对。

图5显示拟南芥(Arabidopsis thaliana)EIN2片段基因的核苷酸序列SEQ ID NO:1。

图6显示来自SEQ ID NO:1中显示的EIN2片段核苷酸序列的EIN2片段蛋白序列(SEQ ID NO:3)。

图7显示全长EIN2序列(登录号NM_120406)的核苷酸序列，SEQ ID NO:4。

图8显示全长EIN2蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO:5。

图9显示表达EIN2片段过表达载体构建体的36个转基因大豆植株(来自5个独立事件，每个事件6-9株植物)的评分结果。以豆薯层锈菌的孢子接种表达EIN2片段蛋白(SEQ IDNO:3)的T₁大豆植物。接种后14天，对所有叶片上的患病叶面积进行评估。所有叶片上表现出真菌菌落或强黄化/褐化的叶面积的平均百分比被视为患病叶面积。所有36个表达EIN2片段(通过RT-PCR检测到表达)的大豆T₁植物与非转基因对照植物平行地进行评估。患病叶面积的平均值显示于图9中。与非转基因对照植物相比，EIN2片段蛋白的过表达显著(**:p<0.01)减少了患病叶面积，减少38.8％。

图10包含对序列表中的序列的简要描述。

发明详述

通过参考以下对本发明优选实施方案的详细描述和本文中包括的实施例，可以更容易理解本发明。

定义

除非另有说明，本文中所使用的术语应该依照相关领域普通技术人员的惯常用法来理解。除了本文中提供的术语定义以外，分子生物学中常用术语定义也可参见Rieger等,1991Glossary of genetics:classical and molecular,第5版,Berlin:Springer-Verlag；以及Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等编辑,CurrentProtocols,a joint ven-ture between Greene Publishing Associates,Inc.and JohnWiley&Sons,Inc.,(1998增刊)。

应理解的是，如说明书和权利要求中所使用的，取决于其使用的上下文，“a”(一个)或“an”(一个)可以指一个或多个。因此，例如，提到“一个细胞”时可以指使用了至少一个细胞。应理解的是，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方案目的，其并不旨在进行限制。

整个申请参考了多份出版物。所有这些出版物的公开内容和这些出版物中引用的参考文献就其全部内容通过参考引用并入本申请，以对本发明所属领域的状况进行更详细的描述。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶促反应的标准技术，以及各种分离技术为本领域技术人员已知和普遍使用的技术。Sambrook等,1989Molecular Cloning,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,N.Y.；Maniatis等,1982Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory,Plainview,N.Y.；Wu(编辑)1993Meth.Enzy-mol.218,第1部分；Wu(编辑)1979Meth Enzymol.68；Wu等(编辑)1983Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编辑)1980Meth.En-zymol.65；Miller(编辑)1972Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；Old和Primrose,1981Principles of Gene Manipulation,University of California Press,Berkeley；Schleif和Wensink,1982Practical Methods in Molecular Biol-ogy；Glover(编辑)1985DNA Cloning第1和第2卷,IRL出版社,Oxford,UK；Hames和Higgins(编辑)1985NucleicAcid Hybridization,IRL出版社,Oxford,UK；以及Setlow和Hollaender 1979GeneticEngineering:Principles and Methods,第1-4卷,Plenum出版社,New York中描述了大量标准技术。使用的缩写和命名被视为本领域中的标准用法，并在专业期刊例如本文中所引用的那些期刊中广泛使用。

蛋白质的“同源物”涵盖肽、寡肽、多肽、蛋白质和/或酶，其相对于所讨论的未经修饰蛋白质，具有氨基酸替换、缺失和/或插入，并且与其源自的未经修饰蛋白质具有相似的功能活性。

核酸的“同源物”涵盖相对于所述未经修饰的核酸具有核酸替换、缺失和/或插入的核苷酸和/或多核苷酸，其中由这样的核酸编码的蛋白质与由该核酸所源自的未经修饰的核酸编码的未经修饰的蛋白质具有类似的功能活性。特别地，核酸的同源物可以涵盖基于简并氨基酸密码的替换。

术语“同一性”、“同源性”和“相似性”在本文中可互换使用。两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的“同一性”或“同源性”和“相似性”在每种情况下均就相应的EIN2核酸序列或EIN2氨基酸序列的全长而言。

优选地，按以下方法计算“序列同一性百分比”：比较两个最优比对的序列的特定区域，确定出现在两个序列中的一致碱基或氨基酸的位置的数目以得到匹配的位置数，以该位置数除以所比较的区域中位置的总数，将结果乘以100。

用于序列比较的比对方法在本领域熟知，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch的算法((1970)J.Mol.Biol.48:443-453)来寻找使两序列之间的匹配数最大化且空位数最小化的全局(即跨越完整序列)的比对。BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215:403-10)计算序列同一性或相似性或同源性百分比，并对两序列之间的同一性或相似性或同源性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。同源物可以例如，使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的成对比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软件包(Campanella等,(2003)BMC Bioinformatics,10:29.2003Jul10；4:29.MatGAT:an application that generates similar-ity/identity matricesusing protein or DNA sequences)的方法之一，也可以确定全局相似性/同源性/同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定的结构域。可以利用上述程序，采用默认参数，针对完整核酸或氨基酸序列或者选择的结构域或保守基序来确定序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。

也可以通过使用Clustal方法(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensi-tivemultiple sequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Bio-sci.1989Apr；5(2):151-1)的Informax(美国)公司的Vector NTI Suite 7.1程序，采用下列设置，计算序列的同一性：

多重比对参数：

空位开放罚分 10

空位延伸罚分 10

空位分离罚分距离(gap separation penalty range) 8

空位分离罚分关闭

比对延迟的％同一性(％identity for alignment delay) 40

残基特异性空位关闭

亲水残基空位关闭

过渡权重 0

成对比对参数：

FAST算法开启

K-tuple大小 1

空位罚分 3

窗口大小 5

最佳对角线数目(number of best diagonals) 5

可选地，可以根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tada-shi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D.Multiple sequencealignment with the Clustal series of programs.(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500,网页:http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#，和以下设置确定同一性：

DNA空位开放罚分 15.0

DNA空位延伸罚分 6.66

DNA矩阵 Identity

蛋白质空位开放罚分 10.0

蛋白质空位延伸罚分 0.2

蛋白质矩阵 Gonnet

蛋白质/DNA ENDGAP -1

蛋白质/DNA GAPDIST 4

可以利用本领域已知的序列比较和比对算法(见Gribskov和Devereux,SequenceAnalysis Primer,Stockton出版社,1991及其中引用的参考文献)，以及采用例如BESTFIT软件程序中执行的Smith-Waterman算法使用默认参数(例如University of WisconsinGenetic Computing Group)计算核苷酸或蛋白质序列之间的百分比差异，以优化根据本发明有用的核酸或蛋白与EIN2核酸或EIN2蛋白之间的序列同一性。

“缺失”指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸或从DNA、ssRNA和/或dsRNA中除去一个或多个核酸。

“插入”是指将一个或多个氨基酸残基或核酸残基引入到蛋白质或核酸的预定位点。

“替换”是指蛋白质中的氨基酸被具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其它氨基酸取代。

在核酸水平上，替换指核酸中一个或多个核苷酸被其它核苷酸取代，其中由经修饰的核酸编码的蛋白质具有相似的功能。特别地，核酸的同源物涵盖基于简并氨基酸密码的替换。

氨基酸替换一般是单残基的替换，但是视施加于蛋白质上的功能性限制而定也可以是成簇替换，并且可以是1到10个氨基酸；插入或缺失通常在大约1到10个氨基酸残基的数量级。氨基酸替换优选为保守氨基酸替换。保守替换表在本领域公知(参见例如TaylorW.R.(1986)The classification of amino acid conservation J Theor Biol.,119:205-18和下表1)。

表1：保守氨基酸替换的实例

残基	保守替换	残基	保守替换
				A	G,V,I,L,M	L	M,I,V,A,G
C	S,T	N	Q
				E	D	Q	N

D	E	P
				G	A,V,I,L,M	S	T,C
F	Y,W	R	K,H
				I	V,A,G,L,M	T	S,C
H	R,K	W	Y,F
				K	R,H	V	I,A,G,L,M
M	L,I,V,A,G	Y	F,W

可使用本领域公知的肽合成技术，例如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作，容易地进行氨基酸替换、缺失和/或插入。

用于产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的DNA序列操作方法为本领域熟知。例如，本领域的技术人员熟知在DNA预定位置进行替换突变的技术，包括M13诱变、T7-基因体外诱变(USB,Cleveland,OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene,San Diego,CA)、PCR介导的定点诱变或其它定点诱变方案。

直向同源物和旁系同源物涵盖用于描述基因的祖先关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内的基因，其起源自祖先基因的复制；而直向同源物为来自不同生物体的基因，其通过物种形成起源，并且也源自于共同的祖先基因。

术语“编码”用来指，核酸通过遗传密码(即连续的密码子，每个密码子为3核苷酸序列)而包含蛋白质的氨基酸序列信息的能力，其中遗传密码规定在蛋白质合成中下一步加入哪个氨基酸。术语“编码”由此包括核酸所有可能的阅读框。此外，术语“编码”也适用于其编码序列被非编码核酸序列(该非编码核酸序列在翻译前被移去)中断的核酸，例如包含内含子的核酸序列。

术语“结构域”指进化上相关的蛋白质的序列比对中一组在特定位置上保守的氨基酸。虽然同源物之间其它位置上的氨基酸可以不同，但在特定位置上高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能上可能必不可少的氨基酸。

存在用于鉴定结构域的专门数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,5857-5864；Letunic等(2002)Nucleic Acids Res 30,242-244)、InterPro(Mulder等,(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifsand its function in automatic sequence in-terpretation.(In)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings 2nd International Conference onIntelligent Systems for Mo-lecular Biology)Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.编辑,53-61页,AAAIPress,Menlo Park；Hulo等,Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或者Pfam(Bateman等,Nucleic Acids Research30(1):276-280(2002))。可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得一组用于蛋白质序列的硅片(in silico)分析的工具(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)(Gasteiger等ExPASy:the proteomics server for in-depth protein knowledge andanalysis.Nucleic Acids Res 31:3784-3788(2003))。也可以利用常规技术例如通过序列比对来鉴定结构域或基序。

如本文中使用的术语“真菌抗性”、“抗真菌”和/或“真菌抗性的”指，减轻、防止或延迟真菌感染。术语“抗性”指真菌抗性。抗性不意味着植物必须对感染具有100％的抗性。在优选实施方案中，增强或增加真菌抗性意指，与野生型植物相比，抗性植物中的抗性高于10％、高于20％、高于30％、高于40％、高于50％、高于60％、高于70％、高于80％、高于90％或高于95％。

如本文中使用的术语“大豆锈病抗性”、“抗大豆锈病”、“大豆锈病抗性的”、“锈病抗性”、“抗锈病”或“锈病抗性的”意指，与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，减轻或防止或延迟植物、植物部分或植物细胞被层锈菌科真菌(Phacopsoracea)、尤其是豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)(也被称为大豆锈病或亚洲大豆锈病(ASR))感染。抗性不意味植物必须对感染具有100％的抗性。在优选实施方案中，增强或增加锈病抗性意指，与不抗大豆锈病的野生型植物相比，抗性植物中的锈病抗性高于10％、高于20％、高于30％、高于40％、高于50％、高于60％、高于70％、高于80％、高于90％或高于95％。优选地，野生型植物与具有增加的大豆锈病抗性的植物具有相似的、更优选相同的基因型，但不包含外源EIN2核酸、其功能性片段和/或能与EIN2核酸杂交的外源核酸。

植物的真菌抗性水平可用多种方法确定，例如通过评分/测量相对于总叶面积的受感染的叶面积。确定抗性水平的另一个可能方案是对植物上的大豆锈病菌落的数量进行计数或测量由这些菌落产生的孢子的量。另一种分析真菌侵袭程度的方法是通过定量(q)PCR特异性测量锈病菌DNA的量。用于大部分真菌病原体的特异性探针和引物序列可在文献中获得(Frederick RD,Snyder CL,Peterson GL等，2002Polymerase chain reactionassays for the detection and discrimination of the rust pathogens Phakopsorapachyrhizi and P.meibomiae,Phytopathology 92(2)217-227)。

如本文所用的术语“杂交”包括“使核酸分子链通过碱基配对与互补链结合的任何过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,New York)。杂交和杂交强度(即核酸分子之间缔合的强度)受诸如核酸分子之间的互补性程度、所涉及条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸分子内的G:C比例等因子的影响。

如本文所用，术语“Tm”用于指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群一半解离成单链的温度。本领域熟知计算核酸分子的Tm的公式。如标准参考文献所示，当核酸分子在1M NaCl的水溶液中时，Tm值的简单估计可用以下公式计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)(参见例如Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic AcidHybridization(1985))。其它参考文献包括更复杂的计算，其在Tm的计算中考虑结构和序列特征。本领域技术人员熟知严格条件，可见于Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。

特别地，术语“严格条件”指这样的条件，其中作为互补核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)的片段或与互补核酸分子相同的100个连续核苷酸或更多、150个连续核苷酸或更多、200个连续核苷酸或更多或者250个连续核苷酸或更多在下述条件下与特定核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)杂交，所述条件等价于在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，用2X SSC、0.1％SDS于50℃或65℃、优选于65℃洗涤。优选地，杂交条件等价于在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，用1X SSC、0.1％SDS于50℃或65℃、优选于65℃洗涤；更优选地，杂交条件等价于在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中于50℃杂交，用0.1X SSC、0.1％SDS于50℃或65℃、优选于65℃洗涤。优选地，互补核苷酸与整个EIN2核酸或其片段杂交。可选地，优选的杂交条件涵盖于1x SSC中在65℃或于1x SSC和50％甲酰胺中在42℃杂交并随后于0.3x SSC中65℃洗涤，或者于4x SSC中在50℃或于6x SSC和50％甲酰胺中在40℃杂交并随后于2x SSC中在50℃洗涤。其它优选的杂交条件为0.1％SDS、0.1SSD和65℃。

除非上下文另有明确说明，术语“植物”旨在涵盖处于成熟或发育的任何阶段的植物，以及取自或源自任何此类植物的任何组织或器官(植物部分)。植物部分包括但不限于植物细胞、茎、根、花、胚珠、雄蕊、种子、叶、胚、分生区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体、发根培养物和/或等等。本发明也包括由本发明的植物生产的种子。优选地，种子包含外源EIN2核酸。在一个实施方案中，种子可以发育成与植物种子的野生型品种相比具有增加的真菌感染抗性的植物。如本文所用“植物细胞”包括但不限于原生质体、产配子细胞和可以再生成整株植物的细胞。本领域熟知并广泛公开多种植物组织的组织培养物和从其进行的植物再生。

本文提及的“内源”核酸和/或蛋白质指，所讨论的核酸和/或蛋白质以其天然形式存在于植物中(即，没有经任何人为干预)。

术语“外源”核酸指利用遗传技术已引入到植物中的核酸。“外源”核酸可以以非天然形式存在于植物中，不同于以天然形式存在于植物中的所讨论的核酸，或者可以与以天然形式存在于植物中的核酸相同，但不整合在其天然的遗传环境中。“外源性”的相应含义适用于蛋白质表达的上下文中。例如，与内源基因的表达相比，含有转基因(即外源核酸)的转基因植物可以出现相应基因或蛋白质的总体表达的实质性增加。根据本发明的转基因植物可以包括整合在任何遗传基因座上的外源EIN2核酸，和可选地，植物还可以包括处于天然遗传背景中的内源基因。

出于本发明的目的，对于例如包含任何一个或多个EIN2核酸的核酸序列、核酸分子、表达盒或载体构建体，“重组”表示所有这些构建体人为地通过遗传技术方法产生，其中

(a)EIN2核酸序列或其部分，或

(b)与本发明的EIN2核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)a)和b)

不位于其天然遗传环境或己人为地通过遗传技术方法进行了修饰。修饰可采取例如替换、增加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境应理解为意指，原始植物中的天然基因组或染色体座位、或存在于基因组文库中、或者与天然启动子的组合。

例如，天然存在的表达盒——例如编码本发明方法中可用蛋白质的核酸序列的天然启动子与该相应的核酸序列的天然组合(如上定义)——当通过非天然的、合成(“人工”)的方法例如诱变处理而修饰后，将变成重组表达盒。合适的方法描述于例如US 5,565,350,WO 00/15815或US200405323中。此外，天然存在的表达盒——例如编码本发明方法中可用蛋白质的核酸序列的天然启动子与该相应的核酸序列的天然组合(如上定义)——当未整合于天然遗传环境而是整合于不同的遗传环境中时，变成重组表达盒。

术语“分离的核酸”或“分离的蛋白质”指不位于其天然遗传环境，特别是其天然的细胞环境的核酸或蛋白质。因此，分离的核酸或分离的蛋白质基本上与其天然环境的其它组分分离。然而，本领域技术人员知道，视所使用的分离程序而定，分离的核酸或分离的蛋白质的制备物可出现一定程度的杂质。本领域熟知用于纯化核酸和蛋白质的方法。分离的基因可以从生物体分离或可以人工例如通过化学合成制备。在这点上，重组核酸也可以是分离的形式。

如本文中使用的，术语“转基因”指，生物体，例如植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分外源地含有，优选地通过非主要是生物学的方法(优选通过农杆菌转化)引入的，本文所述的核酸、重组构建体、载体或表达盒或其部分。重组构建体或其部分稳定地整合在染色体中，这使其可以通过克隆繁殖、营养繁殖或有性繁殖而传递给后续世代。优选的后续世代也是转基因的。主要是生物学的方法可以是植物杂交和/或天然重组。

出于本发明目的，转基因植物、植物细胞或组织应被理解为意指，利用遗传技术将包括一个或多个EIN2核酸的外源EIN2核酸、重组构建体、载体或表达盒整合到基因组中。

“野生型”植物、“野生型”植物部分或“野生型”植物细胞意指，所述植物、植物部分或植物细胞不表达外源EIN2核酸或外源EIN2蛋白质。

天然座位意指特定染色体上的位置，优选某些基因之间的位置，更优选与被转化的原始植物中相同的序列背景。

优选地，转基因植物、其植物细胞或组织表达本文中描述的EIN2核酸、EIN2构建体或EIN2表达盒。

术语“表达”或“基因表达”是指一个特定基因或多个特定基因或特定遗传载体构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别是指基因(一个或多个)或遗传载体构建体转录为结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，其中后者可以有或没有随后翻译为蛋白质。该过程包括DNA的转录和所获得的RNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”也包括mRNA的翻译和随之的编码蛋白质的合成，即蛋白质表达。

如本文所用的术语“增加的表达”或“增强的表达”或“过表达”或“增加内容物”表示，超出原野生型表达水平的任何形式的表达。为了本发明目的，原始野生型表达水平也可以为0(无表达)。

增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的文献记载，包括例如由适当的启动子驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调编码目的蛋白的核酸序列的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或替换，在体内改变内源启动子(见Kmiec,US 5,565,350；Zarling等,WO9322443)，或者可以将分离的启动子在相对于本发明基因的合适方向和距离引入植物细胞中，从而控制该基因的表达。

术语“功能片段”指，分别仅包含全长核酸或全长蛋白质的一部分、但相应地在植物中被表达或阻抑时仍提供相同功能(例如，真菌抗性)的任何核酸和/或蛋白质。优选地，片段包含原序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％。优选地，功能片段分别包含原核酸和/或原蛋白质中的连续核酸或氨基酸。在一个实施方案中，任何EIN2核酸的片段在相应EIN2核酸的至少20％、至少30％、至少50％、至少75％、至少90％的核苷酸长度上具有以上定义的同一性。

本文所用的术语“剪接变体”涵盖这样的核酸序列变体，其中选择的内含子和/或外显子已被切除、取代、置换或添加，或者其中内含子已被缩短或增长。因此，剪接变体可以有一个或多个或甚至所有内含子是被除去或添加的。按照该定义，cDNA可以被视为包含内含子的相应基因组序列的剪接变体，反过来也一样。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。预测和分离这类剪接变体的方法是本领域众所周知的(参见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics 6:25)。

在需要核酸过表达的情形中，术语“相似的功能活性”或“相似的功能”意指，任何同源物和/或片段在植物中表达时提供真菌抗性。优选地，相似的功能活性意指，与SEQ IDNO:1或2或4所定义的EIN2核苷酸序列的外源表达提供的功能活性相比，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％或更高的真菌抗性。

如本文所用的术语“增加的活性”或“增强的活性”意指，具有增加的活性并提供与仅表达相应内源EIN2核酸的野生型植物相比增加的真菌抗性的任何蛋白质。就过表达而言，为了本发明目的，原始野生型表达水平也可以为0(无表达)。

对于载体构建体和/或重组核酸分子，术语“有效连接”旨在指，待表达的核酸与调控序列(包括启动子、终止子、增强子和/或其它表达控制元件(例如多聚核苷酸化信号))以允许(例如，当将载体导入宿主植物细胞中时，在宿主植物细胞中)表达该核酸的方式连接。这类调控序列描述在例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic出版社,San Diego,CA(1990)以及Gruber和Crosby,in:Meth-ods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick和Thompson编著,第7章,89-108,CRC出版社:Boca Raton,Florida中，包括其中的参考文献。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的调控序列，和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞或某些条件下表达的调控序列。本领域技术人员将理解的是，载体的设计可取决于如下因素，例如待转化的宿主细胞的选择、所需核酸的表达水平等。

本文述及的术语“引入”或“转化”涵盖将外源多核苷酸转移进宿主细胞，而不考虑转移所用的方法。能够随后通过器官发生或者胚胎发生进行克隆繁殖的植物组织都可以使用本发明的载体构建体转化，并从其再生整个植物。具体的组织选择将因可获得的和最适于待转化的具体物种的克隆繁殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时地或稳定地引入宿主细胞，并且可以，例如作为质粒以非整合的状态维持。可选地，其可以整合进入宿主基因组。宿主基因组包括包含在核中的核酸以及包含在质体例如叶绿体和/或线粒体中的核酸。得到的转化植物细胞可以接着以本领域技术人员已知的方式再生为转化的植物。

术语“终止子”涵盖这样的控制序列，其是位于转录单位末端的DNA序列，发送对初级转录物进行3’加工和多聚腺苷酸化以及终止转录的信号。终止子可以源自天然基因、多种其它植物基因、或T-DNA。例如，待加入的终止子可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其它植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

发明详述

EIN2核酸

为实现对真菌病原体例如层锈菌科(Phacopsoraceae)的病原体(例如大豆锈病)增加的抗性而待过表达的EIN2核酸优选为编码EIN2蛋白的核酸，优选如SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34所定义的核酸，或其片段、同源物、衍生物、直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体。优选地，编码本发明的EIN2蛋白的核酸与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性或甚至100％序列同一性，或为其功能性片段或其剪接变体。最优选的是与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34至少90％同一性、至少92％、至少95％、至少97％，更优选的是至少98％或至少99％同一性。

优选地，为实现对真菌病原体例如层锈菌科(Phacopsoraceae)的病原体(例如大豆锈病)增加的抗性而待过表达的EIN2核酸优选为编码EIN2蛋白的核酸，优选如SEQ IDNO:2所定义的核酸，或其片段、同源物、衍生物、直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体。优选地，编码本发明的EIN2蛋白的核酸与SEQ ID NO:2具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性或甚至100％序列同一性，或为其功能性片段或其剪接变体。最优选的是与SEQ IDNO:2至少90％同一性、至少92％、至少95％、至少97％同一性，更优选的是至少98％或至少99％同一性。

更优选地，为实现对真菌病原体例如层锈菌科(Phacopsoraceae)的病原体(例如大豆锈病)增加的抗性而待过表达的EIN2核酸优选为编码EIN2蛋白的核酸，优选如SEQ IDNO:1所定义的核酸，或其片段、同源物、衍生物、直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体。优选地，编码本发明的EIN2蛋白的核酸与SEQ ID NO:1具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性或甚至100％序列同一性，或为其功能性片段或其剪接变体。最优选的是与SEQ IDNO:1至少92％、至少95％、至少97％同一性，更优选的是至少98％或至少99％同一性。

优选地，为实现对真菌病原体例如层锈菌科(Phacopsoraceae)的病原体(例如大豆锈病)增加的抗性而待过表达的EIN2核酸优选为编码EIN2蛋白的核酸，优选如SEQ IDNO:4所定义的核酸，或其片段、同源物、衍生物、直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体。优选地，编码本发明的EIN2蛋白的核酸与SEQ ID NO:4具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性或甚至100％序列同一性，或为其功能性片段或其剪接变体。最优选的是与SEQ IDNO:4至少90％、至少92％、至少95％、至少97％同一性，更优选的是至少98％或至少99％同一性。

优选地，EIN2核酸为分离的核酸分子，所述核酸分子由选自以下的核酸组成或包含选自以下的核酸：

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸、或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；

(ii)编码EIN2蛋白的核酸，所述EIN2蛋白包含按照递增的优选次序与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26所示的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列、或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；优选地，该EIN2蛋白具有与SEQ ID NO:1、2、4或6编码的EIN2蛋白基本上相同的生物活性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)在高严格杂交条件下与(i)或(ii)的任何核酸分子的互补序列杂交的核酸分子；优选编码EIN2蛋白的核酸分子；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:3或5中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选编码的蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和

(iv)与以上(i)至(iii)的EIN2核酸编码相同的EIN2蛋白、但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的EIN2核酸的核酸。

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸、或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；

(ii)编码EIN2蛋白的核酸，所述EIN2蛋白为按照递增的优选次序与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性、或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；优选地，该EIN2蛋白具有与SEQ ID NO:1编码的EIN2蛋白基本上相同的生物活性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

优选地，EIN2核酸为分离的核酸分子，所述核酸分子由EIN2C末端片段的编码序列或其片段组成，包含选自以下的核酸：

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1或2所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸、或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；

优选地，EIN2核酸为分离的核酸分子，所述核酸分子包含选自以下的核酸：

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:2或4所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸，或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码EIN2蛋白的核酸，所述EIN2蛋白为按照递增的优选次序与SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性、或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物；优选地，该EIN2蛋白具有与SEQ ID NO:2或4编码的EIN2蛋白基本上相同的生物活性；优选EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

核酸的同一性百分比就本文具体公开的序列中给出的整个核苷酸区域而述及。

优选EIN2核酸的部分为SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34中给出的核苷酸序列的长约1000-2000、约2000-2500、约2500-3000、约3000-3500、约3500-4000、约4000-4500、约4500-5000、约5000-5500或约5500-5900个核苷酸(优选连续核苷酸，优选从核酸的5’或3’末端开始计数)。

优选EIN2核酸包含SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34中所示核苷酸序列的至少约1000、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约4500、至少约5000、至少约5500、或至少约5900个核苷酸(优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’或3’末端开始计数)或直至其全长。

优选EIN2核酸包含SEQ ID NO:1、2、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34中所示核酸序列的至少约1000、至少约1500、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、或至少约2600个核苷酸(优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’或3’末端开始计数)或直至其全长。

优选EIN2核酸的部分为SEQ ID NO:1、2、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34中给出的核苷酸序列的长约1000-1500、约1500-2000、约2000-2100、约2100-2200、约2200-2300、约2300-2400、约2400-2500、约2500-2600、或约2600-2606个核苷酸(优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’或3’末端开始计数)。

优选EIN2核酸包含SEQ ID NO:4中所示核酸序列的至少约2000、至少约2500、至少约3000、至少约3100、至少约3200、至少约3300、至少约3400、至少约3500、至少约3600、至少约3700、或至少约3800个核苷酸(优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’或3’末端开始计数)或直至其全长。

优选EIN2核酸的部分为SEQ ID NO:4中给出的核酸序列的长约2000-2500、约2500-3000、约3000-3100、约3100-3200、约3200-3300、约3300-3400、约3400-3500、约3500-3600、约3600-3700、或约3700-3800、或约3800-3885个核苷酸(优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’或3’末端开始计数)。

优选地，EIN2核酸为EIN2核酸剪接变体。优选的剪接变体为SEQ ID NO:6所示核酸的剪接变体。作为SEQ ID NO:6的剪接变体的优选EIN2核酸显示于图3中。

优选地，EIN2核酸为分离的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:6的剪接变体，其中剪接变体选自：

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1、2或4所示核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸，或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；

(ii)编码EIN2蛋白的核酸，所述EIN2蛋白为按照递增的优选次序与SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性、或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；优选地，该EIN2蛋白具有与SEQ ID NO:1、2或4编码的EIN2蛋白基本上相同的生物活性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

优选的SEQ ID NO:6的剪接变体由SEQ ID NO:1、2或4中所示的任一核苷酸序列组成或包含该序列。最优选的为SEQ ID NO:1中显示的EIN2核酸剪接变体。

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:6所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸，或其剪接变体，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；

(ii)在高严格杂交条件下与(i)的任何核酸分子的互补序列杂交的核酸分子；优选编码EIN2蛋白的核酸分子；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:3或5中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选编码的蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和

(iii)与以上(i)至(ii)的EIN2核酸编码相同的EIN2蛋白、但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(ii)的EIN2核酸的核酸；

其中其剪接变体选自：

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1、2或4所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸，或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物；

(ii)编码EIN2蛋白的核酸，所述EIN2蛋白为按照递增的优选次序与SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性、或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物；优选地，该EIN2蛋白具有与SEQ ID NO:1、2、4或6编码的EIN2蛋白基本上相同的生物活性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

更优选地，EIN2核酸为分离的核酸分子，所述核酸分子包含选自以下的核酸：

按照递增的优选次序与SEQ ID NO:6所示的核酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸，或其剪接变体；

其中其剪接变体选自：

按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1、2或4所示的核酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸；优选SEQ ID NO:1。

本文中提到的所有核酸序列(单链和双链DNA与RNA序列，例如cDNA和mRNA)都能够通过化学合成从核苷酸结构单元以已知的方式产生，例如通过双螺旋的各重叠的、互补的核酸结构单元的片段缩合产生。可以例如以已知的方式，通过亚磷酰胺方法(Voet,Voet,第2版,Wiley Press,New York,第896-897页)进行寡核苷酸的化学合成。利用DNA连接酶的Klenow片段进行的合成寡核苷酸的累加和空位的填充、连接反应以及通用克隆技术描述于Sambrook等(1989)中，见下文。

本文中描述的EIN2核酸可以用于本发明的构建体、方法、植物、可收获部分和产品。

EIN2蛋白

EIN2蛋白优选为SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26定义的蛋白，或其片段、同源物、衍生物、直向同源物或旁系同源物。优选地，本发明的EIN2蛋白由这样的核酸编码，所述核酸为与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性、或其功能性片段。更优选地，本发明的EIN2蛋白与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性，或为其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物。最优选的是与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26至少90％同一性、至少92％、至少95％、至少97％同一性、更优选的是至少98％或至少99％序列同一性。

更优选地，本发明的EIN2蛋白与SEQ ID NO:3具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性，或为其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物。

更优选地，本发明的EIN2蛋白与SEQ ID NO:5具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性，或为其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物。

EIN2蛋白优选为SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26定义的蛋白，或其片段、同源物、衍生物、直向同源物或旁系同源物。优选地，本发明的EIN2蛋白由这样的核酸编码，所述核酸为与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性、或其功能性片段。更优选地，本发明的EIN2蛋白与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性，或为其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物。最优选的是与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26至少92％、至少95％、至少97％同一性、更优选的是至少98％或至少99％同一性。

优选地，EIN2蛋白为由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列的蛋白：

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26所示的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；优选该EIN2蛋白具有与SEQ ID NO:1、2、4或6编码的EIN2蛋白基本上相同的生物活性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；或

(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸为按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性、或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性。

优选地，EIN2蛋白为由EIN2C末端片段或其片段组成的蛋白，包含选自以下的氨基酸序列：

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；优选该EIN2蛋白具有与SEQ ID NO:1或2编码的EIN2蛋白基本上相同的生物活性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；或

(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸为按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1或2所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性。

优选地，EIN2蛋白为包含选自以下的氨基酸序列的蛋白：

(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸为按照递增的优选次序与SEQ ID NO:1或2所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物、或其剪接变体，其中序列的过表达赋予植物相对于对照植物增强的真菌抗性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性。

优选地，EIN2蛋白为包含选自以下的氨基酸序列的蛋白：

(i)按照递增的优选次序与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物；优选该EIN2蛋白具有与SEQ ID NO:4编码的EIN2蛋白基本上相同的生物活性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；或

(ii)由核酸编码的氨基酸序列，所述核酸为按照递增的优选次序与SEQ ID NO:4所示的核酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，或其功能性片段、衍生物、直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性。

EIN2蛋白的优选衍生物为由选自以下的氨基酸序列组成或包含选自以下的氨基酸序列的EIN2蛋白：

按照递增的优选次序与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26所示的氨基酸序列具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，

其中非一致的氨基酸残基为SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26的相应氨基酸残基的保守氨基酸替换，优选如表1中所示的替换；优选该EIN2蛋白具有与SEQ IDNO:3或5，或与SEQ ID NO:1、2、4或6编码的EIN2蛋白基本上相同的生物活性；优选该EIN2蛋白赋予相对于对照植物增强的真菌抗性。

优选地，EIN2蛋白由SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26所示的氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有一个或多个的SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26的相应氨基酸残基的保守氨基酸替换，优选如表1中所示的替换。优选地，SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、1-10、10-20、20-30、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、60-170、170-180、180-190、190-200、200-210、或210-220个氨基酸残基为SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26的相应氨基酸残基的保守氨基酸替换，优选如表1中所示的替换。

更优选地，EIN2蛋白由与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列组成或包含该氨基酸序列，其中至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115或至少120个非一致的氨基酸残基，或其中1-10、10-20、20-30、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、60-170、170-180、180-190、190-200、200-210或210-220个或甚至所有的非一致氨基酸残基为SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26的相应氨基酸残基的保守氨基酸替换，优选如表1中所示的替换。

多肽或蛋白质的同一性百分比就本文具体公开的整个氨基酸序列来表示。

优选地，EIN2蛋白包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1050、至少约1100、至少约1150、至少约1200、至少约1250或至少约1290个氨基酸残基(优选连续的氨基酸残基，优选从氨基酸序列的N末端或C末端开始计数)或直至其全长。

优选地，EIN2多肽包含SEQ ID NO:5所示核酸序列编码的任何氨基酸序列的约500-600、约600-700、约700-800、约800-900、约900-1000、约1050-1100、约1100-1150、约1150-1200或约1250-1294个氨基酸残基(优选连续的氨基酸残基，优选从氨基酸序列的N末端或C末端开始计数)或直至其全长。

优选地，EIN2蛋白包含SEQ ID NO:3、12、14、16、18、20、22、24或26中所示氨基酸序列的至少约500、至少约550、至少约600、至少约650、至少约700、至少约750、至少约800、或至少约840个氨基酸残基(优选连续的氨基酸残基，优选从氨基酸序列的N末端或C末端开始计数)或直至其全长。

优选地，EIN2多肽包含SEQ ID NO:3、12、14、16、18、20、22、24或26中所示核酸序列编码的任何氨基酸序列的约500-550、约550-600、约600-650、约650-700、约700-750、约750-800或约800-842个氨基酸残基(优选连续的氨基酸残基，优选从氨基酸序列的N末端或C末端开始计数)或直至其全长。

本文中描述的EIN2蛋白可以用于本发明的构建体、方法、植物、可收获部分和产品。

增加真菌抗性的方法；调节基因表达的方法

本发明的一个实施方案是，通过与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比增加EIN2蛋白或其功能性片段、直向同源物、旁系同源物或同源物的表达，来增加植物、植物部分和/或植物细胞中真菌抗性，优选对层锈菌科真菌(Phacopsoraceae)例如大豆锈病的抗性的方法。

本发明还提供，在植物或植物细胞中增加对抗真菌病原体，尤其是半死体营养型病原体，尤其是锈病病原体(即锈菌目(Pucciniales)的真菌病原体)，优选层锈菌科真菌病原体的抗性，优选抗层锈菌属真菌病原体，最优选抗豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称为大豆锈病)抗性的方法，其中与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，EIN2蛋白被过表达。

本发明还提供，通过过表达EIN2蛋白，在植物或植物细胞中增加抗层锈菌属真菌病原体抗性，最优选抗豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsorameibomiae)(也称为大豆锈病)抗性的方法。

在优选的实施方案中，与没有转化EIN2核酸的野生型植物相比较，植物中EIN2蛋白的蛋白量和/或功能增加了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％或更多。

在本发明的一个实施方案中，EIN2蛋白由核酸编码，所述核酸包含

(i)与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％、优选至少70％、例如至少75％、更优选至少80％、例如至少85％、更优选至少90％、例如至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、最优选99％同一性的外源核酸，或其功能性片段、或其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；或

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％同一性、优选至少70％、例如至少75％、更优选至少80％、例如至少85％、更优选至少90％、例如至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、最优选99％同源性的氨基酸序列，或其功能性片段、或其直向同源物或旁系同源物，优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)在严格条件下能够与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的外源核酸；优选编码EIN2蛋白的核酸；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:3或5中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；或

(iv)与以上(i)至(iii)的核酸编码相同的EIN2蛋白、但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外源核酸。

本发明的另一个实施方案为，通过增加EIN2蛋白或其功能性片段、直向同源物、旁系同源物或同源物、或其剪接变体的表达来增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性，优选抗层锈菌科真菌例如大豆锈病抗性的方法，其中EIN2蛋白由包含以下的核酸编码

(i)与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的外源核酸，或其功能性片段、或其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白包含与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的氨基酸序列，其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)在严格条件下能够与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的外源核酸；优选编码EIN2蛋白的外源核酸；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:3或5中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或

本发明的再一实施方案为，通过增加EIN2蛋白或其功能性片段、直向同源物、旁系同源物或同源物或其剪接变体的表达来增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性，优选抗层锈菌科真菌(Phacopsoraceae)例如大豆锈病抗性的方法，其中EIN2蛋白由以下编码

(i)与SEQ ID NO:1具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的外源核酸，或其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质为与SEQ ID NO:3具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性、或其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)在严格条件下能够与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的外源核酸；优选编码EIN2蛋白的外源核酸；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:3中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或

本发明的再一实施方案为，通过增加EIN2蛋白或其功能性片段、直向同源物、旁系同源物或同源物、或其剪接变体的表达来增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性，优选抗层锈菌科真菌(Phacopsoraceae)例如大豆锈病抗性的方法，其中EIN2蛋白由以下编码

(i)与SEQ ID NO:4具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的外源核酸，或其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质为与SEQ ID NO:5具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性、或其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

在本发明的另一个方法中，方法包括以下步骤

(a)以重组表达盒稳定地转化植物细胞，所述表达盒包含与启动子功能性连接的

(i)与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸，或其功能性片段、或其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的核酸，所述蛋白包含与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的氨基酸序列、其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)在严格条件下能够与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的核酸；优选编码EIN2蛋白的核酸；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:3或5中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或

(iv)与以上(i)至(iii)的核酸编码相同的EIN2多肽、但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的核酸；

(b)从植物细胞再生出植物；和

(c)表达所述核酸，可选地其中编码EIN2蛋白的核酸以足够产生或增加所述植物中大豆锈病抗性的量和时期来表达。

优选地，方法包括以下步骤

(a)以重组表达盒稳定地转化植物细胞，所述表达盒包含与启动子功能性连接的核酸，所述核酸为：

(i)与SEQ ID NO:1具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸，或其功能性片段、或其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的核酸，所述蛋白为与SEQ ID NO:3具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性、或其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)在严格条件下能够与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的核酸；优选编码EIN2蛋白的核酸；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:3中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或

(b)从植物细胞再生出植物；和

优选地，方法包括以下步骤

(i)与SEQ ID NO:4具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸，或其功能性片段、或其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的核酸，所述蛋白为与SEQ ID NO:5具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性、或其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)在严格条件下能够与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的核酸；优选编码EIN2蛋白的核酸；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:5中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或

(b)从植物细胞再生出植物；和

优选地，启动子是锈病诱导的和/或叶肉特异性启动子，优选锈病诱导的叶肉特异性启动子820。

优选地，用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性，优选抗层锈菌科真菌(Phacopsoraceae)例如大豆锈病抗性的方法还包括步骤：选择表达以下核酸的转基因植物

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白为与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性、或其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)在严格条件下能够与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的外源核酸；优选编码EIN2蛋白的核酸；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:3或5中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或

(iv)与以上(i)至(iii)的核酸编码相同的EIN2多肽、但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外源核酸。

优选的实施方案为，通过增加EIN2蛋白的表达来增加大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中大豆锈病抗性的方法，其中EIN2蛋白由包含以下的核酸编码

(i)与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的外源核酸；

(ii)编码包含氨基酸序列的蛋白质的外源核酸，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iv)与以上(i)至(iii)的核酸编码相同的EIN2蛋白、但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外源核酸，其中EIN2蛋白增加的表达通过以包含条目(i)或(ii)或(iii)或(iv)所述核酸的核酸转化大豆植物、植物部分或植物细胞来实现。

另外优选的实施方案为，通过增加EIN2蛋白的表达来增加大豆植物、大豆植物部分或大豆植物细胞中大豆锈病抗性的方法，其中EIN2蛋白由核酸编码，所述核酸包含

(ii)编码包含与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的外源核酸；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)与以上(i)至(ii)的核酸编码相同的EIN2蛋白、但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(ii)的核酸的外源核酸，其中EIN2蛋白增加的表达通过以包含条目(i)或(ii)或(iii)所述核酸的核酸转化大豆植物、植物部分或植物细胞来实现。

真菌病原体或真菌样病原体(例如假菌界(Chromista))可属于包含根肿菌门(Plasmodiophoramycota)、卵菌门(Oomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、担子菌门(Basidiomycota)及半知菌纲(Deuteromycetes)(半知菌类(Fungi im-perfecti))的组。在表2和3中给出了可以以举例而非限制的方式提及的病原体及与它们相关的疾病。

表2:由活体营养型和/或半死体营养型植物致病真菌引起的疾病

表3:由死体营养型和/或半活体营养型真菌及卵菌纲真菌引起的疾病

以下是特别优选的：

根肿菌门(Plasmodiophoromycota)例如芸苔根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)(十字花科植物的根肿病)、马铃薯粉痂菌(Spongospora subter-ranea)、多粘霉(Polymyxa graminis)，

卵菌门(Oomycota)例如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)(莴苣霜霉病)、在金鱼草(金鱼草霜霉(P.antirrhini))、洋葱(洋葱霜霉(P.destructor))、菠菜(散展霜霉(P.effusa))、大豆(东北霜霉(P.manchurica))、烟草(“青霉”；烟草霜霉(P.tabacina))、苜蓿及三叶草(车轴草霜霉(P.trifolium))中的霜霉(Peronospora)(霜霉病)、葎草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)(啤酒花霜霉病)、单轴霉(Plasmopara)(葡萄树霜霉病)(葡萄生单轴霉(P.viticola))及向日葵(霍尔斯单轴霉(P.halstedii))、大孢指疫霉(谷物及草的霜霉病)、腐霉(Pythium)(例如由德巴利腐霉(P.debaryanum)引起的甜菜猝倒病)、致病疫霉(Phytophthora infestans)(马铃薯和番茄等中的晚疫病)、白锈属种(Albugo)。

子囊菌门(Ascomycota)如Microdochium nivale(黑麦及小麦的雪霉病)、镰孢属(Fusarium)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)(主要在小麦中部分穗不育)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)(番茄的镰孢萎蔫病)、Blumeriagraminis(大麦(大麦专化型)及小麦(小麦专化型)的白粉病)、豌豆白粉菌(Erysiphepisi)(豌豆的白粉病)、仁果干癌丛赤壳(Nectria galligena)(果树的丛赤壳癌肿病(Nectria canker))、葡萄钩丝壳(Uncinula necator)(葡萄树白粉病)、维管束假盘菌(Pseudopeziza tracheiphila)(葡萄树“red fire”病)、麦角菌(Claviceps purpurea)(例如，黑麦及草的麦角病)、禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)(小麦、黑麦及其它草的全蚀病)、Magnaporthe grisea、麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)(大麦叶条纹病)、圆核腔菌(Pyrenophora teres)(大麦网斑病)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)(小麦叶枯病)、苹果黑星菌(Venturia inaequalis)(苹果黑星病)、核盘菌(Sclerotinia sclerotium)(茎断、茎腐)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medi-caginis)(苜蓿、白三叶草及红三叶草的叶斑病)。

担子菌纲(Basidiomycetes)例如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)(大麦、黑麦、小麦的核瑚菌疫病)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)(玉米的泡状黑粉病)、裸黑粉菌(Ustilago nuda)(大麦散黑粉病)、小麦散黑粉菌(Ustilago tritici)(小麦、斯佩尔特小麦的散黑粉病)、燕麦散黑粉菌(Ustilago avenae)(燕麦散黑粉病)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(马铃薯的立枯丝核菌根腐病)、轴黑粉菌属物种(Sphacelotheca)(高梁的丝黑穗病)、亚麻栅锈菌(Melampsora lini)(亚麻锈病)、禾柄锈菌(Pucciniagraminis)(小麦、大麦、黑麦、燕麦的秆锈病)、隐匿柄锈菌(Puccinia re-condita)(小麦叶锈病)、散生柄锈菌(Puccinia dispersa)(黑麦褐锈病)、大麦柄锈菌(Puccinia hordei)(大麦叶锈病)、禾冠柄锈菌(Puccinia coronata)(燕麦冠锈病)、条形柄锈菌(Pucciniastriiformis)(小麦、大麦、黑麦及许多草的黄锈病)、疣顶单胞锈菌(Uromycesappendiculatus)(大豆的褐锈病)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)(许多植物的根及茎腐病)。

半知菌纲(Deuteromycetes)(半知菌类(Fungi imperfecti))例如颖枯壳针孢(Septoria(Stagonospora)nodorum)(小麦颖枯病)、小麦壳针孢(Septoria tritici)、Pseudocercosporella herpotrichoides(小麦、大麦、黑麦的眼斑病)、大麦云纹病菌(Rynchosporium secalis)(黑麦及大麦的叶斑病)、茄链格孢(Alternaria solani)(马铃薯、番茄的早疫病)、甜菜茎点霉(Pboma betae)(甜菜的黑胫病)、甜菜生尾孢(Cercosporabeticola)(甜菜的叶斑病)、芸苔链格孢(Alternaria brassicae)(油菜、甘蓝及其它十字花科植物的黑斑病)、大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)(轮枝孢萎蔫病)、刺盘孢属(Colletotrichum)、豆刺盘孢(Colletotrichum lindemuthianum)(豆炭疽病)、黑胫茎点霉(Pboma Iingam)(甘蓝及油菜的黑胫病)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(葡萄藤、草莓、番茄、啤酒花等的灰霉)。

特别优选的是活体营养型病原体，例如豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和/或那些与豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)具有基本上类似感染机制的病原体，如本文中描述的。特别优选的是来自锈菌纲(Pucciniomycetes)的病原体，优选来自锈菌目(Pucciniales)(锈菌)(以前被称为锈菌目(Uredinales))，其中特别是Melompsoraceae。优选的是层锈菌科(Phakopsoraceae)，更优选层锈菌属(Phakopsora)。特别优选的是豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和/或山马蝗层锈菌(Phakopsora mei-bomiae)。

也优选的锈病真菌选自柄锈菌属(Puccinia)、胶锈菌属(Gymnosporangium)、Juniperus、柱锈菌属(Cronartium)、驼孢锈菌属(Hemileia)、和单胞锈菌属(Uromyces)；优选高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)、桧胶锈菌(Gymnosporangium juniperi-virginianae)、Juniperus virginiana、茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola)、咖啡驼孢锈菌(Hemileiavastatrix)、禾柄锈菌(Puccinia graminis)、禾冠柄锈菌(Puccinia coronata)、菜豆单胞锈菌(Uromyces phaseoli)、萱草柄锈菌(Puccinia hemerocallidis)、Pucciniapersistens supsp.Triticina、条形柄锈菌(Puccinia striiformis)、Puccinia graminiscauses、和/或疣顶单胞锈菌(Uromyces appendeculatus)。

其它优选的病原体，优选玉米的病原体，为导致茎腐病，特别是镰孢(Fusarium)茎腐病、赤霉菌(Gibberella)茎腐病、色二孢菌(Diplodia)茎腐病和炭腐病的病原体，以及导致炭疽病的病原体。优选的导致镰孢茎腐病的病原体为轮枝镰孢(Fusariumverticillioides)、层出镰孢(Fusarium proliferatum)、或胶孢镰孢(Fusariumsubglutinans)。优选的导致赤霉菌茎腐病的病原体为禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)。优选导致色二孢菌茎腐病的病原体为玉蜀黍色二孢(Diplodia maydis)。优选的导致炭腐病的病原体为Macrophomina phaseolina。优选的导致炭疽病的病原体为禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)。

EIN2表达构建体和载体构建体

本发明再一个实施方案为重组载体构建体，其包含：

(a)(i)与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％同一性、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸，或其功能性片段、或其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％、优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的氨基酸序列、其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iv)与以上(i)至(iii)的核酸编码相同的EIN2多肽、但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的核酸，其中所述核酸与(b)启动子和(c)转录终止序列有效连接。

此外，在本发明另一个实施方案中，提供重组载体构建体，其包含：

(a)(i)与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸；

(ii)编码包含与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质的核酸；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(a)(i)与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白质的核酸；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(a)(i)与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性的蛋白质的核酸；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iv)与以上(i)至(iii)的核酸编码相同的EIN2蛋白、但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的核酸，其中所述核酸与(b)启动子和(c)转录终止序列有效连接。

在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地仍然，至少部分地，保留。此环境优选位于核酸序列的至少一侧并具有至少50bp、优选地至少500bp、特别优选地至少1000bp、最优选地至少5000bp的序列长度。

根据本发明的启动子可以是组成型的、可诱导的(尤其是病原体诱导的)、发育阶段优先的、细胞类型优先的、组织优先的或器官优先的。组成型启动子在大多数情况下都有活性。组成型启动子的非限制实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等，1985，Nature 313:810-812)、sX CaMV 35S启动子(Kay等，1987，Science 236:1299-1302)、Sepl启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等，1990，Plant Cell 2:163-171)、拟南芥肌动蛋白启动子、泛素启动子(Christensen等，1989，Plant Molec.Biol.18:675-689)、pEmu(Last等，1991，Theor.Appl.Genet.81:581-588)、玄参花叶病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等，1984，EMBO J.3:2723-2730)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5,683,439)、来自农杆菌属T-DNA的启动子，例如甘露碱合酶、胭脂碱合酶和章鱼碱合酶、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)启动子等。

优选地，本发明的表达载体包含组成型启动子、叶肉特异性启动子、表皮特异性启动子、根特异性启动子、病原体诱导启动子或真菌诱导启动子。

如果一个启动子在其诱导状态下的活性(通过在该启动子控制下产生的RNA的量来测定)比其未诱导状态下的活性高至少30％、至少40％、至少50％，优选至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，更优选至少100％、至少200％、至少300％，则该启动子是可诱导的启动子。如果一个启动子的活性(通过在该启动子控制下产生的RNA的量来测定)在特定的细胞类型、组织或器官中比在相同植物的其它细胞类型、组织中高至少30％、至少40％、至少50％，优选至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，更优选至少100％、200％、300％，则该启动子是细胞、组织或器官特异性启动子，其中优选所述其它的细胞类型或组织是相同植物器官(例如根)的细胞类型或组织。在器官特异性启动子的情况中，启动子活性应该与其它植物器官(例如叶、茎、花或种子)中的启动子活性相比较。优选地，启动子为组成型启动子、叶肉特异性启动子或表皮特异性启动子。

在优选的实施方案中，EIN2蛋白的蛋白量和/或活性的增加以组成型或组织特异性方式发生。在特别优选的实施方案中，例如通过在真菌诱导启动子控制下重组表达EIN2核酸，实现蛋白量和/或蛋白活性的实质性病原体诱导的增加。特别地，EIN2核酸的表达发生在真菌感染的部位，然而，优选地，在未被真菌感染的组织中EIN2核酸的表达保持基本上不变。

发育阶段优先的启动子在发育的特定阶段优先表达。组织和器官优先的启动子包括那些在特定组织或器官(例如叶、根、种子或木质部)中优先表达的启动子。组织优先和器官优先的启动子的实例包括但不限于果实优先、胚珠优先、雄性组织优先、种子优先、珠被优先、块茎优先、茎秆优先、果皮优先、叶优先、柱头优先、花粉优先、花药优先、花瓣优先、萼片优先、花梗优先、长角果优先、茎优先、根优先启动子等等。种子优先的启动子优先地在种子发育和/或萌发期间表达。例如，种子优先启动子可以是胚优先、胚乳优先和种皮优先的。见Thompson等,1989,BioEssays 10:108。种子优先的启动子实例包括但不限于纤维素合酶(celA)、Ciml、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。

其它合适的组织优先或器官优先启动子包括但不限于，油菜籽napin-基因启动子(美国专利号5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP-启动子(Baeumlein等,1991,Mol GenGenet.225(3):459-67)、拟南芥油质蛋白启动子(PCT申请号WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆素启动子(美国专利号5,504,200)、芸苔Bce4-启动子(PCT申请号WO 91/13980)、或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等,1992,Plant Journal,2(2):233-9)以及在如玉蜀黍、大麦、小麦、黑麦、稻等单子叶植物中赋予种子特异性表达的启动子。值得关注的合适启动子是大麦的lpt2或lpt1-基因启动子(PCT申请号WO 95/15389和PCT申请号WO 95/23230)，或在PCT申请号WO 99/16890中描述的那些启动子(大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因和黑麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。

根据本发明有用的启动子包括但不限于主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、napin启动子、大豆凝集素启动子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子，waxy、shrunken 1、shrunken 2、bronze启动子，Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)、SGB6启动子(美国专利号5,470,359)、以及合成的或其它天然的启动子。

表皮特异性启动子可以选自：

WIR5(＝GstA1)；acc.X56012；Dudler和Schweizer；

GLP4,acc.AJ310534；Wei Y.,Zhang Z.,Andersen C.H.,Schmelzer E.,Gregersen P.L.,Collinge D.B.,Smedegaard-Petersen V.和Thordal-Christensen H.,Plant Molecular Biology 36,101(1998)；

GLP2a,acc.AJ237942,Schweizer P.,Christoffel A.和Dudler R.,Plant J.20,541(1999)；

Prx7,acc.AJ003141,Kristensen B.K.,

H.,Rasmussen S.K.和Nielsen K.A.,Molecular Plant Pathology,2(6),311(2001)；

GerA,acc.AF250933；Wu S.,Druka A.,Horvath H.,Kleinhofs A.,KannangaraG.和von Wettstein D.,Plant Phys Biochem 38,685(2000)；

OsROC1,acc.AP004656；

RTBV,acc.AAV62708,AAV62707；

A.,Henrich C.,Bieri S.,He X.,ChenG.,Burkhardt P.K.,Wünn J.,Lucca P.,Hohn T.,Potrykus I.和Fütterer J.,PMB 40,249(1999)；

马铃薯几丁质酶ChtC2-启动子(Ancillo等,Planta.217(4),566,(2003))；

AtProT3启动子(Grallath等,Plant Physiology.137(1),117(2005))；

拟南芥SHN-启动子(涉及产生角质和蜡的AP2/EREBP转录因子)(Aarón等,PlantCell.16(9),2463(2004))；和/或

小麦GSTA1(Dudler等,WP2005306368和Altpeter等,Plant Mo-lecularBiology.57(2),271(2005))。

叶肉特异性启动子可以选自：

PPCZm1(＝PEPC)；Kausch A.P.,Owen T.P.,Zachwieja S.J.,Flynn A.R.和SheenJ.,Plant Mol.Biol.45,1(2001)；

OsrbcS,Kyozuka等,PlaNT Phys 102,991(1993)；Kyozuka J.,McElroy D.,Hayakawa T.,Xie Y.,Wu R.和Shimamoto K.,Plant Phys.102,991(1993)；

OsPPDK,acc.AC099041；

TaGF-2.8,acc.M63223；Schweizer P.,Christoffel A.和Dudler R.,PlantJ.20,541(1999)；

TaFBPase,acc.X53957；

TaWIS1,acc.AF467542；US 200220115849；

HvBIS1,acc.AF467539；US 200220115849；

ZmMIS1,acc.AF467514；US 200220115849；

HvPR1a,acc.X74939；Bryngelsson等,Mol.Plant Microbe Interacti.7(2),267(1994)；

HvPR1b,acc.X74940；Bryngelsson等,Mol.Plant Microbe Interact.7(2),267(1994)；

HvB1,3gluc；acc.AF479647；

HvPrx8,acc.AJ276227；Kristensen等,Molecular Plant Pathology,2(6),311(2001)；和/或

HvPAL,acc.X97313；Wei Y.,Zhang Z.,Andersen C.H.,Schmelzer E.,GregersenP.L.,Collinge D.B.,Smedegaard-Petersen V.和Thordal-Christensen H.PlantMolecular Biology 36,101(1998)。

组成型启动子可以选自：

西芹PcUbi启动子(WO 03/102198)

CaMV 35S启动子：花椰菜花叶病毒35S启动子(Benfey等,1989EMBO J.8(8):2195–2202)，

STPT启动子：拟南芥(Arabidopsis thaliana)短磷酸丙糖转运器启动子(登录号NM_123979)

Act1启动子：稻(Oryza sativa)肌动蛋白1基因启动子(McElroy等,1990PLANTCELL 2(2)163-171a)和/或

EF1A2启动子：大豆(Glycine max)翻译延伸因子EF1α(US20090133159)。

在优选的实施方案中，EIN2蛋白的蛋白量或功能的增加以组成型或组织特异性方式发生。在特别优选的实施方案中，例如通过在真菌诱导性启动子(优选锈病诱导的启动子)控制下外源表达EIN2核酸，实现蛋白量或蛋白功能的实质性病原体诱导的增加。特别地，EIN2核酸的表达发生在真菌感染的部位，然而，优选地，在未被真菌感染的组织中EIN2核酸的表达基本上保持不变。

优选地，EIN2核酸处于锈病诱导的叶肉特异性启动子的控制下。更优选地，启动子是锈病诱导的叶肉特异性启动子820。

优选的终止子为马铃薯(Solanum tuberosum)组织蛋白酶D抑制剂基因的终止子。

优选的启动子-终止子组合(目的基因处于它们之间)为来自西芹的启动子，优选地，西芹泛素启动子或玉蜀黍泛素启动子，与来自马铃薯(Solanum tuberosum)的组织蛋白酶D抑制剂基因的终止子组合。另一个优选的启动子-终止子组合为锈病诱导的叶肉特异性启动子820与来自马铃薯(Solanum tuberosum)的组织蛋白酶D抑制剂基因的终止子组合。

也可以在5’非翻译区(UTR)和/或部分编码序列的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体中在转录单位中纳入可剪接内含子，可以在mRNA和蛋白质水平上造成基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)。通常内含子放置在转录单位5’末端附近时，增强基因表达的作用最大。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见The MaizeHandbook,第116章,Freeling和Walbot编辑,Springer,N.Y.(1994)。

一类载体构建体为“质粒”，其指环状双链DNA环，可以将另外的DNA片段连接到其中。另一类载体为病毒载体，其中可以将另外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体构建体能够在其引入的宿主细胞中自主复制。其它载体构建体在引入到宿主细胞中后整合到宿主植物细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。尤其是，载体构建体能够指导与载体有效连接的基因的表达。然而，本发明旨在包括其它形式的表达载体构建体，例如起等价作用的病毒载体(例如马铃薯病毒X、烟草皱裂病毒和/或Gemini病毒)。

转基因生物；转基因植物、植物部分和植物细胞

一个优选的实施方案是过表达外源EIN2蛋白的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。优选地，在植物、植物部分或植物细胞中过表达的EIN2蛋白由核酸编码，所述核酸包含：

(i)与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％同一性的外源核酸，或其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；或

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％同一性的氨基酸序列、或其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

最优选地，外源核酸与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性；或包含编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性。

一个优选的实施方案是过表达外源EIN2蛋白的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。优选地，在植物、植物部分或植物细胞中过表达的EIN2蛋白由以下编码：

(i)与SEQ ID NO:1具有至少60％同一性的外源核酸，或其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；或

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质为与SEQ ID NO:3具有至少60％同一性、或其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(i)与SEQ ID NO:4具有至少60％同一性的外源核酸，或其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；或

(ii)编码与SEQ ID NO:5具有至少60％同一性的蛋白质的外源核酸，其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(iii)在严格条件下能够与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的外源核酸；优选编码EIN2蛋白的外源核酸；优选其中核酸分子编码具有与SEQ ID NO:5中描述的多肽基本上相同特性的多肽；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；和/或

最优选地，外源核酸与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性；或包含编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性。

最优选地，外源核酸与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性；或包含编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性。

最优选地，外源核酸与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性；或包含编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性、或甚至100％序列同一性。

在优选的实施方案中，与没有转化EIN2核酸的野生型植物相比较，转基因植物中EIN2蛋白的蛋白量增加了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％或更多。

更优选地，通过以本文中描述的重组载体转化，已经获得根据本发明的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。

植物生物技术领域熟知转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的适宜方法。可使用任何方法将重组表达载体转化到植物细胞中以获得本发明的转基因植物。转化双子叶植物的一般方法在例如美国专利号4,940,838、5,464,763等中公开。转化特定的双子叶植物(例如棉花)的方法在美国专利号5,004,863、5,159,135和5,846,797中示出。可使用在美国专利号4,992,375、5,416,011、5,569,834、5,824,877、6,384,301和EP 0301749B1中示出的大豆转化方法。转化方法可包括直接和间接转化方法。适宜的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、脂质体介导的转化(US4,536,475)、使用基因枪的生物射弹方法(Fromm ME等,Bio/Technology.8(9):833-9,1990；Gordon-Kamm等,Plant Cell 2:603,1990)、电穿孔、在包含DNA的溶液中孵育干胚、和显微注射。在这些直接转化方法的情况下，使用的质粒不需要满足任何特别的要求。可使用简单的质粒例如pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等等。如果要从经转化的细胞再生完整植物，优选地在质粒上放置额外的可选择的标志基因。直接转化技术同等适用于双子叶和单子叶植物。

也可利用农杆菌通过细菌感染(例如EP 0 116 718)、利用病毒载体通过病毒感染(EP 0 067 553、US 4,407,956、WO 95/34668、WO 93/03161)或利用花粉(EP 0 270 356、WO85/01856、US 4,684,611)进行转化。本领域熟知基于农杆菌的转化技术(特别是用于双子叶植物)。农杆菌属菌株(例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述T-DNA元件在用农杆菌感染后转移至植物。T-DNA(转移DNA)整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri或Ti质粒上或单独包含于所谓的双元载体中。在例如Horsch RB等,(1985)Science 225:1229中描述了农杆菌介导的转化方法。农杆菌介导的转化最适于双子叶植物但也适合于单子叶植物。在例如White FF,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants,TransgenicPlants,第1卷,Engineering and Utilization,S.D.Kung和R.Wu编辑,Academic Press,1993,第15–38页；Jenes B等,Techniques for Gene Transfer,Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,S.D.Kung and R.Wu编辑,Academic Press,1993,第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225中，描述了通过农杆菌对植物的转化。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管可将本发明的核苷酸序列插入到属于各种类别的任何植物和植物细胞中，但它在作物植物细胞中特别有用。

可通过本领域技术人员熟知的所有方法再生遗传修饰的植物细胞。合适方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或

和Willmitzer的出版物中。

在转化后，可以选择存在一个或多个标志物的植物细胞或细胞群，所述标志物由与目标基因共转移的植物可表达的基因编码，然后将经转化的材料再生为完整植物。为选择经转化的植物，通常将在转化中获得的植物材料置于选择性条件，使得经转化的植物可与未经转化的植物区别。例如，可种植用上述方法获得的种子，在最初生长阶段后，通过喷雾对所述种子进行适当的选择。再一可行方案是使用适当的选择剂在琼脂平板上生长种子(酌情在消毒之后)，使得只有经转化的种子可以生长为植物。可选地，筛选存在可选择标志物(例如上文描述的那些)的经转化的植物。也可以通过筛选EIN2核酸的存在，直接选择经转化的植物。

在DNA转移和再生后，也可以例如使用Southern分析，评估推定的经转化的植物中目标基因的存在、拷贝数和/或基因组结构。可选或额外地，可使用Northern和/或Western分析监测新导入的DNA的表达水平，本领域技术人员熟知这两种技术。

可通过多种方法繁殖所产生的经转化的植物，例如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，可将第一代(或T1)经转化的植物自交并选择纯合的第二代(或T2)转化体，然后可通过经典育种技术进一步繁殖T2植物。所产生的经转化的生物可以是多种形式的。例如，它们可为转化的细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如全部细胞经转化以含有表达盒)；经转化的和未转化组织的嫁接物(例如在植物中，嫁接至未转化的接穗上的经转化的砧木)。

优选地，构建体或载体或表达盒不存在于起始植物的基因组中，或存在于转基因植物的基因组中但不位于其在起初植物基因组的天然座位上。

优选地，本发明的转基因植物或通过本发明方法获得的植物具有增加的抗真菌病原体抗性、优选抗锈病病原体(即锈菌目(Pucciniales)的真菌病原体)，优选抗层锈菌科(Phacopsoraceae)的真菌病原体，更优选抗层锈菌属(Phacopsora)的真菌病原体，最优选抗豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)(也称为大豆锈病)的抗性。优选地，对豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和/或山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)的抗性得到增加。

优选地，植物、植物部分或植物细胞是选自以下的植物或来源于以下的植物：菜豆、大豆、豌豆、三叶草、葛、紫苜蓿、兵豆、羽扇豆、野豌豆、花生、稻、小麦、大麦、拟南芥、兵豆、香蕉、canola、棉花、马铃薯、玉蜀黍、甘蔗、苜蓿和甜菜。

在本发明的一个实施方案中，植物选自菜豆(beans)、大豆(soya)、豌豆(pea)、三叶草(clover)、葛(kudzu)、紫苜蓿(Lucerne)、兵豆(lentils)、羽扇豆(lupins)、野豌豆(vetches)和/或花生(groundnut)。优选地，植物为豆类，包括菜豆属(Phaseolus)的植物(包括四季豆、矮生菜豆、蔓菜豆(French bean,dwarf bean,climbing bean,Phaseolusvulgaris)、棉豆(Lima bean,Phaseolus lunatus L.)、宽叶菜豆(Tepary bean,Phaseolusacuti-folius A.Gray)、红花菜豆(runner bean,Phaseolus coccineus))；大豆属(Glycine)(包括野生大豆(Glycine soja)、大豆(Glycine max(L.)Merill))；豌豆属(pea,Pisum)(包括硬荚豌豆(shelling peas,Pisum sativum L.convar.sativum)，也称为滑或圆粒豌豆；皱粒豌豆(marrowfat pea,Pisum sati-vum L.convar.medullareAlef.emend.C.O.Lehm)、糖荚豌豆(sugar pea,Pisum sativum L.convar.axiphium Alefemend.C.O.Lehm)，也称为雪豌豆(snow pea)、可食用荚豌豆或嫩豌豆(edible-poddedpea,mangetout,Pisum granda sneida L.convar.sneidulo p.shneiderium))；花生(peanut,Arachis hypogaea)、三叶草属物种(clover,Trifolium)、苜蓿属(medick,Medicago)、野葛(kudzuvine,Pueraria lobata)、紫苜蓿(common lucerne,alfalfa,M.sativa L.)、鹰嘴豆属(chickpea,Cicer)、兵豆属(lens,Lens)(兵豆(Lens culinarisMedik.))、羽扇豆属(lupines.Lupinus)；野豌豆属(vetches,Vicia)、蚕豆(field bean,broad bean,Vicia faba)、山黧豆属(vetchling,Lathyrus)(包括家山黧豆(chicklingpea,Lathyrus sativus)、攻红山黧豆(heath pea,Lathyrus tuberosus))；豇豆属(Vigna)(包含乌头叶豇豆(moth bean,Vigna aconitifolia(Jacq.)Maréchal)、赤豆(adzukibean,Vigna angularis(Willd.)Ohwi&H.Ohashi)、黑吉豆(urd bean,Vigna mungo(L.)Hepper)、绿豆(mung bean,Vigna radiata(L.)R.Wilczek)、bambara groundnut(Vignasubterrane(L.)Verdc.)、赤小豆(rice bean,Vigna umbellata(Thunb.)Ohwi&H.Ohashi)、野豇豆(Vigna vexillata(L.)A.Rich.)、豇豆(Vigna unguiculata(L.)Walp.)，在三个亚种长豇豆(asparagus bean)、眉豆(cowpea)、短豇豆(catjang bean)中))；木豆(pigeonpea,Cajanus cajan(L.)Millsp.)、硬皮豆属(Macrotyloma)(包括geocarpagroundnut(Macrotyloma geocarpum(Harms)Maréchal&Baudet)、硬皮豆(horse bean,Macrotyloma uniflorum(Lam.)Verdc.))；四棱豆(goa bean,Psophocarpustetragonolobus(L.)DC.)、非洲豆薯(African yam bean,Sphenostylis stenocarpa(Hochst.ex A.Rich.)Harms)、埃及黑豆(Egyptian black bean)、膨皮豆(dolichosbean)、扁豆(Lablab bean)(Lablab purpureus(L.)Sweet)、豆薯属(yam bean,Pachyrhizus)、瓜尔豆(guar bean,Cyamopsis tetragonolobus(L.)Taub.)；和/或刀豆属(Canavalia)(包括洋刀豆(jack bean,Canavalia ensiformis(L.)DC.)、刀豆(swordbean,Canavalia gladiata(Jacq.)DC.))。

更优选的是选自以下的植物：菜豆、大豆、豌豆、三叶草、葛、紫苜蓿、兵豆、羽扇豆、野豌豆和花生。最优选为大豆或来源于大豆的植物、植物部分或植物细胞。

优选地，本发明的转基因植物或通过本发明方法获得的植物为大豆植物且具有对锈菌目(Pucciniales)(锈病)真菌病原体、优选层锈菌科(Phacopsoraceae)真菌病原体，更优选层锈菌属(Phacopsora)的真菌病原体，最优选豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)(也称为大豆锈病)的增加抗性。优选地，对豆薯层锈菌和/或山马蝗层锈菌的抗性得到增加。

生产转基因植物的方法

根据本发明的一个实施方案提供了用于生产抗真菌病原体，优选层锈菌科(Phacopsoraceae)的病原体(例如大豆锈病)的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，其中用来产生转基因植物的重组核酸包含在植物细胞中起作用的启动子，所述启动子与EIN2核酸(优选为SEQ ID NO:1)和终止子调控序列有效连接。

在一个实施方案中，本发明涉及用于生产具有增加的真菌抗性的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，包括：

(a)将根据本发明的重组载体构建体引入到植物、植物部分或植物细胞中，和

(b)从植物、植物部分或植物细胞产生转基因植物。

优选地，用于生产转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法还包括以下步骤：

(c)表达EIN2蛋白，所述EIN2蛋白优选由包含以下的核酸编码：

(i)与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％同一性的外源核酸，其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白包含与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％同一性的氨基酸序列、其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

优选地，所述引入和表达不包括基本上生物学的方法。

更优选地，用于生产转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法还包括以下步骤：

(c)表达EIN2蛋白，所述EIN2蛋白优选由以下编码：

(i)与SEQ ID NO:1具有至少60％同一性的外源核酸，其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白为与SEQ ID NO:3具有至少60％同一性、或其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

(c)表达EIN2蛋白，所述EIN2蛋白优选由以下编码：

(i)与SEQ ID NO:4具有至少60％同一性的外源核酸，其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白为与SEQ ID NO:5具有至少60％同一性、或其功能性片段，其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

优选地，用于生产转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法还包括选择转基因植物的步骤，所述转基因植物表达：

优选地，用于生产转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法还包括步骤：收获转基因植物的种子和种植种子并使种子生长至植物，其中长成的植物包含：

(i)与SEQ ID NO:1、2、4、6、11、13、15、17、19、21、23、25、27、28、29、30、31、32、33或34具有至少60％同一性的外源核酸，其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物，或其剪接变体；

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白包含与SEQ ID NO:3、5、12、14、16、18、20、22、24或26具有至少60％同一性的氨基酸序列、或其功能性片段、其直向同源物或旁系同源物；优选所编码的蛋白质赋予相对于对照植物增强的真菌抗性；

优选地，收获转基因植物的种子和种植种子并使种子生长至植物的步骤重复1次以上，优选1、2、3、4、5、6、、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50次，其中长成的植物包含：

可通过上述已知的方法选择转基因植物(例如通过筛选与EIN2基因共转移的植物可表达基因编码的一个或多个标志物的存在，或直接筛选EIN2核酸)。

此外，提供了外源EIN2核酸或包含EIN2核酸的重组载体构建体用于转化植物、植物部分或植物细胞以提供抗真菌的植物、植物部分或植物细胞的用途。

可收获部分和产品

根据本发明的转基因植物的可收获部分是本发明的一部分。优选地，可收获部分包含EIN2核酸或EIN2蛋白。可收获部分可以是包含EIN2核酸或EIN2蛋白的种子、根、叶和/或花，或其部分。大豆植物优选的部分为包含EIN2核酸或EIN2蛋白的大豆。

来源于根据本发明的转基因植物，其部分或其可收获部分的产品是本发明的一部分。优选的产品是粉(meal)或油，优选大豆粉或大豆油。优选大豆粉和/或大豆油包含EIN2核酸或EIN2蛋白。

生产产品的方法

在一个实施方案中，用于生产产品的方法包括

a)种植本发明的植物或可以通过本发明方法获得的植物，和

b)从或通过本发明的植物和/或这些植物的部分(例如种子)生产所述产品。

在另外的实施方案中，方法包含步骤a)种植本发明的植物，b)从植物移走如上定义的可收获部分，和c)从或通过本发明的可收获部分生产所述产品。

可在植物种植的位置生产产品，可从植物种植的位置移走植物和/或其部分以生产产品。通常，种植植物，从植物移走所需用的可收获部分(如果可行的话以重复循环进行)，以及从植物的可收获部分生产产品。每次实施本发明的方法时，植物的种植步骤可只进行一次，而允许重复多次产品生产的步骤，例如通过重复移走本发明的植物的可收获部分，并且如果必要的话进一步处理这些部分以得到产品。也可重复进行种植本发明的植物的步骤，并储存植物或可收获部分，直到对积累的植物或植物部分进行一次产品的生产。种植植物和生产产品的步骤也可在时间上重叠进行，甚至很大程度上同时进行或者先后进行。通常在生产产品前种植植物一段时间。

在一个实施方案中，由所述本发明方法生产的产品是植物产品，例如但不限于食品、饲料、食品添加剂、饲料添加剂、纤维、化妆品和/或药品。食品可以理解为是用于营养和/或补充营养的组合物。动物饲料和动物饲料添加剂特别地被认为是食品。

在另一个实施方案中，本发明的生产方法用于制造农产品，例如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂肪、油、聚合物、维生素等等。

植物产品可以在很大程度上由一种或多种农产品组成。

培育方法/植物改良方法/生产植物品种的方法

可以使用植物培育的已知方法，将本发明的转基因植物与类似的转基因植物、或与缺乏本发明核酸的转基因植物、或与非转基因植物杂交，以制备种子。此外，本发明的转基因植物细胞或植物可以包含一个或多个外源核酸，和/或与包含一个或多个外源核酸的另一转基因植物杂交，由此在植物和/或其后代中产生转基因的“堆积”(stack)。然后种植种子以获得包含HCP7核酸的杂交可育转基因植物。杂交可育转基因植物可含有从母本或从父本遗传的特定表达盒。第二植物可以是自交植物。杂交可育转基因植物可以是杂交种。任何这些杂交可育转基因植物的种子也包括在本发明的范围内。可以从可育转基因植物收获本发明的种子，并将其用于种植本发明的经转化的植物的后代，包括包含外源核酸的杂交种植物品系。

因此，本发明的一个实施方案是用于培育真菌抗性植物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将本文描述的转基因植物或可通过本文中描述的方法获得的植物与第二植物杂交；

(b)从(a)中描述的杂交步骤获得种子；

(c)种植所述种子并使其生长成植物；和

(d)从所述植物选择表达EIN2蛋白的植物，优选所述EIN2蛋白由包含以下的核酸编码：

另一个优选实施方案是用于植物改良的方法，包括：

(a)通过本发明的任何方法获得转基因植物；

(b)在一个植物细胞中将(a)的植物的至少一个植物细胞的遗传物质与在一个或多个基因上不同于(a)的植物的植物细胞的至少一个细胞的遗传物质组合，或将(a)的转基因植物与第二植物杂交；

(c)由产生自(b)的一个植物细胞的至少一个植物、或由步骤(b)的杂交的植物获得种子；和

(d)种植所述种子并使种子生长成植物；和

(e)从所述植物选择表达编码HCP7蛋白的核酸的植物；和可选地

(f)从表达编码HCP7蛋白的核酸的植物生产繁殖材料。

可以通过上述已知方法选择转基因植物(例如通过筛选与EIN2基因共转移的植物可表达基因编码的一个或多个标志物的存在，或筛选EIN2核酸本身)。

根据本发明，如果所引入的EIN2核酸整合到非染色体自主复制子中或整合到植物染色体中，则其可以在植物细胞中被稳定维持。无论是存在于染色体外非复制性或复制性载体构建体中，还是存在于整合到染色体中的载体构建体中，外源EIN2核酸优选位于植物表达盒中。植物表达盒优选含有能够在植物细胞中驱动基因表达的调控序列，所述调控序列有效连接，以致于每个序列能够实现其功能，例如，通过多腺苷酸化信号终止转录。优选的多腺苷酸化信号是来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA，例如Ti质粒pTiACH5的称为章鱼碱合酶的基因3(Gielen等,1984,EMBO J.3:835)或其功能等同物的多腺苷酸化信号，但在植物中起作用的所有其它终止子也是合适的。由于植物基因表达通常不限于转录水平上，植物表达盒优选包含其它功能性连接的序列，诸如翻译增强子，例如含有增加多肽/RNA比率的来自烟草花叶病毒5’非翻译引导序列的超驱动序列(Gallie等,1987,Nucl.Acids Research 15:8693-8711)。植物表达载体的实例包括在Becker,D.等,1992,New plant binary vectors with selectable markers located proximal to theleft border,Plant Mol.Biol.20:1195-1197；Bevan,M.W.,1984,Binary Agrobacteriumvectors for plant transformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721；和Vectors forGene Transfer in Higher Plants；in:Transgenic Plants,第1卷,Engineer-ing andUtilization,Kung和R.Wu编辑,Academic Press,1993,S.15-38中详细说明的那些植物表达载体。

实施例

以下的实施例并不旨在限制本发明的权利要求的范围，而旨在作为一些实施方式的示例。本领域技术人员可以想到的示例方法的任何变化形式都旨在落入本发明的范围内。

实施例1：一般方法

可以例如利用亚磷酰胺方法(Voet,Voet,第2版,Wiley Press New York,第896-897页)，以已知的方式，进行寡核苷酸的化学合成。用于本发明目的而实施的克隆步骤，例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、将核酸转移至硝化纤维和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、细菌培养、噬菌体增殖和重组DNA的序列分析，按Sambrook等,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),ISBN 0-87969-309-6的描述进行。用MWG-Licor激光荧光DNA测序仪，按Sanger法(Sanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463(1977))，进行重组DNA分子的测序。

实施例2：克隆过表达载体构建体

通过使用DNeasy Plant Mini Kit von Qiagen(Invitrogen)从拟南芥(生态型Col-0)中提取基因组DNA。DNA制备和纯化的所有步骤按照说明书中的描述进行。

首先，按照Phusion hot-start、Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)的操作规程中的描述，通过PCR从基因组DNA特异性扩增EIN2的C末端片段。

针对Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶的操作规程的组合物如下：1xPCR缓冲液、每种dNTP各0.2mM、100-1000ng拟南芥基因组DNA(品种Columbia-0)、20pmol正向引物、20pmol反向引物、0.5μl Phusion hot-start、Pfu Ultra、Pfu Turbo或HerculaseDNA聚合酶。

扩增循环如下：在98℃进行1个30秒的循环，接着进行36个循环，每个循环为98℃10秒、66℃ 20秒和72℃ 120秒，接着在72℃进行1个7分钟的循环，然后至4℃。

以与EIN2编码序列中的序列及EIN2编码序列终止密码子下游的3’UTR特异性结合的方式，设计引物(如SEQ ID NO:7和8中所示)。设计正向引物(SEQ ID NO:7)，以使NotI限制性位点(粗体)位于新的ATG(加下划线)的上游，该新ATG的导入使该C末端片段容易翻译成蛋白质。设计反向引物(SEQ ID NO:8)，使AscI限制性位点(粗体)位于终止密码子(加下划线)的下游

i)正向引物：5′-

CCTATGCGGCCGCCCATGCTCTGGCTGGCAGCC-3′(SEQ ID NO:7)

ii)反向引物：5′-

CCTATGGCGCGCCCTTCTTCTTCAACCCAATGATCCGTAC-3′(SEQ ID NO:8)

使用GFX PCR DNA凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,德国)，从1％琼脂糖凝胶中洗脱和纯化扩增的片段(2642bp)。

使用限制性酶NotI和AscI(NEB Biolabs)消化扩增的片段，并连接到经NotI/AscI消化的Gateway pENTRY-B载体(Invitrogen,Life Technolo-gies,Carlsbad,California,美国)中，使EIN2片段以有义方向位于attL1和attL2重组位点之间。

由于EIN2片段将被用于几个其它下游实验，随后将EIN2片段亚克隆进GATEWAYENTRY-B(Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,California,美国)中，使EIN2片段以有义方向位于西芹泛素(PcUbi)启动子和根癌农杆菌来源的胭脂碱合酶终止子(NOS)之间。PcUbi启动子调控欧芹(Petroselinum crispum)的ubi4-2基因(登录号X64345)的组成型表达(Kawalleck等.1993Plant Molecular Biology 21(4):673-684)。

因此，使用如上所述包含EIN2片段的pENTRY-B载体作为模板进行PCR反应，按照Phusion hot-start、Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)的操作规程中的描述，特异性扩增EIN2片段。

针对Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶的操作规程的组合物如下：1xPCR缓冲液、每种dNTP各0.2mM、从前述PCR获得的100ng模板DNA、20pmol正向引物、20pmol反向引物、1mM MgCl₂、0.5μl Phusion hot-start、Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶。

扩增循环如下：

在98℃进行1个30秒的循环，接着进行35个循环，每个循环为98℃ 10秒、64℃ 10秒和在72℃ 70秒，接着在72℃进行1个10分钟的循环，然后至4℃。

设计引物(如SEQ ID 9和10所示)，以便特异性扩增EIN2片段，并在起始ATG之前引入PacI位点和在终止密码子的下游引入AscI限制性位点。

i)正向引物：5′-AATTAATTAACCATGCTCTGGCTGGCAGC-3′(SEQ ID NO:9)

ii)反向引物：5′-TTGGCGCGCCTCAACCCAATGATCCGTAC-3′(SEQ ID NO:10)

使用GFX PCR DNA凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,德国)，从1％琼脂糖凝胶中洗脱和纯化扩增的片段(2628bp)。

使用限制性酶PacI和AscI(NEB Biolabs)消化洗脱的片段，并连接到PacI/AscIGATEWAY ENTRY-B(Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,California,美国)中，使EIN2片段以有义方向位于西芹泛素(PcUbi)启动子和根癌农杆菌来源的胭脂碱合酶终止子(NOS)之间。

也可以通过DNA合成(Geneart,Regensburg,德国)产生本发明所提及的所有DNA片段。

为了获得二元植物转化载体，使用空的pENTRY-A载体、上述pENTRY-B载体中PcUbi启动子::EIN2片段::nos终止子、和空的pENTRY-C，根据生产商的操作规程，进行三重LR反应(Gateway sys-tem,Invitrogen,Life Technologies,Carlsbad,California,USA)。使用二元pDEST载体作为靶，所述双元载体包括：(1)用于细菌选择的壮观霉素/链霉素抗性盒，(2)用于在农杆菌中复制的pVS1起点，(3)用于在大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右和左边界之间处于PcUbi启动子控制下的AHAS选择(见图2)。将重组反应物转化到大肠杆菌(DH5α)中，小量抽提和通过特定的限制性消化进行筛选。对每个载体构建体的阳性克隆测序并进行大豆转化。

实施例3：大豆转化

将表达载体构建体(见实施例2)转化到大豆中。

3.1大豆种子的灭菌和萌发

事实上任何大豆品种的任何种子都可用于本发明的方法。多种大豆栽培种(包括Jack、Williams 82、Jake、Stoddard和Resnik)适于大豆转化。在有密闭盖的干燥器中，通过向100ml漂白剂(5.25％次氯酸钠)逐滴加入3.5ml 12N HCl产生氯气，在容器中对大豆种子进行灭菌。在容器中24至48小时后，移走种子，将约18至20粒种子置于在100mm培养皿中的含或不含5μM 6-苄基氨基嘌呤(BAP)的固体GM培养基上。没有BAP时幼苗更伸长并且根发育，特别是次生根和侧根形成。BAP通过形成较短和较粗壮的幼苗来强壮幼苗。

使用在25℃光下(>100μEinstein/m²s)生长的7日龄幼苗作为三种外植体类型的外植体材料。此时，种皮裂开，具有单小叶的叶的上胚轴最少已经生长到子叶的长度。上胚轴应当是至少0.5cm以避开子叶节组织(由于大豆栽培种和种子批次可在发育时间上不同，对萌发阶段的描述比具有萌发时间更准确)。

对于接种整个幼苗，参见方法A(实施例3.3.1和3.3.2)，或对于接种叶外植体，参见方法B(实施例3.3.3)。

对于方法C(参见实施例3.3.4)，从每个幼苗移走下胚轴和两片子叶的一片半或部分。然后将幼苗置于繁殖培养基上2至4周。幼苗产生若干分支的枝条，从其获得外植体。外植体大部分源自从顶芽长出的小植株。这些外植体优选地用作靶组织。

3.2农杆菌培养物的培养和制备

通过将携带所需双元载体(例如H.Klee.R.Horsch和S.Rogers1987Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its further Applica-tionsto Plant Biology；Annual Review of Plant Physiology Vol.38:467-486)的农杆菌(例如根癌农杆菌(A.tumefaciens)或发根农杆菌(A.rhizogenes))在固体YEP生长培养基(YEP培养基：10g酵母提取物、10g细菌蛋白胨(Bacto Peptone)、5g NaCl，调节pH至7.0，用水补至最终体积为1升，对于YEP琼脂平板加入20g琼脂，高压灭菌)上画线，并于25℃培养直至出现菌落(约2天)，制备了农杆菌培养物。取决于Ti或Ri质粒、双元载体和细菌染色体上存在的可选择标志基因，使用不同的选择化合物在YEP固体和液体培养基中进行根癌农杆菌和发根农杆菌的选择。多种农杆菌菌株可用于转化方法。

在约2天后，挑单个菌落(用灭菌牙签)并接种到含抗生素的50ml液体YEP中，在175rpm振荡(25℃)直到OD₆₀₀达到0.8至1.0之间(约2天)。制备用于转化的工作甘油储液(15％)并将1ml农杆菌储液等分到1.5ml Eppendorf管中，然后储存于-80℃。

在外植体接种前1天，在500ml Erlenmeyer烧瓶中用5μl至3ml工作农杆菌储液接种200ml YEP。将烧瓶在25℃振荡过夜直至OD₆₀₀在0.8和1.0之间。在制备大豆外植体之前，通过在20℃于5,500g离心10分钟来沉淀农杆菌。将沉淀重悬于液体CCM中至所需密度(OD₆₀₀0.5-0.8)并在使用前置于室温至少30分钟。

3.3外植体制备和共培养(接种)

3.3.1方法A：转化当天制备外植体。

此时幼苗的上胚轴已经从至少0.5cm伸长但通常在0.5至2cm之间。成功地使用了长度多达4cm的伸长的上胚轴。然后制备了外植体：i)有一些根或没有根，ii)有部分、一个或两个子叶，移走全部预先形成的叶，包括顶端分生组织，并且用锋利的解剖刀切割数次以损伤位于第一组叶位置处的节。

在节处的切割不仅诱导农杆菌感染，也散布(distribute)腋生分生组织细胞和破坏预先形成的枝条。在创伤和制备后，将外植体放置在培养皿中，然后用液体CCM/农杆菌混合物共培养30分钟。然后从液体培养基移走外植体，放在灭菌滤纸上置于具有固体共培养培养基的15x100mm培养板上。放置创伤的靶组织，使得它们直接接触培养基。

3.3.2修改的方法A：上胚轴外植体制备

将从4至8日龄的幼苗制备的大豆上胚轴区段用作再生和转化的外植体。使大豆栽培种L00106CN、93-41131和Jack的种子在含或不含细胞分裂素的1/10MS盐或相似的组合物培养基中发芽4至8天。通过从茎段移走子叶节和茎节制备上胚轴外植体。上胚轴被切成2至5段。特别优选的是附着于包含腋生分生组织的初生节或较高节的区段。

外植体用于农杆菌感染。在含有适当的抗生素的LB培养基中过夜培养携带含有目的基因(GOI)和AHAS、bar或dsdA可选择标志基因的质粒的农杆菌AGL1，收获并重悬于含有乙酰丁香酮的接种培养基中。将新制备的上胚轴区段在农杆菌悬液中浸泡30至60分钟，然后在无菌滤纸上将外植体蘸干。然后将接种后的外植体在含有L-半胱氨酸和TTD及其它化学品(例如用于增强T-DNA传送的乙酰丁香酮)的共培养培养基上培养2至4天。然后将受感染的上胚轴外植体置于含有选择剂(例如灭草烟(Imazapyr)(用于AHAS基因)、草铵膦(用于bar基因)或D-丝氨酸(用于dsdA基因))的枝条诱导培养基上。将再生的枝条在具有选择剂的伸长培养基上进行传代培养。

为再生转基因植物，随后在含有细胞分裂素(例如BAP、TDZ和/或Kinetin)的培养基上培养所述区段，用于诱导枝条。在4至8周后，将培养的组织转移到含有较低浓度的细胞分裂素的培养基，以进行枝条伸长。将伸长的枝条转移到含生长素的培养基进行生根和植物发育。再生了多个枝条。

回收了许多显示强cDNA表达的稳定转化的部分。从上胚轴外植体再生了大豆植物。证明了有效的T-DNA递送和稳定转化的部分。

3.3.3方法B：叶外植体

为制备叶外植体，从下胚轴移走子叶。将子叶彼此分离，并移走上胚轴。通过在托叶基部仔细切割，从上胚轴移走由叶片、叶柄和托叶组成的初生叶，使得外植体上包括腋生分生组织。为创伤外植体以及剌激枝条从头形成，移走任何预先形成的枝条，并用锋利的解剖刀在托叶之间的区域切割3至5次。

在外植体制备后，立即将外植体全部浸入或将受创伤的叶柄末端浸入农杆菌悬液。在接种后，在无菌滤纸上将外植体吸干以除去过量的农杆菌培养物，并将外植体放在覆盖固体CCM培养基的圆形7cm Whatman纸上，使创伤侧接触该Whatman纸(见上文)。此滤纸防止根癌农杆菌在大豆外植体上过度生长。用Parafilm^TM"M"(American Na-tional Can,Chicago,Ill.,美国)包裹5个平板并在黑暗中或光下于25℃孵育3至5天。

3.3.4方法C：繁殖的腋生分生组织

为制备繁殖的腋生分生组织外植体，使用繁殖的3-4周龄的小植株。可从第1至第4个节制备腋生分生组织外植体。从每株幼苗可获得平均3至4个外植体。通过切割节间上腋节下方0.5至1.0cm，从小植株制备外植体，并从外植体移走叶柄和叶。用解剖刀切割腋生分生组织所在的尖端以诱导枝条从头生长并允许农杆菌接近靶细胞。因此，0.5cm外植体包括茎和芽。

在切割后，将外植体立即放入农杆菌悬液20至30分钟。在接种后，将外植体在无菌滤纸上吸干以除去过量的农杆菌培养物，然后视农杆菌菌株而定，将外植体几乎完全浸没于固体CCM中或置于覆盖在固体CCM上的圆形7cm滤纸上面。此滤纸防止农杆菌在大豆外植体上过度生长。用Parafilm^TM"M"(American National Can,Chicago,Ill.,美国)包裹平板并在黑暗中于25℃孵育2至3天。

3.4枝条诱导

于25℃在黑暗中共培养3至5天后，将外植体在液体SIM培养基(SIM参见Olhoft等,2007A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soyusing primary-node explants from seedlings In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant(2007)43:536–549；以除去过量的农杆菌)或Modwash培养基(1X B5主要盐、1X B5次要盐、1XMSIII铁、3％蔗糖、1X B5维生素、30mM MES、350mg/L Timentin^TM pH 5.6，WO2005/121345)中漂洗，并在无菌滤纸上吸干(以防止损伤，尤其是叶片上)，然后置于固体SIM培养基上。放置约5个外植体(方法A)或10至20个外植体(方法B和C)，以使靶组织直接接触培养基。在前2周，可用或不用选择培养基培养外植体。优选地，将外植体转移到不含选择剂的SIM上1周。

对于叶外植体(方法B)，外植体应置于培养基中，使得它与培养基的表面垂直，叶柄包埋在培养基中，叶片在培养基外。

对于繁殖的腋生分生组织(方法C)，将外植体置于培养基中，使得它与培养基的表面平行(向基的)，外植体部分包埋在培养基中。

用Scotch 394透气胶带(3M,St.Paul,Minn.,美国)包裹平板，置于生长箱中在平均温度25℃、18小时光照/6小时黑暗周期、70-100μE/m²s下2周。外植体留在含有或不含选择剂的SIM培养基上，直到在靶区域(例如在上胚轴上第一节处的腋生分生组织)上出现从头枝条生长。此时可转移到新鲜培养基。在约1周后，将外植体从含或不含选择剂的SIM转移到含选择剂的SIM。此时，在多种SIM中在叶外植体的叶柄基部(方法B)、在幼苗外植体的初生节(方法A)和在繁殖的外植体的腋生节(方法C)处有大量的从头枝条发育。

优选地，在共培养后至多2周移走转化前形成的全部枝条以刺激从分生组织的新生长。这有助于减少初级转化物的嵌合性并增加转基因分生组织细胞的扩增。在此期间可或可不将外植体切割为较小的片(即通过切割上胚轴从外植体分离节)。

3.5枝条延伸

在SIM培养基(优选含有选择剂)上2至4周后(或直到形成大量枝条)，将外植体转移到刺激枝条原基的枝条伸长的SEM培养基(枝条伸长培养基，参见Olhoft等,2007A novelAgrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soy using primary-node explants from seedlings.In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant(2007)43:536–549)。该培养基可或可不含有选择化合物。

每2至3周后，在仔细移走死亡组织后，将外植体转移到新鲜SEM培养基(优选含有选择剂)。外植体应当保持在一起而不裂成碎片并保持一定健康。继续转移外植体直至外植体死亡或枝条伸长。移走大于3cm的伸长的枝条，并视栽培种而定置于RM培养基中约1周(方法A和B)，或2至4周(方法C)，在此时开始形成根。在外植体有根的情况下，将它们直接转移到土壤中。将生根的枝条转移到土壤并在生长箱中硬化2至3周，然后转移到温室。用此方法获得的再生的植物是可育的并平均每株植物产生500颗种子。

在与根癌农杆菌共培养5天后，在幼苗腋生分生组织外植体上，特别是在外植体制备过程中创伤的区域内(方法A)，广泛分布目的基因(GOI)的瞬时表达。将外植体置于不含选择剂的枝条诱导培养基以观察初生节如何响应枝条诱导和再生。到此为止，大于70％的外植体在此区域形成新枝条。在SIM上14天后GOI的表达稳定，暗示T-DNA整合到大豆基因组中。此外，预实验导致在SIM上3周后形成表达cDNA的枝条。

对于方法C，使用繁殖的腋生分生组织方案的大豆小植株的平均再生时间是自外植体接种后14周。因此，此方法具有快速的再生时间，从而导致可育、健康的大豆植物。

实施例4：病原体测定试验

4.1植物的生长

将每个事件10株T₁植物载入盆中，在植物生长箱中生长3-4周(16小时白天和8小时夜晚节律、温度为16-22℃、湿度为75％)直到头2个具三小叶的叶片充分展开。

4.2接种

用豆薯层锈菌(P.pachyrhizi)的孢子接种植物。

为获得用于接种的适合的孢子材料，在接种前2-3天收集15-20天前感染了锈病的大豆叶并转移到琼脂平板(1％琼脂于水中)。将叶以正面放置在琼脂上，这允许真菌生长通过该组织并生产非常幼龄的孢子。将孢子从叶敲离并加入Tween-水溶液中以获得接种溶液。孢子的计数在光学显微镜下用Thoma计数室进行。为接种植物，将孢子悬液加入压缩空气操作的喷雾瓶并均匀地施加于植物或叶上，直到叶表面良好润湿。对于宏观测定，我们使用1-5x 10⁵孢子/m1的孢子密度。对于显微观察，使用大于5x10⁵孢子/m1的密度。将接种的植物置于平均22℃和大于90％空气湿度的温室培养箱中达24小时。然后在平均25℃和70％空气湿度的培养箱中继续培养。

实施例5：显微筛选

为评估病原体的发展，在感染后48小时用苯胺蓝对接种的植物叶进行染色。

苯胺蓝染色用于检测荧光物质。在宿主相互作用和非宿主相互作用中防御反应期间，积累或产生了例如酚类、胼胝质或木质素等物质，这些物质在细胞壁处局部掺入乳突中或掺入整个细胞中(超敏反应，HR)。与苯胺蓝缔合形成复合物，导致例如在胼胝质的情况下黄色荧光。将叶材料转移到含有脱色液II(乙醇/醋酸6/1)的falcon试管或皿中并在水浴中于90℃孵育10-15分钟。然后立即移除脱色液II，用水清洗叶片2次。为进行染色，将叶在染色液II(0.05％苯胺蓝＝甲基蓝，0.067M磷酸氢二钾)中孵育1.5-2小时并随后立即通过显微镜分析。

通过显微镜评估(计数)不同的相互作用类型。使用Olympus UV显微镜BX61(入射光)和UV Longpath滤镜(激发：375/15，分光器：405LP)。在苯胺蓝染色后，在UV光下孢子呈现蓝色。可通过绿/黄染色在真菌附着胞下识别乳突。以全细胞荧光表征了超敏反应(HR)。

实施例6：评估对大豆锈菌的易感性

通过估计叶背面(远轴侧)患病面积(被形成孢子的夏孢子堆所覆盖的面积)，对大豆锈菌的进程评分。此外也考虑叶的黄化(见图1)。

用豆薯层锈菌的孢子接种表达EIN2片段蛋白的所有36株T₁大豆植物(5个独立事件，每个事件6-9株)。在接种后14天，对接种的大豆植物抗豆薯层锈菌的大豆宏观疾病症状进行评分。

所有叶上显示真菌菌落或强烈黄化/棕化的叶面积的平均百分比被视为患病叶面积。与非转基因对照植物平行评估表达EIN2片段(通过RT-PCR检查表达)的全部36株T₁大豆植物。与转基因植物平行种植的非转基因大豆植物被用作对照。与野生型植物相比，表达重组EIN2片段的植物的患病叶面积的平均值如图9所示。与非转基因对照植物相比，对于所产生的所有事件和植物，EIN2片段的过表达平均将患病叶面积降低了38.8％。此数据清楚地显示，与非转基因对照相比，EIN2片段表达载体构建体在植物中的表达(见图2)可以导致转基因植物的较低的疾病评分。因此，在大豆中表达EIN2片段蛋白(如SEQ ID NO:3所示)可以显著(p<0.01)增加大豆对大豆锈菌的抗性。

实施例7：玉米表达盒的构建

以能进行进一步克隆的方式合成编码EIN2c-末端的核酸序列(如SEQ ID NO:2中所示)。然后通过将编码拟南芥EIN2c-末端基因的合成DNA克隆至SCBV254启动子(甘蔗杆状病毒启动子片段ScBV-254)的下游和t-nos终止子(根癌农杆菌胭脂碱合酶的3'UTR)的上游，在载体中组装表达盒。也将来自稻Met1基因的内含子克隆到启动子和EIN2c-末端序列之间。

使用例如pBi-nAR的植物转化双元载体(

和Willmitzer 1990,PlantSci.66:221-230)。植物双元载体的更多实例有pSUN300或pSUN2-GW载体和pPZP载体(Hajdukiewicz等,Plant Molecular Biology 25:989-994,1994)。作为靶标使用的双元植物转化载体的组成如下：(1)用于细菌选择的卡那霉素抗性盒，(2)用于在农杆菌中复制的pVS1起点，(3)用于在大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右和左边界之间处于ZmAHAS启动子控制下的作为可选择标志物的ZmAHAS基因。

通过将如上所述的表达盒连接到双元载体中来进行双元载体的构建。使用标准条件将包含表达盒的重组载体转化到Top10细胞(Invitrogen)中。37℃过夜培养在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上，选择经转化的细胞。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)按生产商的操作指南提取质粒DNA。按照标准分子生物学技术(Sambrook等,1989,“Molecu-lar Cloning:A Laboratory Manual,”第2版,Cold Spring Harbor Labora-tory Press,Cold Spring Harbor,NY)进行随后克隆的分析和限制性作图。

实施例8：玉米转化

在补充有合适抗生素的YP培养基中培养携带含有目的基因和突变的玉米AHAS基因的质粒的农杆菌细胞1-2天。收集一环农杆菌细胞并将其悬浮在1.8ml M-LS-002培养基(LS-inf)中。于1,200rpm震荡5分钟至3小时孵育培养物。在授粉后8-11天收获玉米棒。在20％Clorox溶液中对玉米棒消毒5分钟，接着喷洒70％乙醇，然后以灭菌水充分冲洗。切割0.8-2.0mm大小的不成熟胚到含有在LS-inf溶液中的农杆菌细胞的试管中。

按照修改自日本烟草农杆菌介导的植物转化方法(美国专利号5,591,616、5,731,179、6,653,529和美国专利申请公布号2009/0249514)的操作规程，将构建体转化到不成熟胚中。两类质粒载体用于转化。一类是在边界的左和右侧上各仅有一个T-DNA边界，可选择标志基因和目的基因位于左和右T-DNA边界之间。另一类是如日本烟草美国专利号No.5,731,179中描述的所谓的“双T-DNA构建体”。在双DNA构建体中，可选择标志基因位于一套T-DNA边界之间，目的基因包含在第2套T-DNA边界之间。两类质粒载体都可使用。将质粒载体电穿孔到农杆菌中。

通过将试管颠倒数次进行胚的农杆菌感染。将混合液倾倒在包含共培养培养基(M-LS-011)的平板表面上的滤纸盘上。移去液态琼脂溶液，在显微镜下检查胚，以盾片侧向上的方式放置。在黑暗中于22℃培养胚2-4天，转移到不含选择剂的M-MS-101培养基上孵育4至7天。然后将胚转移到含有0.75μM咪草烟(imazethapyr)的M-LS-202培养基上，于27℃培养3周，以选择经转化的愈伤组织细胞。

通过将抗性愈伤组织转移到添加有0.75μM咪草烟的M-LS-504培养基上，在光下于26℃培养2至3周来触发植物再生。然后将再生的枝条转移到包含M-MS-618培养基(0.5μM咪草烟)的生根盒中。将具有根的小植株转移到无泥土的盆栽混合物中，在生长室中培植一周，然后移植到较大的花盆并保持在温室中直到成熟。

转基因玉米植物生产也描述于例如美国专利号5,591,616和6,653,529、美国专利申请公布号2009/0249514、和WO/2006136596中，它们每个均通过参考就其全部内容并入本文。可以使用如美国专利号5,591,616、5,731,179，美国专利申请公布号2002/0104132等等中描述的农杆菌转化，进行玉米的转化。也可以采用Ishida等(Nature Biotech.,1996,14:745-750)描述的方法的修改版进行玉米(Zea mays L.)的转化。自交系A188(Universityof Minnesota)或以A188为亲本的杂交种是用于转化的良好的供体材料来源(Fromm等,Biotech,1990,8:833)，但是也可成功地使用其它基因型。在授粉后约11天(DAP)，从玉米植物收获穗，此时不成熟胚的长度为约1至1.2mm。以携带“超级双元”(“super binary”)载体的根癌农杆菌共培养不成熟胚，通过器官发生获得转基因植物。超级双元载体系统描述于WO 94/00977和WO 95/06722中。按所描述的，构建载体。可以使用多种选择标志基因，包括编码突变乙酰羟酸合成酶(AHAS)的玉米基因(美国专利号6,025,541)。类似地，可以使用各种启动子调控性状基因，以提供基因转录的组成型、发育的、可诱导的、组织或环境的调控。

可以使用切离的胚，可以在愈伤组织诱导培养基上培养切离的胚，然后在含有咪唑啉酮作为选择剂的玉米再生培养基上培养。在光下于25℃孵育培养皿2-3周，或直到枝条发育。从每个胚将绿色的枝条转移到玉米生根培养基上，于25℃培养2-3周，直到根发育。将生根的枝条移植到温室的土壤中。从表现对咪唑啉酮除草剂抗性和转基因PCR阳性的植物产生T1种子。

实施例9：镰孢(Fusarium)和刺盘孢(Colletotrichum)抗性筛选

于温室或植物生长箱内在控制的环境中在标准生长条件(20-25℃、60-90％湿度)下种植转基因植物。在植物进入繁殖阶段不久，使用镰孢属(Fusarium)物种或禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)的真菌孢子悬浮液(PBS溶液中105个孢子)在主茎基部附近接种转基因植物。于20-25℃和60-90％湿度下培育植物2-4周。

为了对疾病评分，将主茎切开，通过观察真菌在主茎上生长时真菌特有的棕色至黑色来对疾病的进程进行评分。通过指定目测分数，确定病害等级。每个实验中，对多于10株的转基因植物(和野生型植物作为对照)的患病叶面积进行评分。为了分析，将非转基因母株的平均患病叶面积设为100％来计算转基因株系的相对患病叶面积。

EIN2 c-末端基因的表达导致玉米对镰孢属(Fusarium)物种和禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)的增强的抗性。

Claims

1.用于在大豆植物、植物部分或植物细胞中增加抗层锈菌属(Phakopsora)真菌病原体的抗性的方法，

其中该方法包括步骤：与野生型大豆植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加大豆植物、植物部分或植物细胞中EIN2蛋白的表达和/或活性，

其中EIN2蛋白为SEQ ID NO:3的氨基酸序列，该EIN2蛋白赋予增强的抗层锈菌属真菌病原体的抗性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中EIN2蛋白由以下编码：

(i)SEQ ID NO:1或2的外源核酸；或

(ii)编码SEQ ID NO:3的外源核酸；或

(iii)与以上(i)至(ii)的任何核酸编码相同的EIN2蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(ii)的核酸的外源核酸。

3.根据权利要求1所述的方法，包括：

(a)以表达盒稳定地转化植物细胞，所述表达盒包含与启动子功能性连接的

(i)SEQ ID NO:1或2的外源核酸；或

(ii)编码SEQ ID NO:3的外源核酸；或

(iii)与以上(i)至(ii)的任何核酸编码相同的EIN2蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(iii)的核酸的外源核酸；

(b)从植物细胞再生植物；和

(c)表达所述外源核酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其中启动子为组成型启动子、病原体可诱导启动子、叶肉特异性启动子或表皮特异性启动子。

5.制备具有增加的真菌病原体抗性的大豆转基因植物、转基因植物部分或转基因细胞的方法，其中所述真菌抗性是抗层锈菌属(Phakopsora)真菌病原体抗性，所述方法包括用重组载体构建体转化大豆植物、植物部分或植物细胞，

其中所述重组载体构建体包含

(a)编码ENI2蛋白的核酸，其中EIN2蛋白为SEQ ID NO:3的氨基酸序列，该EIN2蛋白赋予增强的抗层锈菌属真菌抗性，

其中(a)的核酸与(b)启动子和(c)转录终止序列有效连接。

6.根据权利要求5所述的方法，其中编码EIN2蛋白的核酸选自：

(i)具有SEQ ID NO:1或2的核酸；或

(ii)编码SEQ ID NO:3的核酸；或

(iii)与以上(i)至(ii)的任何核酸编码相同的EIN2蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于以上(i)至(ii)的核酸的核酸。

7.根据权利要求5所述的方法，其中启动子为组成型启动子、病原体可诱导启动子、叶肉特异性启动子或表皮特异性启动子。

8.用于生产具有增加的抗真菌抗性的大豆转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，其中所述真菌抗性是抗层锈菌属(Phakopsora)真菌病原体抗性，所述方法包括：

(a)将编码EIN2蛋白的核酸引入到大豆植物、植物部分或植物细胞中；

(b)从大豆植物、植物部分或植物细胞产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞；和

(c)表达所述EIN2蛋白，其中EIN2蛋白为SEQ ID NO:3的氨基酸序列，该EIN2蛋白赋予增强的抗层锈菌属真菌抗性。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述EIN2蛋白由以下核酸编码：

(i)SEQ ID NO:1或2的外源核酸；或

(ii)编码SEQ ID NO:3的外源核酸；或

10.根据权利要求8所述的方法，还包括收获大豆转基因植物的种子、种植种子和使种子生长成植物，其中长成的植物包含：

(i)SEQ ID NO:1或2的外源核酸；或

(ii)编码SEQ ID NO:3的外源核酸；或

11.根据权利要求2至3任一项所述的任何外源核酸或根据权利要求5或6或7所述的重组载体构建体用于转化大豆植物、植物部分或植物细胞以提供具有抗层锈菌属(Phakopsora)真菌抗性的大豆植物、植物部分或植物细胞的用途。

12.生产权利要求5至10任一项所述的大豆转基因植物的可收获部分的方法，其包括从权利要求5至10任一项所述的方法获得具有抗层锈菌属(Phakopsora)真菌抗性的大豆转基因植物，从所述转基因植物获得植物可收获部分。

13.根据权利要求12所述的方法，其中可收获部分为转基因大豆种子。

14.根据权利要求8或12所述的方法，还包括从获得的大豆植物或从获得的大豆植物可收获部分产生产品。

15.根据权利要求14所述的方法，其中产品为大豆粉或大豆油。

16.生产产品的方法，包括：

a)种植可通过权利要求5至10任一项所述的方法得到的转基因大豆植物，和

b)从或通过植物和/或植物的部分，生产所述产品。

17.根据权利要求16的方法，包括：

a)种植可通过权利要求5至10任一项所述的方法得到的转基因大豆植物，并从植物上移下可收获部分；和

b)从或通过植物的可收获部分生产所述产品。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述可收获部分是大豆种子。

19.根据权利要求16或17所述的方法，其中产品为大豆粉或大豆油。

20.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中真菌抗性为对大豆锈病的抗性。

21.根据权利要求20所述的方法，其中对大豆锈病的抗性为对山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)和/或豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)的抗性。

22.用于培育抗层锈菌属(Phakopsora)真菌抗性植物的方法，包括：

(a)将可通过权利要求5至10任一项所述的方法获得的植物与第二植物杂交；

(b)从步骤(a)的杂交得到种子；

(c)种植所述种子并使种子生长成植物；和

(d)从所述植物选择表达EIN2蛋白的植物，其中所述EIN2蛋白为SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述EIN2蛋白由以下编码：

(i)SEQ ID NO:1或2的外源核酸；或

(ii)编码SEQ ID NO:3的外源核酸；或

24.根据权利要求22所述的方法，其中获得所述真菌抗性大豆植物的可收获部分。

25.根据权利要求11所述的用途，其中真菌抗性为对大豆锈病的抗性。

26.根据权利要求25所述的用途，其中对大豆锈病的抗性为对山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)和/或豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)的抗性。