CN112888791A - 通过快速温育和核酸富集来鉴定和分析微生物样本 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于使用核苷或核苷酸类似物鉴定和分析样本中微生物体的方法、组合物和试剂盒。

Description

通过快速温育和核酸富集来鉴定和分析微生物样本

相关申请的交叉引用

本申请按照美国法典第35卷第119条要求2019年4月29日提交的临时申请序列号62/840,322的优先权，其公开内容以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及用于使用核苷或核苷酸类似物鉴定和分析样本中微生物体的方法、组合物和试剂盒。

背景技术

确定患者是否患有微生物感染是常见的临床挑战。败血症是住院患者最常见的死亡原因，在美国每年估计有20万人死亡。然而，败血症是不精确的临床综合征，具有可变的临床表现。诊断通常基于对感染的怀疑，结合器官功能障碍的迹象。败血症的早期诊断和抗生素施用至关重要，因为进展为严重败血症或败血性休克会产生严重的后果。遗憾的是，在重病患者中区分败血症和其他炎性病症通常具有挑战性。检测血液中的细菌感染是诊断败血症并开始使用抗微生物剂治疗的关键步骤。然而，在严重败血症的患者中有60％至70％的患者血液培养物呈阴性，并且在研究中有>80％的患者血液培养物呈阴性。此外，传统微生物学方法花费的时间太长，无法影响针对病原菌的一线疗法。PCR和质谱的发展增加了鉴定血液样本中细菌的可能性，但通常依赖于耗时的分析前处理(诸如血液培养)以增加病原体负荷。感染的替代物包括增加的循环细胞因子和急性期蛋白，诸如C反应蛋白；然而，它们的浓度在生理事件(诸如分娩)或病理组织损伤(诸如烧伤)期间也会增加。通常对于败血症，进行血液培养测试，以试图确定引起血液感染的细菌或真菌的类型。将血液培养物与其他血液测试分开收集，通常从不同的静脉中采集不止一次。可能需要几天才能获得血液培养的结果。由于体外培养条件，仅三分之一至二分之一的败血症人群将具有呈阳性的血液培养物，这意味着细菌实际上在体外条件下会生长和增殖。

发明内容

目前，细菌的检测通常需要培养，以便(1)分离用于分析的细菌，以及(2)减少任何可能使分析困难或不可能的污染背景细胞或其他物质。例如，在败血症患者中，必须培养血液以分离病原菌。类似地，在食品监测中，必须培养样本以分离污染微生物。遗憾的是，标准培养过程可能需要数天。就败血症而言，该滞后时间可导致不必要的抗生素施用或误诊，从而导致患者并发症或死亡。在食品行业中，该滞后时间会延迟将导致召回或其他预防措施的信息。因此，对活动性感染的快速检测可采取能够减少问题并挽救人类生命的措施。

虽然PCR检测方法可能不需要长期培养，但与无偏测序方法相反，PCR需要感兴趣的生物体的基因组序列的先验知识。也就是说，研究人员必须知道他们在寻找什么，而对于稀有或未发现的生物体来说，情况可能不是这样。另外，PCR依赖性方法仅检测样本中遗传物质的存在，并且不能区分该物质是来自活生物体还是死生物体。在许多情况下，识别由活微生物体引起的活动性感染是治疗选择甚至是识别食品或环境中的污染物的最重要考虑因素。

本公开提供了一种用于鉴定和分析样本中的活的和/或增殖的微生物体的方法，该方法包括：(a)获得具有或疑似具有一种或多种类型的微生物的样本；(b)在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育该样本，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物掺入到新合成的微生物核酸中；(c)通过使新合成的微生物核酸与标记试剂接触来标记新合成的微生物核酸，该标记试剂选择性地结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物或与之结合；(d)分离或纯化该带标记的新合成的微生物核酸；以及(e)基于测序或确定分离的或纯化的新合成的微生物核酸的种类，确定样本中活的和/或增殖的微生物体的种类。在另一个实施方案中，样本获自患有或疑似患有微生物感染的受试者。在另一个实施方案中，受试者患有或疑似患有败血症。在另一个实施方案中，对于(a)，在(b)之前使用去宿主(dehost)方法处理所获得的样本，以便选择性地移除非微生物核酸。在另一个实施方案中，去宿主方法包括：通过以下方式移除非微生物核酸：(i)通过使所获得的样本与重组蛋白接触来选择性地切割非微生物DNA，该重组蛋白包含：结合结构域，该结合结构域选择性地结合到由组蛋白结合的非微生物核酸或包含甲基化CpG残基的非微生物核酸；以及具有切割核酸的活性的核酸酶结构域；或(ii)使用结合到固体底物的亲和剂，该固体底物选择性地结合到由组蛋白结合的核酸或选择性地结合到非微生物核酸的甲基化CpG残基。在某个实施方案中，样本为从环境测试场所获得的环境样本。在另一个实施方案中，测试环境场所的微生物污染。在另一个实施方案中，样本为从疑似有微生物污染的食品获得的样本。在另一个实施方案中，一种或多种类型的微生物体为细菌、真菌、病毒、藻类、古细菌和/或原生动物。在另一个实施方案中，细菌选自衣氏放线菌(Actinomyces israelii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、韩瑟勒巴通氏菌(Bartonella henselae)、五日热巴通氏菌(Bartonella quintana)、百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)、埃氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、回归热包柔氏螺旋体(Borreliarecurrentis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布氏杆菌(Brucella canis)、羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringen)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、圣地罗西钩端螺旋体(Leptospira santarosai)、韦氏钩端螺旋体(Leptospira weilii)、野口氏钩端螺旋体(Leptospira noguchii)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次氏立克次体(Rickettsia rickettsia)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)和/或假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)。在另一个实施方案中，真菌选自伞状犁头霉(Absidia corymbifera)、分枝梨头霉(Absidia ramose)、Achorion gallinae、马杜拉放线菌属(Actinomadura spp.)、皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatididis)、Aleurisma brasiliensis、Allersheria boydii、节皮菌属(Arthroderma spp.)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatu)、蛙粪霉属(Basidiobolus spp.)、芽生菌属(Blastomyces)、背芽突霉属(Cadophora spp.)、白假丝酵母(Candida albicans)、芹菜尾孢菌(Cercospora apii)、金孢子菌属(Chrysosporium spp.)、枝孢菌属(Cladosporium spp.)、Cladothrix asteroids、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、罗伦隐球菌(Cryptococcus laurentii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)、Dematiumwernecke、衣氏盘状菌(Discomyces israelii)、埃蒙斯菌属(Emmonsia spp.)、Emmonsiella capsulate、地霉内孢霉(Endomyces geotrichum)、Entomophthoracoronate、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、新型线黑粉菌(Filobasdiellaneoformans)、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、白地霉(Geotrichumcandidum)、Glenosporakhartoumensis、石膏样裸囊菌(Gymnoascus gypseus)、小单孢子囊素(Haplosporangiumparvum)、组织胞浆菌(Histoplasma)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、Hormiscium dermatididis、着色芽生菌属(Hormodendrum spp.)、角质霉菌属(Keratinomyces spp.)、Langeronia soudanense、塞内加尔小球腔菌(Leptosphaeriasenegalensis)、伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)、Lobmyces loboi、罗布菌(Loboaloboi)、洛博芽生菌病(Lobomycosis)、马杜拉分支菌属(Madurella spp.)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、石榴碱微球菌(Micrococcus pelletieri)、小孢子菌属(Microsporum spp.)、念珠菌属(Monilia spp.)、毛霉属(Mucor spp.)、结核分枝杆菌、奈尼兹皮真菌属(Nannizzia spp.)、罗萨梯新龟甲形菌(Neotestudina rosatii)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)、白色粉孢(Oidium albicans)、乳卵孢子菌(Oospora lactis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、鲍埃得彼得利壳菌(Petriellidiumboydii)、瓶霉属(Phialophora spp.)、何德毛结节菌(Piedraia hortae)、糠秕孢子菌(Pityrosporum furfur)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)(或卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii))、Pullularia gougerotii、罗梅罗刺壳孢菌(Pyrenchaetaromeroi)、西伯鼻孢子菌(Rhinosporidium seeberi)、小孢子霉属(Sabouraudites)(小孢霉属(Microsporum))、Sartorya fumigate、黄瘤孢属(Sepedonium)、孢子丝菌属(Sporotrichum spp.)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、黑葡萄穗霉(Stachybotryschartarum)、链霉菌属(Streptomyce spp.)、皮肤癣菌属(Tinea spp.)、圆酵母属(Torulaspp.)、毛癣菌属(Trichophyton spp.)、毛孢子菌属(Trichosporon spp.)和/或粉红楚普夫菌(Zopfia rosatii)。在另一个实施方案中，病毒选自单纯病毒、水痘病毒、细胞巨化病毒、玫瑰疱疹病毒、淋巴潜隐病毒、猴病毒、哺乳动物腺病毒、α-乳头瘤病毒、β-乳头瘤病毒、X-乳头瘤病毒、γ-乳头瘤病毒、丑型乳头瘤病毒、寅型乳头瘤病毒、甲型多瘤病毒、乙型多瘤病毒、γ-多瘤病毒、丁型多瘤病毒、软疣痘病毒、正痘病毒、副痘病毒、α-TTV、β-TTV、γ-TTV、圆环病毒、格环病毒(Gemycircular)、Gemykibivirus、Gemyvongvirus、红病毒、依赖病毒、博卡病毒、正肝去氧核糖核酸病毒、γ逆转录病毒、δ-逆转录病毒、慢病毒、逆转录病毒科、科罗病毒、轮状病毒、东南亚十二RNA病毒、α-冠状病毒、β-冠状病毒、环曲病毒、哺乳动物星状病毒、诺罗病毒、札幌病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、心病毒、柯萨病毒、肠病毒、肝病毒、嵴病毒、副肠孤病毒、Rosavirus、萨佩洛病毒(Salivirus)、甲病毒、风疹病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、亨尼巴病毒、麻疹病毒、呼吸道病毒、腮腺炎病毒、偏肺病毒、正肺病毒(Orthopneumovirus)、Ledantevirus、狂犬病毒、水泡病毒、哺乳类沙粒病毒(Mammarenavirus)、正内罗病毒(Orthonairovirus)、正本雅病毒(Orthobunyavirus)、白蛉病毒、α-流感病毒、β-流感病毒、γ-流感病毒、Quaranjavirus、托高土病毒和/或δ病毒。在另一个实施方案中，一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2-乙炔基-腺苷、N6-炔丙基-腺苷、2'-(O-炔丙基)-腺苷、3'-(O-炔丙基)-腺苷、5-乙炔基-胞苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷、2'-(O-炔丙基)-胞苷、3'-(O-炔丙基)-胞苷、2'-(O-炔丙基)-鸟苷、3'-(O-炔丙基)-鸟苷、5-乙炔基-尿苷、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷、2'-(O-炔丙基)-尿苷、3'-(O-炔丙基)-尿苷、(2'S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、8-叠氮基-腺苷、N⁶-(6-叠氮基)己基-2'-脱氧-腺苷、2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、5-叠氮基甲基-尿苷、5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷、5-(3-叠氮基丙基)-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-胞苷、5-叠氮基-PEG₄-2'-脱氧胞苷、5-溴-2'-脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-碘-2'脱氧尿苷和5-碘尿苷。在另一个实施方案中，一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2-乙炔基-腺苷、N6-炔丙基-腺苷、2'-(O-炔丙基)-腺苷、3'-(O-炔丙基)-腺苷、5-乙炔基-胞苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷、2'-(O-炔丙基)-胞苷、3'-(O-炔丙基)-胞苷、2'-(O-炔丙基)-鸟苷、3'-(O-炔丙基)-鸟苷、5-乙炔基-尿苷、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷、2'-(O-炔丙基)-尿苷、3'-(O-炔丙基)-尿苷、(2'S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷和(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷。在另一个实施方案中，一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自8-叠氮基-腺苷、N⁶-(6-叠氮基)己基-2'脱氧-腺苷，其中一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、5-叠氮基甲基-尿苷、5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷、5-(3-叠氮基丙基)-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-胞苷和5-叠氮基-PEG₄-2'-脱氧胞苷。在另一个实施方案中，一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自5-溴-2'脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-碘-2'脱氧尿苷和5-碘尿苷。在另一个实施方案中，将样本在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育5分钟至180分钟。在另一个实施方案中，将样本在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育30分钟至120分钟。在另一个实施方案中，标记试剂是以高特异性结合到一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的抗体。在具体实施方案中，抗体以高特异性结合到5-溴-2'脱氧尿苷或碘脱氧尿苷。在另一个实施方案中，标记试剂通过点击化学、应变[3+2]环加成反应或施陶丁格连接而结合到一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物或与之结合。在另一个实施方案中，标记试剂包含叠氮基团，该叠氮基团通过点击化学而结合到包含炔基基团的核苷或核苷酸类似物。在另一个实施方案中，标记试剂包含炔基基团，该炔基基团通过点击化学而结合到包含叠氮基团的核苷或核苷酸类似物。在某个实施方案中，标记试剂包含生物素基团。在另一个实施方案中，包含生物素基团的标记试剂选自：

在另一个实施方案中，标记试剂还包含可化学切割的接头或可酶切割的接头。在另一个实施方案中，可切割接头是基于酸不稳定性的接头或基于二硫化物的接头。在某个实施方案中，基于酸不稳定性的接头包含腙或顺式乌头酰基基团。在另一个实施方案中，可酶切割的接头包括基于肽的接头或基于β-葡糖苷酸的接头。在另一个实施方案中，下拉(pulldown)剂用于分离或纯化带标记的新合成的微生物核酸。在另一个实施方案中，下拉试剂为固定到固体载体上的抗体，其中该抗体以高特异性结合到标记试剂，或以高特异性结合到一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物。在另一个实施方案中，下拉试剂为固定到固体载体上的链霉亲和素或亲和素，并且其中标记试剂包含生物素基团。在某个实施方案中，固体载体是纳米材料或微米材料、小珠或板。在另一个实施方案中，在上述(e)之前，从分离的或纯化的新合成的微生物核酸中移除或切割标记试剂或标记。在另一个实施方案中，分离的或纯化的新合成的微生物核酸的种类通过使用包含来自不同微生物体的核酸的探针的微阵列来确定。在另一个实施方案中，分离的或纯化的新合成的微生物核酸的种类通过以下步骤确定：(i)使用基于第一PCR的方法，使用包含荧光染料的引物扩增该分离的或纯化的新合成的微生物核酸，以形成标记产物，其中该引物包含对保守的微生物16S rRNA基因区具有特异性的序列；(ii)将该标记产物施加到包含探针的微阵列，该探针包含来自20种或更多种微生物体的独特的16srRNA可变区序列；(iii)基于对微阵列的荧光杂交产物成像来确定活的和/或增殖的微生物体的种类，并基于微阵列探针的序列来确定微生物体的种类。在另一个实施方案中，通过对分离的或纯化的新合成的微生物核酸进行测序来确定或确认分离的或纯化的新合成的微生物核酸的种类。在另一个实施方案中，使用基于转座体的测序方法，对分离的或纯化的新合成的微生物核酸进行测序。在另一个实施方案中，新合成的微生物核酸的测序通过以下方式进行：(a)将分离的或纯化的新合成的微生物核酸施加到小珠连接的转座体，其中该小珠连接的转座体同时介导微生物核酸的片段化和测序引物的添加；(b)用包含索引序列和衔接子序列的引物扩增该微生物核酸片段以形成扩增产物文库；(c)洗涤并合并该扩增产物文库；(d)对该扩增产物文库进行测序；以及(e)基于使用生物信息学分析将获自该扩增产物文库的序列与已知微生物体序列的数据库相关联，确定活的和/或增殖的微生物体的种类。在另一个实施方案中，新合成的微生物核酸是RNA，其中在上述(e)之前将微生物RNA逆转录成cDNA，并且其中活的和/或增殖的微生物体的基因表达可基于使用微阵列和/或通过测序而分析来自新合成微生物RNA的基因产物的表达水平来确定。

在具体实施方案中，本公开还提供了一种用于确定抗微生物剂在调节样本中微生物体的生长和增殖方面的有效性的方法，该方法包括：(a)获得具有或疑似具有一种或多种类型的微生物体的样本；(b)将该样本分成两个样本：对照样本和处理样本；(c)在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育对照样本，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物掺入到新合成的微生物核酸中；(c')在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物和抗微生物剂的存在下温育处理样本，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物掺入到新合成的微生物核酸中；(d)通过使对照样本和处理样本的新合成的微生物核酸与标记试剂接触来标记该新合成的微生物核酸，该标记试剂选择性地结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物或与之结合；(e)从对照样本和处理样本中分离或纯化该带标记的新合成的微生物核酸；(f)确定对照样本中分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量或种类；(f’)确定处理样本中分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和种类；(g)将对照样本中分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和/或种类与处理样本中分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量或种类进行比较并确定其任何变化，其中如果处理样本中新合成的微生物核酸的基因表达水平与对照样本相比降低，或者处理样本中新合成的微生物核酸的量和/或种类与对照样本相比降低，则表明抗微生物剂在调节微生物体的生长和增殖方面是有效的。在另一个实施方案中，抗微生物剂选自抗生素、抗真菌剂和抗病毒药。在另一个实施方案中，抗生素选自阿莫西林、氨苄青霉素、巴氨西林、羧苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、匹氨西林、匹美西林、羟基噻吩青霉素、头孢乙腈、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢来星、头孢洛宁、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢曲秦、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑啉、头孢拉定、头孢甲氧环烯胺、头孢替唑、头孢克洛、头孢孟多、头孢美唑、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢唑南、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地秦、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢泊肟、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克定、头孢吡肟、头孢瑞南、头孢噻利、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢托罗、头孢洛林、头孢氯嗪、头孢罗兰、头孢帕罗、头孢卡奈、头孢屈洛、头孢吡酮、头孢三唑、头孢维曲、头孢马替林、cefmepidium、头孢维星、头孢噁唑、头孢罗替、头孢舒米、头孢呋汀、头孢噻氧、氨曲南、亚胺培南、多利培南、厄他培南、美罗培南、阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、地红霉素、罗红霉素、泰利霉素、克林霉素、林可霉素、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素、氟甲喹、萘啶酸、噁喹酸、吡咯米酸、吡哌酸、罗索沙星、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、芦氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、格雷沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、司帕沙星、替马沙星、托氟沙星、贝西沙星、德拉沙星、克林沙星、吉米沙星、普卢利沙星、西他沙星、曲伐沙星、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、复方磺胺甲噁唑、地美环素、强力霉素、米诺环素、氧四环素、四环素、替加环素、万古霉素、替考拉宁、特拉万星、利奈唑胺、环丝氨酸、利福平、利福布汀、利福喷汀、利福拉齐、紫霉素、卷曲霉素、杆菌肽、多粘菌素B、氯霉素、甲硝唑、替硝唑和呋喃妥因。在另一个实施方案中，抗真菌剂选自阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、酮康唑、异康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑、阿巴康唑、艾氟康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、两性霉素B、制霉菌素、纳他霉素、曲古霉素、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、托萘酯、氟胞嘧啶、布替萘芬、灰黄霉素、环吡酮、硫化硒、塔瓦布尔(tavaborole)。在另一个实施方案中，抗病毒药选自阿昔洛韦、溴夫定、二十二醇、泛昔洛韦、膦甲酸、碘苷、喷昔洛韦、三氟尿苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、伐昔洛韦、曲金刚胺(tromatandine)、普立替韦、金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦、帕拉米韦、扎那米韦、阿那匹韦、波西普韦、西鲁瑞韦、丹诺普韦、福达瑞韦(faldaprevir)、格拉卡匹韦、格佐普韦、那拉匹韦、帕利瑞韦、西咪匹韦、西美瑞韦(sovaprevir)、特拉匹韦、伐尼瑞韦、vedroprevir、伏西瑞韦(voxilaprevir)、达卡他韦、艾尔巴韦、雷迪帕韦、奥达拉斯韦、奥比他韦、哌仑他韦、拉维达韦、ruzasvir、samatasvir、维帕他韦、贝克拉布韦、达萨布韦、地乐波韦(deleobuvir)、非利布韦(filibuvir)、色曲布韦(setrobuvir)、索非布韦、radalbuvir、乌普立布韦(uprifosbuvir)、拉米夫定、替比夫定、克拉夫定、阿德福韦、替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺、恩夫韦地、马拉韦罗、维立韦罗、赛尼克韦罗、PRO 140、伊巴珠单抗、fostemsavir、地达诺新、恩曲他滨、拉米夫定、司他夫定、齐多夫定、氨多索韦、阿立他滨、森沙戊定(censavudine)、艾夫他滨、拉西韦(racivir)、stampidine、4'-乙炔基-2-氟-2'-脱氧腺苷、扎西他滨、依法韦仑、奈韦拉平、地拉韦定、依曲韦林、利匹韦林、多拉韦林、度鲁特韦、埃替格韦、雷特格韦、BI 224436、卡博格韦(cabotegravir)、比卡格韦、MK-2048、贝韦立马、BMS-955176、安普那韦、膦沙那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、利托那韦、沙喹那韦、阿扎那韦、达芦那韦、替拉那韦、度鲁特韦、埃替格韦、雷特格韦、BI 224436、卡博格韦、比卡格韦、MK-2048、可比司他、利托那韦、干扰素-α、聚乙二醇干扰素-α、甲吲噻腙、利福平、咪喹莫特、瑞喹莫德、鬼臼毒素、福米韦森、西多福韦、普来可那立、法匹拉韦、加利地韦(galidesivir)、瑞德西韦、美立他滨(mericitabine)、MK-608、NITD008、吗啉胍、曲金刚胺和三氮唑核苷(triazavirin)。在另一个实施方案中，样本获自患有或疑似患有微生物感染的受试者。在具体实施方案中，受试者患有或疑似患有败血症。在另一个实施方案中，

一种或多种类型的微生物体为细菌、真菌和/或病毒。在另一个实施方案中，细菌选自衣氏放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、韩瑟勒巴通氏菌、五日热巴通氏菌、百日咳博代氏杆菌、博氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、埃氏疏螺旋体、回归热包柔氏螺旋体、流产布鲁氏菌、犬布氏杆菌、羊布鲁氏杆菌、猪布鲁氏杆菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肉毒梭状芽孢杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺性军团杆菌、问号钩端螺旋体、圣地罗西钩端螺旋体、韦氏钩端螺旋体、野口氏钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、立克次氏立克次体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内志贺菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、梅毒螺旋体、解脲支原体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和/或假结核耶尔森菌。在另一个实施方案中，真菌选自伞状犁头霉、分枝梨头霉、Achorion gallinae、马杜拉放线菌属、皮炎组织胞浆菌、Aleurismabrasiliensis、Allersheria boydii、节皮菌属、黄曲霉、烟曲霉、蛙粪霉属、芽生菌属、背芽突霉属、白假丝酵母、芹菜尾孢菌、金孢子菌属、枝孢菌属、Cladothrix asteroids、粗球孢子菌、白色隐球菌、格特隐球菌、罗伦隐球菌、新型隐球菌、雅致小克银汉霉、Dematiumwernecke、衣氏盘状菌、埃蒙斯菌属、Emmonsiella capsulate、地霉内孢霉、Entomophthoracoronate、絮状表皮癣菌、新型线黑粉菌、着色真菌属、白地霉、Glenosporakhartoumensis、石膏样裸囊菌、小单孢子囊素、组织胞浆菌、荚膜组织胞浆菌、Hormisciumdermatididis、着色芽生菌属、角质霉菌属、Langeronia soudanense、塞内加尔小球腔菌、伞状毛霉菌、Lobmyces loboi、罗布菌、洛博芽生菌病、马杜拉分支菌属、糠秕马拉色菌、石榴碱微球菌、小孢子菌属、念珠菌属、毛霉属、结核分枝杆菌、奈尼兹皮真菌属、罗萨梯新龟甲形菌、诺卡氏菌属、白色粉孢、乳卵孢子菌、巴西副球孢子菌、鲍埃得彼得利壳菌、瓶霉属、何德毛结节菌、糠秕孢子菌、耶氏肺孢子菌或卡氏肺孢子菌、Pullularia gougerotii、罗梅罗刺壳孢菌、西伯鼻孢子菌、小孢子霉属(小孢霉属(Microsporum))、Sartorya fumigate、黄瘤孢属、孢子丝菌属、葡萄穗霉属、黑葡萄穗霉、链霉菌属、皮肤癣菌属、圆酵母属、毛癣菌属、毛孢子菌属和/或粉红楚普夫菌。在另一个实施方案中，病毒选自单纯病毒、水痘病毒、细胞巨化病毒、玫瑰疱疹病毒、淋巴潜隐病毒、猴病毒、哺乳动物腺病毒、α-乳头瘤病毒、β-乳头瘤病毒、X-乳头瘤病毒、γ-乳头瘤病毒、丑型乳头瘤病毒、寅型乳头瘤病毒、甲型多瘤病毒、乙型多瘤病毒、γ-多瘤病毒、丁型多瘤病毒、软疣痘病毒、正痘病毒、副痘病毒、α-TTV、β-TTV、γ-TTV、圆环病毒、格环病毒、Gemykibivirus、Gemyvongvirus、红病毒、依赖病毒、博卡病毒、正肝去氧核糖核酸病毒、γ逆转录病毒、δ-逆转录病毒、慢病毒、逆转录病毒科、科罗病毒、轮状病毒、东南亚十二RNA病毒、α-冠状病毒、β-冠状病毒、环曲病毒、哺乳动物星状病毒、诺罗病毒、札幌病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、心病毒、柯萨病毒、肠病毒、肝病毒、嵴病毒、副肠孤病毒、Rosavirus、萨佩洛病毒、甲病毒、风疹病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、亨尼巴病毒、麻疹病毒、呼吸道病毒、腮腺炎病毒、偏肺病毒、正肺病毒、Ledantevirus、狂犬病毒、水泡病毒、哺乳类沙粒病毒、Orthohantavirus、正内罗病毒、正本雅病毒、白蛉病毒、α-流感病毒、β-流感病毒、γ-流感病毒、Quaranjavirus、托高土病毒和/或δ病毒。在某个实施方案中，一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2-乙炔基-腺苷、N6-炔丙基-腺苷、2'-(O-炔丙基)-腺苷、3'-(O-炔丙基)-腺苷、5-乙炔基-胞苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷、2'-(O-炔丙基)-胞苷、3'-(O-炔丙基)-胞苷、2'-(O-炔丙基)-鸟苷、3'-(O-炔丙基)-鸟苷、5-乙炔基-尿苷、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷、2'-(O-炔丙基)-尿苷、3'-(O-炔丙基)-尿苷、(2'S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、8-叠氮基-腺苷、N⁶-(6-叠氮基)己基-2'-脱氧-腺苷、2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、5-叠氮基甲基-尿苷、5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷、5-(3-叠氮基丙基)-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-胞苷、5-叠氮基-PEG₄-2'-脱氧胞苷、5-溴-2'-脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-碘-2'脱氧尿苷和5-碘尿苷。在另一个实施方案中，一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2-乙炔基-腺苷、N6-炔丙基-腺苷、2'-(O-炔丙基)-腺苷、3'-(O-炔丙基)-腺苷、5-乙炔基-胞苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷、2'-(O-炔丙基)-胞苷、3'-(O-炔丙基)-胞苷、2'-(O-炔丙基)-鸟苷、3'-(O-炔丙基)-鸟苷、5-乙炔基-尿苷、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷、2'-(O-炔丙基)-尿苷、3'-(O-炔丙基)-尿苷、(2'S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷和(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷。在另一个实施方案中，一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自8-叠氮基-腺苷、N⁶-(6-叠氮基)己基-2'脱氧-腺苷，其中一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、5-叠氮基甲基-尿苷、5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷、5-(3-叠氮基丙基)-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-胞苷和5-叠氮基-PEG₄-2'-脱氧胞苷。在具体实施方案中，一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自5-溴-2'脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-碘-2'脱氧尿苷和5-碘尿苷。在另一个实施方案中，将对照样本和处理样本均在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育相同的时间段，即5分钟至180分钟。在另一个实施方案中，将对照样本和处理样本均在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育相同的时间段，即30分钟至120分钟。在另一个实施方案中，标记试剂是以高特异性结合到一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的抗体。在另一个实施方案中，抗体以高特异性结合到5-溴-2'脱氧尿苷或碘脱氧尿苷。在某个实施方案中，标记试剂通过点击化学、应变[3+2]环加成反应或施陶丁格连接而结合到一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物或与之结合。在另一个实施方案中，标记试剂包含叠氮基团，该叠氮基团通过点击化学而结合到包含炔基基团的核苷或核苷酸类似物。在另一个实施方案中，标记试剂包含炔基基团，该炔基基团通过点击化学而结合到包含叠氮基团的核苷或核苷酸类似物。在另一个实施方案中，标记试剂包含生物素基团。在具体实施方案中，包含生物素基团的标记试剂选自：

在另一个实施方案中，标记试剂还包含可化学切割的接头或可酶切割的接头。在另一个实施方案中，可切割接头是基于酸不稳定性的接头或基于二硫化物的接头。在另一个实施方案中，基于酸不稳定性的接头包含腙或顺式乌头酰基基团。在另一个实施方案中，可酶切割的接头包括基于肽的接头或基于β-葡糖苷酸的接头。在具体实施方案中，下拉剂用于分离或纯化带标记的新合成的微生物核酸。在另一个实施方案中，下拉试剂为固定到固体载体上的抗体，其中该抗体以高特异性结合到标记试剂，或以高特异性结合到一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物。在另一个实施方案中，下拉试剂为固定到固体载体上的链霉亲和素或亲和素，并且其中标记试剂包含生物素基团。在另一个实施方案中，固体载体是纳米材料或微米材料、小珠或板。在另一个实施方案中，在上述(f)、(f')和(g)之前，从分离的或纯化的新合成的微生物核酸中移除或切割标记试剂或标记。在另一个实施方案中，通过使用包含来自不同微生物体的核酸的探针的微阵列来确定对照样本和处理样本中分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和/或种类。在另一个实施方案中，对照样本和处理样本中分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和/或种类通过以下步骤确定：(i)使用基于第一PCR的方法，使用包含荧光染料的引物扩增来自对照样本的分离的或纯化的新合成的微生物核酸，以形成标记产物，其中该引物包含对保守的微生物16S rRNA基因区具有特异性的序列；(i')使用基于第一PCR的方法，使用包含荧光染料的引物扩增来自处理样本的分离的或纯化的新合成的微生物核酸，以形成标记产物，其中该引物包含对保守的微生物16S rRNA基因区具有特异性的序列；(ii)将来自对照样本的标记产物施加到包含探针的第一微阵列，该探针包含来自20种或更多种微生物体的独特的16s rRNA可变区序列；(ii')将来自处理样本的标记产物施加到第二微阵列，其中该第二微阵列是第一微阵列的复制品；以及(iii)基于对第一微阵列和第二微阵列的荧光杂交产物成像来确定抗微生物剂在调节样本中微生物体的生长和增殖方面的有效性，并确定微阵列之间荧光杂交产物的强度、位置或缺失是否有任何变化，其中如果第一微阵列和第二微阵列之间荧光杂交产物的强度降低，或者如果第一微阵列和第二微阵列之间荧光杂交产物的位置或缺失发生变化，则表明抗微生物剂在调节微生物体的生长和增殖方面是有效的。在另一个实施方案中，通过对来自对照样本和来自处理样本的分离的或纯化的新合成的微生物核酸进行测序来确定或确认抗微生物剂在调节样本中微生物体的生长和增殖方面的有效性，其中处理样本中新合成的微生物核酸的基因表达水平与对照样本相比降低，或者处理样本中新合成的微生物核酸的量和/或种类与对照样本相比降低，则表明抗微生物剂在调节微生物体的生长和增殖方面是有效的。在另一个实施方案中，使用基于转座体的测序方法，对来自对照样本和处理样本的分离的或纯化的新合成的微生物核酸进行测序。在另一个实施方案中，来自对照样本和处理样本的新合成的微生物核酸的测序通过以下方式进行：(a)将来自对照样本和处理样本的分离的或纯化的新合成的微生物核酸施加到小珠连接的转座体，其中该小珠连接的转座体同时介导微生物核酸的片段化和测序引物的添加；(b)用包含索引序列和衔接子序列的引物扩增该微生物核酸片段以形成扩增产物文库；(c)洗涤并合并来自对照样本的扩增产物文库；(c')洗涤并合并来自处理样本的扩增产物文库；(d)对来自对照样本的扩增产物文库进行测序；(d')对来自处理样本的扩增产物文库进行测序；以及(e)使用生物信息学分析，确定来自对照样本和处理样本的分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和/或种类的任何变化。在另一个实施方案中，新合成的微生物核酸是RNA，其中在上述(f)、(f')和(g)之前将微生物RNA逆转录成cDNA，并且其中抗微生物剂在调节微生物体的生长和增殖方面的有效性可基于通过使用微阵列和/或通过测序而确定来自对照样本和处理样本的新合成的微生物核酸的基因表达水平的变化来确定。

附图说明

图1呈现了用于从快速细菌培养物中富集新合成的DNA的工作流程的示例性实施方案。新合成的DNA的富集允许对患者样本中的活细菌进行遗传鉴定。

图2呈现了用于从快速细菌培养物中富集新合成的RNA的工作流程的示例性实施方案。新合成的RNA的富集允许评估患者样本中的活细菌的基因表达。

具体实施方式

如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物，除非文中另外明确指出。因此，例如，提及“微生物体”包括多种此类微生物体，并且提及“核苷类似物”包括提及一种或多种核苷类似物以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

另外，除非另有说明，否则使用“或”表示“和/或”。类似地，“包括”、“包含”、“具有”和“含有”是可互换的，并非旨在进行限制。

还应当理解，在各种实施方案的描述使用术语“包括”的情况下，本领域的技术人员将理解，在一些特定实例中，实施方案可替代地使用语言“基本上由...组成”或“由...组成”来描述。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。虽然许多方法和试剂与本文所述的那些方法和试剂类似或等同，但本文公开了示例性方法和材料。

为了描述和公开可与本文的描述结合使用的方法，本文提及的所有出版物全文以引用方式并入本文。此外，关于在一个或多个出版物中呈现的与本公开中明确定义的术语相似或相同的任何术语，在所有方面都将以本公开中明确提供的术语定义为准。

应当理解，本公开不限于本文所述的具体方法、方案和试剂等，因为这些可有所变化。本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。

除了在操作实施例中，或在另外指明的情况下，本文所用的所有表示成分或反应条件的量的数字应理解为在所有情况下均用术语“约”修饰。当用于描述本发明时，与百分比相关的术语“约”是指±1％。

如本文所用，术语“点击化学”是指当在铜(I)催化剂的存在下进行时的[3+2]环加成反应。铜(I)催化剂可包含

铜(I)离子或铜(I)螯合部分。铜(I)螯合部分可为“特征在于存在两个或更多个极性基团的任何实体，所述两个或更多个极性基团可参与与铜(I)离子形成络合物(包含一个以上的配位键)”(例如参见，Salic等人，美国专利申请第20070207476号(出处同上))。铜(I)螯合剂的示例包括但不限于新铜试剂和浴铜灵二磺酸盐(例如，参见Salic等人的美国专利申请第20070207476号和Sharpless等人，美国公布第2003000516671号)。[3+2]环加成反应也称为1,3偶极环加成反应，并且可能发生在1,3-偶极体和亲偶极体之间。1,3-偶极体的示例包括叠氮化物。亲偶极体的示例包括炔烃。

如本文所用，术语“染料”是指发射光以产生可观察到的可检测信号的化合物。

如本文所用，术语““双重标记”是指其中用产生可区分信号的两种可检测试剂标记核酸的标记过程。由这种标记过程产生的核酸被称为是双重标记的。

如本文所用，术语“染料标记的炔烃”是指已被进一步修饰以包含染料标记的炔烃。

如本文所用，术语“染料标记的叠氮化物”和“叠氮化物-染料分子”是指也用染料标记的具有反应性叠氮基团的化合物或分子。示例包括但不限于：罗丹明-叠氮化物、Alexa

350-叠氮化物(Molecular Probes^TM/Invitrogen^TM，Carlsbad，CA)、Alexa

488-叠氮化物(Molecular Probes^TM/Invitrogen^TM，Carlsbad，CA)、Alexa

555-叠氮化物(Molecular Probes^TM/Invitrogen^TM，Carlsbad，CA)、Alexa

568-叠氮化物(Molecular Probes^TM/Invitrogen^TM，Carlsbad，CA)、Alexa

568-叠氮化物(Molecular Probes^TM/Invitrogen^TM，Carlsbad，CA)、Alexa

594-叠氮化物、Alexa

633-叠氮化物(Molecular Probes^TM/Invitrogen^TM，Carlsbad，CA)、Alexa

647-叠氮化物(Molecular Probes^TM/Invitrogen^TM，Carlsbad，CA)、Cascade

叠氮化物(Molecular Probes^TM/Invitrogen^TM，Carlsbad，CA)、荧光素-叠氮化物、香豆素-叠氮化物、BODIPY-叠氮化物、花青-叠氮化物或四甲基罗丹明(TMR)-叠氮化物。

如本文所用，术语“染料标记的环炔烃”是指已被进一步修饰以包含染料标记的环炔烃。术语“环炔烃”是指可用于应变[3+2]环加成反应以标记DNA的化合物或分子。在该上下文中，环炔烃的示例包括但不限于：环辛炔、二氟环辛炔、杂环炔、二氯环辛炔、二溴环辛炔或二碘环辛炔。

如本文所用，术语“有效量”是指在细胞、组织或微生物体中引起相关反应的物质、化合物、分子、试剂或组合物的量。例如，在微生物体与核苷类似物接触的情况下，有效量是掺入微生物体的DNA中的核苷的量。

如本文所用，术语“荧光团”或“荧光的”是指在结合到感兴趣的生物化合物或分析物时显示荧光变化的组合物。本公开的优选荧光团包括在水性介质中具有高量子产率的荧光染料。示例性荧光团包括氧杂蒽、吲哚、硼聚苯并氮杂吲哚(borapolyazaindacene)、呋喃和苯并呋喃、花青等。本发明的荧光团可被取代以改变该荧光团的溶解度、光谱性质或物理性质。

如本文所用，术语“标记”是指当作为本公开的标记试剂的一部分并用于本公开的方法中时，保留其天然性质(例如，光谱性质、构象和活性)的化学部分或蛋白质。例示性的“标记”分子可以是直接可检测的(荧光团)、间接可检测的(半抗原或酶)，或者可用于检测和纯化掺入核苷的核酸(例如，生物素-链霉亲和素下拉测定)。此类“标记”分子包括但不限于点击化学设计的生物素标记、含亚氨基生物素或脱硫生物素的标记，诸如

可用辐射计数装置测量的放射性报告分子；可用分光光度计目视观察或测量的颜料、染料或其他色原；可用自旋标记分析仪测量的自旋标记；荧光部分，其中输出信号通过激发合适的分子加合物生成，并且可通过用被染料吸收的光激发来可视化，或者可用例如标准荧光计或成像系统测量。“标记”分子可以是发光物质，诸如荧光体或荧光团；生物发光物质；化学发光物质，其中输出信号通过信号化合物的化学修饰生成；含金属的物质；或酶，其中会发生依赖于酶的信号二次生成，例如由无色底物形成有色产物。“标记”也可采用化学或生物化学的形式、或惰性颗粒的形式，包括但不限于胶体金、微球、量子点或无机晶体，诸如纳米晶体或荧光体(例如，参见Beverloo等人，Anal.Biochem.，203,326-34，1992年)。“标记”分子也可以是用于对核苷类似物“加标签”的“标签”或半抗原。然后“标签”能够被选择性地结合到该“标签”的另一种试剂结合。例如，可使用生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素作为“标签”，然后使用与底物(例如，小珠)、标记或酶(例如，辣根过氧化物酶)偶联的亲和素或链霉亲和素结合到基于生物素的“标签”。就后者而言，然后可使用显色底物(例如，四甲基联苯胺)或荧光底物诸如Amplex Red或Amplex Gold(Molecular Probes,Inc.)。以类似的方式，标签可为半抗原或抗原(例如，地高辛)，并且可使用酶、荧光或放射性标记的抗体结合到该标签。许多报告基因分子是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于颗粒、荧光染料、半抗原、酶及其显色、荧光和化学发光底物，以及在Richard P.Haugland的“MOLECULAR PROBES HANDBOOK OFFLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS”，第10版(2005年)中描述的其他报告基因分子。

术语“微生物体”或“微生物”在本文中可互换使用，并且是指微观生物体，其可以以其单细胞形式或以细胞集落存在。出于本公开的目的，如本文所用，“微生物体”包括细菌、真菌、病毒、藻类、古细菌和原生动物。

如本文所用，术语“微生物增殖”是指微生物体的扩增和/或生长。

术语“核苷类似物”和“核苷酸类似物”可互换使用，并且在本文中是指在结构上类似于掺入到新合成的微生物核酸中的天然核苷或核苷酸的分子或化合物。就核苷而言，一旦进入细胞内，它们就被磷酸化成核苷酸，然后掺入新生的核酸聚合物中。核苷酸由于它们的电荷而难以穿过细胞膜并且比核苷更不稳定，因此它们的使用通常需要额外的步骤和试剂进行转染来将核苷酸转运穿过脂质双层。本发明的核苷类似物以与天然核苷酸类似的方式掺入核酸(DNA或RNA)中，其中正确的聚合酶将该类似物识别为天然核苷酸并且在合成中没有中断。这些类似物包含许多最终用于检测的不同部分，诸如卤代类似物(溴代、氯代、碘代等)和包含生物正交部分的那些诸如叠氮基、炔烃或膦。

如本文所用，术语“下拉试剂”是指用于纯化或分离包含本文所公开的一种或多种标记的核苷酸类似物的新生核酸聚合物的试剂。“下拉试剂”通常结合到固体载体诸如小珠，并选择性地与本文所公开的标记结合。通常，标记用作如上所述的“标签”。在示例性实施方案中，下拉试剂为偶联至固体载体(诸如小珠、超顺磁性微米或纳米颗粒、板等)的链霉亲和素。在另一个实施方案中，下拉试剂是对固定在固体载体(诸如小珠、超顺磁性微米或纳米颗粒、板等)上的标记或“标签”具有特异性的抗体或其他类型的亲和配体。

如本文所用，术语“施陶丁格连接”是指由Saxon和Bertozzi开发的化学反应(E.Saxon和C.Bertozzi，Science，2000年，287:2007-2010)，这是经典施陶丁格反应的修改形式。经典施陶丁格反应为其中叠氮化物与膦或亚磷酸酯的组合产生氮杂叶立德中间体的化学反应，该氮杂叶立德中间体在水解时产生氧化膦和胺。施陶丁格反应是将叠氮化物还原为胺的温和方法；并且三苯基膦通常用作还原剂。在施陶丁格连接中，将亲电子阱(通常为甲酯)适当地置于三芳基膦芳基(通常位于磷原子的邻位)上并且与叠氮化物反应，以产生氮杂叶立德中间体，该氮杂叶立德中间体在水性介质中重排以产生具有酰胺基和氧化膦官能团的化合物。施陶丁格连接的命名是因为它将两个起始分子连接(联接/共价连接)在一起，而在经典施陶丁格反应中，两种产物在水解后未共价连接。

术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指可从中获得样本的动物，尤其是人。这包括人和非人动物。术语“非人动物”和“非人哺乳动物”在本文中可互换使用，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，诸如非人灵长类(尤其是高级灵长类)、绵羊、狗、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔子、牛，以及非哺乳动物，诸如鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是作为疾病模型的实验动物或动物替代品。“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人、非人灵长类、家畜和农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物，诸如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等。患者或受试者包括前述的任何子集，例如，以上所有，但不包括一个或多个群组或物种，诸如人、灵长类或啮齿类。受试者可以是男性或女性。受试者可以是完全发育的受试者(例如，成人)或经历发育过程的受试者(例如，儿童、婴儿或胎儿)。

活的、增殖的微生物体(例如，细菌、藻类、古细菌、原生动物和真菌)不断合成新的DNA。与之形成直接对比的是，不再存活的微生物体将不再合成DNA。虽然活的、非增殖的微生物体有可能合成新的DNA来修复和维持它们的基因组，但新的DNA合成速率将远低于活的、增殖的微生物体。本公开提供了利用DNA合成中的前述差异的方法和技术，以便快速鉴定样本(诸如来自患者的血液样本或环境样本)或来自疑似受污染食品的样本中的活的、增殖的微生物体。具体地，本文提出的方法和技术允许鉴定样本中的活的、增殖的微生物体，而不管样本是否还包含非活的或非增殖的微生物体或被其污染。更具体地，本文提出的方法和技术提供了从样本中的一种或多种微生物体获得的新合成微生物DNA的选择性富集和测序，从而允许鉴定样本中包含的活的、增殖的微生物体。

本发明还提供可用于选择性富集来自混合群体中特定生物体或类似生物体群组的DNA和RNA的方法和组合物。例如，对于去宿主应用，人们期望从来自感染宿主的DNA或RNA的背景富集感染性生物体的DNA或RNA。该方法允许从混合群体中快速富集靶向生物体(例如，细菌)的DNA和/或RNA，以便鉴定靶向生物体。富集需要使得仅靶向生物体能够合成DNA和/或RNA的条件。例如，培养基条件、温度和/或特异性抑制剂可用于选择性抑制样本中的靶向群体或亚群。

例如，可从患有或疑似患有败血症的受试者获得血液，并且在血液样本中的哺乳动物细胞受到DNA和/或RNA合成抑制而样本中的细菌细胞可继续合成DNA和/或RNA的条件下培养。这样，细菌DNA和/或RNA被选择性标记。在一个实施方案中，血液样本可在LB肉汤或其他细菌培养基中分离和接种或培养，使得哺乳动物细胞将不会继续进行DNA和/或RNA合成(或具有显著减少的DNA和/或RNA合成)，而同时微生物群体将继续进行DNA和RNA合成，从而导致例如EdU的选择性掺入。在另一个实施方案中，可降低血液培养物的温度，从而抑制哺乳动物细胞的复制和合成，而当回到更高的温度时，将仅维持或更新微生物的复制和合成。温度可在数分钟至数小时的时间段内降低。在另一个实施方案中，可使用选择性靶向哺乳动物DNA和/或RNA机制的DNA和/或RNA合成的小分子抑制剂。例如，一种抑制剂来自鹅膏毒蕈(称为α-鹅膏蕈碱)，每年在无法鉴别蘑菇的采摘者中造成约100人死亡。RNAP抑制剂可对单一类别的生物体具有特异性。例如，α-鹅膏蕈碱影响高等真核生物，但对细菌没有影响。相反，一些药物特异性地影响细菌RNAP。其中最熟知的是利福平，其由真菌产生并且目前用作抗结核药物，如利福平衍生物甲哌力复霉素(Rif)。Rif对细菌RNAP具有特异性。抑制剂的这种特异性出于两个原因而出现。首先，抑制剂通常由一种生物体制备以杀死另一种生物体，并且产生生物体必须进化出不会自杀的抑制剂。第二，抑制剂通常与酶的保守性较低的部分结合，其中序列变异可防止它们作用于所有RNAP。

本公开还提供涉及在使用本公开的方法鉴定新生微生物核酸合成之前将样本去宿主的实施方案。此类去宿主技术和组合物涉及，例如，选择性切割含有微生物和非微生物核酸两者的样本中的非微生物核酸，使得样本变得大量富含微生物核酸。去宿主方法的示例包括以下文献中描述的那些：Feehery等人，PLoS ONE，8:e76096(2013年)；Sachse等人，Journal of Clinical Microbiology，47:1050-1057(2009年)；Barnes等人，PLoS ONE，9(10):e109061(2014年)；Leichty等人，Genetics，198(2):473-81(2014年))；Hasan等人，JClin Microbiol，54(4):919-27(2016年)；以及Liu等人，PLoS ONE，11(1):e0146064(2016年)；这些文献的公开内容全文并入本文。另外，用于进行去宿主的商业试剂盒也是可用的，包括NEBNext Microbiome DNA Enrichment^TM试剂盒、Molzym MolYsis Basic^TM试剂盒和MICROBEEnrich^TM试剂盒。

在一些实施方案中，本文所公开的去宿主方法和组合物利用了与非微生物核酸相关的特性，包括CpG残基处的甲基化，以及与DNA结合蛋白诸如组蛋白的缔合。例如，在一个具体实施方案中，去宿主方法和组合物可利用与非微生物核酸(例如，组蛋白、限制性酶)选择性结合的核酸结合蛋白。在另一个实施方案中，去宿主方法和组合物可包含选择性地与非微生物核酸结合并且还选择性地降解非微生物核酸的重组蛋白，即，重组蛋白包含非微生物核酸结合结构域和核酸酶结构域两者。在具体实施方案中，核酸结合蛋白是组蛋白。组蛋白存在于真核细胞的细胞核中，并且存在于某些古细菌(即，热变形菌目(Thermoproteales)和古细菌域(Eurarrochaea))中，但不存在于细菌或病毒中。在另一个实施方案中，然后可通过使用底物从样本中移除组蛋白结合的非微生物核酸，该底物包含选择性地结合到组蛋白(即，组蛋白结合结构域)的亲和剂。可结合到组蛋白的亲和剂的示例包括但不限于克罗莫结构域、Tudor、恶性脑肿瘤(MBT)、植物同源结构域(PHD)、溴结构域、SANT、YEATS、脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸(PWWP)、溴邻同源性结构域(BAH)、锚蛋白重复序列、WD40重复序列、ATRX-DNMT3A-DNMT3L(ADD)或zn-CW。在另一个实施方案中，组蛋白结合结构域可包括特异性地结合到来自如下蛋白的组蛋白的结构域，诸如HAT1、CBP/P300、PCAF/GCN5、TIP60、HB01(ScESA1、SpMST1)、ScSAS3、ScSAS2(SpMST2)、ScRTT109、SirT2(ScSir2)、SUV39H1、SUV39H2、G9a、ESET/SETDB1、EuHMTase/GLP、CLL8、SpClr4、MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、MLL5、SET1A、SET1B、ASH1、Sc/Sp SET1、SET2(Sc/Sp SET2)、NSD1、SYMD2、DOT1、Sc/Sp DOT1、Pr-SET 7/8、SUV4 20H1、SUV420H2、SpSet 9、EZH2、RIZ1、LSD1/BHC110、JHDM1a、JHDM1b、JHDM2a、JHDM2b、JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D、CARM1、PRMT4、PRMT5、Haspin、MSK1、MSK2、CKII、Mst1、Bmi/Ring1A、RNF20/RNF40或ScFPR4或它们的组蛋白结合片段。

在另外的实施方案中，本公开还提供了选择性地结合到包含甲基化CpG的DNA的核酸结合蛋白或核酸结合结构域。CG二核苷酸基序(“CpG位点”或“CG位点”)存在于DNA的区域中，在该区域中，在沿其5'至3'方向的碱基的线性序列中，胞嘧啶核苷酸后面是鸟嘌呤核苷酸。CpG岛(或CG岛)是具有高CpG位点频率的区域。CpG为5'-C-磷酸-G-3'的简写，即胞嘧啶和鸟嘌呤被一个磷酸分开。CpG二核苷酸中的胞嘧啶可被甲基化以形成5-甲基胞嘧啶。胞嘧啶甲基化在整个人基因组的多个CpG位点处发生。CG位点处的胞嘧啶甲基化也在其他真核生物的整个基因组中发生。在哺乳动物中，例如，70％至80％的CpG胞嘧啶可被甲基化。在感兴趣的微生物(诸如细菌和病毒)中，这种CpG甲基化不会发生或显著低于人基因组中的CpG甲基化。因此，可通过选择性地切割CpG甲基化DNA来实现去宿主。

在一些实施方案中，本公开提供了包含结合到CpG岛或CpG位点的核酸结合蛋白或结合结构域的去宿主方法。在另一个实施方案中，结合结构域包含结合到甲基化CpG岛的蛋白质或其片段。在另一个实施方案中，核酸结合蛋白结合结构域包含甲基-CpG-结合结构域(MBD)。MBD的一个示例是折叠成α/β夹层结构的约70个残基的多肽，该夹层结构包括扭曲的β折叠层，该扭曲的β折叠层由在C末端处由α1螺旋和发夹环形成的另一层支撑。这些层都是两亲性的，α1螺旋和β折叠平行，并且疏水面彼此紧密堆积。β折叠由夹在两条较短外链(β1和β4)之间的两条长的内链(β2和β3)构成。在另一个实施方案中，核酸结合蛋白或结合结构域包含选自MECP2、MBD1、MBD2和MBD4或它们的片段的蛋白。在另一个实施方案中，核酸结合蛋白或结合结构域包含MBD2。在某个实施方案中，核酸结合蛋白或结合结构域包含MBD2的片段。在另一个实施方案中，核酸结合蛋白或结合结构域包含MBD5、MBD6、SETDB1、SETDB2、TIP5/BAZ2A或BAZ2B或它们的片段。在另一个实施方案中，核酸结合蛋白或结合结构域包含CpG甲基化或脱甲基化蛋白或其片段。在另一个实施方案中，然后可通过使用包含亲和剂的底物从样本中移除组蛋白结合的非微生物核酸，该亲和剂选择性地结合到核酸结合蛋白或结合结构域，该核酸结合蛋白或结合结构域结合到CpG岛或CpG位点。亲和剂的示例包括选择性地结合到核酸结合蛋白或结合结构域的抗体或抗体片段，该核酸结合蛋白或结合结构域结合到CpG岛或CpG位点。包含抗体或抗体片段的亲和剂可结合到底物，或者其自身可通过结合到底物的第二抗体结合，从而提供从样本分离和移除非微生物核酸的手段。

在另一个实施方案中，本公开提供了使用核酸酶或包含核酸酶结构域的重组蛋白的去宿主方法，由此核酸酶将非微生物核酸切割成片段。在后一种情况下，重组蛋白还可包含对核酸结合蛋白(例如，组蛋白、甲基-CpG-结合蛋白)具有活性的核酸蛋白结合结构域。一种或多种核酸酶可包括但不限于非特异性核酸酶、核酸内切酶、非特异性核酸内切酶、非特异性核酸外切酶、归巢核酸内切酶和限制性核酸内切酶。在另一个实施方案中，核酸酶结构域衍生自其中核酸酶或核酸酶结构域本身不具有其自身独特靶标的任何核酸酶。在另一个实施方案中，核酸酶结构域在与其他蛋白质融合时具有活性。非特异性核酸酶的示例包括FokI和I-TevI。在一些实施方案中，核酸酶结构域为FokI或其片段。在另一个实施方案中，核酸酶结构域为I-TevI或其片段。在另一个实施方案中，FokI或I-TevI或其片段为未突变的和/或野生型的。核酸酶的另外示例包括但不限于脱氧核糖核酸酶I(DNA酶I)、RecBCD核酸酶、T7核酸内切酶、T4核酸内切酶IV、Bal 31核酸内切酶、核酸内切酶I(endo I)、微球菌核酸酶、核酸内切酶II(endo VI、exo III)、脉孢菌核酸内切酶、S1-核酸酶、P1-核酸酶、绿豆核酸酶I、Ustilago核酸酶(DNA酶I)、AP核酸内切酶和Endo R。

感兴趣的微生物体可在各种样本中鉴定，包括但不限于来自患者的样本(例如，血液、尿液和脊髓液)、食品样本(例如，面粉、牛肉和莴苣)或环境样本(例如，地下水和医院建筑物拭子)。本文所公开的方法、组合物和试剂盒的主要优点是可鉴定样本中活的和/或增殖的微生物体，而不需要在鉴定前大量培养微生物体。因此，不能在常规培养基上或在组织培养物中体外培养的微生物体诸如梅毒螺旋体(梅毒)和环境细菌可使用本公开的方法、组合物和试剂盒容易地鉴定。

此外，本文公开了用于对新合成核酸进行标记、纯化和测序以鉴定和分析患者、食物、环境或其他样本中的活微生物体的方法。本公开的方法还可用于筛选测试化合物(例如，抗生素)对样本中鉴定的活微生物体的作用。本文所公开的方法利用了“饲喂”微生物并掺入新合成或新生核酸的核苷类似物。就微生物而言，可通过本文所公开的方法检测任何类型的微生物体，包括细菌、真菌、病毒、藻类、古细菌和原生动物。

细菌是缺乏细胞核并且不含细胞器的原核生物。在细菌家族内有两类：具有较厚细胞壁的革兰氏阳性菌和具有夹在内膜和外膜之间的较薄层的革兰氏阴性菌。细菌种类繁多，并且就数量而言，细菌是迄今为止地球上最成功的生物体。细菌是唯一可在人体内无害生活的微生物体，通常有助于消化等身体功能。除了病毒之外，细菌在人类疾病方面引起的问题最多，诸如败血症。可使用本文所公开的方法、组合物和试剂盒鉴定和分析的细菌的示例包括但不限于：衣氏放线菌、炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、韩瑟勒巴通氏菌、五日热巴通氏菌、百日咳博代氏杆菌、博氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体、埃氏疏螺旋体、回归热包柔氏螺旋体、流产布鲁氏菌、犬布氏杆菌、羊布鲁氏杆菌、猪布鲁氏杆菌、空肠弯曲杆菌、肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肉毒梭状芽孢杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺性军团杆菌、问号钩端螺旋体、圣地罗西钩端螺旋体、韦氏钩端螺旋体、野口氏钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、立克次氏立克次体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、宋内志贺菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、梅毒螺旋体、解脲支原体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森菌。

真菌是真核生物，这意味着它们具有明确的细胞核和细胞器。其细胞大于原核生物诸如细菌。一旦真菌菌落达到一定的生长水平(例如，面包上的霉菌)，它们就对人眼可见。真菌可分为三大类：(1)呈线状(丝状)生长和多细胞结构的霉菌；(2)通常为非丝状且可为单细胞的酵母；(3)具有用于产生孢子的子实体的蕈类。真菌对免疫受损的人来说是个问题，并且对植物来说也是重要的病原体。可使用本文所公开的方法、组合物和试剂盒鉴定和分析的真菌的示例包括但不限于：伞状犁头霉、分枝梨头霉、Achorion gallinae、马杜拉放线菌属、皮炎组织胞浆菌、Aleurisma brasiliensis、Allersheria boydii、节皮菌属、黄曲霉、烟曲霉、蛙粪霉属、芽生菌属、背芽突霉属、白假丝酵母、芹菜尾孢菌、金孢子菌属、枝孢菌属、Cladothrix asteroids、粗球孢子菌、白色隐球菌、格特隐球菌、罗伦隐球菌、新型隐球菌、雅致小克银汉霉、Dematium wernecke、衣氏盘状菌、埃蒙斯菌属、Emmonsiellacapsulate、地霉内孢霉、Entomophthora coronate、絮状表皮癣菌、新型线黑粉菌、着色真菌属、白地霉、Glenospora khartoumensis、石膏样裸囊菌、小单孢子囊素、组织胞浆菌、荚膜组织胞浆菌、Hormiscium dermatididis、着色芽生菌属、角质霉菌属、Langeroniasoudanense、塞内加尔小球腔菌、伞状毛霉菌、Lobmyces loboi、罗布菌、洛博芽生菌病、马杜拉分支菌属、糠秕马拉色菌、石榴碱微球菌、小孢子菌属、念珠菌属、毛霉属、结核分枝杆菌、奈尼兹皮真菌属、罗萨梯新龟甲形菌、诺卡氏菌属、白色粉孢、乳卵孢子菌、巴西副球孢子菌、鲍埃得彼得利壳菌、瓶霉属、何德毛结节菌、糠秕孢子菌、耶氏肺孢子菌或卡氏肺孢子菌、Pullularia gougerotii、罗梅罗刺壳孢菌、西伯鼻孢子菌、小孢子霉属(小孢霉属(Microsporum))、Sartorya fumigate、黄瘤孢属、孢子丝菌属、葡萄穗霉属、黑葡萄穗霉、链霉菌属、皮肤癣菌属、圆酵母属、毛癣菌属、毛孢子菌属和粉红楚普夫菌。

病毒代表一大类亚微观感染因子，通常被认为是无生命的极其复杂的分子，通常含有包围遗传物质的RNA或DNA核心但没有半透膜的蛋白质衣壳，仅在活细胞中能够生长和繁殖，并在人、动物和植物中引起各种重要疾病。可使用本文所公开的方法、组合物和试剂盒鉴定和分析的病毒的示例包括但不限于：单纯病毒、水痘病毒、细胞巨化病毒、玫瑰疱疹病毒、淋巴潜隐病毒、猴病毒、哺乳动物腺病毒、α-乳头瘤病毒、β-乳头瘤病毒、X-乳头瘤病毒、γ-乳头瘤病毒、丑型乳头瘤病毒、寅型乳头瘤病毒、甲型多瘤病毒、乙型多瘤病毒、γ-多瘤病毒、丁型多瘤病毒、软疣痘病毒、正痘病毒、副痘病毒、α-TTV、β-TTV、γ-TTV、圆环病毒、格环病毒、Gemykibivirus、Gemyvongvirus、红病毒、依赖病毒、博卡病毒、正肝去氧核糖核酸病毒、γ逆转录病毒、δ-逆转录病毒、慢病毒、逆转录病毒科、科罗病毒、轮状病毒、东南亚十二RNA病毒、α-冠状病毒、β-冠状病毒、环曲病毒、哺乳动物星状病毒、诺罗病毒、札幌病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、心病毒、柯萨病毒、肠病毒、肝病毒、嵴病毒、副肠孤病毒、Rosavirus、萨佩洛病毒、甲病毒、风疹病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、亨尼巴病毒、麻疹病毒、呼吸道病毒、腮腺炎病毒、偏肺病毒、正肺病毒、Ledantevirus、狂犬病毒、水泡病毒、哺乳类沙粒病毒、Orthohantavirus、正内罗病毒、正本雅病毒、白蛉病毒、α-流感病毒、β-流感病毒、γ-流感病毒、Quaranjavirus、托高土病毒和/或δ病毒。

藻类是更难定义的生物体群组，根据一些定义，它既包含原核生物，也包含真核生物。与其他微生物体不同，藻类是典型的光合作用者，并且通常存在于海洋环境中。有害藻华(HAB)是指通过产生天然毒素、对其他生物体造成机械破坏或通过其他方式对其他生物体造成负面影响的藻华。HAB通常与大规模的海洋死亡事件有关，并且已与各种类型的贝类中毒有关。HAB涉及有毒或其他有害的浮游植物，诸如亚历山大藻(Alexandrium)属和凯伦藻(Karenia)属的沟鞭藻类或拟菱形藻(Pseudo-nitzschia)属的硅藻类。这种水华通常呈现红色或棕色调，俗称赤潮。本公开的方法、组合物和试剂盒允许从样本(例如，环境样本)中鉴定这种藻类。

古细菌是与细菌具有相似形态的原核生物。古细菌在遗传、生物化学和结构特征方面不同于真核生物和细菌。例如，古细菌具有独特的鞭毛蛋白和醚连接的脂质，并且它们的细胞壁缺乏胞壁质。古细菌与已知的病原体共有一些特征，这些特征可反映导致疾病的可能性。此类特征包括与宿主的充分接触(即，机会)和在宿主中长期定植并与内源性菌群共存的能力。在人类结肠、阴道和口腔微生物菌群中检测到厌氧古细菌展示出它们定殖在人类宿主中的能力。本公开的方法、组合物和试剂盒允许从样本(例如，环境样本、从受试者获得的样本等)中鉴定这种古细菌。

原生动物是指以有机物质(诸如其他微生物体或有机组织和碎片)为食的单细胞真核生物(自由生活的或寄生的)。按照传统定义，原生动物的大小范围从1微米到几毫米甚至更大。所有原生动物都是异养的，它们从其他生物体中获取营养物质，要么全部摄入，要么食用其有机残留物和废物。一些原生动物通过吞噬作用摄入食物，用伪足吞噬有机颗粒(就像变形虫一样)，或通过称为细胞口的特殊口状孔摄入食物。其他原生动物通过渗透压摄入食物，通过其细胞膜吸收溶解的营养物质。许多原生动物病原体是人体寄生虫，引起疾病诸如疟疾(由疟原虫(Plasmodium)引起)、阿米巴病、贾第鞭毛虫病、弓形体病、隐孢子虫病、滴虫病、恰加斯氏病、利什曼病、非洲锥虫病(昏睡病)、阿米巴痢疾、棘阿米巴角膜炎和原发性阿米巴脑膜脑炎(纳格勒阿米巴病)。本公开的方法、组合物和试剂盒允许从样本(例如，环境样本、从受试者获得的样本等)中鉴定这种原生动物。

本公开的方法提供对来自样本的前述微生物体(特别是活的和/或增殖的微生物体)的鉴定和分析。如上文所指出的那样，样本可源自多种来源，包括来自受试者、来自环境、来自食品等。本公开的组合物、方法和试剂盒可使用来自受试者的任何类型的样本，包括但不限于血液、尿液、唾液、中耳抽吸物、胆汁、阴道分泌物、脓液、胸腔积液、滑液和腹腔脓肿。因此，本公开的方法、组合物和试剂盒不受从受试者获得的样本的类型和位置的特别限制。此外，本文公开的方法、试剂盒和组合物在鉴定导致患者败血症或导致患者尿道感染的微生物体方面提供了优于标准方法的改进，因为本文公开的方法、试剂盒和组合物能够以比标准方法快得多的方式准确鉴定致病微生物体。因此，可更快地施用用于所鉴定的微生物体的合适的抗微生物剂，从而以更快的方式对抗和清除微生物感染，并可能预防或减轻与微生物感染相关的副作用，诸如败血性休克、寒战、发烧、身体疼痛、心理能力变化、疲劳、不适、呼吸问题、异常心脏感染、炎症、恶心和呕吐、焦虑等。此外，本文公开的方法、试剂盒和组合物还可确定抗微生物剂是否能有效抑制或杀死微生物。因此，如果微生物体对特定的抗微生物剂具有抗性，则本文所公开的方法、试剂盒和组合物可以快速的方式进行这种测定，使得可尝试另一种抗微生物剂。

本公开的方法、组合物和试剂盒可利用核苷和核苷酸类似物两者来鉴定新生微生物核酸合成。如下文更全面描述的，本公开的方法、组合物和试剂盒可利用多种类型的核苷和核苷酸类似物，并且其使用可有利于建立基线核酸合成，以及确定核酸合成速率的变化，诸如抗微生物剂的添加。核苷通常用于将类似物添加到细胞培养物中或施用给动物的实验，因为核苷类似物易于被活细胞吸收，在活细胞中它们被磷酸化成核苷酸，然后被掺入到正在生长的核酸聚合物中。相比之下，在掺入到细胞中之前或之后，核苷酸更不稳定，更容易被酶切割，并且通常不如核苷稳定。此外，由于来自磷酸基团的额外电荷，核苷酸不易转运到活细胞中，并且通常需要转染步骤来获得足够浓度的跨细胞膜的核苷酸。这对于体内或离体/体内实验均不理想，在这些实验中，应将细胞扰动保持在最小程度以准确解释结果。出于这些原因，以下公开内容通常将核苷称为添加到细胞或动物中的类似物，但这绝不旨在进行限制，其中核苷酸同样重要。

核苷和核苷酸类似物可以是四种DNA碱基(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T))中任一种的类似物，也可以是四种RNA碱基(腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U))中任一种的类似物，并且包括它们的三磷酸和亚磷酰胺形式。核苷和核苷酸类似物通过微生物体中存在的聚合酶掺入到新合成核酸中。核苷和核苷酸类似物与天然存在的核苷的不同之处在于，通常通过合成化学技术改变了磷酸主链、戊糖和/或核糖或脱氧核糖，例如，核苷酸或核苷可被改变以包含可检测标记(例如，染料、荧光团)、生物正交官能部分(例如，参与特定化学反应如点击化学的部分)、生物分子(例如，酶、抗体、生物素)等，其中的任一种均可用于本公开的方法、组合物和试剂盒中，以鉴定新制得的微生物核酸聚合物。在一个实施方案中，核苷类似物是卤代类似物，包括但不限于溴代、氯代和碘代部分。卤代类似物的示例包括但不限于2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、5-溴-2'脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-碘-2'脱氧尿苷和5-碘尿苷。就卤代类似物而言，已专门开发出以高亲和力结合到这些类似物的抗体，如溴-2'脱氧尿苷和碘脱氧尿苷(参见Dako，Carpinteria，CA；BD Bioscience，San Diego，CA；EMD Biosciences，Madison，WI)。在另一个实施方案中，核苷或核苷酸类似物包含生物正交官能部分，包括但不限于叠氮基、炔基或膦基部分。包含生物正交官能部分的核苷或核苷酸类似物的实例包括但不限于2-乙炔基-腺苷、N6-炔丙基-腺苷、2'-(O-炔丙基)-腺苷、3'-(O-炔丙基)-腺苷、5-乙炔基-胞苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷、2'-(O-炔丙基)-胞苷、3'-(O-炔丙基)-胞苷、2'-(O-炔丙基)-鸟苷、3'-(O-炔丙基)-鸟苷、5-乙炔基-尿苷、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷、2'-(O-炔丙基)-尿苷、3'-(O-炔丙基)-尿苷、(2'S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、8-叠氮基-腺苷、N⁶-(6-叠氮基)己基-2'-脱氧-腺苷、2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、5-叠氮基甲基-尿苷、5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷、5-(3-叠氮基丙基)-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-胞苷和5-叠氮基-PEG₄-2'-脱氧胞苷。

在具体实施方案中，核苷类似物包含生物正交官能部分，该生物正交官能部分可经历点击化学、应变[3+2]环加成反应或与标记试剂的官能团的施陶丁格连接。在一些实施方案中，反应性生物正交部分由核苷的碱基携带。携带反应性生物正交部分的碱基可以是嘌呤(例如，腺嘌呤或鸟嘌呤)或嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶)。在某些实施方案中，碱基为尿嘧啶；在一些此类实施方案中，尿嘧啶在5-位上携带反应性生物正交部分。在某些实施方案中，碱基为腺嘌呤；在一些此类实施方案中，腺嘌呤携带反应性生物正交部分。在某些实施方案中，生物正交部分间接连接到碱基，而在其他实施方案中，生物正交部分直接共价连接到碱基。在某些实施方案中，反应性生物正交部分由核苷的糖(核糖和脱氧核糖)携带。在某些实施方案中，生物正交部分间接连接到糖，而在其他实施方案中，生物正交部分直接且共价连接到糖。在某些实施方案中，反应性生物正交部分连接到核苷的磷酸部分。携带反应性生物正交部分的糖可共价连接到嘌呤(例如，腺嘌呤或鸟嘌呤)或嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶)。在某些实施方案中，碱基为尿嘧啶，而在其他实施方案中，碱基为腺嘌呤。

反应性生物正交部分可为1,3-偶极体，诸如氧化腈、叠氮化物、重氮甲烷、硝酮或腈亚胺。在某些实施方案中，1,3-偶极体为叠氮化物。另选地，反应性生物正交官能部分可为亲偶极体，诸如烯烃(例如，乙烯基、丙烯基等)或炔烃(例如，乙炔基、丙炔基等)。在某些实施方案中，亲偶极体为炔烃，例如乙炔基团。

上述这些生物正交官能部分为非天然的、非干扰的生物正交化学部分，其具有可通过高选择性反应修饰的独特化学官能团。具体地，这些掺入的核苷使用标记试剂进行标记，该标记试剂包含在细胞环境的存在下将与核苷选择性地形成共价键的化学柄。

解剖复杂的细胞过程(包括微生物增殖)需要在生物分子在其原栖息地内发挥功能时跟踪生物分子的能力。近年来，生物正交官能部分已被用作将生物分子加标签的另一种方法。已描述了使用生物正交官能部分来检测代谢物和使用叠氮化物部分作为生物正交官能部分的翻译后修饰。一旦通过代谢或通过化学修饰被引入靶生物分子中，叠氮化物便可使用如下三个高选择性反应中的一个高选择性反应用探针加标签：施陶丁格连接、Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成或应变促进[3+2]环加成反应(例如，参见Agard等人，J AmChem Soc.，2004年11月24日；1 26(46):1 5046-7)。

生物正交官能部分可用于通过掺入核苷或核苷酸类似物来标记核酸。因此，可使用如下生物正交标记来标记核酸，诸如施陶丁格连接、Cu(I)催化的叠氮化物和炔烃的[3+2]环加成(“点击化学”)或由Barry Sharpless和Carolyn Bertozzi独立描述的“无铜”点击化学(例如，参见Sharpless等人，Angew Chem Int Ed Engl.，2002年3月15日；41(6):1053-7；Meldal等人，J.Org.Chem.，2002年，67,3057；Agard等人，J Am Chem Soc.2004年11月24日；1 26(46):1 5046-7；美国专利第7,122,703号；美国公布第2003000516671号)。点击化学和施陶丁格连接已适于通过直接检测核苷酸掺入来测量细胞增殖。参见Salic等人，“Methods and Compositions for Labeling Nucleic Acids”，美国公布第20070207476号和第20070099222号(提交于2006年10月27日)。

用于标记核酸的点击化学技术涉及用含有反应性不饱和基团的第一核苷或核苷酸类似物处理细胞，使得第一核苷类似物掺入到新合成的微生物核酸中。然后，使细胞与标记试剂接触，该标记试剂包含连接到标记的第二反应性不饱和基团，使得在第一反应性不饱和基团和第二反应性不饱和基团之间发生[3+2]环加成。

对标记微生物核酸的[3+2]环加成的以下描述仅作为示例提供，而并非旨在限制本发明的范围。

作为使用点击化学标记微生物DNA的一个示例，将样本用有效量的炔烃修饰的核苷类似物(例如，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU))处理限定的时间段，使得将EdU掺入新合成的DNA中。在用EdU标记后，带标记的微生物DNA在铜(I)催化剂的存在下与叠氮化物-二硫化物-生物素接头反应。通过[3+2]环加成反应在叠氮化物和所掺入的核苷类似物之间形成共价键，然后可使用链霉亲和素偶联的底物(例如，小珠)捕获所得的复合物。在洗涤底物后，通过添加还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)从底物中释放微生物DNA。然后可使用标准方法(例如，具有PCR文库扩增的Illumina Nextera DNA Flex)测定微生物DNA的序列。

在使用点击化学标记微生物DNA的第二示例中，将样本用有效量的叠氮化物修饰的核苷类似物(例如，5-叠氮基-2'-脱氧尿嘧啶(AzdU))处理限定的时间段，使得将AzdU掺入新合成的微生物DNA中。在用AzdU标记后，带标记的微生物DNA在铜(I)催化剂的存在下与染料标记的炔烃反应。由于叠氮化物部分和炔烃部分之间的[3+2]环加成反应的结果，形成了共价键。然后可使用标准方法测量染料标记，该标准方法包括但不限于流式细胞术、荧光显微镜法、成像、多孔板测定或高含量筛选。

在使用点击化学标记RNA的示例中，将样本在有效量的炔烃修饰的核苷类似物(例如，5-乙炔基-尿苷(EU))的存在下温育限定的时间段，使得将EU掺入新合成的微生物RNA中。在用EU标记后，微生物被裂解并在铜(I)催化剂的存在下与叠氮化物-二硫化物-生物素接头反应。通过[3+2]环加成反应在叠氮化物和所掺入的核苷类似物之间形成共价键，然后可使用链霉亲和素偶联的底物(例如，小珠)捕获所得的复合物。在洗涤底物后，通过添加还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)从底物中释放RNA。将该RNA逆转录成cDNA。从该cDNA可制备测序文库。

Bertozzi等人已描述了利用应变[3+2]环加成反应而不使用铜(I)催化剂的一种替代点击化学的方法是“无铜”点击化学反应。Bertozzi等人，“Compositions and methodsfor modification of biomolecules”，美国专利申请第20060110782号。

例如，微生物可首先用有效量的叠氮化物修饰的核苷类似物(例如，AzdU)处理限定的时间段，使得将叠氮化物修饰的核苷类似物掺入新合成的微生物DNA中。在加入AzdU后，用有效量的具有反应性环炔烃部分的化合物或分子处理细胞，使得在叠氮化物部分和环炔烃部分之间发生应变[3+2]环加成反应。环炔烃可被修饰以进一步包含：染料标记，然后该染料标记可使用标准方法测量，该标准方法包括但不限于流式细胞术、荧光显微镜法、成像、多孔板测定或高含量筛选；可与下拉试剂一起使用的生物素标记；HRP酶；等等。可用于应变[3+2]环加成反应以标记DNA的环炔烃包括但不限于：环辛炔、二氟环辛炔、杂环炔、二氯环辛炔、二溴环辛炔或二碘环辛炔。本领域已知的其他化学方法可应用于微生物DNA的标记。例如，Bertozzi等人描述的叠氮化物-膦化学，也称为施陶丁格连接，可用于检测叠氮化物修饰的核苷类似物(例如，AzdU)向新合成的微生物DNA中的掺入。参见Bertozzi等人，“Chemoselective ligation”，美国专利申请第20070037964号。首先使微生物与有效量的叠氮化物修饰的核苷类似物(例如，AzdU)接触限定的时间段。然后，微生物与工程化的膦部分反应。工程化的膦部分的一个示例为2-二苯基膦基苯甲酸甲酯。当使用叠氮化物-膦化学来标记微生物DNA时，工程化的膦部分还包含染料分子、生物素部分、酶等。一旦叠氮化物部分与膦部分之间发生反应，就可将生物素分子用于下拉测定等。

为了测量基线微生物增殖和微生物增殖的后续变化，本公开还提供了与首次使用的核苷或核苷酸类似物相比有差别地标记的第二核苷或核苷酸类似物的用途。进一步设想可使用第三和/或第四核苷或核苷酸类似物，以便测量抗微生物剂(例如，抗生素)对微生物增殖或微生物体的基因表达的有效性。可通过用第一核苷或核苷酸类似物标记核酸来记录基线合成速率。在引入第二核苷或核苷酸类似物之前，不需要移除第一核苷或核苷酸类似物。此外，通过首先在引入第二核苷或核苷酸类似物之前移除第一核苷或核苷酸类似物，可使得难以准确确定微生物增殖速率。此外，免洗涤步骤使该过程与高通量筛选(HTS)兼容。

本文所公开的组合物、方法和试剂盒的主要优点之一是，与标准方案不同，样本中微生物的鉴定不需要长的培养步骤。由于在活的、增殖的生物体中不断产生DNA，本公开的组合物、方法和试剂盒可鉴定微生物体，而无需使用培养步骤来培养微生物体。相反，本公开的组合物、方法和试剂盒利用温育步骤，其中将样本在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育最小时间段，使得将核苷或核苷酸类似物掺入新制得的微生物核酸中。因此，一旦获得样本，就可将样本在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟、115分钟，120分钟、125分钟、130分钟、145分钟、150分钟、155分钟、160分钟、165分钟、170分钟、175分钟、180分钟、190分钟、200分钟、220分钟、330分钟、240分钟、260分钟、280分钟、300分钟、350分钟、400分钟、500分钟、600分钟，或包括或介于前述时间点的任两个时间点之间的任何范围，包括它们的分数增量。

本公开还提供用一种或多种类型的标记试剂标记含有核苷或核苷酸类似物的新制得的微生物核酸。本文所公开的标记试剂特异性地结合到核苷或核苷酸类似物。例如，标记试剂可为第一抗体，其可偶联到标记或由共价连接到标记的第二抗体结合，其中第一抗体结合到所掺入的核苷或核苷酸类似物。此类第一抗体的示例可包括抗BrdU抗体、抗ldU抗体和抗CldU抗体，所有这些抗体可从各种供应商处商购获得。然而，还设想了可选择性地结合到所掺入的核苷或核苷酸类似物(如上所述)的其他抗体。就第二抗体而言，第二抗体可结合到基板，诸如小珠或板。因此，第二抗体可用作允许分离或纯化新合成的微生物核酸的下拉试剂。另选地，标记试剂可以是包含官能团(例如，叠氮化物)的化合物，这些官能团被设计成使得它们可与具有互补生物正交官能团(例如，炔基基团)的核苷或核苷酸类似物进行化学反应，并且这些官能团包含标记，诸如染料部分、荧光团部分、亲和配体(例如，GST、生物素、组氨酸等)、酶(例如，辣根过氧化物酶)等。包含生物素标记的标记试剂的示例包括如下：

如上文已经提及的，标记的作用是允许在标记后可视化或检测核酸聚合物，例如新合成的微生物DNA。通常，对标记(或可检测试剂或部分)进行选择，使得其可被下拉试剂选择性地结合，或者另选地，其可生成信号，该信号可被测量并且其强度与例如被分析样本中的标记核酸聚合物的量相关(例如，成比例)。因此，设想可使用多种标记来检测、鉴定和定量新合成的微生物核酸，例如，第一种标记可被下拉试剂结合以提供新合成的微生物核酸的分离，并且第二、第三或更多种标记可用于生成被测量的信号，并且信号的强度与被分析样本中带标记的核酸聚合物的量相关。多种标记的此类用途对于确定增殖速率或新核酸合成；或测试所施用试剂诸如抗生素的效果是特别有利的。此外，标记试剂还可包含可化学切割的接头或可酶切割的接头，使得如果需要的话可移除该标记。可使用任何数量的可化学切割的接头，但通常应为可在温和反应条件下切割的接头，诸如基于酸不稳定性的接头、基于碱不稳定性的接头、基于重氮基的接头或基于二硫化物的接头。基于酸不稳定性的接头的示例包括包含腙、烯胺、烯醇醚、亚胺或顺式乌头酰基基团的接头。基于碱不稳定性的接头的示例包括基于氨基甲酸酯和基于酯的接头。另选地，可切割接头可为可酶切割的接头。可酶切割的接头的示例包括基于肽的接头或基于β-葡糖苷酸的接头。

如本文所述的用于鉴定和分析样本中的微生物体的方法还提供带标记的微生物核酸的分离或纯化。在具体实施方案中，可使用下拉试剂纯化或分离带标记的微生物核酸。在这种情况下，新合成的微生物核酸用标记试剂标记，该标记试剂结合到如本文所述的掺入核苷类似物或与之结合，并且该标记试剂包含可被固定化下拉试剂择性地结合的标记。标记试剂可以是抗体或另一种类型的基于亲和力的配体(例如，GST、生物素、组氨酸等)。下拉试剂可为对标记试剂具有特异性的第二抗体，或者可为对标记试剂具有高亲和力和选择性亲和力的另一类型的试剂或化合物。例如，标记试剂可以是基于生物素的分子，其通过点击化学与核苷类似物结合，并且其本身可被包含亲和素或链霉亲和素的下拉试剂选择性地结合。因此，基于生物素的标记试剂和基于链霉亲和素的下拉试剂之间的相互作用允许从“未标记的”微生物核酸和其他微生物成分中分离或纯化“带标记的”微生物核酸。通常，将下拉试剂固定到固体载体上，诸如板、小珠、纳米材料或微米材料(例如，磁性纳米粒子)。

本公开还提供了，本公开的组合物、方法和试剂盒可检测试剂对微生物生存力、生长和增殖的有效性。例如，可将抗微生物剂直接添加到样本中，并且可使用本公开的方法基于对新合成的核酸的检测或其缺失来确定对微生物生存力、生长和/或增殖的最终影响。为了更可控的结果，可将样本分成两个样本：“对照”样本和“处理”样本，从而将抗微生物剂添加到“处理”样本中并将溶媒对照添加到“对照样本”中，并测定两个样本之间新合成的微生物核酸的产量的任何差异，由此，如果“处理”样本与“对照”样本相比具有更少或不具有新合成的微生物核酸，则表明该抗微生物剂的有效性。另选地，基于在施用抗微生物剂之前采集第一样本，并在施用抗微生物剂之后的一个或多个时间点采集第二、第三或更多个样本，可确定待测试的系统中抗微生物剂的效果。例如，可在施用抗生素之前和之后从败血症人类患者获得血液样本，由此新合成核酸的降低的速率或缺乏表明抗生素对引起败血症的细菌的生存力、生长和/或增殖的有效性。可与本公开的组合物、方法和试剂盒一起使用的抗微生物剂的示例包括但不限于抗生素、抗真菌剂、抗病毒药和抗寄生虫药。抗生素是一类对细菌具有活性的抗微生物物质，并且是用于对抗细菌感染的最重要类型的抗菌剂。抗生素药物广泛用于治疗和预防此类感染。它们可杀死细菌或抑制细菌的生长。可与本文所公开的组合物、方法和试剂盒一起使用的抗生素的示例包括但不限于青霉素类，诸如阿莫西林、氨苄青霉素、巴氨西林、羧苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、匹氨西林、匹美西林和羟基噻吩青霉素；头孢菌素类，诸如头孢乙腈、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢来星、头孢洛宁、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢曲秦、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑啉、头孢拉定、头孢甲氧环烯胺、头孢替唑、头孢克洛、头孢孟多、头孢美唑、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢唑南、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地秦、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢泊肟、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克定、头孢吡肟、头孢瑞南、头孢噻利、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢托罗、头孢洛林、头孢氯嗪、头孢罗兰、头孢帕罗、头孢卡奈、头孢屈洛、头孢吡酮、头孢三唑、头孢维曲、头孢马替林、cefmepidium、头孢维星、头孢噁唑、头孢罗替、头孢舒米、头孢呋汀和头孢噻氧；单环内酰胺类，诸如氨曲南；碳青霉烯类，诸如亚胺培南、多利培南、厄他培南和美罗培南；大环内酯类抗生素，诸如阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、地红霉素、罗红霉素和泰利霉素；林可酰胺类，诸如克林霉素和林可霉素；氨基糖苷类抗生素，诸如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素和妥布霉素；喹诺酮类抗生素，诸如氟甲喹、萘啶酸、噁喹酸、吡咯米酸、吡哌酸、罗索沙星、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、芦氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、格雷沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、司帕沙星、替马沙星、托氟沙星、贝西沙星、德拉沙星、克林沙星、吉米沙星、普卢利沙星、西他沙星、曲伐沙星；磺酰胺类，诸如磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、复方磺胺甲噁唑；四环素类抗生素，诸如地美环素、强力霉素、米诺环素、氧四环素、四环素和替加环素；糖肽类抗生素，诸如万古霉素和替考拉宁；脂糖肽类抗生素，诸如特拉万星；噁唑烷酮类抗生素，诸如利奈唑胺和环丝氨酸；利福霉素类，诸如利福平、利福布汀、利福喷汀和利福拉齐；结核放线菌素类，诸如紫霉素和卷曲霉素；其他抗生素，诸如杆菌肽、多粘菌素B、氯霉素、甲硝唑、替硝唑和呋喃妥因。抗真菌剂是一类对真菌具有活性的抗微生物物质，并且是用于对抗真菌感染的最重要类型的抗真菌剂。抗真菌药物广泛用于治疗和预防此类感染。它们可杀死真菌或抑制真菌生长。可与本文所公开的组合物、方法和试剂盒一起使用的抗真菌剂的示例包括但不限于烯丙胺类抗真菌剂，诸如阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬和特比萘芬；咪唑类抗真菌剂，诸如联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、酮康唑、异康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑和特康唑；三唑类抗真菌剂，诸如阿巴康唑、艾氟康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑；以及噻唑类抗真菌剂，诸如阿巴芬净；多烯类抗真菌剂，诸如两性霉素B、制霉菌素、纳他霉素和曲古霉素；棘白霉素类，诸如阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净；硫代氨基甲酸酯类抗真菌剂，诸如托萘酯；抗代谢物类抗真菌剂，诸如氟胞嘧啶；苄胺类，诸如布替萘芬；其他抗真菌剂，诸如灰黄霉素、环吡酮、硫化硒和塔瓦布尔。抗病毒药是防止病毒进入、复制、传播和/或成熟的药物。可与本文所公开的组合物、方法和试剂盒一起使用的抗病毒药的示例包括但不限于抗疱疹剂，诸如阿昔洛韦、溴夫定、二十二醇、泛昔洛韦、膦甲酸、碘苷、喷昔洛韦、三氟尿苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、伐昔洛韦、曲金刚胺和普立替韦；抗流感剂，诸如金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦、帕拉米韦和扎那米韦；NS3/4A蛋白酶抑制剂，诸如阿那匹韦、波西普韦、西鲁瑞韦、丹诺普韦、福达瑞韦、格拉卡匹韦、格佐普韦、那拉匹韦、帕利瑞韦、西咪匹韦、西美瑞韦、特拉匹韦、伐尼瑞韦、vedroprevir和伏西瑞韦；NS5A抑制剂，诸如达卡他韦、艾尔巴韦、雷迪帕韦、奥达拉斯韦、奥比他韦、哌仑他韦、拉维达韦、ruzasvir、samatasvir和维帕他韦；NS5B RNA聚合酶抑制剂，诸如贝克拉布韦、达萨布韦、地乐波韦、非利布韦、色曲布韦、索非布韦、radalbuvir、乌普立布韦；抗乙型肝炎药，诸如拉米夫定、替比夫定、克拉夫定、阿德福韦、替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺；进入/融合抑制剂，诸如恩夫韦地、马拉韦罗、维立韦罗、赛尼克韦罗、PRO 140、伊巴珠单抗和fostemsavir；逆转录酶抑制剂，诸如地达诺新、恩曲他滨、拉米夫定、司他夫定、齐多夫定、氨多索韦、阿立他滨、森沙戊定、艾夫他滨、拉西韦、stampidine、4'-乙炔基-2-氟-2'-脱氧腺苷、扎西他滨、依法韦仑、奈韦拉平、地拉韦定、依曲韦林、利匹韦林和多拉韦林；整合酶抑制剂，诸如度鲁特韦、埃替格韦、雷特格韦、BI 224436、卡博格韦、比卡格韦和MK-2048；成熟抑制剂，诸如贝韦立马和BMS-955176；蛋白酶抑制剂，诸如安普那韦、膦沙那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、利托那韦、沙喹那韦、阿扎那韦、达芦那韦和替拉那韦；整合酶抑制剂，诸如度鲁特韦、埃替格韦、雷特格韦、BI 224436、卡博格韦、比卡格韦和MK-2048；核苷酸类似物/NtRTI，诸如替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺(TAF)；药代动力学增效剂，诸如可比司他和利托那韦；以及干扰素，诸如干扰素-α和聚乙二醇干扰素-α；其他抗病毒药，诸如甲吲噻腙、利福平、咪喹莫特、瑞喹莫德、鬼臼毒素、福米韦森、西多福韦、普来可那立、法匹拉韦、加利地韦、瑞德西韦、美立他滨、MK-608、NITD008、吗啉胍、曲金刚胺和三氮唑核苷。

本文所公开的组合物、方法和试剂盒还提高通过使用微阵列鉴定新合成的微生物核酸来鉴定样本中的微生物，该微阵列包含针对来自许多不同微生物的核酸的探针。通常，微阵列将具有针对来自20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、100000种或包括或介于前述值的任两个值之间的任何范围(包括它们的分数增量)种不同微生物体的核酸的探针。探针通常被设计成具有与一个或多个靶生物体基因组的片段互补的序列(例如，16S rRNA)。寡核苷酸可通过机械沉积点样到阵列上、用改进的喷墨印刷头喷涂或通过一系列光催化反应原位合成。探针以“特征”的矩形网格放置在阵列上，每个网格包含相同寡核苷酸的多个拷贝。阵列上特征的密度在平台之间有所不同，从典型点型阵列的每个载玻片20,000个点到使用原位合成寡核苷酸的平台诸如NimbleGen和Affymetrix的数百万个点。阵列可用垫片细分为子阵列，从而允许在一张载玻片上测试多个样本。随机散布在阵列中的复制特征可用于允许校正划痕和空间效应。在一些阵列上，包括具有随机序列的阴性对照探针，以提供用于背景噪声校正的阈值水平。本领域已描述了任何数量的病原体检测微阵列，包括ViroChip(Wang D.等人，PLoSBiol.，2003年；1:E2)；重测序病原体微阵列(Leski T.等人，PLoS ONE.，2009年；4:e6569)；通用检测微阵列(Belosludtsev Y.等人，BioTechniques.，2004年；37:654–8,66)；GreeneChip(Quan等人，J Clin Microbiol.，2007年；45:2359–64)；和Lawrence Livermore微生物检测阵列(Gardner S.等人，BMC Genomics.，2010年；11:668)。例如，LawrenceLivermore微生物检测阵列具有用于近6,000个病毒和15,000个细菌以及真菌和原生动物生物体的探针。在将新合成的微生物DNA施加到微阵列之后，检测其特定序列的任何探针将发出荧光，并被扫描仪读取。然后使用算法分析来自扫描仪的原始数据。生物信息学用于鉴定大量核酸序列或探针，这些核酸序列或探针是微生物的特征。

本文所公开的组合物、方法和试剂盒还提供通过对已掺入本公开的核苷或核苷酸类似物的新合成的微生物核酸进行测序来鉴定样本中的微生物体。任何数量的测序方法可用于对新合成的微生物DNA或已逆转录成cDNA的微生物RNA进行测序，包括基于Sanger双脱氧链终止测序方法的测序技术，体外转座，包括454FLX^TM或454TITANIUM^TM(Roche)、SOLEXA^TM基因组分析仪(Illumina)、HELISCOPE^TM单分子测序仪(Helicos Biosciences)和SOLID^TMDNA测序仪(Life Technologies/Applied Biosystems)仪器)的下一代序列平台，以及仍由公司诸如Intelligent Biosystems和Pacific Biosystems开发的其他平台。尽管对于不同的下一代测序平台来说，生成序列信息的化学方法各不相同，但是它们都共有从大量测序模板生成序列数据的共同特征，测序反应在这些模板上同时进行。一般来讲，使用扫描仪收集来自所有这些测序反应的数据，然后使用计算机和强大的生物信息学程序进行组装和分析。测序反应以“大规模并行”或“多重”方式进行、读取、组装和分析。这些仪器的大规模并行性质要求改变对需要哪种测序模板以及如何生成它们的想法，以便从这些强大的仪器获得最大可能的测序数据量。因此，现在不再需要大肠杆菌中的DNA克隆的基因组文库，而重要的是考虑用于生成DNA片段文库的体外系统，该DNA片段文库包含从样本中靶DNA生成的DNA片段的集合或群体，其中该集合或群体中所有DNA片段的组合显示出定性和/或定量地代表从中生成DNA片段的靶DNA序列的序列。事实上，在一些情况下，有必要考虑生成由多个基因组DNA片段文库组成的DNA片段文库，每个基因组DNA片段文库用不同的地址标签或条形码进行标记，以允许识别每个已测序片段的来源。

一般来讲，这些下一代测序方法需要将基因组DNA或双链cDNA(由RNA制备)片段化成更小的ssDNA片段，并且向ssDNA片段的至少一条链或优选两条链添加标签。在一些方法中，标签提供了使用DNA聚合酶进行DNA测序的引发位点。在一些方法中，标签还提供用于将片段捕获到表面诸如小珠上的位点(例如，对于这些方法中的一些，在乳液PCR扩增之前；例如，使用如美国专利第7,323,305号中所述的方法)。在大多数情况下，用作下一代测序的模板的DNA片段文库包含带5'标签和3'标签的DNA片段或“带双标签的DNA片段”。一般来讲，用于生成下一代测序用的DNA片段文库的当前方法包括：使用超声仪、雾化器或核酸酶将期望进行测序的靶DNA(例如，靶DNA包含基因组DNA或RNA逆转录后的双链cDNA)片段化，并将由衔接子或标签组成的寡核苷酸接合(例如，通过连接)到片段的5'端和3'端。一些下一代测序方法在其测序过程中使用环状ssDNA底物。例如，Drmanac等人的美国专利申请第20090011943号、第20090005252号、第20080318796号、第20080234136号、第20080213771号、第20070099208号和第20070072208号公开了用于大规模平行DNA测序的环状ssDNA模板的生成。Gunderson和Steemers的美国专利申请第20080242560号公开了包括以下方法的方法：制作数字DNA球(参见，例如美国专利申请第20080242560号中的图8)；和/或DNA(诸如基因组DNA)的基因座特异性切割和扩增，包括通过多个置换扩增或全基因组扩增进行扩增(例如，其中的图17)或通过超支化RCA(例如，其中的图18)进行扩增以生成扩增的核酸阵列(例如，ILLUMINA BeadArrays^TM；ILLUMINA，San Diego Calif.，USA)。

在具体实施方案中，本公开提供了使用基于转座体的测序方法来鉴定样本中的微生物体。此类基于转座体的测序方法描述于US2014/0162897、US2015/0368638、US2018/0245069、US2018/0023119、WO20122103545、WO20150160895、WO2016130704、WO2019028047、US9574226、EP3161152，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本公开。通过使用转座酶介导的片段化和加标签，可以最大限度地减少将靶核酸诸如DNA转化成准备用于下一代测序的衔接子修饰模板所需的步骤数。该过程(在本文中称为“片段标签化”)通常涉及转座体复合物对靶核酸的修饰，该转座体复合物包含与转座子对复合的转座酶，该转座子对包含单链衔接子序列和双链转座子末端序列区，以及针对特定目的设计的任选的附加序列。片段标签化导致靶核酸的片段化和衔接子与双链体核酸片段的两条链的5'端的连接同时发生。在转座体复合物与载体结合的情况下，所得片段在片段标签化反应后与固体载体结合(或者就5'连接的转座体复合物而言直接结合，或者就3'连接的转座体复合物而言通过杂交结合)。具体地，通过使用本文所述的转座酶和转座子末端组合物，可从靶微生物DNA(包括从微生物RNA制备的双链cDNA)生成带双标签的线性ssDNA片段或带标签的环状ssDNA片段(及其扩增产物)的文库，以用于基因组、亚基因组、转录组或宏基因组分析或微生物RNA表达的分析(例如，用于制备微阵列分析的标记靶标；例如，用于分析拷贝数变异，用于检测和分析单核苷酸多态性，以及用于从环境样本诸如土壤或水源中寻找基因)。

在具体实施方案中，本文所述的基于转座体的测序方法使用体外转座反应将新合成的微生物DNA同时断裂成片段，并将标签接合到每个片段的5'端。可通过使用单独的转座酶和转座子末端组合物或包含在转座酶和转座子末端组合物之间形成的稳定复合物的单一转座体组合物组装反应来进行体外转座反应。因此，应当理解，任何描述使用转座酶和转座子末端组合物的基于转座体的测序方法也可使用由转座酶和转座子末端组合物制成的转座体组合物，并且任何描述使用转座体组合物的基于转座体的测序方法也可使用组成转座体组合物的单独的转座酶和转座子末端组合物。

本文所述的基于转座体的测序方法可用于从新合成的微生物DNA生成带标签的DNA片段的文库，该基于转座体的测序方法包括：在体外转座反应中将该新合成的微生物DNA与至少一种转座酶和与该转座酶形成转座复合物的转座子末端组合物一起温育，该转座子末端组合物包含(i)转移链，该转移链表现出转移的转座子末端序列以及任选地该转移的转座子末端序列的5'-附加序列，和(ii)非转移链，该非转移链表现出在该新合成的微生物DNA中可发生多次插入的条件和足够长的时间下与该转移的转座子末端序列互补的序列，每次插入都导致包含转移链或由转移链组成的第一标签接合到靶DNA中核苷酸的5’端，从而片段化该靶DNA并生成退火的带5’标签的DNA片段的群体，每个带5’标签的DNA片段在5’端具有第一标签；然后将带5’标签的DNA片段的3'端接合到第一标签或第二标签，从而生成带标签的DNA片段(例如，包含带标签的环状ssDNA片段或带5’标签和带3'标签的DNA片段(或“带双标签的DNA片段”))的文库。在另一个实施方案中，上述基于转座体的测序方法使用单独的转座酶和转座子末端组合物，而在其他实施方案中，基于转座体的测序方法使用转座体组合物进行，该转座体组合物包含在转座酶和转座子末端组合物之间形成的复合物。

本公开还提供了通过使用基于转座体的测序方法来鉴定微生物体，其中转座体复合物结合到固体载体。使用小珠连接的转座体进行测序的商业产品的示例为

提供的Nextera^TMDNA Flex系统。Nextera^TMDNA Flex系统可用于使用本文所述的方法来鉴定微生物体。核酸片段文库可使用基于转座体的方法来制备，其中两个转座子末端序列(其中一个连接到标签序列)与转座酶形成转座体复合物。该转座体复合物用于在溶液中将靶核酸片段化并加标签，以生成准备好用于测序仪的片段标签化文库。该转座体复合物可被固定在固体表面上，例如通过附加在两个末端序列之一的5'端的生物素。使用固定化转座体通过减少手动和总的文库制备时间、成本和试剂要求，降低样本输入量要求，以及能够使用未纯化或降解的样本作为文库制备的起点，提供了优于溶液相方法的显著优点。用于将转座体固定在固体表面上以产生均一的片段大小和文库产量的示例性转座程序和系统在WO2014/108810和WO2016/189331中有详细描述，这些专利中的每一篇均全文以引用方式并入本文。在PCT公布WO2016/189331和US 2014/093916A1中描述的某些基于小珠的片段标签化方法中，使用生物素-链霉亲和素相互作用将转座体结合到磁性小珠。

一般来讲，转座体使用共价或非共价结合配偶体(例如，亲和元件和亲和结合配偶体)固定在基板诸如载玻片或小珠上。例如，转座体复合物通过连接到该转座体复合物的生物素酰化接头固定在链霉亲和素包被的小珠上。通过转座体复合物捕获新合成的微生物核酸，将该核酸片段化并加标签(“片段标签化”)。扩增该带标签的片段，任选地(例如，通过杂交探针)捕获感兴趣的扩增子，并对该带标签的片段进行测序。

使用固体载体连接的转座体复合物进行文库制备减少了对进入文库制备过程的样本输入归一化以及在富集或测序步骤之前对文库输出归一化的需求。即使当使用不同的样本输入浓度时，使用这些复合物也产生相对于溶液相方法具有更一致插入片段大小的文库。在一些实施方案中，通过一种或多种多核苷酸(例如，寡核苷酸)，诸如包含转座子末端序列的多核苷酸(寡核苷酸)，将转座体复合物固定到载体。在一些实施方案中，转座体复合物可通过附加到转座子序列末端的接头固定，例如，将转座酶偶联到固体载体。在一些实施方案中，转座酶和转座子多核苷酸(例如，寡核苷酸)均被固定到固体载体。当提及分子(例如，核酸、酶)固定到固体载体时，术语“固定的”、“附连的”和“连接的”在本文中可互换使用，并且除非另外明确地或通过上下文指明，否则这些术语均旨在涵盖直接或间接、共价或非共价连接。在本公开的某些实施方案中，共价连接可以是优选的，但通常所需的是分子(例如，核酸、酶)在旨在使用载体的条件下(例如，在需要核酸扩增和/或测序的应用中)保持固定或连接到载体。在一些情况下，在基于小珠的片段标签化中，转座体可通过配体对(例如，亲和元件和亲和结合配偶体)结合到小珠表面。

基于转座子的技术可用于将DNA片段化，例如，如在NEXTERA^TMXT和FLEX DNA样本制备试剂盒(Illumina,Inc.)的工作流程中所例示的，其中新合成的微生物核酸用转座体复合物处理，该转座体复合物同时将靶标片段化并加标签(“片段标签化”)，从而形成在该片段的末端处用独特衔接子序列加标签的片段化核酸分子的群体。

转座反应是其中一个或多个转座子在随机位点或几乎随机位点处插入靶核酸中的反应。转座反应中的组分包括转座酶(或能够将如本文所述的核酸片段化并加标签的其他酶，诸如整合酶)和转座子元件，该转座子元件包括与该酶结合的双链转座子末端序列，以及连接到这两个转座子末端序列之一的衔接子序列。双链转座子末端序列的一条链被转移到靶核酸的一条链上，而互补转座子末端序列链则没有被转移(即，非转移转座子序列)。衔接子序列可根据需要或期望包含一个或多个功能序列(例如，引物序列)。

因此，在另一个实施方案中，样本中微生物体的鉴定和分析还包括生成带标签的核酸片段的文库的步骤，包括：提供包含固定于其上的本文所述的转座体复合物的固体载体；以及在足以将靶核酸片段化成多个靶片段并将第一转座子的3'端接合到靶片段的5'端以提供多个带5'标签的靶片段的条件下使固体载体与分离的或纯化的新合成的微生物核酸接触。在另一个实施方案中，该方法还包括扩增带5’标签的靶片段。在另一个实施方案中，该方法还包括对带5’标签的靶片段中的一个或多个带5’标签的靶片段或其扩增产物进行测序。在一些方面，本公开提供了通过本文所述方法产生的新合成微生物核酸的带5’标签片段的文库。

在另一方面，本发明提供了包括本发明的至少一种核苷类似物和标记试剂的试剂盒。该试剂盒通常还将包括在一种或多种方法中使用核苷类似物和标记试剂(通常用于检测或测量微生物核酸合成的变化)的说明书。

在示例性实施方案中，该试剂盒包括含有生物正交官能部分的核苷或核苷酸类似物，以及可与生物正交官能部分发生点击化学的第一标记试剂。另外的试剂盒组分包括下拉试剂、缓冲液、其他检测试剂和标准品。

以下实施例旨在说明而非限制本公开。尽管它们是可使用方法中的典型方法，但另选地也可使用本领域技术人员已知的其他方法。

实施例

检测和鉴定来自败血症患者的样本中的细菌的示例性方法。本公开的方法和技术允许检测败血症患者中的细菌。如图1所示，将血液样本在含有核苷标记试剂5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)的培养基中培养。在短时间培养(数分钟至数小时)后，经历DNA合成的活细胞将EdU掺入它们的基因组中。在此，如果要查询抗生素抗性，则可在培养基中包含感兴趣的抗生素。在快速培养后，将细胞裂解，然后任选地可从裂解物中纯化DNA。然后通过与叠氮化物-二硫化物-生物素接头的点击反应，用生物素标记新合成的包含EdU的DNA。用生物素标记后，新合成的DNA随后被链霉亲和素偶联的小珠捕获。在洗涤小珠后，通过添加二硫苏糖醇(DTT)从小珠中释放DNA。为了鉴定产生该DNA的细菌，使用标准方法(例如，具有PCR文库扩增的Illumina Nextera DNA Flex)制备测序文库，然后测序。序列的生物信息学分析揭示了引起败血症的细菌的种类。

快速分析含有活微生物体的样本中的微生物基因表达的示例性方法。本公开的方法和技术还可用于快速分析含有活微生物体的样本中的微生物基因表达(图2)。样本不是用EdU培养，而是用5-乙炔基尿苷(EU)培养，然后将其掺入新合成的微生物RNA中。在该RNA的生物素标记和基于链霉亲和素的纯化后，将该RNA逆转录成cDNA。从该cDNA制备测序文库。测序和生物信息学分析随后揭示了样本中活微生物体的基因表达。该基因表达分析可用于鉴定引起疾病表型的基因或确定该微生物体是否对抗生素有反应。除了关于基因表达的信息外，RNA序列分析还可用于鉴定菌株。因为RNA是在活的、非增殖的微生物中合成的，所以RNA分析能够鉴定在培养中存活但不复制的污染性或感染性微生物。

应当理解，在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种修改。因此，其他实施方案也在以下权利要求书的范围内。

Claims (79)

1.一种用于鉴定和分析样本中的活的和/或增殖的微生物体的方法，所述方法包括：

(a)获得具有或疑似具有一种或多种类型的微生物体的样本；

(b)在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育所述样本，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物掺入到新合成的微生物核酸中；

(c)通过使新合成的微生物核酸与标记试剂接触来标记所述新合成的微生物核酸，所述标记试剂选择性地结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物或与之结合；

(d)分离或纯化所述带标记的新合成的微生物核酸；以及

(e)基于测序或确定所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的种类，确定所述样本中所述活的和/或增殖的微生物体的种类。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本获自患有或疑似患有微生物感染的受试者。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者患有或疑似患有败血症。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中对于(a)，在(b)之前使用去宿主方法处理所获得的样本，以便选择性地移除非微生物核酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述去宿主方法包括：

通过以下方式移除非微生物核酸：

(a)通过使所获得的样本与重组蛋白接触来选择性地切割非微生物DNA，所述重组蛋白包含：结合结构域，所述结合结构域选择性地结合到由组蛋白结合的非微生物核酸或包含甲基化CpG残基的非微生物核酸；以及具有切割核酸的活性的核酸酶结构域；

或

(b)使用结合到固体底物的亲和剂，所述固体底物选择性地结合到由组蛋白结合的核酸或选择性地结合到非微生物核酸的甲基化CpG残基。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本为从环境测试场所获得的环境样本。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述环境场所正在进行微生物污染测试。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本为从疑似有微生物污染的食品获得的样本。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的微生物体为细菌、真菌、病毒、藻类、古细菌和/或原生动物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细菌选自衣氏放线菌(Actinomycesisraelii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、韩瑟勒巴通氏菌(Bartonella henselae)、五日热巴通氏菌(Bartonella quintana)、百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)、埃氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、回归热包柔氏螺旋体(Borrelia recurrentis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布氏杆菌(Brucellacanis)、羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringen)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、圣地罗西钩端螺旋体(Leptospira santarosai)、韦氏钩端螺旋体(Leptospira weilii)、野口氏钩端螺旋体(Leptospira noguchii)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次氏立克次体(Rickettsia rickettsia)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)和/或假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述真菌选自伞状犁头霉(Absidiacorymbifera)、分枝梨头霉(Absidia ramose)、Achorion gallinae、马杜拉放线菌属(Actinomadura spp.)、皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatididis)、Aleurismabrasiliensis、Allersheria boydii、节皮菌属(Arthroderma spp.)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatu)、蛙粪霉属(Basidiobolus spp.)、芽生菌属(Blastomyces spp.)、背芽突霉属(Cadophora spp.)、白假丝酵母(Candida albicans)、芹菜尾孢菌(Cercospora apii)、金孢子菌属(Chrysosporium spp.)、枝孢菌属(Cladosporium spp.)、Cladothrix asteroids、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、罗伦隐球菌(Cryptococcus laurentii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)、Dematium wernecke、衣氏盘状菌(Discomyces israelii)、埃蒙斯菌属(Emmonsia spp.)、Emmonsiella capsulate、地霉内孢霉(Endomycesgeotrichum)、Entomophthora coronate、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、新型线黑粉菌(Filobasdiella neoformans)、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、白地霉(Geotrichum candidum)、Glenospora khartoumensis、石膏样裸囊菌(Gymnoascusgypseus)、小单孢子囊素(Haplosporangium parvum)、组织胞浆菌(Histoplasma)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、Hormiscium dermatididis、着色芽生菌属(Hormodendrum spp.)、角质霉菌属(Keratinomyces spp.)、Langeronia soudanense、塞内加尔小球腔菌(Leptosphaeria senegalensis)、伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)、Lobmyces loboi、罗布菌(Loboa loboi)、洛博芽生菌病(Lobomycosis)、马杜拉分支菌属(Madurella spp.)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、石榴碱微球菌(Micrococcuspelletieri)、小孢子菌属(Microsporum spp.)、念珠菌属(Monilia spp.)、毛霉属(Mucorspp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、奈尼兹皮真菌属(Nannizziaspp.)、罗萨梯新龟甲形菌(Neotestudina rosatii)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)、白色粉孢(Oidium albicans)、乳卵孢子菌(Oospora lactis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、鲍埃得彼得利壳菌(Petriellidium boydii)、瓶霉属(Phialophora spp.)、何德毛结节菌(Piedraia hortae)、糠秕孢子菌(Pityrosporumfurfur)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)(或卡氏肺孢子菌(Pneumocystiscarinii))、Pullularia gougerotii、罗梅罗刺壳孢菌(Pyrenchaeta romeroi)、西伯鼻孢子菌(Rhinosporidium seeberi)、小孢子霉属(Sabouraudites)(小孢霉属(Microsporum))、Sartorya fumigate、黄瘤孢属(Sepedonium)、孢子丝菌属(Sporotrichumspp.)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、链霉菌属(Streptomyce spp.)、皮肤癣菌属(Tinea spp.)、圆酵母属(Torula spp.)、毛癣菌属(Trichophyton spp.)、毛孢子菌属(Trichosporon spp.)和/或粉红楚普夫菌(Zopfiarosatii)。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒选自单纯病毒、水痘病毒、细胞巨化病毒、玫瑰疱疹病毒、淋巴潜隐病毒、猴病毒、哺乳动物腺病毒、α-乳头瘤病毒、β-乳头瘤病毒、X-乳头瘤病毒、γ-乳头瘤病毒、丑型乳头瘤病毒、寅型乳头瘤病毒、甲型多瘤病毒、乙型多瘤病毒、γ-多瘤病毒、丁型多瘤病毒、软疣痘病毒、正痘病毒、副痘病毒、α-TTV、β-TTV、γ-TTV、圆环病毒、格环病毒、Gemykibivirus、Gemyvongvirus、红病毒、依赖病毒、博卡病毒、正肝去氧核糖核酸病毒、γ逆转录病毒、δ-逆转录病毒、慢病毒、逆转录病毒科、科罗病毒、轮状病毒、东南亚十二RNA病毒、α-冠状病毒、β-冠状病毒、环曲病毒、哺乳动物星状病毒、诺罗病毒、札幌病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、心病毒、柯萨病毒、肠病毒、肝病毒、嵴病毒、副肠孤病毒、Rosavirus、萨佩洛病毒、甲病毒、风疹病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、亨尼巴病毒、麻疹病毒、呼吸道病毒、腮腺炎病毒、偏肺病毒、正肺病毒、Ledantevirus、狂犬病毒、水泡病毒、哺乳类沙粒病毒、Orthohantavirus、正内罗病毒、正本雅病毒、白蛉病毒、α-流感病毒、β-流感病毒、γ-流感病毒、Quaranjavirus、托高土病毒和/或δ病毒。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2-乙炔基-腺苷、N6-炔丙基-腺苷、2'-(O-炔丙基)-腺苷、3'-(O-炔丙基)-腺苷、5-乙炔基-胞苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷、2'-(O-炔丙基)-胞苷、3'-(O-炔丙基)-胞苷、2'-(O-炔丙基)-鸟苷、3'-(O-炔丙基)-鸟苷、5-乙炔基-尿苷、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷、2'-(O-炔丙基)-尿苷、3'-(O-炔丙基)-尿苷、(2'S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、8-叠氮基-腺苷、N⁶-(6-叠氮基)己基-2'-脱氧-腺苷、2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、5-叠氮基甲基-尿苷、5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷、5-(3-叠氮基丙基)-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-胞苷、5-叠氮基-PEG₄-2'-脱氧胞苷、5-溴-2'-脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-碘-2'脱氧尿苷和5-碘尿苷。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2-乙炔基-腺苷、N6-炔丙基-腺苷、2'-(O-炔丙基)-腺苷、3'-(O-炔丙基)-腺苷、5-乙炔基-胞苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷、2'-(O-炔丙基)-胞苷、3'-(O-炔丙基)-胞苷、2'-(O-炔丙基)-鸟苷、3'-(O-炔丙基)-鸟苷、5-乙炔基-尿苷、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷、2'-(O-炔丙基)-尿苷、3'-(O-炔丙基)-尿苷、(2'S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷和(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自8-叠氮基-腺苷、N⁶-(6-叠氮基)己基-2'脱氧-腺苷，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、5-叠氮基甲基-尿苷、5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷、5-(3-叠氮基丙基)-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-胞苷和5-叠氮基-PEG₄-2'-脱氧胞苷。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自5-溴-2'脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-碘-2'脱氧尿苷和5-碘尿苷。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述样本在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育5分钟至180分钟。

18.根据权利要求17所述的方法，其中将所述样本在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育30分钟至120分钟。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记试剂是以高特异性结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的抗体。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗体以高特异性结合到5-溴-2'脱氧尿苷或碘脱氧尿苷。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记试剂通过点击化学、应变[3+2]环加成反应或施陶丁格连接而结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物或与之结合。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述标记试剂包含叠氮基团，所述叠氮基团通过点击化学而结合到包含炔基基团的核苷或核苷酸类似物。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述标记试剂包含炔基基团，所述炔基基团通过点击化学而结合到包含叠氮基团的核苷或核苷酸类似物。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记试剂包含生物素基团。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述包含生物素基团的标记试剂选自：

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记试剂还包含可化学切割的接头或可酶切割的接头。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述可切割接头是基于酸不稳定性的接头或基于二硫化物的接头。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述基于酸不稳定性的接头包含腙或顺式乌头酰基基团。

29.根据权利要求26所述的方法，其中所述可酶切割的接头包括基于肽的接头或基于β-葡糖苷酸的接头。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中下拉剂用于分离或纯化所述带标记的新合成的微生物核酸。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述下拉试剂为固定到固体载体上的抗体，其中所述抗体以高特异性结合到标记试剂，或以高特异性结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述下拉试剂为固定到固体载体上的链霉亲和素或亲和素，并且其中所述标记试剂包含生物素基团。

33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述固体载体是纳米材料或微米材料、小珠或板。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在权利要求1的(e)之前，从所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸中移除或切割所述标记试剂或标记。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的种类通过使用包含来自不同微生物体的核酸的探针的微阵列来确定。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的种类通过以下方式来确定：

(i)使用基于第一PCR的方法，使用包含荧光染料的引物扩增所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸，以形成标记产物，其中所述引物包含对保守的微生物16S rRNA基因区具有特异性的序列；

(ii)将所述标记产物施加到包含探针的微阵列，所述探针包含来自20种或更多种微生物体的独特的16s rRNA可变区序列；

(iii)基于对所述微阵列的荧光杂交产物成像来确定所述活的和/或增殖的微生物体的种类，并基于所述微阵列探针的序列来确定所述微生物体的种类。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过对所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸进行测序来确定或确认所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的种类。

38.根据权利要求37所述的方法，其中使用基于转座体的测序方法，对所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸进行测序。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述新合成的微生物核酸的测序通过以下方式进行：

(a)将所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸施加到小珠连接的转座体，其中所述小珠连接的转座体同时介导微生物核酸的片段化和测序引物的添加；

(b)用包含索引序列和衔接子序列的引物扩增所述微生物核酸片段以形成扩增产物文库；

(c)洗涤并合并所述扩增产物文库；

(d)对所述扩增产物文库进行测序；以及

(e)基于使用生物信息学分析将获自所述扩增产物文库的序列与已知微生物体序列的数据库相关联，确定所述活的和/或增殖的微生物体的种类。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述新合成的微生物核酸是RNA，其中在权利要求1的(e)之前将所述微生物RNA逆转录成cDNA，并且其中所述活的和/或增殖的微生物体的基因表达可基于使用微阵列和/或通过测序而分析来自新合成微生物RNA的基因产物的表达水平来确定。

41.一种用于确定抗微生物剂在调节样本中微生物体的生长和增殖方面的有效性的方法，所述方法包括：

(a)获得具有或疑似具有一种或多种类型的微生物体的样本；

(b)将所述样本分成两个样本：对照样本和处理样本；

(c)在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育所述对照样本，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物掺入到新合成的微生物核酸中；

(c')在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物和抗微生物剂的存在下温育所述处理样本，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物掺入到新合成的微生物核酸中；

(d)通过使所述对照样本和所述处理样本的新合成的微生物核酸与标记试剂接触来标记所述新合成的微生物核酸，所述标记试剂选择性地结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物或与之结合；

(e)从所述对照样本和所述处理样本中分离或纯化所述带标记的新合成的微生物核酸；

(f)确定所述对照样本中所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量或种类；

(f’)确定所述处理样本中所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和种类；以及

(g)将所述对照样本中所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和/或种类与所述处理样本中所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量或种类进行比较并确定其任何变化，

其中如果所述处理样本中所述新合成的微生物核酸的基因表达水平与所述对照样本相比降低，或者所述处理样本中所述新合成的微生物核酸的量和/或种类与所述对照样本相比降低，则表明所述抗微生物剂在调节所述微生物体的生长和增殖方面是有效的。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗微生物剂选自抗生素、抗真菌剂和抗病毒药。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述抗生素选自阿莫西林、氨苄青霉素、巴氨西林、羧苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、匹氨西林、匹美西林、羟基噻吩青霉素、头孢乙腈、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢来星、头孢洛宁、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢曲秦、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑啉、头孢拉定、头孢甲氧环烯胺、头孢替唑、头孢克洛、头孢孟多、头孢美唑、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢唑南、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地秦、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢泊肟、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克定、头孢吡肟、头孢瑞南、头孢噻利、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢托罗、头孢洛林、头孢氯嗪、头孢罗兰、头孢帕罗、头孢卡奈、头孢屈洛、头孢吡酮、头孢三唑、头孢维曲、头孢马替林、cefmepidium、头孢维星、头孢噁唑、头孢罗替、头孢舒米、头孢呋汀、头孢噻氧、氨曲南、亚胺培南、多利培南、厄他培南、美罗培南、阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、地红霉素、罗红霉素、泰利霉素、克林霉素、林可霉素、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素、氟甲喹、萘啶酸、噁喹酸、吡咯米酸、吡哌酸、罗索沙星、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、芦氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、格雷沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、司帕沙星、替马沙星、托氟沙星、贝西沙星、德拉沙星、克林沙星、吉米沙星、普卢利沙星、西他沙星、曲伐沙星、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、复方磺胺甲噁唑、地美环素、强力霉素、米诺环素、氧四环素、四环素、替加环素、万古霉素、替考拉宁、特拉万星、利奈唑胺、环丝氨酸、利福平、利福布汀、利福喷汀、利福拉齐、紫霉素、卷曲霉素、杆菌肽、多粘菌素B、氯霉素、甲硝唑、替硝唑和呋喃妥因。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述抗真菌剂选自阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、酮康唑、异康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑、阿巴康唑、艾氟康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、两性霉素B、制霉菌素、纳他霉素、曲古霉素、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、托萘酯、氟胞嘧啶、布替萘芬、灰黄霉素、环吡酮、硫化硒、塔瓦布尔。

45.根据权利要求42所述的方法，其中所述抗病毒药选自阿昔洛韦、溴夫定、二十二醇、泛昔洛韦、膦甲酸、碘苷、喷昔洛韦、三氟尿苷、阿糖腺苷、阿糖胞苷、伐昔洛韦、曲金刚胺、普立替韦、金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦、帕拉米韦、扎那米韦、阿那匹韦、波西普韦、西鲁瑞韦、丹诺普韦、福达瑞韦、格拉卡匹韦、格佐普韦、那拉匹韦、帕利瑞韦、西咪匹韦、西美瑞韦、特拉匹韦、伐尼瑞韦、vedroprevir、伏西瑞韦、达卡他韦、艾尔巴韦、雷迪帕韦、奥达拉斯韦、奥比他韦、哌仑他韦、拉维达韦、ruzasvir、samatasvir、维帕他韦、贝克拉布韦、达萨布韦、地乐波韦、非利布韦、色曲布韦、索非布韦、radalbuvir、乌普立布韦、拉米夫定、替比夫定、克拉夫定、阿德福韦、替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺、恩夫韦地、马拉韦罗、维立韦罗、赛尼克韦罗、PRO 140、伊巴珠单抗、fostemsavir、地达诺新、恩曲他滨、拉米夫定、司他夫定、齐多夫定、氨多索韦、阿立他滨、森沙戊定、艾夫他滨、拉西韦、stampidine、4'-乙炔基-2-氟-2'-脱氧腺苷、扎西他滨、依法韦仑、奈韦拉平、地拉韦定、依曲韦林、利匹韦林、多拉韦林、度鲁特韦、埃替格韦、雷特格韦、BI 224436、卡博格韦、比卡格韦、MK-2048、贝韦立马、BMS-955176、安普那韦、膦沙那韦、茚地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、利托那韦、沙喹那韦、阿扎那韦、达芦那韦、替拉那韦、度鲁特韦、埃替格韦、雷特格韦、BI 224436、卡博格韦、比卡格韦、MK-2048、可比司他、利托那韦、干扰素-α、聚乙二醇干扰素-α、甲吲噻腙、利福平、咪喹莫特、瑞喹莫德、鬼臼毒素、福米韦森、西多福韦、普来可那立、法匹拉韦、加利地韦、瑞德西韦、美立他滨、MK-608、NITD008、吗啉胍、曲金刚胺和三氮唑核苷。

46.根据权利要求41至44中任一项所述的方法，其中所述样本获自患有或疑似患有微生物感染的受试者。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述受试者患有或疑似患有败血症。

48.根据权利要求41至46中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的微生物体为细菌、真菌和/或病毒。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述细菌选自衣氏放线菌(Actinomycesisraelii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、韩瑟勒巴通氏菌(Bartonella henselae)、五日热巴通氏菌(Bartonella quintana)、百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)、埃氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、回归热包柔氏螺旋体(Borrelia recurrentis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布氏杆菌(Brucellacanis)、羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringen)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、圣地罗西钩端螺旋体(Leptospira santarosai)、韦氏钩端螺旋体(Leptospira weilii)、野口氏钩端螺旋体(Leptospira noguchii)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次氏立克次体(Rickettsia rickettsia)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)和/或假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)。

50.根据权利要求47所述的方法，其中所述真菌选自伞状犁头霉(Absidiacorymbifera)、分枝梨头霉(Absidia ramose)、Achorion gallinae、马杜拉放线菌属(Actinomadura spp.)、皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatididis)、Aleurismabrasiliensis、Allersheria boydii、节皮菌属(Arthroderma spp.)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatu)、蛙粪霉属(Basidiobolus spp.)、芽生菌属(Blastomyces spp.)、背芽突霉属(Cadophora spp.)、白假丝酵母(Candida albicans)、芹菜尾孢菌(Cercospora apii)、金孢子菌属(Chrysosporium spp.)、枝孢菌属(Cladosporium spp.)、Cladothrix asteroids、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、白色隐球菌(Cryptococcus albidus)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、罗伦隐球菌(Cryptococcus laurentii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)、Dematium wernecke、衣氏盘状菌(Discomyces israelii)、埃蒙斯菌属(Emmonsia spp.)、Emmonsiella capsulate、地霉内孢霉(Endomycesgeotrichum)、Entomophthora coronate、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、新型线黑粉菌(Filobasdiella neoformans)、着色真菌属(Fonsecaea spp.)、白地霉(Geotrichum candidum)、Glenospora khartoumensis、石膏样裸囊菌(Gymnoascusgypseus)、小单孢子囊素(Haplosporangium parvum)、组织胞浆菌(Histoplasma)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、Hormiscium dermatididis、着色芽生菌属(Hormodendrum spp.)、角质霉菌属(Keratinomyces spp.)、Langeronia soudanense、塞内加尔小球腔菌(Leptosphaeria senegalensis)、伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)、Lobmyces loboi、罗布菌(Loboa loboi)、洛博芽生菌病(Lobomycosis)、马杜拉分支菌属(Madurella spp.)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、石榴碱微球菌(Micrococcuspelletieri)、小孢子菌属(Microsporum spp.)、念珠菌属(Monilia spp.)、毛霉属(Mucorspp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、奈尼兹皮真菌属(Nannizziaspp.)、罗萨梯新龟甲形菌(Neotestudina rosatii)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)、白色粉孢(Oidium albicans)、乳卵孢子菌(Oospora lactis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、鲍埃得彼得利壳菌(Petriellidium boydii)、瓶霉属(Phialophora spp.)、何德毛结节菌(Piedraia hortae)、糠秕孢子菌(Pityrosporumfurfur)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)(或卡氏肺孢子菌(Pneumocystiscarinii))、Pullularia gougerotii、罗梅罗刺壳孢菌(Pyrenchaeta romeroi)、西伯鼻孢子菌(Rhinosporidium seeberi)、小孢子霉属(Sabouraudites)(小孢霉属(Microsporum))、Sartorya fumigate、黄瘤孢属(Sepedonium)、孢子丝菌属(Sporotrichumspp.)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、链霉菌属(Streptomyce spp.)、皮肤癣菌属(Tinea spp.)、圆酵母属(Torula spp.)、毛癣菌属(Trichophyton spp.)、毛孢子菌属(Trichosporon spp.)和/或粉红楚普夫菌(Zopfiarosatii)。

51.根据权利要求47所述的方法，其中所述病毒选自单纯病毒、水痘病毒、细胞巨化病毒、玫瑰疱疹病毒、淋巴潜隐病毒、猴病毒、哺乳动物腺病毒、α-乳头瘤病毒、β-乳头瘤病毒、X-乳头瘤病毒、γ-乳头瘤病毒、丑型乳头瘤病毒、寅型乳头瘤病毒、甲型多瘤病毒、乙型多瘤病毒、γ-多瘤病毒、丁型多瘤病毒、软疣痘病毒、正痘病毒、副痘病毒、α-TTV、β-TTV、γ-TTV、圆环病毒、格环病毒、Gemykibivirus、Gemyvongvirus、红病毒、依赖病毒、博卡病毒、正肝去氧核糖核酸病毒、γ逆转录病毒、δ-逆转录病毒、慢病毒、逆转录病毒科、科罗病毒、轮状病毒、东南亚十二RNA病毒、α-冠状病毒、β-冠状病毒、环曲病毒、哺乳动物星状病毒、诺罗病毒、札幌病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、心病毒、柯萨病毒、肠病毒、肝病毒、嵴病毒、副肠孤病毒、Rosavirus、萨佩洛病毒、甲病毒、风疹病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、亨尼巴病毒、麻疹病毒、呼吸道病毒、腮腺炎病毒、偏肺病毒、正肺病毒、Ledantevirus、狂犬病毒、水泡病毒、哺乳类沙粒病毒、Orthohantavirus、正内罗病毒、正本雅病毒、白蛉病毒、α-流感病毒、β-流感病毒、γ-流感病毒、Quaranjavirus、托高土病毒和/或δ病毒。

52.根据权利要求41至50中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2-乙炔基-腺苷、N6-炔丙基-腺苷、2'-(O-炔丙基)-腺苷、3'-(O-炔丙基)-腺苷、5-乙炔基-胞苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷、2'-(O-炔丙基)-胞苷、3'-(O-炔丙基)-胞苷、2'-(O-炔丙基)-鸟苷、3'-(O-炔丙基)-鸟苷、5-乙炔基-尿苷、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷、2'-(O-炔丙基)-尿苷、3'-(O-炔丙基)-尿苷、(2'S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、8-叠氮基-腺苷、N⁶-(6-叠氮基)己基-2'-脱氧-腺苷、2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、5-叠氮基甲基-尿苷、5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷、5-(3-叠氮基丙基)-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-胞苷、5-叠氮基-PEG₄-2'-脱氧胞苷、5-溴-2'-脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-碘-2'脱氧尿苷和5-碘尿苷。

53.根据权利要求41至51中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2-乙炔基-腺苷、N6-炔丙基-腺苷、2'-(O-炔丙基)-腺苷、3'-(O-炔丙基)-腺苷、5-乙炔基-胞苷、5-乙炔基-2'-脱氧胞苷、2'-(O-炔丙基)-胞苷、3'-(O-炔丙基)-胞苷、2'-(O-炔丙基)-鸟苷、3'-(O-炔丙基)-鸟苷、5-乙炔基-尿苷、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷、2'-(O-炔丙基)-尿苷、3'-(O-炔丙基)-尿苷、(2'S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷、(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷、2'(S)-2'-脱氧-2'-氟-5-乙炔基尿苷和(2'S)-2'-氟-5-乙炔基尿苷。

54.根据权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自8-叠氮基-腺苷、N⁶-(6-叠氮基)己基-2'脱氧-腺苷，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、5-叠氮基甲基-尿苷、5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷、5-(3-叠氮基丙基)-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-尿苷、5-叠氮基-PEG₄-胞苷和5-叠氮基-PEG₄-2'-脱氧胞苷。

55.根据权利要求41至53中任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物选自5-溴-2'脱氧尿苷、5-溴尿苷、5-碘-2'脱氧尿苷和5-碘尿苷。

56.根据权利要求41至54中任一项所述的方法，其中将所述对照样本和所述处理样本两者在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育相同的时间段，即5分钟至180分钟。

57.根据权利要求55所述的方法，其中将所述对照样本和所述处理样本两者在一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的存在下温育相同的时间段，即30分钟至120分钟。

58.根据权利要求41至56中任一项所述的方法，其中所述标记试剂是以高特异性结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物的抗体。

59.根据权利要求57所述的方法，其中所述抗体以高特异性结合到5-溴-2'脱氧尿苷或碘脱氧尿苷。

60.根据权利要求41至58中任一项所述的方法，其中所述标记试剂通过点击化学、应变[3+2]环加成反应或施陶丁格连接而结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物或与之结合。

61.根据权利要求59所述的方法，其中所述标记试剂包含叠氮基团，所述叠氮基团通过点击化学而结合到包含炔基基团的核苷或核苷酸类似物。

62.根据权利要求59所述的方法，其中所述标记试剂包含炔基基团，所述炔基基团通过点击化学而结合到包含叠氮基团的核苷或核苷酸类似物。

63.根据权利要求41至61中的任一项所述的方法，其中所述标记试剂包含生物素基团。

64.根据权利要求62所述的方法，其中所述包含生物素基团的标记试剂选自：

65.根据权利要求41至62中的任一项所述的方法，其中所述标记试剂还包含可化学切割的接头或可酶切割的接头。

66.根据权利要求63所述的方法，其中所述可切割接头是基于酸不稳定性的接头或基于二硫化物的接头。

67.根据权利要求64所述的方法，其中所述基于酸不稳定性的接头包含腙或顺式乌头酰基基团。

68.根据权利要求63所述的方法，其中所述可酶切割的接头包括基于肽的接头或基于β-葡糖苷酸的接头。

69.根据权利要求41至66中任一项所述的方法，其中下拉剂用于分离或纯化所述带标记的新合成的微生物核酸。

70.根据权利要求67所述的方法，其中所述下拉试剂为固定到固体载体上的抗体，其中所述抗体以高特异性结合到标记试剂，或以高特异性结合到所述一种或多种类型的核苷或核苷酸类似物。

71.根据权利要求67所述的方法，其中所述下拉试剂为固定到固体载体上的链霉亲和素或亲和素，并且其中所述标记试剂包含生物素基团。

72.根据权利要求68或权利要求69所述的方法，其中所述固体载体是纳米材料或微米材料、小珠或板。

73.根据权利要求41至70中任一项所述的方法，其中在权利要求42的(f)、(f')和(g)之前，从所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸中移除或切割所述标记试剂或标记。

74.根据权利要求41至71中任一项所述的方法，其中通过使用包含来自不同微生物体的核酸的探针的微阵列来确定所述对照样本和所述处理样本中所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和/或种类。

75.根据权利要求72所述的方法，其中通过以下方式来确定所述对照样本和所述处理样本中所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和/或种类：

(i)使用基于第一PCR的方法，使用包含荧光染料的引物扩增来自所述对照样本的所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸，以形成标记产物，其中所述引物包含对保守的微生物16S rRNA基因区具有特异性的序列；

(i')使用基于第一PCR的方法，使用包含所述荧光染料的引物扩增来自所述处理样本的所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸，以形成标记产物，其中所述引物包含对保守的微生物16S rRNA基因区具有特异性的序列；

(ii)将来自所述对照样本的所述标记产物施加到包含探针的第一微阵列，所述探针包含来自20种或更多种微生物体的独特的16s rRNA可变区序列；

(ii')将来自所述处理样本的所述标记产物施加到第二微阵列，其中所述第二微阵列是所述第一微阵列的复制品；以及

(iii)基于对所述第一微阵列和所述第二微阵列的荧光杂交产物成像来确定抗微生物剂在调节样本中微生物体的生长和增殖方面的有效性，并确定所述微阵列之间所述荧光杂交产物的强度、位置或缺失是否有任何变化，

其中如果所述第一微阵列和所述第二微阵列之间所述荧光杂交产物的强度降低，或者如果所述第一微阵列和所述第二微阵列之间所述荧光杂交产物的位置或缺失发生变化，则表明所述抗微生物剂在调节所述微生物体的生长和增殖方面是有效的。

76.根据权利要求41至73中任一项所述的方法，其中通过对来自所述对照样本和来自所述处理样本的所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸进行测序来确定或确认抗微生物剂在调节样本中微生物体的生长和增殖方面的有效性，

其中所述处理样本中所述新合成的微生物核酸的基因表达水平与所述对照样本相比降低，或者所述处理样本中所述新合成的微生物核酸的量和/或种类与所述对照样本相比降低，表明所述抗微生物剂在调节所述微生物体的生长和增殖方面是有效的。

77.根据权利要求74所述的方法，其中使用基于转座体的测序方法，对来自所述对照样本和所述处理样本的所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸进行测序。

78.根据权利要求75所述的方法，其中来自所述对照样本和所述处理样本的所述新合成的微生物核酸的测序通过以下方式进行：

(a)将来自所述对照样本和所述处理样本的所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸施加到小珠连接的转座体，其中所述小珠连接的转座体同时介导微生物核酸的片段化和测序引物的添加；

(b)用包含索引序列和衔接子序列的引物扩增所述微生物核酸片段以形成扩增产物文库；

(c)洗涤并合并来自所述对照样本的所述扩增产物文库；

(c')洗涤并合并来自所述处理样本的所述扩增产物文库；

(d)对来自所述对照样本的所述扩增产物文库进行测序；

(d')对来自所述处理样本的所述扩增产物文库进行测序；以及

(e)使用生物信息学分析，确定来自所述对照样本和所述处理样本的所述分离的或纯化的新合成的微生物核酸的基因表达水平和/或量和/或种类的任何变化。

79.根据权利要求41至76中任一项所述的方法，其中所述新合成的微生物核酸是RNA，其中在权利要求41的(f)、(f')和(g)之前将所述微生物RNA逆转录成cDNA，并且其中抗微生物剂在调节微生物体的生长和增殖方面的有效性可基于通过使用微阵列和/或通过测序而确定来自所述对照样本和所述处理样本的新合成的微生物核酸的基因表达水平的变化来确定。

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