KR20220004947A - 신속한 인큐베이션 및 핵산 풍부화에 의한 미생물 샘플의 확인 및 분석 - Google Patents

신속한 인큐베이션 및 핵산 풍부화에 의한 미생물 샘플의 확인 및 분석 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 샘플 내의 미생물을 확인 및 분석하기 위한 방법, 조성물, 및 키트에 관한 것이다.

Description

신속한 인큐베이션 및 핵산 풍부화에 의한 미생물 샘플의 확인 및 분석
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 29일자로 출원된 미국 가출원 제62/840,322호로부터의 우선권을 35 U.S.C. §119 하에서 주장하며, 이의 개시 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 샘플 내의 미생물을 확인 및 분석하기 위한 방법, 조성물, 및 키트에 관한 것이다.
환자가 미생물 감염을 갖는지의 여부를 결정하는 것은 일반적인 임상적 난제이다. 패혈증은 입원 환자에서 가장 흔한 사망 원인으로서, 미국에서 매년 200,000건의 사망이 추정된다. 그러나, 패혈증은 가변성 임상 제시(variable clinical presentation)를 갖는 부정확한 임상 증후군이다. 진단은 통상 기관 기능이상의 징후와 조합된, 감염의 의심에 기초한다. 중증 패혈증 또는 패혈증 쇼크로의 진행은 심각한 결과를 갖기 때문에, 조기 패혈증 진단 및 항생제 투여는 극히 중요하다. 불행하게도, 중환자(seriously ill patient)에서는 패혈증과 기타 다른 염증성 질환 사이를 구별하기가 종종 어렵다. 혈액 내 세균성 감염의 검출은 패혈증 진단에 있어서 그리고 항미생물제에 의한 치료를 개시하는 데 있어서 핵심 단계이다. 그러나, 혈액 배양물은 중증 패혈증을 갖는 환자의 60 내지 70%에서 음성이며, 80% 초과가 연구에서 음성이었다. 게다가, 전통적인 미생물학적 방법은 병원성 세균에 대한 1차 요법(first line therapy)에 영향을 미치기에는 너무 오래 걸린다. PCR 및 질량 분석법에서의 발달은 혈액 샘플 내의 세균을 확인할 가능성을 증가시켜 왔지만, 종종 병원균 부하를 증가시키기 위하여 혈액 배양과 같은 시간-소모적인 사전분석 처리에 의존한다. 감염에 대한 프록시(proxy)는 증가된 순환 사이토카인 및 급성기 단백질, 예컨대 C-반응성 단백질을 포함하지만; 이들의 농도는 분만과 같은 생리학적 사건, 또는 화상과 같은 병리학적 조직 손상 동안에도 증가된다. 전형적으로 패혈증의 경우, 어떤 유형의 세균 또는 진균이 혈액 내 감염을 야기하였는지를 확인하기 위하여 혈액 배양 검사가 행해진다. 혈액 배양물은 다른 혈액 검사와는 별도로 수집되며, 종종 이들은 상이한 정맥으로부터 1회를 초과하여 취해진다. 혈액 배양물의 결과를 얻는 데 수일이 걸릴 수 있다. 시험관내(in vitro) 배양 조건으로 인해, 패혈증을 갖는 사람들 중 1/3 내지 절반만이 양성인 혈액 배양물을 가질 것인데, 이때 양성이란, 세균이 실제로 시험관내 조건에서 성장하고 증식함을 의미한다.
현재, 세균의 검출은 종종 (1) 분석을 위해 세균을 단리하고 (2) 분석을 어렵게 하거나 불가능하게 할 수 있는 임의의 오염 배경 세포 또는 다른 물질을 감소시키기 위하여 배양을 필요로 한다. 예를 들어, 패혈증을 갖는 환자에서는, 병원성 세균을 단리하기 위하여 혈액이 배양되어야 한다. 유사하게, 식품의 모니터링에서는, 오염 미생물을 단리하기 위하여 샘플이 배양되어야 한다. 불행하게도, 표준 배양 프로세스는 수일이 걸릴 수 있다. 패혈증의 경우, 이러한 지연 시간은 항생제의 불필요한 투여 또는 오진으로 이어질 수 있으며, 이는 환자 합병증 또는 사망을 초래할 수 있다. 식품 산업에서는, 이러한 지연 시간이 리콜 또는 다른 예방적 조치에 이르게 될 정보를 지연시킨다. 따라서, 활성 감염의 신속한 검출은 문제를 감소시키고 인간의 생명을 구할 수 있는 조치를 가능하게 할 수 있다.
PCR 검출 방법은 연장된 배양을 필요로 하지 않을 수 있지만, 비편향 서열분석 접근법과는 대조적으로 PCR은 관심 유기물의 게놈 서열의 선험적 지식을 필요로 한다. 즉, 연구자들은 그들이 찾고 있는 것이 무엇인지를 알아야 하고, 이는 희귀하거나 미발견된 유기체의 경우에는 해당되지 않을 가능성이 높을 것이다. 추가적으로, PCR-의존적 방법은 샘플 내의 유전 물질의 존재를 검출할 뿐이며, 그 물질이 살아있는 유기체로부터 유래되었는지 죽은 유기체로부터 유래되었는지 그 여부를 구별할 수 없다. 많은 경우에, 살아있는 미생물에 의해 야기되는 활성 감염의 확인은 치료 선택지에 있어서의, 또는 심지어 식료품 또는 환경에서의 오염물의 확인에 있어서도 가장 중요한 고려사항이다.
본 발명은 샘플 내의 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 확인 및 분석을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은(a) 하나 이상의 유형의 미생물을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 샘플을 획득하는 단계; (b) 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 상기 샘플을 인큐베이션하는 단계 - 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 새로 합성된 미생물 핵산 내로 도입됨 -; (c) 상기 새로 합성된 미생물 핵산을 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 선택적으로 결합하거나 그와 선택적으로 결합하는 표지화 시약과 접촉시킴으로써 상기 새로 합성된 미생물 핵산을 표지하는 단계; (d) 상기 표지된 새로 합성된 미생물 핵산을 단리하거나 정제하는 단계; 및 (e) 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 서열분석 또는 그의 정체(identity)의 결정에 기초하여 상기 샘플 내의 상기 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 정체를 결정하는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 샘플은 미생물 감염을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 획득된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 대상체는 패혈증을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심된다. 추가의 실시 형태에서, (a)에 대하여, 상기 획득된 샘플은 비미생물 핵산을 선택적으로 제거하기 위하여 (b) 이전에 디호스팅(dehosting) 방법을 사용하여 처리된다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 디호스팅 방법은 비미생물 핵산을 제거하는 단계를 포함하며, 상기 단계는 (i) 상기 획득된 샘플을 재조합 단백질과 접촉시킴으로써 비미생물 DNA를 선택적으로 절단하는 단계 - 상기 재조합 단백질은 히스톤(들)에 의해 결합된 비미생물 핵산에 또는 메틸화 CpG 잔기를 포함하는 비미생물 핵산에 선택적으로 결합하는 결합 도메인, 및 핵산을 절단하는 활성을 갖는 뉴클레아제 도메인을 포함함 -; 또는 (ii) 히스톤(들)에 의해 결합된 핵산에 선택적으로 결합하거나 또는 비미생물 핵산의 메틸화 CpG 잔기에 선택적으로 결합하는, 고체 기재에 결합된 친화성 작용제(affinity agent)의 사용에 의해 수행된다. 소정의 실시 형태에서, 상기 샘플은 환경 검사 현장으로부터 획득된 환경 샘플이다. 다른 실시 형태에서, 상기 환경 현장은 미생물 오염에 대해 검사 중이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 샘플은 미생물 오염으로 의심되는 식료품으로부터 획득된 샘플이다. 추가의 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 미생물은 세균, 진균, 바이러스, 조류(algae), 고세균, 및/또는 원생동물이다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 세균은 악티노미세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바르토넬라 헨셀라이(Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나(Bartonella quintana), 보드데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보르렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보르렐리아 가리니이(Borrelia garinii), 보르렐리아 아프젤리이(Borrelia afzelii), 보르렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캄필로박테르 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미디아 뉴모니아이(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아이(Corynebacterium diphtheriae), 엔테로콕쿠스 파이칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로콕쿠스 파이시움(Enterococcus faecium), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 하이모필루스 인플루엔자이(Haemophilus influenzae), 헬리코박테르 필로리(Helicobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 렙토스피라 산타로사이(Leptospira santarosai), 렙토스피라 웨일리이(Leptospira weilii), 렙토스피라 노구치이(Leptospira noguchii), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 미코박테리움 레프라이(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 미코플라스마 뉴모니아이(Mycoplasma pneumoniae), 나이세리아 고노로에아이(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리케치아 리케치아(Rickettsia rickettsia), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 아갈락티아이(Streptococcus agalactiae), 스트렙토콕쿠스 뉴모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholerae), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 및/또는 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 상기 진균은 아브시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 아브시디아 라모세(Absidia ramose), 아코리온 갈리나이(Achorion gallinae), 악티노마두라 종(Actinomadura spp.), 아젤로미세스 데르마티디디스(Ajellomyces dermatididis), 알레우리스마 브라실리엔시스(Aleurisma brasiliensis), 알레르세리아 보이디이(Allersheria boydii), 아르트로데르마 종(Arthroderma spp.), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가투(Aspergillus fumigatu), 바시디오볼루스 종(Basidiobolus spp.), 블라스토미세스 종(Blastomyces spp.), 카도포라 종(Cadophora spp.), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 세르코스포라 아피이(Cercospora apii), 크리소스포리움 종(Chrysosporium spp.), 클라도스포리움 종(Cladosporium spp.), 클라도트릭스 아스테로이드스(Cladothrix asteroids), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 크립토콕쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), 크립토콕쿠스 가티이(Cryptococcus gattii), 크립토콕쿠스 라우렌티이(Cryptococcus laurentii), 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 쿠닝하멜라 엘레간스(Cunninghamella elegans), 데마티움 웨르넥케(Dematium wernecke), 디스코미세스 이스라엘리이(Discomyces israelii), 에몬시아 종(Emmonsia spp.), 에몬시엘라 캅술라테(Emmonsiella capsulate), 엔도미세스 게오트리쿰(Endomyces geotrichum), 엔토모프토라 코로나테(Entomophthora coronate), 에피데르모피톤 플록코숨(Epidermophyton floccosum), 필로바시디엘라 네오포르만스(Filobasidiella neoformans), 폰세카에아 종(Fonsecaea spp.), 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 글레노스포라 크하르토우멘시스(Glenospora khartoumensis), 김노아스쿠스 깁세우스(Gymnoascus gypseus), 하플로스포란기움 파르붐(Haplosporangium parvum), 히스토플라스마(Histoplasma), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 호르미스시움 데르마티디디스(Hormiscium dermatididis), 호르모덴드럼 종(Hormodendrum spp.), 케라티노미세스 종(Keratinomyces spp.), 란게로니아 소우다넨세(Langeronia soudanense), 렙토스파이리아 세네갈렌시스(Leptosphaeria senegalensis), 리크테이미아 코림비페라(Lichtheimia corymbifera), 로브미세스 로보이(Lobmyces loboi), 로보아 로보이(Loboa loboi), 로보미코시스(Lobomycosis), 마두렐라 종(Madurella spp.), 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur), 미크로콕쿠스 펠레티에리(Micrococcus pelletieri), 미크로스포룸 종(Microsporum spp.), 모닐리아 종(Monilia spp.), 무코르 종(Mucor spp.), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 난니지아 종(Nannizzia spp.), 네오테스투디나 로사티이(Neotestudina rosatii), 노카르디아 종(Nocardia spp.), 오이디움 알비칸스(Oidium albicans), 오오스포라 락티스(Oospora lactis), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 페트리엘리디움 보이디이(Petriellidium boydii), 피알로포라 종(Phialophora spp.), 피에드라이아 호르타이(Piedraia hortae), 피티로스포룸 푸르푸르(Pityrosporum furfur), 뉴모시스티스 지로벡시이(Pneumocystis jirovecii)(또는 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii)), 풀룰라리아 고우게로티이(Pullularia gougerotii), 피레노카이타 로메로이(Pyrenochaeta romeroi), 리노스포리디움 세에베리(Rhinosporidium seeberi), 사보우라우디테스(Sabouraudites)(미크로스포룸(Microsporum)), 사르토리아 푸미가테(Sartorya fumigate), 세페도니움(Sepedonium), 스포로트리쿰 종(Sporotrichum spp.), 스타키보트리스(Stachybotrys), 스타키보트리스 카르타룸(Stachybotrys chartarum), 스트렙토미세스 종(Streptomyces spp.), 티네아 종(Tinea spp.), 토룰라 종(Torula spp.), 트리코피톤 종(Trichophyton spp.), 트리코스포론 종(Trichosporon spp.), 및/또는 좁피아 로사티이(Zopfia rosatii)로부터 선택된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 바이러스는 심플렉스바이러스(Simplexvirus), 바리셀로바이러스(Varicellovirus), 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 로세올로바이러스(Roseolovirus), 림포-크립토바이러스(Lympho-cryptovirus), 라디노바이러스(Rhadinovirus), 마스타데노바이러스(Mastadenovirus), α-파필로마바이러스(α-Papillomavirus), β-파필로마바이러스(β-Papillomavirus), Χ-파필로마바이러스(Χ-Papillomavirus), γ-파필로마바이러스(γ-Papillomavirus), 무파필로마바이러스(Mupapillomavirus), 누파필로마바이러스(Nupapillomavirus), 알파폴리오마바이러스(Alphapolyomavirus), 베타폴리오마바이러스(Betapolyomavirus), γ-폴리오마바이러스(γ-Polyomavirus), 델타폴리오마바이러스(Deltapolyomavirus), 몰루스시폭스바이러스(Molluscipoxvirus), 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus), 파라폭스바이러스(Parapoxvirus), α-토르쿠에바이러스(α-Torquevirus), β-토르쿠에바이러스(β-Torquevirus), γ-토르쿠에바이러스(γ-Torquevirus), 시클로바이러스(Cyclovirus), 게미시르쿨라르(Gemycircular), 게미키비바이러스(Gemykibivirus), 게미봉바이러스(Gemyvongvirus), 에리트로바이러스(Erythrovirus), 데펜도바이러스(Dependovirus), 보카바이러스(Bocavirus), 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus), 감마레트로바이러스(Gammaretrovirus), 델타레트로바이러스(Deltaretrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus), 시미이스푸마바이러스(Simiispumavirus), 콜티바이러스(Coltivirus), 로타바이러스(Rotavirus), 세아도르나바이러스(Seadornavirus), α-코로나바이러스(α-Coronavirus), β-코로나바이러스(β-Coronavirus), 토로바이러스(Torovirus), 마마스트로바이러스(Mamastrovirus), 노로바이러스(Norovirus), 사포바이러스(Sapovirus), 플라비바이러스(Flavivirus), 헤파시바이러스(Hepacivirus), 페기바이러스(Pegivirus), 오르토헤페바이러스(Orthohepevirus), 카르디오바이러스(Cardiovirus), 코사바이러스(Cosavirus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 헤파토바이러스(Hepatovirus), 코부바이러스(Kobuvirus), 파레코바이러스(Parechovirus), 로사바이러스(Rosavirus), 살리바이러스(Salivirus), 알파바이러스(Alphavirus), 루비바이러스(Rubivirus), 에볼라바이러스(Ebolavirus), 마르부르그바이러스(Marburgvirus), 헤니파바이러스(Henipavirus), 모르빌리바이러스(Morbilivirus), 레스피로바이러스(Respirovirus), 루불라바이러스(Rubulavirus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 오르토뉴모바이러스(Orthopneumovirus), 레단테바이러스(Ledantevirus), 리사바이러스(Lyssavirus), 베시쿨로바이러스(Vesiculovirus), 맘마레나바이러스(Mammarenavirus), 오르토한타바이러스(Orthohantavirus), 오르토나이로바이러스(Orthonairovirus), 오르토부니아바이러스(Orthobunyavirus), 플레보바이러스(Phlebovirus), α-인플루엔자바이러스(α-Influenzavirus), β-인플루엔자바이러스(β-Influenzavirus), γ-인플루엔자바이러스(γ-Influenzavirus), 쿠아란자바이러스(Quaranjavirus), 토고토바이러스(Thogotovirus), 및/또는 델타바이러스(Deltavirus)로부터 선택된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2-에티닐-아데노신, N6-프로파르길-아데노신, 2'-(O-프로파르길)-아데노신, 3'-(O-프로파르길)-아데노신, 5-에티닐-시티딘, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 2'-(O-프로파르길)-시티딘, 3'-(O-프로파르길)-시티딘, 2'-(O-프로파르길)-구아노신, 3'-(O-프로파르길)-구아노신, 5-에티닐-우리딘, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 2'-(O-프로파르길)-우리딘, 3'-(O-프로파르길)-우리딘, (2'S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 2'(S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 8-아지도-아데노신, N6-(6-아지도)헥실-2'데옥시-아데노신, 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 5-아지도메틸-우리딘, 5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사-펜타데카노일-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘, 5-(3-아지도프로필)-우리딘, 5-아지도-PEG4-우리딘, 5-아지도-PEG4-시티딘, 5-아지도-PEG4-2'-데옥시시티딘, 5-브로모-2'데옥시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도-2'데옥시우리딘, 및 5-요오도우리딘으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2-에티닐-아데노신, N6-프로파르길-아데노신, 2'-(O-프로파르길)-아데노신, 3'-(O-프로파르길)-아데노신, 5-에티닐-시티딘, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 2'-(O-프로파르길)-시티딘, 3'-(O-프로파르길)-시티딘, 2'-(O-프로파르길)-구아노신, 3'-(O-프로파르길)-구아노신, 5-에티닐-우리딘, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 2'-(O-프로파르길)-우리딘, 3'-(O-프로파르길)-우리딘, (2'S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 2'(S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 및 (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘으로부터 선택된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 8-아지도-아데노신, N6-(6-아지도)헥실-2'데옥시-아데노신으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 5-아지도메틸-우리딘, 5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사-펜타데카노일-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘, 5-(3-아지도프로필)-우리딘, 5-아지도-PEG4-우리딘, 5-아지도-PEG4-시티딘, 및 5-아지도-PEG4-2'-데옥시시티딘으로부터 선택된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 5-브로모-2'데옥시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도-2'데옥시우리딘, 및 5-요오도우리딘으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 샘플은 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 5분 내지 180분 동안 인큐베이션된다. 다른 실시 형태에서, 상기 샘플은 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 30분 내지 120분 동안 인큐베이션된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 높은 특이성으로 결합하는 항체이다. 특정 실시 형태에서, 상기 항체는 5-브로모-2'데옥시우리딘, 또는 요오도데옥시우리딘에 높은 특이성으로 결합한다. 다른 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학(click chemistry), 변형된 [3+2] 부가환화 반응, 또는 스타우딩거 라이게이션(Staudinger ligation)을 통해 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하거나 그와 결합한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학을 통해 알키닐 기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하는 아지드 기를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학을 통해 아지드 기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하는 알키닐 기를 포함한다. 소정의 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 비오틴 기를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 비오틴 기를 포함하는 상기 표지화 시약은 하기로부터 선택된다:
Figure pct00001
,
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
및
Figure pct00005
. 추가의 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 화학적으로 절단가능한 링커 또는 효소적으로 절단가능한 링커를 추가로 포함한다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 절단가능한 링커는 산-불안정성(acid-labile)-기반 링커 또는 다이설파이드-기반 링커이다. 소정의 실시 형태에서, 상기 산-불안정성-기반 링커는 하이드라존 또는 시스-아코니틸 기를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 효소적으로 절단가능한 링커는 펩티드-기반 링커 또는 β-글루쿠로니드-기반 링커를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 풀다운 작용제(pulldown agent)가 상기 표지된 새로 합성된 미생물 핵산을 단리하거나 정제하는 데 사용된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 풀다운 시약은 고체 지지체 상에 고정화된 항체이며, 상기 항체는 표지화 시약에 높은 특이성으로, 또는 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 높은 특이성으로 결합한다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 풀다운 시약은 고체 지지체 상에 고정화된 스트렙타비딘 또는 아비딘이고, 상기 표지화 시약은 비오틴 기를 포함한다. 소정의 실시 형태에서, 상기 고체 지지체는 나노- 또는 마이크로-재료, 비드 또는 플레이트이다. 다른 실시 형태에서, 상기 표지화 시약 또는 표지는 전술된 (e) 이전에 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산으로부터 제거되거나 절단된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 정체는 상이한 미생물로부터의 핵산에 대한 프로브를 포함하는 마이크로어레이(microarray)를 사용함으로써 결정된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 정체는 하기 단계들에 의해 결정된다: (i) 표지된 산물을 형성하도록 형광 염료를 함유하는 프라이머를 사용하는 제1 PCR-기반 방법을 사용하여 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 증폭시키는 단계 - 상기 프라이머는 보존된 미생물 16S rRNA 유전자 영역에 특이적인 서열을 포함함 -; (ii) 상기 표지된 산물을 20개 이상의 미생물로부터의 특유의 16s rRNA 가변 영역 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 마이크로어레이에 적용하는 단계; (iii) 형광 혼성화 산물에 대한 상기 마이크로어레이의 이미징에 기초하여 상기 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 정체를 결정하는 단계 및 상기 마이크로어레이 프로브의 서열에 기초하여 상기 미생물의 정체를 결정하는 단계. 다른 실시 형태에서, 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 정체는 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 서열분석함으로써 결정되거나 확인된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산은 트랜스포좀-기반 서열분석 방법을 사용하여 서열분석된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 서열분석은 하기 단계들에 의해 행해진다: (a) 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 비드-연결된 트랜스포좀에 적용하는 단계 - 상기 비드-연결된 트랜스포좀은 미생물 핵산의 단편화 및 서열분석용 프라이머의 부가를 동시에 매개함 -; (b) 상기 미생물 핵산 단편을 인덱스 및 어댑터 서열을 포함하는 프라이머로 증폭시켜, 증폭된 산물들의 라이브러리를 형성하는 단계; (c) 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 세척하고 풀링하는 단계; (d) 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 서열분석하는 단계; 및 (e) 생물정보학적 분석을 사용하여, 상기 증폭된 산물들의 라이브러리로부터 획득된 서열을 미생물의 기지의 서열의 데이터베이스와 상관시킨 것에 기초하여 상기 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 정체를 결정하는 단계. 다른 실시 형태에서, 상기 새로 합성된 미생물 핵산은 RNA이며, 상기 미생물 RNA는 전술된 (e) 이전에 cDNA로 역전사되고, 상기 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 유전자 발현은 서열분석에 의해 그리고/또는 마이크로어레이를 사용하여 새로 합성된 미생물 RNA로부터의 유전자 산물의 발현 수준을 분석하는 것에 기초하여 결정될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 또한 샘플 내의 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 있어서의 항미생물제의 유효성을 결정하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 유형의 미생물을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플을 2개의 샘플, 즉 대조군 샘플 및 처리된 샘플로 나누는 단계; (c) 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 상기 대조군 샘플을 인큐베이션하는 단계 - 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 새로 합성된 미생물 핵산 내로 도입됨 -; (c') 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 및 항미생물제의 존재 하에서 상기 처리된 샘플을 인큐베이션하는 단계 - 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 새로 합성된 미생물 핵산 내로 도입됨 -; (d) 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플의 상기 새로 합성된 미생물 핵산을 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 선택적으로 결합하거나 그와 선택적으로 결합하는 표지화 시약과 접촉시킴으로써 상기 새로 합성된 미생물 핵산을 표지하는 단계; (e) 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플로부터 상기 표지된 새로 합성된 미생물 핵산을 단리하거나 정제하는 단계; (f) 상기 대조군 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 또는 정체를 결정하는 단계; (f') 상기 처리된 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및 정체를 결정하는 단계; (g) 상기 대조군 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및/또는 정체에 있어서의 어떠한 변화를 상기 처리된 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 또는 정체와 비교하고 결정하는 단계를 포함하며, 상기 대조군 샘플과 대비하여 상기 처리된 샘플 내의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준이 감소되거나, 또는 상기 대조군 샘플과 대비하여 상기 처리된 샘플 내의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 양 및/또는 정체가 감소되는 경우, 이는 상기 항미생물제가 상기 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 효과적임을 나타낸다. 다른 실시 형태에서, 상기 항미생물제는 항생제, 항진균제, 및 항바이러스제로부터 선택된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 항생제는 아목시실린, 암피실린, 박암피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴, 세파드록실, 세팔렉신, 세팔로글리신, 세팔로늄, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파피린, 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린, 세프라딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세팜만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프프로질, 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 카파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포벡신, 세폭사졸, 세프로틸, 세푸수미드, 세푸라세팀, 세프티옥사이드, 아즈트레오남, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아지트로마이신, 에리트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 록시트로마이신, 텔리트로마이신, 클린다마이신, 린코마이신, 아미카신, 젠타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 플루메퀸, 날리딕산, 옥솔린산, 피로미드산, 피페미드산, 로속사신, 시프로플록사신, 에녹사신, 로메플록사신, 나디플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 페플록사신, 루플록사신, 발로플록사신, 가티플록사신, 그레파플록사신, 레보플록사신, 목시플록사신, 파주플록사신, 스파르플록사신, 테마플록사신, 토수플록사신, 베시플록사신, 델라플록사신, 클리나플록사신, 제미플록사신, 프룰리플록사신, 시타플록사신, 트로바플록사신, 설파메티졸, 설파메톡사졸, 설피속사졸, 트리메토프림-설파메톡사졸, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린, 티게사이클린, 반코마이신, 테이코플라닌, 텔라반신, 리네졸리드, 사이클로세린, 리팜핀, 리파부틴, 리파펜틴, 리팔라질, 비오마이신, 카프레오마이신, 박시트라신, 폴리믹신 B, 클로람페니콜, 메트로니다졸, 티니다졸, 및 니트로푸란토인으로부터 선택된다.. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 항진균제는 아모롤핀, 부테나핀, 나프티핀, 테르비나핀, 비포나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 펜티코나졸, 케토코나졸, 이소코나졸, 룰리코나졸, 미코나졸, 오모코나졸, 옥시코나졸, 세르타코나졸, 설코나졸, 티오코나졸, 테르코나졸, 알바코나졸, 에피나코나졸, 플루코나졸, 이사부코나졸, 이트라코나졸, 포사코나졸, 라부코나졸, 테르코나졸, 보리코나졸, 아바펀진, 암포테리신 B, 니스타틴, 나타마이신, 트리코마이신, 아니둘라펀진, 카스포펀진, 미카펀진, 톨나프테이트, 플루시토신, 부테나핀, 그리세오풀빈, 시클로피록스, 황화셀레늄, 타바보롤로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 상기 항바이러스제는 아시클로비르, 브리부딘, 도코사놀, 팜시클로비르, 포스카르넷, 이독수리딘, 펜시클로비르, 트리플루리딘, 비다라빈, 시타라빈, 발아시클로비르, 트로마탄딘, 프리텔리비르, 아만타딘, 리만타딘, 오셀타미비르, 페라미비르, 자나미비르, 아수나프레비르, 보세프레비르, 실루프레비르, 다노프레비르, 팔다프레비르, 글레카프레비르, 그라조프레비르, 나를라프레비르, 파리타프레비르, 시메프레비르, 소바프레비르, 텔라프레비르, 바니프레비르, 베드로프레비르, 복실라프레비르, 다클라타스비르, 엘바스비르, 레디파스비르, 오달라스비르, 옴비타스비르, 피브렌타스비르, 라비다스비르, 루자스비르, 사마타스비르, 벨파타스비르, 베클라부비르, 다사부비르, 델레오부비르, 필리부비르, 세트로부비르, 소포스부비르, 라달부비르, 우프리포스부비르, 라미부딘, 텔비부딘, 클레부딘, 아데포비르, 테노프비르 디소프록실, 테노포비르 알라페나미드, 엔푸비르티드, 마라비록, 비크리비록, 세니크리비록, PRO 140, 이발리주맙, 포스템사비르, 디다노신, 엠트리시타빈, 라미부딘, 스타부딘, 지도부딘, 암독소비르, 아프리시타빈, 센사부딘, 엘부시타빈, 라시비르, 스탐피딘, 4'-에티닐-2-플루오로-2'-데옥시아데노신, 잘시타빈, 에파비렌즈, 네비라핀, 델라비르딘, 에트라비린, 릴피비린, 도라비린, 돌루테그라비르, 엘비테그라비르, 랄테그라비르, BI 224436, 카보테그라비르, 빅테그라비르, MK-2048, 베비리마트, BMS-955176, 암프레나비르, 포삼프레나비르, 인디나비르, 로피나비르, 넬피나비르, 리토나비르, 사퀴나비르, 아타자나비르, 다루나비르, 티프라나비르, 돌루테그라비르, 엘비테그라비르, 랄테그라비르, BI 224436, 카보테그라비르, 빅테그라비르, MK-2048, 코비시스타트, 리토나비르, 인터페론-α, 페그인터페론-α, 메티사존, 리팜피신, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 포도필로톡신, 포미비르센, 시도포비르, 플레코나릴, 파비피라비르, 갈리데시비르, 렘데시비르, 메리시타빈, MK-608, NITD008, 모록시딘, 트로만타딘, 및 트리아자비린으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 샘플은 미생물 감염을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 획득된다. 특정 실시 형태에서, 상기 대상체는 패혈증을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심된다. 다른 실시 형태에서,
상기 하나 이상의 유형의 미생물은 세균, 진균, 및/또는 바이러스이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 세균은 악티노미세스 이스라엘리이, 바실루스 안트라시스, 바실루스 세레우스, 바르토넬라 헨셀라이, 바르토넬라 퀸타나, 보드데텔라 페르투시스, 보르렐리아 부르그도르페리, 보르렐리아 가리니이, 보르렐리아 아프젤리이, 보르렐리아 레쿠렌티스, 브루셀라 아보르투스, 브루셀라 카니스, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 캄필로박테르 제주니, 클라미디아 뉴모니아이, 클라미디아 트라코마티스, 클라미도필라 프시타시, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 디피실레, 클로스트리디움 페르프린겐스, 클로스트리디움 테타니, 코리네박테리움 디프테리아이, 엔테로콕쿠스 파이칼리스, 엔테로콕쿠스 파이시움, 에스케리키아 콜리, 프란시셀라 툴라렌시스, 하이모필루스 인플루엔자이, 헬리코박테르 필로리, 레지오넬라 뉴모필라, 렙토스피라 인테로간스, 렙토스피라 산타로사이, 렙토스피라 웨일리이, 렙토스피라 노구치이, 리스테리아 모노시토게네스, 미코박테리움 레프라이, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 미코박테리움 울세란스, 미코플라스마 뉴모니아이, 나이세리아 고노로에아이, 나이세리아 메닝기티디스, 슈도모나스 아에루기노사, 리케치아 리케치아, 살모넬라 티피, 살모넬라 티피무리움, 시겔라 손네이, 스타필로콕쿠스 아우레우스, 스타필로콕쿠스 에피데르미디스, 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스, 스트렙토콕쿠스 아갈락티아이, 스트렙토콕쿠스 뉴모니아이, 스트렙토콕쿠스 피오게네스, 트레포네마 팔리둠, 우레아플라스마 우레아리티쿰, 비브리오 콜레라이, 예르시니아 페스티스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 및/또는 예르시니아 슈도투베르쿨로시스로부터 선택된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 진균은 아브시디아 코림비페라, 아브시디아 라모세, 아코리온 갈리나이, 악티노마두라 종, 아젤로미세스 데르마티디디스, 알레우리스마 브라실리엔시스, 알레르세리아 보이디이, 아르트로데르마 종, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 푸미가투, 바시디오볼루스 종, 블라스토미세스 종, 카도포라 종, 칸디다 알비칸스, 세르코스포라 아피이, 크리소스포리움 종, 클라도스포리움 종, 클라도트릭스 아스테로이드스, 콕시디오이데스 이미티스, 크립토콕쿠스 알비두스, 크립토콕쿠스 가티이, 크립토콕쿠스 라우렌티이, 크립토콕쿠스 네오포르만스, 쿠닝하멜라 엘레간스, 데마티움 웨르넥케, 디스코미세스 이스라엘리이, 에몬시아 종, 에몬시엘라 캅술라테, 엔도미세스 게오트리쿰, 엔토모프토라 코로나테, 에피데르모피톤 플록코숨, 필로바시디엘라 네오포르만스, 폰세카에아 종, 게오트리쿰 칸디둠, 글레노스포라 크하르토우멘시스, 김노아스쿠스 깁세우스, 하플로스포란기움 파르붐, 히스토플라스마, 히스토플라스마 캅술라툼, 호르미스시움 데르마티디디스, 호르모덴드럼 종, 케라티노미세스 종, 란게로니아 소우다넨세, 렙토스파이리아 세네갈렌시스, 리크테이미아 코림비페라, 로브미세스 로보이, 로보아 로보이, 로보미코시스, 마두렐라 종, 말라세지아 푸르푸르, 미크로콕쿠스 펠레티에리, 미크로스포룸 종, 모닐리아 종, 무코르 종, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 난니지아 종, 네오테스투디나 로사티이, 노카르디아 종, 오이디움 알비칸스, 오오스포라 락티스, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스, 페트리엘리디움 보이디이, 피알로포라 종, 피에드라이아 호르타이, 피티로스포룸 푸르푸르, 뉴모시스티스 지로벡시이(또는 뉴모시스티스 카리니이), 풀룰라리아 고우게로티이, 피레노카이타 로메로이, 리노스포리디움 세에베리, 사보우라우디테스(미크로스포룸), 사르토리아 푸미가테, 세페도니움, 스포로트리쿰 종, 스타키보트리스, 스타키보트리스 카르타룸, 스트렙토미세스 종, 티네아 종, 토룰라 종, 트리코피톤 종, 트리코스포론 종, 및/또는 좁피아 로사티이로부터 선택된다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 바이러스는 심플렉스바이러스, 바리셀로바이러스, 시토메갈로바이러스, 로세올로바이러스, 림포-크립토바이러스, 라디노바이러스, 마스타데노바이러스, α-파필로마바이러스, β-파필로마바이러스, Χ-파필로마바이러스, γ-파필로마바이러스, 무파필로마바이러스, 누파필로마바이러스, 알파폴리오마바이러스, 베타폴리오마바이러스, γ-폴리오마바이러스, 델타폴리오마바이러스, 몰루스시폭스바이러스, 오르토폭스바이러스, 파라폭스바이러스, α-토르쿠에바이러스, β-토르쿠에바이러스, γ-토르쿠에바이러스, 시클로바이러스, 게미시르쿨라르, 게미키비바이러스, 게미봉바이러스, 에리트로바이러스, 데펜도바이러스, 보카바이러스, 오르토헤파드나바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 렌티바이러스, 시미이스푸마바이러스, 콜티바이러스, 로타바이러스, 세아도르나바이러스, α-코로나바이러스, β-코로나바이러스, 토로바이러스, 마마스트로바이러스, 노로바이러스, 사포바이러스, 플라비바이러스, 헤파시바이러스, 페기바이러스, 오르토헤페바이러스, 카르디오바이러스, 코사바이러스, 엔테로바이러스, 헤파토바이러스, 코부바이러스, 파레코바이러스, 로사바이러스, 살리바이러스, 알파바이러스, 루비바이러스, 에볼라바이러스, 마르부르그바이러스, 헤니파바이러스, 모르빌리바이러스, 레스피로바이러스, 루불라바이러스, 메타뉴모바이러스, 오르토뉴모바이러스, 레단테바이러스, 리사바이러스, 베시쿨로바이러스, 맘마레나바이러스, 오르토한타바이러스, 오르토나이로바이러스, 오르토부니아바이러스, 플레보바이러스, α-인플루엔자바이러스, β-인플루엔자바이러스, γ-인플루엔자바이러스, 쿠아란자바이러스, 토고토바이러스, 및/또는 델타바이러스로부터 선택된다. 소정의 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2-에티닐-아데노신, N6-프로파르길-아데노신, 2'-(O-프로파르길)-아데노신, 3'-(O-프로파르길)-아데노신, 5-에티닐-시티딘, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 2'-(O-프로파르길)-시티딘, 3'-(O-프로파르길)-시티딘, 2'-(O-프로파르길)-구아노신, 3'-(O-프로파르길)-구아노신, 5-에티닐-우리딘, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 2'-(O-프로파르길)-우리딘, 3'-(O-프로파르길)-우리딘, (2'S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 2'(S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 8-아지도-아데노신, N6-(6-아지도)헥실-2'데옥시-아데노신, 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 5-아지도메틸-우리딘, 5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사-펜타데카노일-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘, 5-(3-아지도프로필)-우리딘, 5-아지도-PEG4-우리딘, 5-아지도-PEG4-시티딘, 5-아지도-PEG4-2'-데옥시시티딘, 5-브로모-2'데옥시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도-2'데옥시우리딘, 및 5-요오도우리딘으로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2-에티닐-아데노신, N6-프로파르길-아데노신, 2'-(O-프로파르길)-아데노신, 3'-(O-프로파르길)-아데노신, 5-에티닐-시티딘, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 2'-(O-프로파르길)-시티딘, 3'-(O-프로파르길)-시티딘, 2'-(O-프로파르길)-구아노신, 3'-(O-프로파르길)-구아노신, 5-에티닐-우리딘, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 2'-(O-프로파르길)-우리딘, 3'-(O-프로파르길)-우리딘, (2'S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 2'(S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 및 (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘으로부터 선택된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 8-아지도-아데노신, N6-(6-아지도)헥실-2'데옥시-아데노신으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 5-아지도메틸-우리딘, 5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사-펜타데카노일-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘, 5-(3-아지도프로필)-우리딘, 5-아지도-PEG4-우리딘, 5-아지도-PEG4-시티딘, 및 5-아지도-PEG4-2'-데옥시시티딘으로부터 선택된다. 특정 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 5-브로모-2'데옥시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도-2'데옥시우리딘, 및 5-요오도우리딘으로부터 선택된다. 다른 실시 형태에서, 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플은 둘 모두 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 5분 내지 180분 동안 동일한 기간 동안 인큐베이션된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플은 둘 모두 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 30분 내지 120분 동안 동일한 기간 동안 인큐베이션된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 높은 특이성으로 결합하는 항체이다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 항체는 5-브로모-2'데옥시우리딘, 또는 요오도데옥시우리딘에 높은 특이성으로 결합한다. 소정의 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학, 변형된 [3+2] 부가환화 반응, 또는 스타우딩거 라이게이션을 통해 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하거나 그와 결합한다. 다른 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학을 통해 알키닐 기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하는 아지드 기를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학을 통해 아지드 기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하는 알키닐 기를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 비오틴 기를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 비오틴 기를 포함하는 상기 표지화 시약은 하기로부터 선택된다:
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Figure pct00010
.
다른 실시 형태에서, 상기 표지화 시약은 화학적으로 절단가능한 링커 또는 효소적으로 절단가능한 링커를 추가로 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 절단가능한 링커는 산-불안정성-기반 링커 또는 다이설파이드-기반 링커이다. 추가의 실시 형태에서, 상기 산-불안정성-기반 링커는 하이드라존 또는 시스-아코니틸 기를 포함한다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 효소적으로 절단가능한 링커는 펩티드-기반 링커 또는 β-글루쿠로니드-기반 링커를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 풀다운 작용제가 상기 표지된 새로 합성된 미생물 핵산을 단리하거나 정제하는 데 사용된다. 다른 실시 형태에서, 상기 풀다운 시약은 고체 지지체 상에 고정화된 항체이며, 상기 항체는 표지화 시약에 높은 특이성으로, 또는 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 높은 특이성으로 결합한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 풀다운 시약은 고체 지지체 상에 고정화된 스트렙타비딘 또는 아비딘이고, 상기 표지화 시약은 비오틴 기를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 고체 지지체는 나노- 또는 마이크로-재료, 비드 또는 플레이트이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 표지화 시약 또는 표지는 전술된 (f), (f') 및 (g) 이전에 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산으로부터 제거되거나 절단된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및/또는 정체를 결정하는 것은 상이한 미생물로부터의 핵산에 대한 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 사용함으로써 결정된다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및/또는 정체를 결정하는 것은 (i) 표지된 산물을 형성하도록 형광 염료를 함유하는 프라이머를 사용하는 제1 PCR-기반 방법을 사용하여 상기 대조군 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 증폭시키는 단계 - 상기 프라이머는 보존된 미생물 16S rRNA 유전자 영역에 특이적인 서열을 포함함 -; (i') 표지된 산물을 형성하도록 상기 형광 염료를 함유하는 프라이머를 사용하는 상기 제1 PCR-기반 방법을 사용하여 상기 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 증폭시키는 단계 - 상기 프라이머는 보존된 미생물 16S rRNA 유전자 영역에 특이적인 서열을 포함함 -; (ii) 상기 대조군 샘플로부터의 상기 표지된 산물을 20개 이상의 미생물로부터의 특유의 16s rRNA 가변 영역 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 제1 마이크로어레이에 적용하는 단계; (ii') 상기 처리된 샘플로부터의 상기 표지된 산물을 제2 마이크로어레이에 적용하는 단계 - 상기 제2 마이크로어레이는 상기 제1 마이크로어레이의 복제물(duplicate)임 -; 및 (iii) 형광 혼성화 산물에 대한 상기 제1 마이크로어레이의 이미징 및 상기 제2 마이크로어레이의 이미징에 기초하여 상기 샘플 내의 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 있어서의 항미생물제의 유효성을 결정하는 단계 및 상기 마이크로어레이들 사이에 상기 형광 혼성화 산물의 강도, 위치, 또는 부재에 관하여 어떠한 변화가 있는지를 결정하는 단계에 의해 행해지며, 상기 제1 마이크로어레이와 상기 제2 마이크로어레이 사이에 상기 형광 혼성화 산물의 강도가 감소되는 경우, 또는 제1 마이크로어레이와 제2 마이크로어레이 사이에 형광 혼성화 산물의 위치 또는 부재에 관하여 변화가 있는 경우, 이는 상기 항미생물제가 상기 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 효과적임을 나타낸다. 다른 실시 형태에서, 상기 샘플 내의 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 있어서의 항미생물제의 유효성은 상기 대조군 샘플로부터의 그리고 상기 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 서열분석함으로써 결정되거나 확인되며, 상기 대조군 샘플과 대비하여 상기 처리된 샘플 내의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준이 감소되거나, 또는 상기 대조군 샘플과 대비하여 상기 처리된 샘플 내의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 양 및/또는 정체가 감소되는 경우, 이는 상기 항미생물제가 상기 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 효과적임을 나타낸다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산은 트랜스포좀-기반 서열분석 방법을 사용하여 서열분석된다. 추가의 실시 형태에서, 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 서열분석은 하기 단계들에 의해 행해진다: (a) 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 비드-연결된 트랜스포좀에 적용하는 단계 - 상기 비드-연결된 트랜스포좀은 미생물 핵산의 단편화 및 서열분석용 프라이머의 부가를 동시에 매개함 -; (b) 상기 미생물 핵산 단편을 인덱스 및 어댑터 서열을 포함하는 프라이머로 증폭시켜, 증폭된 산물들의 라이브러리를 형성하는 단계; (c) 상기 대조군 샘플로부터의 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 세척하고 풀링하는 단계; (c') 상기 처리된 샘플로부터의 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 세척하고 풀링하는 단계; (d) 상기 대조군 샘플로부터의 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 서열분석하는 단계; (d') 상기 처리된 샘플로부터의 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 서열분석하는 단계; 및 (e) 생물정보학적 분석의 사용에 기반하여, 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및/또는 정체에 있어서의 어떠한 변화를 결정하는 단계. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 새로 합성된 미생물 핵산은 RNA이며, 상기 미생물 RNA는 전술된 (f), (f') 및 (g) 이전에 cDNA로 역전사되고, 상기 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 있어서의 항미생물제의 유효성은 서열분석에 의해 그리고/또는 마이크로어레이를 사용함으로써 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준에 있어서의 변화를 결정하는 것에 기초하여 결정될 수 있다.
도 1은 신속한 세균 배양으로부터 새로 합성된 DNA의 풍부화를 위한 워크플로우의 예시적인 실시 형태를 제시한다. 새로 합성된 DNA의 풍부화는 환자 샘플에서 살아있는 세균의 유전자적 확인을 가능하게 한다.
도 2는 신속한 세균 배양으로부터 새로 합성된 RNA의 풍부화를 위한 워크플로우의 예시적인 실시 형태를 제시한다. 새로 합성된 RNA의 풍부화는 환자 샘플에서 살아있는 세균에 의한 유전자 발현의 평가를 가능하게 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 단수형의 "미생물(a microorganism)"에 대한 언급은 복수의 그러한 미생물을 포함하며, 단수형의 "뉴클레오시드 유사체(the nucleoside analog)"에 대한 언급은 당업자에게 알려진 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체 및 이의 등가물에 대한 언급을 포함하며, 등등이다.
또한, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함하다", "포함한다", "포함하는", "구비하다", "구비한다", 및 "구비하는"은 상호교환 가능하고 제한하고는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 실시 형태를 기재함에 있어서 용어 "포함하는"을 사용하는 경우, 당업자는 일부 구체적인 경우에, 일 실시 형태가 표현 "~로 본질적으로 이루어진" 또는 "~로 이루어진"을 사용하여 대안적으로 기재될 수 있음을 이해할 것임이 추가로 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 많은 방법 및 시약이 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 동등하지만, 예시적인 방법 및 재료가 본 명세서에 개시되어 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물은 본 명세서의 설명과 관련하여 사용될 수 있는, 방법을 기술하고 개시하려는 목적으로 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 더욱이, 본 명세서에서 명확히 정의된 용어와 유사하거나 동일한 하나 이상의 간행물에 제시된 임의의 용어와 관련하여, 본 명세서에서 명확히 제공된 바와 같은 용어의 정의가 모든 점에서 우선시 될 것이다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 및 시약 등으로 제한되지 않으며, 그 자체로서 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 실시 형태를 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 본 발명의 범주는 오직 청구범위에 의해서만 정의된다.
작업예(operating example) 이외에 또는 달리 지시된 경우 이외에, 본 명세서에 사용되는 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 본 발명을 설명하는 데 사용될 때 용어 "약"은 ±1%를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "클릭 화학"은 구리(I) 촉매의 존재 하에서 수행될 때 [3+2] 부가환화 반응을 지칭한다. 구리(I) 촉매는 구리(I) 이온 또는 구리(I) 킬레이팅 모이어티(chelating moiety)를 포함할 수 있다.
구리(I) 킬레이팅 모이어티는 "구리(I) 이온과의 착물(하나 초과의 배위 결합을 함유함)의 형성에 참여할 수 있는 2개 이상의 극성 기의 존재를 특징으로 하는 임의의 실체(entity)"일 수 있다(예를 들어, Salic et al.의 미국 특허 출원 공개 제20070207476호(상기) 참조). 구리(I) 킬레이팅제의 예에는 네오쿠프로인 및 바토쿠프로닌 다이설포네이트가 포함되지만 이로 한정되지 않는다(예를 들어, Salic et al.의 미국 특허 출원 공개 제20070207476호 및 Sharpless et al.의 미국 특허 출원 공개 제2003000516671호 참조). [3+2] 부가환화 반응은 1,3-쌍극성 부가환화로도 알려져 있으며, 1,3-쌍극자와 친쌍극자체(dipolarophile) 사이에서 일어날 수 있다. 1,3-쌍극자의 예에는 아지드가 포함된다. 친쌍극자체의 예에는 알킨이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염료"는 광을 방출하여 관찰가능한 검출가능 신호를 생성하는 화합물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이중 표지화(dual labeling)"는 구별가능한 신호를 생성하는 2개의 검출가능 작용제(detectable agent)로 핵산이 표지되는 표지화 프로세스를 지칭한다. 그러한 표지화 프로세스로부터 생성되는 핵산은 이중 표지된(dually labeled)이라고 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염료-표지된 알킨"은 염료 표지를 포함하도록 추가로 변형된 알킨을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염료-표지된 아지드" 및 "아지드-염료 분자"는 염료로 또한 표지된 반응성 아지드 기를 갖는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 예에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: 로다민-아지드, Alexa Fluor® 350-아지드(Molecular Probes™/Invitrogen™, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), Alexa Fluor® 488-아지드(Molecular Probes™/Invitrogen™, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), Alexa Fluor® 555-아지드(Molecular Probes™/Invitrogen™, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), Alexa Fluor® 568-아지드(Molecular Probes™/Invitrogen™, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), Alexa Fluor® 568-아지드(Molecular Probes™/Invitrogen™, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), Alexa Fluor® 594-아지드, Alexa Fluor® 633-아지드(Molecular Probes™/Invitrogen™, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), Alexa Fluor® 647-아지드(Molecular Probes™/Invitrogen™, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), Cascade Blue® 아지드(Molecular Probes™/Invitrogen™, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), 플루오레세인-아지드, 쿠마린-아지드, BODIPY-아지드, 시아닌-아지드, 또는 테트라메틸로다민(TMR)-아지드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염료-표지된 사이클로알킨"은 염료 표지를 포함하도록 추가로 변형된 사이클로알킨을 지칭한다. 용어 "사이클로알킨"은 DNA를 표지하기 위하여 변형된(strained) [3+2] 부가환화 반응에 사용될 수 있는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 이와 관련하여, 사이클로알키닐의 예에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: 사이클로옥틴, 다이플루오로사이클로옥틴, 헤테로사이클로알킨, 다이클로로사이클로옥틴, 다이브로모사이클로옥틴, 또는 다이요오도사이클로옥틴.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 세포, 조직, 또는 미생물에서 관련 반응을 유도하는 물질, 화합물, 분자, 작용제 또는 조성물의 양을 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체와 접촉되는 미생물의 경우에, 유효량은 미생물의 DNA 내로 도입되는 뉴클레오시드의 양이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "형광단" 또는 "형광발생성(fluorogenic)"은 관심 생물학적 화합물 또는 분석물에 결합할 때 형광의 변화를 보여주는 조성물을 지칭한다. 본 발명의 바람직한 형광단은 수성 매질 중에 높은 양자 수율을 갖는 형광 염료를 포함한다. 예시적인 형광단에는 잔텐, 인돌, 보라폴리아자인다센, 푸란, 및 벤조푸란, 시아닌이 특히 포함된다. 본 발명의 형광단은 형광단의 용해도, 스펙트럼 특성 또는 물리적 특성을 변경시키기 위해 치환될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "표지"는 본 발명의 표지화 시약의 일부로서 본 발명의 방법에 사용될 때 그의 고유 특성(예를 들어, 스펙트럼 특성, 형태 및 활성)을 보유하는 화학적 모이어티 또는 단백질을 지칭한다. 예시적인 "표지" 분자는 직접적으로 검출가능할 수 있거나(형광단), 간접적으로 검출가능할 수 있거나(합텐 또는 효소), 또는 뉴클레오시드 도입된 핵산의 검출 및 정제(예를 들어, 비오틴-스트렙타비딘 풀다운 검정)에 사용될 수 있다. 그러한 "표지" 분자는 하기를 포함하지만 이로 한정되지 않는다: 클릭 화학용으로 설계된 비오틴 표지, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴 함유 표지, 예컨대
Figure pct00011
,
Figure pct00012
,
Figure pct00013
,
Figure pct00014
,
및
Figure pct00015
; 방사선-계수 장치로 측정될 수 있는 무선 리포터 분자; 분광광도계로 시각적으로 관찰되거나 측정될 수 있는 안료, 염료 또는 다른 색원체(chromogen); 스핀 표지 분석기(spin label analyzer)로 측정될 수 있는 스핀 표지; 출력 신호가 적합한 분자 부가물(molecular adduct)의 여기에 의해 발생되고, 염료에 의해 흡수되거나, 예를 들어 표준 형광측정기 또는 이미징 시스템에 의해 측정될 수 있는 광에 의한 여기에 의해 시각화될 수 있는 형광 모이어티. "표지" 분자는 발광 물질, 예컨대 인광체 또는 형광원(fluorogen); 생물발광 물질; 출력 신호가 신호 화합물의 화학적 변형에 의해 발생되는 화학발광 물질; 금속-함유 물질; 또는 무색 기질로부터의 착색 생성물의 형성과 같이, 신호의 효소-의존적 2차 발생이 일어나는 효소일 수 있다. "표지"는 또한 화학적 또는 생화학적 입자의 형태를 취할 수 있거나, 또는 콜로이드성 금, 미소구체, 양자점, 또는 나노결정 또는 인광체와 같은 무기 결정을 포함하지만 이로 한정되지 않는 불활성 입자의 형태를 취할 수 있다(예를 들어, 문헌[Beverloo et al., Anal. Biochem. 203, 326-34 (1992)] 참조). "표지" 분자는 또한 "태그" 또는 뉴클레오시드 유사체를 "태깅"하는 데 사용되는 합텐일 수 있다. 이때, "태그"는 "태그"에 선택적으로 결합하는 다른 시약에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, "태그"로서 비오틴, 이미노비오틴 또는 데스티오비오틴을 사용할 수 있고, 이때에는 기재(예를 들어, 비드), 표지, 또는 효소(예를 들어, 서양 고추냉이 퍼옥시다제)에 접합된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 사용하여 비오틴-기반 "태그"에 결합할 수 있다. 후자와 관련하여, 이때에는 색원체성 기질(예를 들어, 테트라메틸벤지딘) 또는 형광원성 기질, 예컨대 Amplex Red 또는 Amplex Gold(Molecular Probes, Inc.)가 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 태그는 합텐 또는 항원(예를 들어, 디곡시게닌)일 수 있고, 효소적으로 표지된, 형광적으로 표지된, 또는 방사성 표지된 항체가 태그에 결합하는 데 사용될 수 있다. 다수의 리포터 분자가 당업자에게 알려져 있으며, 이에는 입자, 형광 염료, 합텐, 효소 및 이들의 색원체성, 형광원성, 및 화학발광성 기질, 및 문헌[MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS by Richard P. Haugland, 10th Ed., (2005)]에 기재된 다른 리포터 분자가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
용어 "미생물" 또는 "미생물체"는 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되며, 단일-세포 형태로 또는 세포들의 콜로니로 존재할 수 있는 현미경적 유기체를 지칭한다. 본 발명의 목적상, 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "미생물"은 세균, 진균, 바이러스, 조류, 고세균, 및 원생동물을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "미생물 증식"은 미생물(들)의 증폭 및/또는 성장을 지칭한다.
용어 "뉴클레오시드 유사체" 및 "뉴클레오티드 유사체"는 상호교환 가능하게 사용되며, 본 명세서에서 새로 합성된 미생물 핵산 내로 도입되는 천연 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사한 분자 또는 화합물을 지칭한다. 뉴클레오시드의 경우, 일단 세포 내부에 있게 되면, 이들을 뉴클레오티드로 인산화시키고, 이어서 신생(nascent) 핵산 중합체 내로 도입시킨다. 뉴클레오티드는 그들의 전하로 인해 세포막을 가로지르기가 어려우며, 뉴클레오시드보다 더 불안정하며, 이에 따라 그들의 사용은 전형적으로 지질 이중층을 가로질러 뉴클레오티드를 수송하는 데 있어서 형질감염을 위한 추가의 단계 및 시약을 필요로 한다. 본 발명의 뉴클레오시드 유사체는 천연 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 핵산(DNA 또는 RNA) 내로 도입되는데, 여기서는 올바른 폴리머라제 효소가 이들 유사체를 천연 뉴클레오티드로서 인식하고 합성 중에 파괴가 일어나지 않는다. 이들 유사체는 궁극적으로 검출에 사용되는 다수의 상이한 모이어티, 예컨대 할로겐화 유사체(브로모, 클로로, 요오도 등), 및 아지도, 알킨 또는 포스핀과 같은 생물직교 모이어티(bioorthogonal moiety)를 포함하는 것들을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "풀다운 시약"은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 표지된 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 신생 핵산 중합체를 정제하거나 단리하는 데 사용되는 시약을 지칭한다. "풀다운 시약"은 전형적으로 비드와 같은 고체 지지체에 결합되고, 본 명세서에 개시된 표지와 선택적으로 결합한다. 전형적으로, 표지는 전술된 바와 같이 "태그"로서 기능한다. 예시적인 실시 형태에서, 풀다운 시약은 고체 지지체, 예컨대 비드, 초상자성 마이크로- 또는 나노-입자, 플레이트 등에 접합된 스트렙타비딘이다. 다른 실시 형태에서, 풀다운 시약은 고체 지지체, 예컨대 비드, 초상자성 마이크로- 또는 나노-입자, 플레이트 등 상에 고정화된 표지 또는 "태그"에 특이적인 항체 또는 다른 유형의 친화성 리간드이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "스타우딩거 라이게이션"은 Saxon 및 Bertozzi(문헌[E. Saxon and C. Bertozzi, Science, 2000, 287: 2007-2010])에 의해 개발된 화학 반응을 지칭하는 것으로, 이는 고전적인 스타우딩거 반응의 변형이다. 고전적인 스타우딩거 반응은 아지드와 포스핀 또는 포스파이트의 조합이 아자-일라이드 중간체를 생성하는 화학 반응으로서, 아자-일라이드 중간체는 가수분해 시에 포스핀 옥사이드 및 아민을 생성한다. 스타우딩거 반응은 아지드를 아민으로 환원시키는 온화한 방법이며; 트라이페닐포스핀이 환원제로서 일반적으로 사용된다. 스타우딩거 라이게이션에서는, 친전자성 포획체(electrophilic trap)(통상 메틸 에스테르)를 트라이아릴포스핀 아릴 기(통상 인 원자에 대해 오르토 위치에 있음) 상에 적절하게 배치시키고 아지드와 반응시켜 아자-일리드 중간체를 생성하고, 이때 아자-일리드 중간체는 수성 매질 중에서 재배열되어 아미드 기 및 산화포스핀 작용기를 갖는 화합물을 생성한다. 스타우딩거 라이게이션은 2개의 출발 분자를 함께 라이게이션(부착/공유 결합)하기 때문에 그렇게 명명되며, 한편 전통적인 스타우딩거 반응에서는 2개의 생성물이 가수분해 후에 공유 결합되지 않는다.
용어 "대상체", "환자" 및 "개체"는 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되며, 샘플을 획득할 수 있는 동물, 특히 인간을 지칭한다. 이는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물" 및 "비인간 포유동물"은 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되며, 이에는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물, 예컨대 비인간 영장류(특히, 고등 영장류), 양, 개, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 기니 피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소, 및 비포유동물, 예컨대 닭, 양서류, 파충류 등이 포함된다. 일 실시 형태에서, 대상체는 인간이다. 다른 실시 형태에서, 대상체는 질병 모델로서의 실험용 동물 또는 동물 대체물이다. "포유동물"은 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭하며, 이러한 포유동물에는 인간, 비인간 영장류, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등이 포함된다. 환자 또는 대상체는 전술한 것의 임의의 하위세트, 예를 들어 인간, 영장류 또는 설치류와 같은 하나 이상의 군 또는 종을 제외한 상기 전부를 포함한다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 대상체는 완전히 발달된 대상체(예를 들어, 성인) 또는 발달 과정을 거치고 있는 대상체(예를 들어, 유아, 영아 또는 태아)일 수 있다.
살아있는 증식성 미생물(예를 들어, 세균, 조류, 고세균, 원생동물, 및 진균)은 새로운 DNA를 연속적으로 합성한다. 직접 대조하면, 더 이상 생존가능하지 않은 미생물은 더 이상 DNA를 합성하지 않을 것이다. 살아있는 비증식성 미생물이 새로운 DNA를 합성하여 그들의 게놈을 수복하고 유지하는 것이 가능하지만, 새로운 DNA 합성 속도는 살아있는 증식성 미생물보다 훨씬 더 낮을 것이다. 본 발명은 샘플, 예컨대 환자로부터의 혈액 샘플, 또는 환경 샘플; 또는 의심되는 오염된 식료품으로부터의 샘플에서 살아있는 증식성 미생물을 신속하게 확인하기 위하여 DNA 합성에 있어서의 전술한 차이를 이용하는 방법 및 기술을 제공한다. 상세하게는, 본 명세서에 제시된 방법 및 기술은, 샘플이 생존 불가능한 또는 비증식성 미생물을 추가로 포함하거나 또는 이로 오염되었는지의 여부에 관계없이, 샘플 내의 살아있는 증식성 미생물의 확인을 가능하게 한다. 더 구체적으로는, 본 명세서에 제시된 방법 및 기술은 샘플 내의 하나 이상의 미생물로부터 획득된 새로 합성된 미생물 DNA의 선택적 풍부화 및 서열분석을 제공하여, 샘플 내에 함유된 살아있는 증식성 미생물의 확인을 가능하게 한다.
본 발명은 또한 혼합 집단 내의 특정 유기체 또는 유사한 유기체 집단으로부터 DNA 및 RNA를 선택적으로 풍부화하는 데 사용될 수 있는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들어, 디호스팅 응용의 경우, 감염된 숙주로부터의 DNA 또는 RNA의 배경으로부터 감염성 유기체의 DNA 또는 RNA를 풍부화할 것이 요구된다. 상기 방법은 혼합 집단으로부터의 표적화된 유기체(예를 들어, 세균)를 확인하기 위하여, 표적화된 유기체의 DNA 및/또는 RNA의 신속한 풍부화를 가능하게 한다. 이러한 풍부화는 표적화된 유기체만이 DNA 및/또는 RNA를 합성할 수 있도록 하는 조건을 필요로 한다. 예를 들어, 샘플 내의 표적화된 집단 또는 하위집단을 선택적으로 억제하기 위하여, 배지 조건, 온도 및/또는 특정 억제제가 사용될 수 있다.
한 예로서, 패혈증을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터의 혈액을 수득하고, 샘플 내의 세균 세포가 DNA 및/또는 RNA를 계속 합성할 수 있으면서, 혈액 샘플 내의 포유류 세포가 DNA 및/또는 RNA 합성으로부터 억제되는 조건 하에서 배양할 수 있다. 이러한 방식으로, 세균 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 표지된다. 일 실시 형태에서, 혈액 샘플을 단리하고, LB 브로쓰(broth) 또는 다른 세균 배지 중에서 플레이팅하거나 배양하고, 이로써 포유류 세포는 DNA 및/또는 RNA 합성을 계속 거치지 않을 것이며(또는 실질적으로 감소된 DNA 및/또는 RNA 합성을 가질 것이며), 이와 동시에 미생물 집단은 DNA 및 RNA 합성을 계속 거칠 것이며, 이는, 예를 들어 EdU의 선택적 도입으로 이어진다. 다른 실시 형태에서, 혈액 배양물의 온도를 낮출 수 있는데, 그럼으로써 포유류 세포 복제 및 합성이 억제될 것이고, 반면 미생물 복제 및 합성만이 더 높은 온도로 복귀될 때 유지되거나 재생될 것이다. 온도는 수분 내지 수시간의 기간에 걸쳐 낮출 수 있다. 다른 실시 형태에서, 포유류 DNA 및/또는 RNA 기구를 선택적으로 표적화하는 DNA 및/또는 RNA 합성의 소분자 억제제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 억제제는 알파-아마니틴으로 불리는 광대 버섯(Amanita mushroom)으로부터 유도되며, 감별능력이 없는 버섯 채취자 중에 해마다 약 100건의 사망에 대한 원인이 된다. RNAP 억제제는 단일 부류의 유기체에 대해 특이적일 수 있다. 알파-아마니틴은, 예를 들어 고등 진핵생물에는 영향을 미치지만, 세균에는 어떠한 영향도 주지 않는다. 역으로, 일부 약물은 세균 RNAP에 특이적으로 영향을 미친다. 이들 중 가장 잘 알려진 것은 리팜핀인데, 이는 진균에 의해 생성되고 현재 리팜핀 유도체 리팜피신(Rif)으로서 항결핵 약물로서 사용되고 있다. Rif는 세균 RNAP에 특이적이다. 억제제의 이러한 특이성은 2가지 이유로 일어난다. 첫째, 억제제는 종종 하나의 유기체에 의해 다른 유기체를 사멸시키도록 제조되며, 생성 유기체는 자살성(suicidal)이 아닌 억제제를 방출해야 한다. 둘째, 억제제는 효소의 덜 보존된 부분에 통상 결합하는데, 여기서는 서열 변이가 이들이 모든 RNAP에 작용하는 것을 방지할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 신생 미생물 핵산 합성을 확인하기 전에 샘플을 디호스팅하는 것에 관한 실시 형태를 제공한다. 그러한 디호스팅 기법 및 조성물은, 예를 들어 미생물 핵산 및 비미생물 핵산 둘 모두를 함유하는 샘플에서의 비미생물 핵산의 선택적 절단에 관한 것으로, 이에 따라 샘플은 미생물 핵산이 대폭적으로 풍부화되게 된다. 디호스팅 방법의 예에는 문헌[Feehery et al., PLoS ONE 8:e76096 (2013)]; 문헌[Sachse et al., Journal of Clinical Microbiology 47:1050-1057 (2009)]; 문헌[Barnes et al., PLoS ONE 9(10):e109061 (2014)]; 문헌[Leichty et al., Genetics 198(2):473-81 (2014)]; 문헌[Hasan et al., J Clin Microbiol 54(4):919-27 (2016)]; 및 문헌[Liu et al., PLoS ONE 11(1):e0146064 (2016)]에 기재된 것들이 포함되며; 이들의 개시 내용은 본 명세서에 전체적으로 포함된다. 추가로, 디호스팅을 수행하기 위한 시판 키트가 또한 입수가능하며, 이에는 NEBNext Microbiome DNA Enrichment™ 키트, Molzym MolYsis Basic™ 키트, 및 MICROBEEnrich™ 키트가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 디호스팅 방법 및 조성물은 비미생물 핵산과 관련된 특성을 이용하는데, 이에는 CpG 잔기에서의 메틸화, 및 DNA-결합 단백질, 예컨대 히스톤과의 회합이 포함된다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, 디호스팅 방법 및 조성물은 비미생물 핵산과 선택적으로 결합하는 핵산 결합 단백질(예를 들어, 히스톤, 제한 효소)을 이용할 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 디호스팅 방법 및 조성물은, 비미생물 핵산과 선택적으로 결합하고 또한 비미생물 핵산을 선택적으로 분해하는 재조합 단백질을 포함할 수 있으며, 즉, 재조합 단백질은 비미생물 핵산 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인 둘 모두를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 핵산 결합 단백질은 히스톤이다. 히스톤은 진핵 세포의 핵에서, 그리고 소정의 고세균, 즉 테르모프로테우스 목(Thermoproteales) 및 유리고세균 문(Euryarchaeota)에서 발견되지만, 세균 또는 바이러스에서는 발견되지 않는다. 추가의 실시 형태에서, 이어서, 히스톤-결합된 비미생물 핵산은 히스톤 단백질, 즉 히스톤-결합 도메인에 선택적으로 결합하는 친화성 작용제를 포함하는 기재의 사용에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다. 히스톤 단백질에 결합할 수 있는 친화성 작용제의 예에는 크로모도메인, 튜더(Tudor), 악성 뇌종양(MBT), 식물 호메오도메인(PHD), 브로모도메인, SANT, YEATS, 프롤린-트립토판-트립토판-프롤린(PWWP), 브로모 인접 상동성(BAH), 안키린 반복부, WD40 반복부, ATRX-DNMT3A-DNMT3L(ADD), 또는 zn-CW가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 다른 실시 형태에서, 히스톤-결합 도메인은 단백질로부터의 히스톤에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함할 수 있으며, 이에는, 예를 들어 HAT1, CBP/P300, PCAF/GCN5, TIP60, HB01(ScESA1, SpMST1), ScSAS3, ScSAS2(SpMST2), ScRTT109, SirT2(ScSir2), SUV39H1, SUV39H2, G9a, ESET/SETDB1, EuHMTase/GLP, CLL8, SpClr4, MLL1, MLL2, MLL3, MLL4, MLL5, SET1A, SET1B, ASH1, Sc/Sp SET1, SET2(Sc/Sp SET2), NSD1, SYMD2, DOT1, Sc/Sp DOT1, Pr-SET 7/8, SUV4 20H1, SUV420H2, SpSet 9, EZH2, RIZ1, LSD1/BHC110, JHDM1a, JHDM1b, JHDM2a, JHDM2b, JMJD2A/JHDM3A, JMJD2B, JMJD2C/GASC1, JMJD2D, CARM1, PRMT4, PRMT5, Haspin, MSK1, MSK2, CKII, Mst1, Bmi/Ring1A, RNF20/RNF40, 또는 ScFPR4, 또는 이들의 히스톤-결합 단편이 있다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명은 또한 메틸화 CpG를 포함하는 DNA에 선택적으로 결합하는 핵산-결합 단백질 또는 핵산-결합 도메인을 제공한다. CG 다이뉴클레오티드 모티프("CpG 부위" 또는 "CG 부위")는 DNA의 영역에서 발견되는데, 여기서는 시토신 뉴클레오티드의 뒤를 이어서 그의 5'에서 3' 방향을 따른 염기들의 선형 서열 내에 구아닌 뉴클레오티드가 온다. CpG 섬(island)(또는 CG 섬)은 높은 빈도의 CpG 부위를 갖는 영역이다. CpG는 5'-C-포스페이트-G-3', 즉, 시토신과 구아닌이 1개의 포스페이트에 의해 분리된 것에 대한 약칭이다. CpG 다이뉴클레오티드 내의 시토신은 메틸화되어 5-메틸시토신을 형성할 수 있다. 시토신 메틸화는 인간 게놈 전체에 걸쳐 많은 CpG 부위에서 일어난다. CG 부위에서의 시토신 메틸화는 다른 진핵생물의 게놈 전체에 걸쳐서도 일어난다. 포유동물에서는, 예를 들어, CpG 시토신의 70% 내지 80%가 메틸화될 수 있다. 세균 및 바이러스와 같은 관심 미생물에서, 이러한 CpG 메틸화는 일어나지 않거나 인간 게놈에서의 CpG 메틸화보다 유의하게 더 낮다. 따라서, 디호스팅은 CpG 메틸화 DNA를 선택적으로 절단함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 디호스팅 방법을 제공하며, 상기 방법은 CpG 섬 또는 CpG 부위에 결합하는 핵산 결합 단백질 또는 결합 도메인을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 결합 도메인은 메틸화 CpG 섬에 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 핵산 결합 단백질 결합 도메인은 메틸-CpG-결합 도메인(MBD)을 포함한다. MBD의 한 예는, C 말단에 있는 헤파린 루프 및 알파1 나선에 의해 형성된 다른 층에 의해 배킹되는, 꼬인 베타 시트의 층을 포함하는 알파/베타 샌드위치 구조물로 접히는 약 70개 잔기의 폴리펩티드이다. 이들 층은 둘 모두 양친매성이며, 이때 알파1 나선과 베타 시트는 평행하게 놓여 있으며, 소수성 물질이 서로에 대해 조밀하게 패킹된 상태로 대면하고 있다. 베타 시트는 2개의 더 짧은 외부 가닥(베타1 및 베타4)에 의해 샌드위치된 2개의 긴 내부 가닥(베타2 및 베타3)으로 구성된다. 추가의 실시 형태에서, 핵산 결합 단백질 또는 결합 도메인은 MECP2, MBD1, MBD2, 및 MBD4로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질, 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 핵산 결합 단백질 또는 결합 도메인은 MBD2를 포함한다. 소정의 실시 형태에서, 핵산 결합 단백질 또는 결합 도메인은 MBD2의 단편을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 핵산 결합 단백질 또는 결합 도메인은 MBD5, MBD6, SETDB1, SETDB2, TIP5/BAZ2A, 또는 BAZ2B, 또는 이들의 단편을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 핵산 결합 단백질 또는 결합 도메인은 CpG 메틸화 또는 탈메틸화 단백질, 또는 이들의 단편을 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 이어서, CpG-결합된 비미생물 핵산은, CpG 섬 또는 CpG 부위에 결합하는 핵산 결합 단백질 또는 결합 도메인에 선택적으로 결합하는 친화성 작용제를 포함하는 기재의 사용에 의해 샘플로부터 제거될 수 있다. 친화성 작용제의 예에는 CpG 섬 또는 CpG 부위에 결합하는 핵산 결합 단백질 또는 결합 도메인에 선택적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 항체 또는 항체 단편을 포함하는 친화성 작용제는 기재에 결합될 수 있거나, 대안적으로 그 자체가, 기재에 결합된 제2 항체에 결합될 수 있으며, 그럼으로써 비미생물 핵산을 샘플로부터 분리하고 제거하는 수단을 제공할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 사용함으로써, 뉴클레아제가 비미생물 핵산을 단편으로 절단하는 디호스팅 방법을 제공한다. 후자의 경우에, 재조합 단백질은 또한 핵산 결합 단백질(예를 들어, 히스톤, 메틸-CpG-결합 단백질)에 대해 활성을 갖는 핵산 단백질 결합 도메인을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 또는 뉴클레아제는 비특이적 뉴클레아제, 엔도뉴클레아제, 비특이적 엔도뉴클레아제, 비특이적 엑소뉴클레아제, 호밍 엔도뉴클레아제, 및 제한 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 다른 실시 형태에서, 뉴클레아제 도메인은 임의의 뉴클레아제로부터 유도되며, 여기서는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 도메인 그 자체가 그 자신 특유의 표적을 갖지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 뉴클레아제 도메인은 다른 단백질에 융합될 때 활성을 갖는다. 비특이적 뉴클레아제의 예에는 FokI 및 I-TevI가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레아제 도메인은 FokI 또는 이의 단편이다. 추가의 실시 형태에서, 뉴클레아제 도메인은 I-TevI 또는 이의 단편이다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, FokI 또는 I-TevI 또는 이들의 단편은 비돌연변이형(unmutated) 및/또는 야생형이다. 뉴클레아제의 추가의 예에는 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I), RecBCD 엔도뉴클레아제, T7 엔도뉴클레아제, T4 엔도뉴클레아제 IV, Bal 31 엔도뉴클레아제, 엔도뉴클레아제(엔도 I), 미구균 뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 II(엔도 VI, 엑소 III), 뉴로스포라 엔도뉴클레아제, S1-뉴클레아제, P1-뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제 I, 우스틸라고 뉴클레아제(Dnase I), AP 엔도뉴클레아제, 및 엔도 R이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
관심 미생물은 다양한 샘플에서 확인될 수 있으며, 이러한 샘플에는 환자로부터의 샘플(예를 들어, 혈액, 소변, 및 척수액), 식료품 샘플(예를 들어, 밀가루, 소고기, 및 상추), 또는 환경 샘플(예를 들어, 지하수, 및 병원 건물 면봉샘플)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에 개시된 방법, 조성물 및 키트의 주요 이점은, 확인 전에 미생물을 광범위하게 배양할 필요 없이 샘플 내의 생존가능한 그리고/또는 증식성 미생물(들)이 확인될 수 있다는 것이다. 따라서, 조직 배양에서 또는 일상적인 배양 배지 상에서 시험관내에서 배양될 수 없는 미생물, 예컨대 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)(매독) 및 환경 세균은 본 발명의 방법, 조성물 및 키트를 사용하여 용이하게 확인될 수 있다.
또한, 환자 샘플, 식품 샘플, 환경 샘플 또는 다른 샘플 내의 생존가능한 미생물을 확인하고 분석하기 위하여 새로 합성된 핵산을 표지하고, 정제하고, 서열분석하기 위한 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 발명의 방법은 샘플에서 확인된 생존가능한 미생물에 대한 효과에 대해 시험 화합물(예를 들어, 항생제)을 스크리닝하는 데 추가로 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 뉴클레오시드 유사체를 이용하는데, 이것은 미생물에 "공급되고(fed)" 새로 합성된 핵산 또는 신생 핵산 내로 도입된다. 미생물에 관해서는, 세균, 진균, 바이러스, 조류, 고세균, 및 원생동물을 포함한 임의의 유형의 미생물이 본 명세서에 개시된 방법에 의해 검출될 수 있다.
세균은, 핵이 결여되어 있고 세포소기관(organelle)을 함유하지 않는 원핵생물이다. 세균 패밀리 내에는, 더 두꺼운 세포벽을 갖는 그램 양성 세균 및 더 얇은 층이 내부 막과 외부 막 사이에 개재되어 있는 그램 음성 세균의 2가지 부류가 있다. 세균은 매우 다양하며, 개수의 관점에서 지구상에서 단연코 가장 성공적인 유기체이다. 세균은 인체 내에서 무해하게 살면서 종종 소화와 같은 신체 기능을 도와줄 수 있는 유일한 미생물이다. 바이러스를 제외하면, 세균은 패혈증과 같이 인간에서의 질병의 관점에서 대부분의 문제를 야기한다. 본 명세서에 개시된 방법, 조성물 및 키트를 사용하여 확인되고 분석될 수 있는 세균의 예에는 악티노미세스 이스라엘리이, 바실루스 안트라시스, 바실루스 세레우스, 바르토넬라 헨셀라이, 바르토넬라 퀸타나, 보드데텔라 페르투시스, 보르렐리아 부르그도르페리, 보르렐리아 가리니이, 보르렐리아 아프젤리이, 보르렐리아 레쿠렌티스, 브루셀라 아보르투스, 브루셀라 카니스, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 캄필로박테르 제주니, 클라미디아 뉴모니아이, 클라미디아 트라코마티스, 클라미도필라 프시타시, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 디피실레, 클로스트리디움 페르프린겐스, 클로스트리디움 테타니, 코리네박테리움 디프테리아이, 엔테로콕쿠스 파이칼리스, 엔테로콕쿠스 파이시움, 에스케리키아 콜리, 프란시셀라 툴라렌시스, 하이모필루스 인플루엔자이, 헬리코박테르 필로리, 레지오넬라 뉴모필라, 렙토스피라 인테로간스, 렙토스피라 산타로사이, 렙토스피라 웨일리이, 렙토스피라 노구치이, 리스테리아 모노시토게네스, 미코박테리움 레프라이, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 미코박테리움 울세란스, 미코플라스마 뉴모니아이, 나이세리아 고노로에아이, 나이세리아 메닝기티디스, 슈도모나스 아에루기노사, 리케치아 리케치아, 살모넬라 티피, 살모넬라 티피무리움, 시겔라 손네이, 스타필로콕쿠스 아우레우스, 스타필로콕쿠스 에피데르미디스, 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스, 스트렙토콕쿠스 아갈락티아이, 스트렙토콕쿠스 뉴모니아이, 스트렙토콕쿠스 피오게네스, 트레포네마 팔리둠, 우레아플라스마 우레아리티쿰, 비브리오 콜레라이, 예르시니아 페스티스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 및 예르시니아 슈도투베르쿨로시스가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
진균은 진핵생물로서, 이는 이들이 명확한 핵 및 세포소기관을 갖는다는 것을 의미한다. 이들 세포는 세균과 같은 원핵생물보다 더 크다. 진균 콜로니는 일단 그들이 소정의 성장 수준에 도달하였으면 사람의 눈에 가시적일 수 있는데, 이에는, 예를 들어 빵 위의 곰팡이가 있다. 진균은 다음 3개의 주요 군으로 나누어질 수 있다: (1) 실모양(필라멘트상) 성장 및 다세포 구조를 나타내는 곰팡이, (2) 전형적으로 비-필라멘트상이고 단세포형일 수 있는 효모, 및 (3) 포자의 생성을 위한 자실체를 갖는 버섯. 진균은 면역손상에 대해 문제가 될 수 있으며, 식물에 대한 상당한 병원체일 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법, 조성물 및 키트를 사용하여 확인되고 분석될 수 있는 진균의 예에는 아브시디아 코림비페라, 아브시디아 라모세, 아코리온 갈리나이, 악티노마두라 종, 아젤로미세스 데르마티디디스, 알레우리스마 브라실리엔시스, 알레르세리아 보이디이, 아르트로데르마 종, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 푸미가투, 바시디오볼루스 종, 블라스토미세스 종, 카도포라 종, 칸디다 알비칸스, 세르코스포라 아피이, 크리소스포리움 종, 클라도스포리움 종, 클라도트릭스 아스테로이드스, 콕시디오이데스 이미티스, 크립토콕쿠스 알비두스, 크립토콕쿠스 가티이, 크립토콕쿠스 라우렌티이, 크립토콕쿠스 네오포르만스, 쿠닝하멜라 엘레간스, 데마티움 웨르넥케, 디스코미세스 이스라엘리이, 에몬시아 종, 에몬시엘라 캅술라테, 엔도미세스 게오트리쿰, 엔토모프토라 코로나테, 에피데르모피톤 플록코숨, 필로바시디엘라 네오포르만스, 폰세카에아 종, 게오트리쿰 칸디둠, 글레노스포라 크하르토우멘시스, 김노아스쿠스 깁세우스, 하플로스포란기움 파르붐, 히스토플라스마, 히스토플라스마 캅술라툼, 호르미스시움 데르마티디디스, 호르모덴드럼 종, 케라티노미세스 종, 란게로니아 소우다넨세, 렙토스파이리아 세네갈렌시스, 리크테이미아 코림비페라, 로브미세스 로보이, 로보아 로보이, 로보미코시스, 마두렐라 종, 말라세지아 푸르푸르, 미크로콕쿠스 펠레티에리, 미크로스포룸 종, 모닐리아 종, 무코르 종, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 난니지아 종, 네오테스투디나 로사티이, 노카르디아 종, 오이디움 알비칸스, 오오스포라 락티스, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스, 페트리엘리디움 보이디이, 피알로포라 종, 피에드라이아 호르타이, 피티로스포룸 푸르푸르, 뉴모시스티스 지로벡시이(또는 뉴모시스티스 카리니이), 풀룰라리아 고우게로티이, 피레노카이타 로메로이, 리노스포리디움 세에베리, 사보우라우디테스(미크로스포룸), 사르토리아 푸미가테, 세페도니움, 스포로트리쿰 종, 스타키보트리스, 스타키보트리스 카르타룸, 스트렙토미세스 종, 티네아 종, 토룰라 종, 트리코피톤 종, 트리코스포론 종, 및 좁피아 로사티이가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
바이러스는 극히 복잡한 무생물 분자로서 통상 간주되는 초현미경적(submicroscopic) 감염체의 큰 군을 나타내는 것으로, 이것은 전형적으로 유전 물질의 RNA 또는 DNA 코어를 둘러싸는 단백질 코트를 함유하지만 반투과성 막은 함유하지 않으며, 단지 살아있는 세포 내에서만 성장 및 증식할 수 있으며, 인간, 동물, 및 식물에서 다양한 중요한 질병을 야기한다. 본 명세서에 개시된 방법, 조성물 및 키트를 사용하여 확인되고 분석될 수 있는 바이러스의 예에는 심플렉스바이러스, 바리셀로바이러스, 시토메갈로바이러스, 로세올로바이러스, 림포-크립토바이러스, 라디노바이러스, 마스타데노바이러스, α-파필로마바이러스, β-파필로마바이러스, Χ-파필로마바이러스, γ-파필로마바이러스, 무파필로마바이러스, 누파필로마바이러스, 알파폴리오마바이러스, 베타폴리오마바이러스, γ-폴리오마바이러스, 델타폴리오마바이러스, 몰루스시폭스바이러스, 오르토폭스바이러스, 파라폭스바이러스, α-토르쿠에바이러스, β-토르쿠에바이러스, γ-토르쿠에바이러스, 시클로바이러스, 게미시르쿨라르, 게미키비바이러스, 게미봉바이러스, 에리트로바이러스, 데펜도바이러스, 보카바이러스, 오르토헤파드나바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 렌티바이러스, 시미이스푸마바이러스, 콜티바이러스, 로타바이러스, 세아도르나바이러스, α-코로나바이러스, β-코로나바이러스, 토로바이러스, 마마스트로바이러스, 노로바이러스, 사포바이러스, 플라비바이러스, 헤파시바이러스, 페기바이러스, 오르토헤페바이러스, 카르디오바이러스, 코사바이러스, 엔테로바이러스, 헤파토바이러스, 코부바이러스, 파레코바이러스, 로사바이러스, 살리바이러스, 알파바이러스, 루비바이러스, 에볼라바이러스, 마르부르그바이러스, 헤니파바이러스, 모르빌리바이러스, 레스피로바이러스, 루불라바이러스, 메타뉴모바이러스, 오르토뉴모바이러스, 레단테바이러스, 리사바이러스, 베시쿨로바이러스, 맘마레나바이러스, 오르토한타바이러스, 오르토나이로바이러스, 오르토부니아바이러스, 플레보바이러스, α-인플루엔자바이러스, β-인플루엔자바이러스, γ-인플루엔자바이러스, 쿠아란자바이러스, 토고토바이러스, 및 델타바이러스가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
조류는 유기체들의 군을 정의하기가 더 어려우며, 일부 정의에 의하면 원핵생물 및 진핵생물 둘 모두를 함유한다. 다른 미생물과는 달리, 조류는 전형적으로 광합성체(photosynthesizer)이고, 전형적으로 해양 환경에서 발견된다. 유해한 조류 대증식(harmful algal bloom, HAB)은 천연 독소의 생성, 다른 유기체에 대한 기계적 손상을 통해, 또는 다른 수단에 의해 다른 유기체에 부정적인 영향을 야기하는 조류 대증식이다. HAB는 종종 대규모 해양 사망률 사건과 관련되어 있으며, 다양한 유형의 어패류 중독과 관련되어 왔다. HAB는 독성이거나 달리 유해한 식물성 플랑크톤, 예컨대 알렉산드리움(Alexandrium) 및 카레니아(Karenia) 속의 와편모충류(dinoflagellate), 또는 슈도-니츠시아(Pseudo-nitzschia) 속의 규조류(diatom)를 포함한다. 그러한 대증식은 종종 적색 또는 갈색 색조를 띠며, 구어로는 적조(red tide)로 알려져 있다. 본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 샘플, 예를 들어 환경 샘플로부터의 그러한 조류의 확인을 가능하게 한다.
고세균은 세균과 유사한 형태를 갖는 원핵생물이다. 고세균은 유전자적, 생화학적, 및 구조적 특징의 관점에서 진핵생물 및 세균과 상이하다. 예를 들어, 고세균은 독특한 플라젤린 및 에테르-연결된 지질을 보유하며, 그들의 세포벽에 무레인이 결여되어 있다. 고세균은 질병을 야기할 잠재성을 반영할 수 있는 알려진 병원균과 일부 특성을 공유한다. 그러한 특성에는 숙주에 대한 충분한 접근(즉, 기회) 및 장기간 콜로니화에 대한 능력 및 숙주 내에서의 내인성 세균총과의 공존이 포함된다. 인간 결장, 질, 및 구강 미생물 세균총에서의 혐기성 고세균의 검출은 인간 숙주를 콜로니화하는 그들의 능력을 입증한다. 본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 샘플, 예를 들어 환경 샘플, 대상체로부터 획득된 샘플 등으로부터의 그러한 고세균의 확인을 가능하게 한다.
원생동물은 독립생활 또는 기생의 단세포형 진핵생물을 지칭하는 것으로, 이는 다른 미생물 또는 유기 조직 및 잔해와 같은 유기 물질을 먹이로 한다. 전통적으로 정의된 바와 같은 원생동물은 크기가 1 마이크로미터 내지 수 밀리미터 또는 그 이상 정도로 작은 범위이다. 모든 원생동물은 종속영양(heterotrophic)이고, 다른 유기체로부터 영양소를 얻는데, 이는 그들 전체를 섭취하거나 그들의 유기 잔존물 및 폐기물을 소비함으로써 이루어진다. 일부 원생동물은 식세포작용(phagocytosis)에 의해 먹이를 섭취하는데, (아메바와 마찬가지로) 위족을 사용하여 유기 입자를 빨아들이거나, 또는 세포구(cytostome)로 불리는 특수화된 입모양 개구(mouth-like aperture)를 통해 먹이를 섭취한다. 다른 것들은 삼투영양에 의해 먹이를 섭취하는데, 그들의 세포막을 통해 용해된 영양소를 흡수한다. 다수의 원생동물 병원체는 인간 기생충으로서, 이들은 말라리아(플라스모디움(Plasmodium)에 의함), 아메바증(amoebiasis), 편모충증(giardiasis), 톡소플라스마증(toxoplasmosis), 크립토스포리디움증(cryptosporidiosis), 트리코모나스증(trichomoniasis), 샤가스병(Chagas disease), 리슈만편모충증(leishmaniasis), 아프리카 트리파노소마증(African trypanosomiasis)(수면병(sleep sickness)), 아메바성 이질(amoebic dysentery), 가시아메바 각막염(acanthamoeba keratitis), 및 원발성 아메바성 수막뇌염(네글레리아증(naegleriasis))과 같은 질병을 야기한다. 본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 샘플, 예를 들어 환경 샘플, 대상체로부터 획득된 샘플 등으로부터의 그러한 원생동물의 확인을 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 샘플, 특히, 생존가능하고/하거나 증식성인 미생물로부터의 전술한 미생물의 확인 및 분석을 제공한다. 상기에 나타낸 바와 같이, 샘플은 대상체로부터, 환경으로부터, 식료품으로부터 등등을 포함하여 다양한 공급원으로부터 기원될 수 있다. 대상체로부터의 다수의 유형의 샘플이 본 발명의 조성물, 방법, 및 키트와 함께 사용될 수 있으며, 이러한 샘플에는 혈액, 소변, 타액, 중이 흡인물, 담즙, 질 분비물, 고름(pus), 흉막 삼출액, 활액, 및 복강 농양(abscess)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 그러한 바와 같이, 본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 대상체로부터 획득된 샘플의 유형 및 위치에 의해 특별히 제한되지 않는다. 더욱이, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 및 조성물은 환자에서 패혈증을 야기하고 있거나 환자에서 요로 감염을 야기하고 있는 미생물을 확인하는 데 있어서의 표준 방법에 비하여, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 및 조성물이 표준 방법보다 훨씬 더 신속한 방식으로 문제가 되는 미생물을 정확하게 확인할 수 있다는 점에서 개선을 제공한다. 그렇기 때문에, 확인된 미생물(들)에 적절한 항미생물제(들)가 훨씬 더 빨리 투여될 수 있으며, 그럼으로써 패혈성 쇼크, 오한, 열, 몸살, 정신 능력의 변화, 피로, 권태, 호흡 문제, 비정상 심장 감염, 염증, 구역 및 구토, 불안 등과 같은 미생물 감염과 관련된 부작용을 가능한 예방하거나 완화시키면서 그리고 더 신속한 방식으로 미생물 감염에 대항하고 이를 제거할 수 있다. 더욱이, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 및 조성물은 항미생물제가 미생물의 억제 또는 사멸에 효과적인지를 또한 결정할 수 있다. 따라서, 미생물이 특정 항미생물제에 저항성인 경우, 본 명세서에 개시된 방법, 키트 및 조성물은 그러한 결정을 신속한 방식으로 내릴 수 있으며, 이에 따라 다른 항미생물제가 시도될 수 있다.
본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 신생 미생물 핵산 합성을 확인하는 데 있어서 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체 둘 모두를 이용할 수 있다. 하기에 더 충분히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법, 조성물 및 키트는 다수의 유형의 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체를 이용할 수 있으며, 이들의 사용은 기저선 핵산 합성을 확립하는 데, 그리고 항미생물제의 첨가와 같은 핵산 합성 속도의 변화를 결정하는 데 유리할 수 있다. 뉴클레오시드는 전형적으로 이들 유사체가 세포 배양물에 첨가되거나 동물에 투여되는 실험에 사용되는데, 그 이유는, 뉴클레오시드 유사체는 살아있는 세포에 의해 용이하게 취해지며, 여기서 이들은 뉴클레오티드로 인산화되고, 이어서 성장하는 핵산 중합체 내로 도입되기 때문이다. 대조적으로, 뉴클레오티드는 세포 내로의 도입 전 또는 후에, 더 불안정하며 효소 절단에 더 취약하고, 일반적으로 뉴클레오시드보다 덜 안정하다. 게다가, 포스페이트 기로부터의 추가의 전하로 인해, 뉴클레오티드는 살아있는 세포 내로 용이하게 수송되지 않으며, 일반적으로 충분한 농도의 뉴클레오티드가 세포막을 가로지르게 하기 위하여 형질감염 단계를 필요로 한다. 이는, 결과를 정확하게 해석하기 위해 세포 섭동(cell perturbation)이 최소한으로 유지되어야 하는 생체내(in vivo) 또는 생체외/생체내(ex vivo/in vivo) 실험 어느 것에도 이상적이지 않다. 이러한 이유로, 하기 개시 내용은 일반적으로 세포 또는 동물에 첨가되는 유사체로서 뉴클레오시드를 지칭하지만, 이는 결코 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 여기서는 뉴클레오티드도 마찬가지로 중요하다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체는 4개의 DNA 염기(아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 티민(T)) 중 어느 하나 또는 4개의 RNA 염기(아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U)) 중 어느 하나에 대한 유사체일 수 있으며, 이들의 트라이포스페이트 및 포스포르아미다이트 형태를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체는 미생물에 존재하는 폴리머라제에 의해 새로 합성된 핵산 내로 도입된다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체는, 포스페이트 골격, 펜토스 당, 및/또는 리보스 또는 데옥시리보스가, 전형적으로 합성 화학 기법에 의해 변경되었다는 점에서 천연 발생 뉴클레오시드와 상이하며, 예를 들어 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 검출가능한 표지(예를 들어, 염료, 형광단), 생물직교 작용성 모이어티(예를 들어, 클릭 화학과 같은 특정 화학 반응에 관여하는 모이어티), 생체분자(예를 들어, 효소, 항체, 비오틴) 등을 포함하도록 변경될 수 있으며, 이들 중 어느 것도 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에서 신생으로 제조된 미생물 핵산 중합체를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 뉴클레오시드 유사체는 브로모, 클로로, 및 요오도 모이어티를 포함하지만 이로 한정되지 않는 할로겐화 유사체이다. 할로겐화 유사체의 예에는 2'(S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 5-브로모-2'데옥시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도-2'데옥시우리딘, 및 5-요오도우리딘이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 할로겐화 유사체에 관하여, 이들 유사체, 예컨대 브로모-2'데옥시우리딘 및 요오도데옥시우리딘에 높은 친화도로 결합하기 위한 항체가 특별히 개발되었다(미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 Dako; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BD Bioscience; 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 EMD Biosciences). 다른 실시 형태에서, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 아지도, 알키닐 또는 포스피닐 모이어티를 포함하지만 이로 한정되지 않는 생물직교 작용성 모이어티를 포함한다. 생물직교 작용성 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 예에는 2-에티닐-아데노신, N6-프로파르길-아데노신, 2'-(O-프로파르길)-아데노신, 3'-(O-프로파르길)-아데노신, 5-에티닐-시티딘, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 2'-(O-프로파르길)-시티딘, 3'-(O-프로파르길)-시티딘, 2'-(O-프로파르길)-구아노신, 3'-(O-프로파르길)-구아노신, 5-에티닐-우리딘, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 2'-(O-프로파르길)-우리딘, 3'-(O-프로파르길)-우리딘, (2'S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 8-아지도-아데노신, N6-(6-아지도)헥실-2'데옥시-아데노신, 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 5-아지도메틸-우리딘, 5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사-펜타데카노일-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘, 5-(3-아지도프로필)-우리딘, 5-아지도-PEG4-우리딘, 5-아지도-PEG4-시티딘, 및 5-아지도-PEG4-2'-데옥시시티딘이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
특정 실시 형태에서, 뉴클레오시드 유사체는 표지화 시약의 작용기와 클릭 화학, 변형된 [3+2] 부가환화 반응, 또는 스타우딩거 라이게이션 중 어느 것인가를 거칠 수 있는 생물직교 작용성 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 반응성 생물직교 모이어티는 뉴클레오시드의 염기에 의해 보유된다. 반응성 생물직교 모이어티를 보유하는 염기는 퓨린(예를 들어, 아데닌 또는 구아닌) 또는 피리미딘(예를 들어, 시토신, 우라실 또는 티민)일 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 염기는 우라실이고; 일부 그러한 실시 형태에서, 우라실은 5-위치에 반응성 생물직교 모이어티를 보유한다. 소정의 실시 형태에서, 염기는 아데닌이고; 일부 그러한 실시 형태에서, 아데닌은 반응성 생물직교 모이어티를 보유한다. 소정의 실시 형태에서, 생물직교 모이어티는 염기에 간접적으로 부착되는 반면, 다른 실시 형태에서, 생물직교 모이어티는 염기에 직접 공유적으로 부착된다. 소정의 실시 형태에서, 반응성 생물직교 모이어티는 뉴클레오시드의 당(리보스 및 데옥시리보스)에 의해 보유된다. 소정의 실시 형태에서, 생물직교 모이어티는 당에 간접적으로 부착되는 반면, 다른 실시 형태에서, 생물직교 모이어티는 당에 직접 그리고 공유적으로 부착된다. 소정의 실시 형태에서, 반응성 생물직교 모이어티는 뉴클레오시드의 포스페이트 모이어티에 부착된다. 반응성 생물직교 모이어티를 보유하는 당은 퓨린(예를 들어, 아데닌 또는 구아닌) 또는 피리미딘(예를 들어, 시토신, 우라실 또는 티민)에 공유적으로 부착될 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 염기는 우라실인 반면, 다른 실시 형태에서 염기는 아데닌이다.
반응성 생물직교 모이어티는 니트릴 옥사이드, 아지드, 다이아조메탄, 니트론 또는 니트릴 이민과 같은 1,3-쌍극자일 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 1,3-쌍극자는 아지드이다. 대안적으로, 반응성 생물직교 작용성 모이어티는 알켄(예를 들어, 비닐, 프로필레닐 등) 또는 알킨(예를 들어, 에티닐, 프로피닐 등)과 같은 친쌍극자체일 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 친쌍극자체는 알킨, 예컨대 에티닐 기이다.
전술된 이들 생물직교 작용성 모이어티는 고도로 선택적인 반응을 통해 변형될 수 있는 특유의 화학적 작용성을 갖는 비천연, 비섭동성(nonperturbing) 생물직교 화학 모이어티이다. 특히, 이들 도입된 뉴클레오시드는 세포 환경(cellular milieu)의 존재 하에서 뉴클레오시드와의 공유 결합을 선택적으로 형성하게 될 화학적 핸들(chemical handle)을 포함하는 표지화 시약을 사용하여 표지된다.
미생물 증식을 포함한 복잡한 세포 과정을 분석하는 일은 생체분자들이 그들의 본래의 환경(native habitat) 내에서 기능할 때 생체분자들을 추적하는 능력을 필요로 한다. 최근에는, 생물직교 작용성 모이어티가 생체분자를 태깅하기 위한 추가의 방법으로 사용되어 왔다. 생물직교 작용성 모이어티의 사용은 생물직교 작용성 모이어티로서 아지드 모이어티를 사용하는 대사산물의 검출 및 번역후 변형에 대해 기재되어 왔다. 대사적으로 또는 화학적 변형을 통해 일단 표적 생체분자 내로 도입되면, 아지드는 다음 3가지의 고도로 선택적인 반응 중 하나를 사용하여 프로브로 태깅될 수 있다: 스타우딩거 라이게이션, Cu(I)-촉매된 아지드-알킨 부가환화, 또는 변형-촉진된 [3+2] 부가환화(예를 들어, 문헌[Agard et al., J Am Chem Soc. 2004 Nov 24; 1 26(46) :1 5046-7] 참조).
생물직교 작용성 모이어티는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 도입을 통해 핵산을 표지하는 데 사용될 수 있다. 따라서, Barry Sharpless 및 Carolyn Bertozzi(예를 들어, 문헌[Sharpless et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2002 Mar 15;41 (6):1 053-7]; 문헌[Meldal et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 3057]; 문헌[Agard et al., J Am Chem Soc. 2004 Nov 24;1 26(46):1 5046-7]; 미국 특허 제7,122,703호; 미국 특허 출원 공개 제2003000516671호 참조)에 독립적으로 기재된 스타우딩거 라이게이션, 아지드와 알킨의 Cu(I)-촉매된 [3+2] 부가환화("클릭 화학") 또는 "무구리(copper-less)" 클릭 화학과 같은 생물직교 표지화를 사용하여 핵산을 표지할 수 있다. 클릭 화학 및 스타우딩거 라이게이션은 뉴클레오티드 도입의 직접적인 검출을 통해 세포 증식을 측정하도록 조정되어 왔다. Salic, et al., Methods and Compositions for Labeling Nucleic Acids, 미국 특허 제20070207476호 및 제20070099222호(2006년 10월 27일자로 출원됨)를 참조한다.
핵산을 표지하기 위한 클릭 화학 기법은 반응성 불포화 기를 함유하는 제1 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체로 세포를 처리하여, 제1 뉴클레오시드 유사체가 새로 합성된 미생물 핵산 내로 도입되도록 하는 것을 포함한다. 이어서, 세포를 표지에 부착된 제2 반응성 불포화 기를 포함하는 표지화 시약과 접촉시켜, 제1 반응성 불포화 기와 제2 반응성 불포화 기 사이에 [3+2] 부가환화가 일어나게 한다.
미생물 핵산을 표지하기 위한 [3+2] 부가환화 반응에 대한 하기 설명은 단지 예로서만 제공되며, 본 발명의 범주를 제한하고는 것으로 의도되지 않는다.
클릭 화학을 사용하여 미생물 DNA를 표지하는 것의 한 예로서, 샘플을 규정된 기간 동안 유효량의 알킨-변형된 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)으로 처리하여, EdU가 새로 합성된 DNA 내로 도입되도록 한다. EdU로 표지된 후, 표지된 미생물 DNA를 구리(I) 촉매의 존재 하에서 아지드-다이설파이드-비오틴 링커와 반응시킨다. 아지드와 도입된 뉴클레오시드 유사체 사이에, [3+2] 부가환화 반응을 통해 공유 결합이 형성되고, 그러면 생성된 복합체는 스트렙타비딘-접합된 기재(예를 들어, 비드)를 사용하여 포획될 수 있다. 기재를 세척한 후에, 환원제, 예컨대 다이티오트레이톨(DTT)을 첨가하여 미생물 DNA를 기재로부터 유리시킨다. 이어서, 미생물 DNA의 서열을 표준 방법(예를 들어, PCR 라이브러리 증폭을 동반하는 Illumina Nextera DNA Flex)을 사용하여 결정할 수 있다.
클릭 화학을 사용하여 미생물 DNA를 표지하는 것의 두 번째 예에서는, 샘플을 규정된 기간 동안 유효량의 아지드-변형된 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 5-아지도-2'-데옥시우라실(AzdU)로 처리하여, AzdU가 새로 합성된 미생물 DNA 내로 도입되도록 한다. AzdU로 표지한 후, 표지된 미생물 DNA를 구리(I) 촉매의 존재 하에서 염료-표지된 알킨과 반응시킨다. 아지드 모이어티와 알킨 모이어티 사이의 [3+2] 부가환화 반응의 결과로서, 공유 결합이 형성된다. 이어서, 염료 표지를 유세포측정, 형광 현미경법, 이미징, 멀티-웰 플레이트 검정, 또는 고용량 스크리닝(high content screening)을 포함하지만 이로 한정되지 않는 표준 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
클릭 화학을 사용하여 RNA를 표지하는 것의 한 예에서는, 샘플을 규정된 기간 동안 유효량의 알킨-변형된 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 5-에티닐-우리딘(EU)의 존재 하에서 인큐베이션하여, EU가 새로 합성된 미생물 DNA 내로 도입되도록 한다. EU로 표지된 후, 미생물을 용해시키고, 구리(I) 촉매의 존재 하에서 아지드-다이설파이드-비오틴 링커와 반응시킨다. 아지드와 도입된 뉴클레오시드 유사체 사이에, [3+2] 부가환화 반응을 통해 공유 결합이 형성되고, 그러면 생성된 복합체는 스트렙타비딘-접합된 기재(예를 들어, 비드)를 사용하여 포획될 수 있다. 기재를 세척한 후에, 환원제, 예컨대 다이티오트레이톨(DTT)을 첨가하여 RNA를 기재로부터 유리시킨다. RNA는 cDNA로 역전사된다. cDNA로부터, 서열분석 라이브러리가 제조될 수 있다.
Bertozzi et al.에 의해 기재된 구리(I) 촉매를 사용하지 않는 변형된 [3+2] 부가환화 반응의 이점을 취하는, 클릭 화학에 대한 한 가지 대안은 "무구리" 클릭 화학 반응이다[Bertozzi et al., Compositions and methods for modification of biomolecules, 미국 특허 출원 제20060110782호].
예를 들어, 미생물을 규정된 기간 동안 유효량의 아지드-변형된 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 AzdU로 먼저 처리하여, 아지드-변형된 뉴클레오시드 유사체가 새로 합성된 미생물 DNA 내로 도입될 수 있도록 한다. AzdU의 부가 후에, 세포를 반응성 사이클로알킨 모이어티를 갖는 유효량의 화합물 또는 분자로 처리하며, 이로써 변형된 [3+2] 부가환화 반응이 아지드 모이어티와 사이클로알킨 모이어티 사이에 일어나게 된다. 사이클로알킨은 염료 표지 - 이는, 이어서, 염료 표지를 유세포측정, 형광 현미경법, 이미징, 멀티-웰 플레이트 검정, 또는 고용량 스크리닝을 포함하지만 이로 한정되지 않는 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있음 -; 풀다운 시약과 함께 사용될 수 있는 비오틴 표지; HRP 효소 등을 추가로 포함하도록 변형될 수 있다. DNA를 표지하기 위하여 변형된 [3+2] 부가환화 반응에 사용될 수 있는 사이클로알킨에는 사이클로옥틴, 다이플루오로사이클로옥틴, 헤테로사이클로알킨, 다이클로로사이클로옥틴, 다이브로모사이클로옥틴, 또는 다이요오도사이클로옥틴이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 당업계에 알려진 다른 화학이 미생물 DNA의 표지화에 적용될 수 있다. 예를 들어, 스타우딩거 라이게이션으로도 알려진 Bertozzi et al.에 의해 기재된 아지드-포스핀 화학이 새로 합성된 미생물 DNA 내로의 아지드-변형된 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 AzdU의 도입을 검출하는 데 사용될 수 있다. Bertozzi et al., Chemoselective ligation, 미국 특허 출원 공개 제20070037964호를 참조한다. 미생물을 먼저 규정된 기간 동안 유효량의 아지드-변형된 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 AzdU와 접촉시킨다. 이어서, 미생물을 조작된 포스핀 모이어티와 반응시킨다. 조작된 포스핀 모이어티의 한 예는 2-다이페닐포스파닐-벤조산 메틸 에스테르이다. 아지드-포스핀 화학이 미생물 DNA를 표지하는 데 사용되는 경우, 조작된 포스핀 모이어티는 염료 분자, 비오틴 모이어티, 효소 등을 추가로 포함한다. 일단 아지드와 포스핀 모이어티 사이의 반응이 일어났으면, 비오틴 분자는 풀다운 검정 등에서 사용될 수 있다.
기저선 미생물 증식 및 미생물 증식의 후속 변화 둘 모두를 측정하기 위하여, 본 발명은 사용된 제1 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체와 차등적으로 표지된 제2 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 사용을 추가로 제공한다. 미생물에 의한 미생물 증식 또는 유전자 발현에 대한 항미생물제(예를 들어, 항생제)의 유효성을 측정하기 위하여, 제3 및/또는 제4 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체가 사용될 수 있음이 추가로 고려된다. 기저선 합성 속도는 제1 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 의한 핵산의 표지화에 의해 기록될 수 있다. 제2 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 도입 전에, 제1 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 제거할 필요는 없다. 또한, 제2 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 도입 전에 제1 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 먼저 제거하는 경우, 이에 의해 미생물 증식 속도의 정확한 결정이 어려워질 수 있다. 게다가, 세척 단계의 부재는 이 프로세스가 고처리량 스크리닝(HTS)과 양립가능하게 한다.
본 명세서에 개시된 조성물, 방법 및 키트의 주요 이점 중 하나는 샘플 내의 미생물(들)의 확인이 표준 프로토콜과는 달리 긴 배양 단계를 필요로 하지 않는다는 것이다. DNA가 생존가능한 증식성 유기체 내에서 끊임없이 생산되고 있기 때문에, 본 발명의 조성물, 방법 및 키트는 미생물을 성장시키기 위한 배양 단계를 사용할 필요 없이 미생물을 확인할 수 있다. 대신에, 본 발명의 조성물, 방법 및 키트는 인큐베이션 단계를 이용하는데, 여기서는 샘플을 최소한의 기간 동안 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 인큐베이션하여, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체가 신생으로 제조된 미생물 핵산 내로 도입되도록 한다. 따라서, 일단 획득된 샘플은 약 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 105분, 110분, 115분, 120분, 125분, 130분, 145분, 150분, 155분, 160분, 165분, 170분, 175분, 180분, 190분, 200분, 220분, 330분, 240분, 260분, 280분, 300분, 350분, 400분, 500분, 600분, 또는 전술한 시점의 분수적 증분(factional increment)을 포함하여 이들 중 임의의 2개를 포함하거나 이들 사이에 있는 임의의 범위의 시간 동안 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 인큐베이션될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 유형의 표지화 시약을 갖는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 신생으로 제조된 미생물 핵산을 표지하는 것을 추가로 제공한다. 본 명세서에 개시된 표지화 시약은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 특이성으로 결합한다. 예를 들어, 표지화 시약은, 표지에 접합될 수 있거나 표지에 공유적으로 부착된 제2 항체에 의해 결합될 수 있는 제1 항체일 수 있으며, 여기서 제1 항체는 도입된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합한다. 그러한 제1 항체의 예에는 항-BrdU 항체, 항-IdU 항체, 및 항-CldU 항체가 포함될 수 있으며, 이들 모두는 다양한 판매자로부터 구매가능하다. 그러나, (전술된 바와 같이) 도입된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 선택적으로 결합할 수 있는 다른 항체가 또한 고려된다. 제2 항체와 관련하여, 제2 항체는 기재, 예컨대 비드 또는 플레이트에 결합될 수 있다. 따라서, 제2 항체는 새로 합성된 미생물 핵산의 단리 또는 정제를 가능하게 하는 풀다운 시약으로서 기능할 수 있다. 대안적으로, 표지화 시약은 상보적인 생물직교 작용기(예를 들어, 알키닐 기)를 갖는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체와 화학 반응을 거칠 있도록 설계된 작용기(예를 들어, 아지드)를 포함하고, 표지, 예컨대 염료 모이어티, 형광단 모이어티, 친화성 리간드(예를 들어, GST, 비오틴, 히스티딘 등), 효소(예를 들어, 서양 고추냉이 퍼옥사이드)를 포함하는 화합물일 수 있다. 비오틴 표지를 포함하는 표지화 시약의 예에는 하기가 포함된다:
Figure pct00016
,
Figure pct00017
,
Figure pct00018
,
Figure pct00019
,
및
Figure pct00020
.
이미 상기에 언급된 바와 같이, 표지의 역할은 표지 후에 핵산 중합체, 예를 들어 새로 합성된 미생물 DNA의 가시화 또는 검출을 가능하게 하는 것이다. 전형적으로, 표지(또는 검출가능 작용제 또는 모이어티)는, 그것이 풀다운 시약에 의해 선택적으로 결합될 수 있도록 선택되거나, 또는 대안적으로 측정될 수 있는 신호를 발생시킬 수 있도록 선택되는데, 이때 신호의 강도는, 예를 들어 분석되는 샘플 내의 표지된 핵산 중합체의 양과 (예를 들어, 비례해서) 관련되어 있다. 따라서, 새로 합성된 미생물 핵산을 검출하고, 확인하고, 정량화하기 위해 다수의 표지가 사용될 수 있는 것이 고려되는데, 예를 들어, 새로 합성된 미생물 핵산의 단리를 제공하기 위하여 제1 표지가 풀다운 시약에 의해 결합될 수 있고, 측정되는 신호를 발생시키기 위하여 제2, 제3 또는 그 이상의 표지가 사용될 수 있으며, 이때 신호의 강도는 분석되는 샘플 내의 표지된 핵산 중합체의 양과 관련되어 있다. 다수의 표지의 그러한 사용은 증식 속도 또는 새로운 핵산 합성을 결정하거나, 또는 항생제와 같은 투여된 작용제의 효과를 시험하는 데 특히 유리하다. 또한, 표지화 시약은 화학적으로 절단가능한 링커 또는 효소적으로 절단가능한 링커를 추가로 포함할 수 있으며, 이에 따라 표지는 필요하다면 제거될 수 있다. 다수의 화학적으로 절단가능한 링커가 사용될 수 있지만, 일반적으로는 온화한 반응 조건 하에서 절단될 수 있는 링커, 예컨대 산-불안정성-기반 링커, 염기-불안정성-기반 링커, 다이아조-기반 링커 또는 다이설파이드-기반 링커여야 한다. 산-불안정성-기반 링커의 예에는 하이드라존, 엔아민, 엔올 에테르, 이민 또는 시스-아코니틸 기를 포함하는 링커가 포함된다. 염기-불안정성-기반 링커의 예에는 카르바메이트-기반 및 에스테르-기반 링커가 포함된다. 대안적으로, 절단가능한 링커는 효소적으로 절단가능한 링커일 수 있다. 효소적으로 절단가능한 링커의 예에는 펩티드-기반 링커 또는 β-글루쿠로니드-기반 링커가 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 샘플 내의 미생물의 확인 및 분석을 위한 방법은 표지된 미생물 핵산의 단리 또는 정제를 추가로 제공한다. 특정 실시 형태에서, 표지된 미생물 핵산은 풀다운 시약을 사용하여 정제되거나 단리될 수 있다. 그러한 경우에, 새로 합성된 미생물 핵산은, 본 명세서에 기재된 바와 같이 도입된 뉴클레오시드 유사체에 결합하거나 그와 결합하고, 고정화된 풀다운 시약에 의해 선택적으로 결합될 수 있는 표지를 포함하는 표지화 시약으로 표지된다. 표지화 시약은 항체 또는 다른 유형의 친화성-기반 리간드(예를 들어, GST, 비오틴, 히스티딘 등)일 수 있다. 풀다운 시약은 표지화 시약에 특이적인 제2 항체일 수 있거나, 또는 표지화 시약에 대해 높은 그리고 선택적인 친화성을 갖는 다른 유형의 작용제 또는 화합물일 수 있다. 예를 들어, 표지화 시약은 비오틴-기반 분자일 수 있으며, 이것은 클릭 화학을 통해 뉴클레오시드 유사체와 결합하고, 그 자체가 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 풀다운 시약에 의해 선택적으로 결합될 수 있다. 따라서, 비오틴-기반 표지화 시약과 스트렙타비딘-기반 풀다운 작용제 사이의 상호작용은 '비표지된' 미생물 핵산 및 다른 미생물 구성성분으로부터의 '표지된' 미생물 핵산의 분리 또는 정제를 가능하게 한다. 전형적으로, 풀다운 시약은 고체 지지체, 예컨대 플레이트, 비드, 나노- 또는 마이크로-재료(예를 들어, 자성 나노입자) 상에 고정화된다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물, 방법, 및 키트가 미생물 생존력, 성장 및 증식에 대한 작용제의 유효성을 검출할 수 있다는 것을 제공한다. 예를 들어, 항미생물제가 샘플에 직접 첨가될 수 있고, 그 결과로 인한 미생물 생존력, 성장 및/또는 증식에 대한 효과는 본 발명의 방법을 사용하여 새로 합성된 핵산의 검출 또는 결여에 기초하여 결정될 수 있다. 더 많이 제어된 결과를 위하여, 샘플은 2개의 샘플, 즉 '대조군' 샘플 및 '처리된' 샘플로 나누어질 수 있으며, 여기서는 항미생물제를 '처리된' 샘플에 첨가하고 비히클 대조군을 '대조군 샘플'에 첨가하고, 2개의 샘플 사이의 새로 합성된 미생물 핵산의 생성에 있어서의 어떠한 차이를 결정하여, 이에 의해 '처리된' 샘플이 '대조군' 샘플과 비교하여 새로 합성된 미생물 핵산을 더 적게 갖거나 전혀 갖지 않는 경우, 이는 항미생물제의 유효성을 나타내는 지표가 될 것이다. 대안적으로, 항미생물제의 효과는 시험하고자 하는 시스템에서 결정될 수 있는데, 이는, 항미생물제의 투여 전에 제1 샘플을 취하고, 항미생물제의 투여 후에 하나 이상의 시점에서 제2, 제3, 또는 그 이상의 샘플을 취하는 것에 기초한다. 예를 들어, 항생제의 투여 전과 투여 후에 패혈증 인간 환자로부터 혈액 샘플이 획득될 수 있는데, 여기서는 새로 합성된 핵산의 감소된 속도 또는 부재가 패혈증을 야기하는 세균의 생존력, 성장 및/또는 증식에 대한 항생제의 유효성을 나타내는 지표가 된다. 본 발명의 조성물, 방법 및 키트와 함께 사용될 수 있는 항미생물제의 예에는 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 및 항기생충제가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 항생제는 세균에 대해 활성인 항미생물성 물질의 한 유형이며, 세균성 감염에 대항하기 위한 가장 중요한 유형의 항세균제이다. 항생제 의약품이 그러한 감염의 치료 및 예방에 널리 사용된다. 이들은 세균을 사멸시키거나 그의 성장을 억제할 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물, 방법 및 키트와 함께 사용될 수 있는 항생제의 예에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: 페니실린, 예컨대 아목시실린, 암피실린, 박암피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 및 티카르실린; 세팔로스포린, 예컨대 세파세트릴, 세파드록실, 세팔렉신, 세팔로글리신, 세팔로늄, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파피린, 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린, 세프라딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세팜만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프프로질, 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 카파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포벡신, 세폭사졸, 세프로틸, 세푸수미드, 세푸라세팀, 및 세프티옥사이드; 모나박탐, 예컨대 아즈트레오남; 카르바페넴, 예컨대 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 및 메로페넴; 마크로라이드 항생제, 예컨대 아지트로마이신, 에리트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 록시트로마이신, 및 텔리트로마이신; 린코사미드, 예컨대 클린다마이신 및 린코마이신; 아미노글리코시드 항생제, 예컨대 아미카신, 젠타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 및 토브라마이신; 퀴놀론 항생제, 예컨대 플루메퀸, 날리딕산, 옥솔린산, 피로미드산, 피페미드산, 로속사신, 시프로플록사신, 에녹사신, 로메플록사신, 나디플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 페플록사신, 루플록사신, 발로플록사신, 가티플록사신, 그레파플록사신, 레보플록사신, 목시플록사신, 파주플록사신, 스파르플록사신, 테마플록사신, 토수플록사신, 베시플록사신, 델라플록사신, 클리나플록사신, 제미플록사신, 프룰리플록사신, 시타플록사신, 및 트로바플록사신; 설폰아미드, 예컨대 설파메티졸, 설파메톡사졸, 설피속사졸, 트리메토프림-설파메톡사졸; 테트라사이클린 항생제, 예컨대 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린, 및 티게사이클린; 글리코펩티드 항생제, 예컨대 반코마이신 및 테이코플라닌; 지질당펩티드 항생제, 예컨대 텔라반신; 옥사졸리디논 항생제, 예컨대 리네졸리드, 및 사이클로세린; 리마마이신, 예컨대 리팜핀, 리파부틴, 리파펜틴, 및 리팔라질; 튜베르악티노마이신, 예컨대 비오마이신 및 카프레오마이신; 기타 항생제, 예컨대 박시트라신, 폴리믹신 B, 클로람페니콜, 메트로니다졸, 티니다졸, 및 니트로푸란토인. 항진균제는 진균에 대해 활성인 항미생물성 물질의 한 유형이며, 진균성 감염에 대항하기 위한 가장 중요한 유형의 항진균제이다. 항진균제 의약품이 그러한 감염의 치료 및 예방에 널리 사용된다. 이들은 진균을 사멸시키거나 그의 성장을 억제할 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물, 방법, 및 키트와 함께 사용될 수 있는 항진균제의 예에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: 알릴아민 항진균제, 예컨대 아모롤핀, 부테나핀, 나프티핀, 및 테르비나핀; 이미다졸 항진균제, 예컨대 비포나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 펜티코나졸, 케토코나졸, 이소코나졸, 룰리코나졸, 미코나졸, 오모코나졸, 옥시코나졸, 세르타코나졸, 설코나졸, 티오코나졸, 및 테르코나졸; 트라이아졸 항진균제, 예컨대 알바코나졸, 에피나코나졸, 플루코나졸, 이사부코나졸, 이트라코나졸, 포사코나졸, 라부코나졸, 테르코나졸, 및 보리코나졸; 및 티아졸 항진균제, 예컨대 아바펀진; 폴리엔 항진균제, 예컨대 암포테리신 B, 니스타틴, 나타마이신, 및 트리코마이신; 에키노칸딘, 예컨대 아니둘라펀진, 카스포펀진, 및 미카펀진; 티오카르바메이트 항진균제, 예컨대 톨나프테이트; 항대사물 항진균제, 예컨대 플루시토신; 벤질아민, 예컨대 부테나핀; 기타 항진균제, 예컨대 그리세오풀빈, 시클로피록스, 황화셀레늄, 및 타바보롤. 항바이러스제는 바이러스의 침입, 복제, 확산 및/또는 성숙을 예방하는 의약품이다. 본 명세서에 개시된 조성물, 방법, 및 키트와 함께 사용될 수 있는 항바이러스제의 예에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: 항포진제, 예컨대 아시클로비르, 브리부딘, 도코사놀, 팜시클로비르, 포스카르넷, 이독수리딘, 펜시클로비르, 트리플루리딘, 비다라빈, 시타라빈, 발아시클로비르, 트로마탄딘, 및 프리텔리비르; 항인플루엔자제, 예컨대 아만타딘, 리만타딘, 오셀타미비르, 페라미비르, 및 자나미비르; NS3/4A 프로테아제 억제제, 예컨대 아수나프레비르, 보세프레비르, 실루프레비르, 다노프레비르, 팔다프레비르, 글레카프레비르, 그라조프레비르, 나를라프레비르, 파리타프레비르, 시메프레비르, 소바프레비르, 텔라프레비르, 바니프레비르, 베드로프레비르, 및 복실라프레비르; NS5A 억제제, 예컨대 다클라타스비르, 엘바스비르, 레디파스비르, 오달라스비르, 옴비타스비르, 피브렌타스비르, 라비다스비르, 루자스비르, 사마타스비르, 및 벨파타스비르; NS5B RNA 폴리머라제 억제제, 예컨대 베클라부비르, 다사부비르, 델레오부비르, 필리부비르, 세트로부비르, 소포스부비르, 라달부비르, 및 우프리포스부비르; 항-B형 간염제, 예컨대 라미부딘, 텔비부딘, 클레부딘, 아데포비르, 테노프비르 디소프록실, 및 테노포비르 알라페나미드; 침입/융합 억제제, 예컨대 엔푸비르티드, 마라비록, 비크리비록, 세니크리비록, PRO 140, 이발리주맙, 및 포스템사비르; 역전사효소 억제제, 예컨대 디다노신, 엠트리시타빈, 라미부딘, 스타부딘, 지도부딘, 암독소비르, 아프리시타빈, 센사부딘, 엘부시타빈, 라시비르, 스탐피딘, 4'-에티닐-2-플루오로-2'-데옥시아데노신, 잘시타빈, 에파비렌즈, 네비라핀, 델라비르딘, 에트라비린, 릴피비린, 및 도라비린; 인테그라제 억제제, 예컨대 돌루테그라비르, 엘비테그라비르, 랄테그라비르, BI 224436, 카보테그라비르, 빅테그라비르, 및 MK-2048; 성숙 억제제, 예컨대 베비리마트, 및 BMS-955176; 프로테아제 억제제, 예컨대 암프레나비르, 포삼프레나비르, 인디나비르, 로피나비르, 넬피나비르, 리토나비르, 사퀴나비르, 아타자나비르, 다루나비르, 및 티프라나비르; 인테그라제 억제제, 예컨대 돌루테그라비르, 엘비테그라비르, 랄테그라비르, BI 224436, 카보테그라비르, 빅테그라비르, 및 MK-2048; 뉴클레오티드 유사체/NtRTI, 예컨대 테노포비르 디소프록실, 테노포비르 알라페나미드(TAF); 약동학적 증진제, 예컨대 코비시스타트 및 리토나비르; 및 인터페론, 예컨대 인터페론-α, 및 페그인터페론-α; 기타 항바이러스제, 예컨대 메티사존, 리팜피신, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 포도필로톡신, 포미비르센, 시도포비르, 플레코나릴, 파비피라비르, 갈리데시비르, 렘데시비르, 메리시타빈, MK-608, NITD008, 모록시딘, 트로만타딘 및 트리아자비린.
본 명세서에 개시된 조성물, 방법 및 키트는 또한 많은 상이한 미생물로부터의 핵산에 대한 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 사용함으로써 새로 합성된 미생물 핵산을 확인함으로써 샘플 내의 미생물의 확인을 제공한다. 전형적으로, 마이크로어레이는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 5000, 10000, 15000, 20000, 30000, 40000, 50000, 100000개 또는 전술한 값의 분수적 증분을 포함하여 이들 중 임의의 2개를 포함하거나 이들 사이에 있는 임의의 범위의 개수의 상이한 미생물로부터의 핵산에 대한 프로브를 가질 것이다. 프로브는 전형적으로 하나 이상의 표적 유기체 게놈(예를 들어, 16S rRNA)의 세그먼트에 상보적인 서열을 갖도록 설계된다. 올리고(oligo)가 기계적 침착에 의해 어레이 상에 스폿팅되거나, 변형된 잉크젯 프린터 헤드를 사용하여 분무되거나, 일련의 광촉매 반응을 통해 계내(in situ)에서 합성될 수 있다. 프로브들은 '특징부들'의 직사각형 격자 형태로 어레이 상에 배치되며, 각각은 동일한 올리고의 많은 카피를 수용하고 있다. 어레이 상의 특징부들의 밀도는 플랫폼들 사이에서 달라지며, 전형적인 스폿팅된 어레이의 경우 슬라이드당 20,000개의 스폿으로부터 계내 합성된 올리고를 사용하는 NimbleGen 및 Affymetrix와 같은 플랫폼의 경우 수백만에 이른다. 어레이들은 개스킷을 사용하여 서브어레이들로 세분될 수 있으며, 이는 다수의 샘플이 하나의 슬라이드 상에서 검사될 수 있게 할 수 있다. 어레이를 가로질러 랜덤하게 산재된 복제 특징부들은 스크래치 및 공간 효과에 대한 보정을 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 일부 어레이 상에서는, 랜덤 서열들을 갖는 음성 대조군 프로브들을 포함시켜 배경 잡음 보정을 위한 역치 수준을 제공한다. 다수의 병원체 검출 마이크로어레이가 당업계에 기술되어 있으며, 이에는 ViroChip(문헌[Wang D. et al., PLoS Biol. 2003; 1:E2]); 서열 재분석 병원체 마이크로어레이(문헌[Leski T. et al. PLoS ONE. 2009; 4:e6569]); 범용 검출 마이크로어레이(문헌[Belosludtsev Y. et al., BioTechniques. 2004; 37:654-8,66]); GreeneChip(문헌[Quan et al., J Clin Microbiol. 2007; 45:2359-64]); 및 로렌스 리버모어(Lawrence Livermore) 미생물 검출 어레이(문헌[Gardner S. et al. BMC Genomics. 2010; 11:668])가 포함된다. 예를 들어, 로렌스 리버모어 미생물 검출 어레이는 거의 6,000개의 바이러스 및 15,000개의 세균뿐만 아니라 진균 및 원생동물 유기체에 대한 프로브를 갖는다. 새로 합성된 미생물 DNA를 마이크로어레이에 적용한 후, 그의 특이적 서열을 검출하는 임의의 프로브는 형광을 발생시키고, 스캐너에 의해 판독될 것이다. 이어서, 스캐너로부터의 원시 데이터를 알고리즘을 사용하여 분석한다. 미생물의 시그니처인 다수의 핵산 서열 또는 프로브를 확인하는 데 생물정보학이 사용된다.
본 명세서에 개시된 조성물, 방법 및 키트는 또한 본 발명의 혼입된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 갖는 새로 합성된 미생물 핵산을 서열분석함으로써 샘플 내의 미생물의 확인을 제공한다. 새로 합성된 미생물 DNA, 또는 cDNA로 역전사된 미생물 RNA를 서열분석하는 데 다수의 서열분석 방법이 사용될 수 있으며, 이러한 방법에는 Sanger 다이데옥시 사슬 종결 서열분석 방법, 시험관내 트랜스포지션(in vitro transposition), 454 FLX™ 또는 454 TITANIUM™(Roche), SOLEXA™ 게놈 분석기(Genome Analyzer)(Illumina), HELISCOPE™ 단일 분자 서열분석기(Single Molecule Sequencer)(Helicos Biosciences), 및 SOLID™ DNA 서열분석기(Life Technologies/Applied Biosystems) 기기를 포함한 차세대 서열 플랫폼뿐만 아니라, Intelligent Biosystems 및 Pacific Biosystems와 같은 회사들에 의해 아직 개발 중에 있는 기타 플랫폼에 기초한 서열분석 기술이 포함된다. 서열 정보를 생성하는 화학이 상이한 차세대 서열분석 플랫폼들에 대해 달라지지만, 이들 모두는 서열분석 반응들이 동시에 실시되는 매우 많은 수의 서열분석 주형들로부터 서열 데이터를 생성한다는 공통적인 특징을 공유한다. 일반적으로, 이들 서열분석 반응 모두로부터의 데이터를 스캐너를 사용하여 수집하고, 이어서 조립하고 컴퓨터 및 강력한 생물정보학 프로그램을 사용하여 분석한다. 서열분석 반응들은 "대량 병렬(massively parallel)" 또는 "다중(multiplex)" 방식으로 수행되고, 판독되고, 조립되고, 분석된다. 이들 기기의 대량 병렬 성질은 어떤 종류의 서열분석 주형들이 필요하고 이들 강력한 기기로부터 최대 가능한 양의 서열분석 데이터를 획득하기 위하여 이들을 어떻게 생성하는지에 대한 사고방식에 있어서의 변화를 요구해 왔다. 따라서, E. 콜라이(E. coli)에서 DNA 클론들의 게놈 라이브러리를 필요로 하기보다는, 이제는 샘플 내의 표적 DNA로부터 생성되는 DNA 단편들의 수집 또는 집단을 포함하는 DNA 단편 라이브러리들을 생성하기 위한 시험관내 시스템의 관점에서 생각하는 것이 중요하며, 여기서 수집 또는 집단 내의 모든 DNA 단편들의 조합은 DNA 단편들의 생성의 유래가 되는 표적 DNA의 서열을 정성적으로 및/또는 정량적으로 표현하는 서열을 나타낸다. 실제로, 일부 경우에는, 서열분석되는 각각의 단편의 공급원의 확인을 가능하게 하는 상이한 어드레스 태그 또는 바코드로 각각 표지된 다수의 게놈 DNA 단편 라이브러리들로 이루어진 DNA 단편 라이브러리를 생성한다는 관점에서 생각하는 것이 필요하다.
일반적으로, 이들 차세대 서열분석 방법은 게놈 DNA 또는 이중-가닥 cDNA(RNA로부터 제조됨)를 더 작은 ssDNA 단편으로 단편화하고, ssDNA 단편의 적어도 한쪽 가닥 또는 바람직하게는 양쪽 가닥에 태그를 부가하는 것을 필요로 한다. 일부 방법에서, 태그는 DNA 폴리머라제를 사용한 DNA 서열분석을 위한 프라이밍 부위를 제공한다. 일부 방법에서, 태그는 또한 이들 단편을 표면, 예컨대 비드 상에 포획하기 위한 부위를 제공한다(예를 들어, 이들 방법 중 일부의 경우에는 에멀젼 PCR 증폭(emulsion PCR amplification) 전에; 예를 들어, 미국 특허 제7,323,305호에 기재된 바와 같은 방법을 사용함). 대부분의 경우에, 차세대 서열분석을 위한 주형으로서 사용되는 DNA 단편 라이브러리는 5'- 및 3'-태깅된 DNA 단편 또는 "다이-태깅된(di-tagged) DNA 단편"을 포함한다. 일반적으로, 차세대 서열분석을 위한 DNA 단편 라이브러리를 생성하기 위한 현재의 방법은 서열분석하기를 원하는 표적 DNA(예를 들어, RNA의 역전사 후의 이중-가닥 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함하는 표적 DNA)를 초음파처리기, 네뷸라이저, 또는 뉴클레아제를 사용하여 단편화하는 단계, 및 단편의 5' 및 3' 말단에 대한 어댑터들 또는 태그들로 이루어진 올리고뉴클레오티드들을 (예를 들어, 라이게이션에 의해) 결합하는 단계를 포함한다. 차세대 서열분석 방법들 중 일부는 그들의 서열분석 프로세스에서 환형 ssDNA 기질을 사용한다. 예를 들어, Drmanac et al. 의 미국 특허 출원 공개 제20090011943호; 제20090005252호; 제20080318796호; 제20080234136호; 제20080213771호; 제20070099208호; 및 제20070072208호는 대량 병렬 DNA 서열분석을 위한 환형 ssDNA 주형의 생성을 개시한다. Gunderson 및 Steemers의 미국 특허 출원 공개 제20080242560호는 하기를 포함하는 방법들을 개시한다: 디지털 DNA 볼의 제조(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20080242560호에서의 도 8 참조); 및/또는 DNA, 예컨대 게놈 DNA의 유전자좌-특이적 절단 및 증폭 - 이에는, 증폭된 핵산 어레이(예를 들어, ILLUMINA BeadArrays™; ILLUMINA, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 생성하기 위하여, 다치환 증폭 또는 전체 게놈 증폭에 의한(예를 들어, 거기서의 도 17) 또는 초분지형 RCA에 의한(예를 들어, 거기서의 도 18) 증폭에 대한 것이 포함됨.
특정 실시 형태에서, 본 발명은 샘플 내의 미생물을 확인하기 위한 트랜스포좀-기반 서열분석 방법의 사용을 제공한다. 그러한 트랜스포좀-기반 서열분석 방법은 미국 특허 출원 공개 제2014/0162897호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0368638호; 미국 특허 출원 공개 제2018/0245069호; 미국 특허 출원 공개 제2018/0023119호; 국제 특허 출원 공개 WO20122103545호; 국제 특허 출원 공개 WO20150160895호; 국제 특허 출원 공개 WO2016130704호; 국제 특허 출원 공개 WO2019028047호; 미국 특허 제9574226호; EP3161152호에 기재되어 있으며; 이들의 개시 내용은 본 발명을 위해 전체적으로 포함된다. DNA와 같은 표적 핵산을 차세대 서열분석을 위해 준비된 어댑터-변형된 주형으로 변환시키는 데 필요한 단계의 수는 트랜스포사제-매개 단편화 및 태깅의 사용에 의해 최소화될 수 있다. 본 명세서에서 "태그멘테이션(tagmentation)"으로 지칭되는 이러한 프로세스는 종종, 특정 목적을 위해 설계된 선택적인 추가의 서열과 함께, 단일-가닥 어댑터 서열 및 이중-가닥 트랜스포존 말단 서열 영역을 포함하는 트랜스포존 쌍과 복합체화된 트랜스포사제 효소를 포함하는 트랜스포좀 복합체에 의한 표적 핵산의 변형을 수반한다. 태그멘테이션은 표적 핵산의 단편화 및 이중체 핵산 단편의 양쪽 가닥의 5' 말단에 대한 어댑터의 라이게이션을 동시에 가져온다. 트랜스포좀 복합체가 지지체-결합된 경우, 생성된 단편은 태그멘테이션 반응 후에 (5' 연결된 트랜스포좀 복합체의 경우에는 직접, 또는 3' 연결된 트랜스포좀 복합체의 경우에 혼성화를 통해) 고체 지지체에 결합된다. 특히, 트랜스포사제 및 본 명세서에 기재된 트랜스포존 말단 조성물을 사용함으로써, (예를 들어, 마이크로어레이 분석을 위하여 표지된 표적을 제조하는 데 사용하기 위한; 예를 들어 카피수 변이(copy number variation)의 분석을 위한, 단일 뉴클레오티드 다형의 검출 및 분석을 위한, 그리고 토양 또는 수원(water source)과 같은 환경 샘플로부터 유전자를 찾기 위한) 미생물 RNA 발현의 분석 또는 게놈, 서브게놈, 전사학적, 또는 메타게놈 분석을 위한 표적 미생물 DNA(미생물 RNA로부터 제조된 이중-가닥 cDNA를 포함함)로부터 다이-태깅된 선형 ssDNA 단편들 또는 태깅된 환형 ssDNA 단편들의 라이브러리를 생성할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 트랜스포좀-기반 서열분석 방법은 시험관내 트랜스포지션 반응을 사용하여, 새로 합성된 미생물 DNA를 단편들로 파단하고 각각의 단편의 5'-말단에 태그를 결합시키는 것을 동시에 행한다. 시험관내 트랜스포지션 반응은 개별적인 트랜스포사제와 트랜스포존 말단 조성물, 또는 트랜스포사제와 트랜스포존 말단 조성물 사이에 형성되는 안정한 복합체를 포함하는 단일 트랜스포좀 조성물 중 어느 하나를 사용하여 이 반응을 조립함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 트랜스포사제 및 트랜스포존 말단 조성물의 사용을 기술하는 임의의 트랜스포좀-기반 서열분석 방법은 또한 트랜스포사제 및 트랜스포존 말단 조성물로부터 제조된 트랜스포좀 조성물을 사용할 수 있고, 트랜스포좀 조성물의 사용을 기술하는 임의의 트랜스포좀-기반 서열분석 방법은 또한 트랜스포좀 조성물을 구성하는 개별적인 트랜스포사제 및 트랜스포존 말단 조성물을 사용할 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에 기재된 트랜스포좀-기반 서열분석 방법은 새로 합성된 미생물 DNA로부터 태깅된 DNA 단편들의 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있으며, 상기 트랜스포좀-기반 서열분석 방법은 시험관내 트랜스포지션 반응에서 새로 합성된 미생물 DNA를, 새로 합성된 미생물 DNA 내로의 다회의 삽입이 일어날 수 있는 조건 하에서 그리고 충분한 시간 동안, 적어도 하나의 트랜스포사제 및 트랜스포사제와 함께 트랜스포지션 복합체를 형성하는 트랜스포존 말단 조성물과 함께 인큐베이션하는 단계 - 트랜스포존 말단 조성물은 (i) 전달된 트랜스포존 말단 서열, 및 선택적으로, 전달된 트랜스포존 말단 서열의 5'-말단에 위치된 추가의 서열을 나타내는 전달된 가닥, 및 (ii) 전달된 트랜스포존 말단 서열에 상보적인 서열을 나타내는 전달되지 않은 가닥을 포함하며, 이들 각각은 표적 DNA 내의 뉴클레오티드의 5'-말단에 대한 전달된 가닥을 포함하거나 이로 이루어진 제1 태그의 결합을 가져오고, 그럼으로써 표적 DNA의 단편화 및 어닐링된 5'-태깅된 DAN 단편들의 집단의 발생을 가져오고, 이들 각각은 5'-말단 상에 제1 태그를 가짐 -, 및 이어서 5'-태깅된 DNA 단편들의 3'-말단을 제1 태그 또는 제2 태그에 결합시키고, 그럼으로써 태깅된 DNA 단편들(예를 들어, 태깅된 환형 ssDNA 단편들 또는 5'- 및 3'-태깅된 DNA 단편들(또는 "다이-태깅된 DNA 단편들")을 포함함)의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 전술된 트랜스포좀-기반 서열분석 방법은 개별적인 트랜스포사제 및 트랜스포존 말단 조성물을 사용하는 반면, 다른 실시 형태에서, 트랜스포좀-기반 서열분석 방법은 트랜스포사제와 트랜스포존 말단 조성물 사이에 형성되는 복합체를 포함하는 트랜스포좀 조성물을 사용하여 수행된다.
본 발명은 트랜스포좀-기반 서열분석 방법을 사용함에 의한 미생물의 확인을 추가로 제공하는데, 상기 방법에서 트랜스포좀 복합체는 고체 지지체에 결합된다. 서열분석을 위해 비드-연결된 트랜스포좀을 사용하는 시판 제품의 예는 Illumina®에 의해 제공되는 Nextera™ DNA Flex 시스템이다. Nextera™ DNA Flex 시스템은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 미생물을 확인하는 데 사용될 수 있다. 트랜스포좀-기반 방법을 사용하여 핵산 단편 라이브러리가 제조될 수 있는데, 상기 방법에서는 2개의 트랜스포존 말단 서열 - 하나는 태그 서열에 연결되어 있음 - 과 트랜스포사제가 트랜스포좀 복합체를 형성한다. 트랜스포좀 복합체는 표적 핵산을 용액 중에서 단편화하고 태깅하여 서열분석기에서 즉시 사용가능한 태그멘테이션된 라이브러리를 생성하는 데 사용된다. 트랜스포좀 복합체는, 예를 들어 2개의 말단 서열 중 한쪽의 5'-말단에 부착된 비오틴을 통해 고체 표면 상에 고정될 수 있다. 고정화된 트랜스포좀의 사용은 핸즈-온(hands-on) 및 전체 라이브러리 제조 시간, 비용, 및 시약 요건을 감소시키고, 샘플 투입 요건을 낮추고, 라이브러리 제조를 위한 시작점으로서 정제되지 않거나 저하된 샘플의 사용을 가능하게 함으로써 용액상(solution-phase) 접근법에 비해 상당한 이점을 제공한다. 균일한 단편 크기 및 라이브러리 수율을 가져오는, 고체 표면 상에의 트랜스포좀의 고정화를 위한 예시적인 트랜스포지션 절차 및 시스템이 국제 특허 출원 공개 WO2014/108810호 및 WO2016/189331호에 상세히 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 국제 특허 출원 공개 WO2016/189331호 및 미국 특허 출원 공개 제2014/093916A1호에 기재된 소정의 비드-기반 태그멘테이션 방법에서는, 트랜스포좀을 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 사용하여 자성 비드에 결합시킨다.
일반적으로, 공유 또는 비공유 결합 파트너, 예를 들어 친화성 요소 및 친화성 결합 파트너를 사용하여, 슬라이드 또는 비드와 같은 기재 상에 트랜스포좀을 고정화한다. 예를 들어, 트랜스포좀 복합체에 부착된 비오티닐화 링커를 통해 스트렙타비딘-코팅된 비드 상에 트랜스포좀 복합체를 고정화한다. 새로 합성된 미생물 핵산은 고정화된 트랜스포좀 복합체에 의해 포획되고, 핵산은 단편화되고 태깅된다("태그멘테이션"). 태깅된 단편이 증폭되고, 관심 앰플리콘이 선택적으로 (예를 들어, 혼성화 프로브를 통해) 포획되고, 태깅된 단편이 서열분석된다.
라이브러리 제조를 위한 고체 지지체-연결된 트랜스포좀 복합체의 사용은 라이브러리 제조 프로세스에 들어가는 샘플 투입의 정규화 및 풍부화 또는 서열분석 단계 전에의 라이브러리 출력의 정규화에 대한 필요성을 감소시킨다. 이들 복합체의 사용은 또한, 다양한 샘플 투입 농도가 사용될 때에도, 용액상 방법에 비해 더 일관된 삽입물 크기를 갖는 라이브러리를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 트랜스포좀 복합체는 트랜스포존 말단 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 올리고뉴클레오티드), 예컨대 폴리뉴클레오티드(올리고뉴클레오티드)를 통해 지지체에 고정화된다. 일부 실시 형태에서, 트랜스포좀 복합체는, 예를 들어 트랜스포사제 효소를 고체 지지체에 커플링시키는, 트랜스포존 서열의 말단에 부가된 링커를 통해 고정화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 트랜스포사제 효소 및 트랜스포존 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 둘 모두는 고체 지지체에 고정화된다. 고체 지지체에 대한 분자(예를 들어, 핵산, 효소)의 고정화를 언급할 때, 용어 "고정화된", "고정된" 및 "부착된"은 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되며, 이들 용어는 모두 명시적으로 또는 문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한 직접 또는 간접, 공유 또는 비공유 부착을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 소정의 실시 형태에서, 공유 부착이 바람직할 수 있지만, 대체적으로 요구되는 바는, 분자(예를 들어, 핵산, 효소)가, 예를 들어 핵산 증폭 및/또는 서열분석을 필요로 하는 응용에서 지지체를 사용하도록 의도된 조건 하에서 지지체에 고정화되거나 부착된 상태로 남아 있는 것이다. 일부 경우에, 비드-기반 태그멘테이션에서는, 리간드 쌍, 예를 들어 친화성 요소와 친화성 결합 파트너를 통해 트랜스포좀이 비드 표면에 결합될 수 있다.
트랜스포존-기반 기술은, 예를 들어 NEXTERA™ XT 및 FLEX DNA 샘플 제조 키트(Illumina, Inc.)에 대한 워크플로우에 예시된 바와 같이, DNA를 단편화하는 데 이용될 수 있으며, 여기서는 새로 합성된 미생물 핵산이 트랜스포좀 복합체로 처리되는데, 이때 트랜스포좀 복합체는 표적의 단편화 및 태깅("프래그멘테이션")을 동시에 수행함으로써, 단편의 말단에 특유의 어댑터 서열로 태깅된 단편화된 핵산 분자들의 집단을 생성한다.
트랜스포지션 반응은 하나 이상의 트랜스포존이 랜덤한 부위 또는 거의 랜덤한 부위에서 표적 핵산 내로 삽입되는 반응이다. 트랜스포지션 반응에서의 성분들은 트랜스포사제(또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산을 단편화하고 태깅할 수 있는 다른 효소, 예컨대 인테그라제) 및 상기 효소에 결합하는 이중-가닥 트랜스포존 말단 서열 및 2개의 트랜스포존 말단 서열 중 한쪽에 부착된 어댑터 서열을 포함하는 트랜스포존 요소를 포함한다. 이중-가닥 트랜스포존 말단 서열의 한쪽 가닥이 표적 핵산의 한쪽 가닥에 전달되고, 상보적 트랜스포존 말단 서열 가닥은 그렇지 않다(즉, 전사되지 않은 트랜스포존 서열). 어댑터 서열은 필요하거나 원하는 대로 하나 이상의 기능성 서열(예를 들어, 프라이머 서열)을 포함할 수 있다.
따라서, 추가의 실시 형태에서, 샘플 내의 미생물의 확인 및 분석은 태깅된 핵산 단편들의 라이브러리를 생성하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계는 상부에 고정화된 본 명세서에 기재된 트랜스포좀 복합체를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 및 표적 핵산을 복수의 표적 단편들로 단편화하고 제1 트랜스포존의 3'-말단을 표적 단편의 5'-말단에 결합하여 복수의 5'-태깅된 표적 단편을 제공하기에 충분한 조건 하에서 고체 지지체를 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 상기 방법은 5'-태깅된 표적 단편을 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 추가의 실시 형태에서, 상기 방법은 5'-태깅된 표적 단편 또는 이의 증폭 산물 중 하나 이상을 서열분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성되는 새로 합성된 미생물 핵산의 5'-태깅된 단편들의 라이브러리를 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체 및 표지화 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 일반적으로 또한, 전형적으로는 미생물 핵산 합성의 변화를 검출하거나 측정하기 위한 하나 이상의 방법에서 뉴클레오시드 유사체 및 표지화 시약을 사용하기 위한 설명서를 포함할 것이다.
예시적인 실시 형태에서, 상기 키트는 생물직교 작용성 모이어티를 함유하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체, 및 생물직교 작용성 모이어티와 클릭 화학을 거칠 수 있는 제1 표지화 시약을 포함한다. 추가의 키트 성분들은 풀다운 시약, 완충액, 기타 검출 시약 및 표준물을 포함한다.
하기 실시예는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니라 예시하고자 하는 것이다. 이들이 사용될 수 있는 것들의 전형이지만, 당업자에게 알려진 다른 절차가 대안적으로 사용될 수 있다.
실시예
패혈증 환자로부터의 샘플 내의 세균을 검출 및 확인하기 위한 예시적인 방법. 본 발명의 방법 및 기술은 패혈증 환자에서의 세균 검출을 가능하게 한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 혈액 샘플을 뉴클레오시드 표지화 시약 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)을 함유하는 배지 중에서 배양한다. 단기간의 배양 후(수분 내지 수시간), DNA 합성을 거치고 있는 살아있는 세포는 EdU를 그들의 게놈 내로 도입시킨다. 여기서, 항생제 저항성이 조사되어야 하는 경우, 관심 항생제가 배양 배지 중에 포함될 수 있다. 신속한 배양 후에, 이어서 세포를 용해시키고, 이어서 선택적으로 DNA를 용해물로부터 정제할 수 있다. 이어서, EdU를 함유하는 새로 합성된 DNA를 아지드-다이설파이드-비오틴 링커와의 클릭 반응을 통해 비오틴으로 표지한다. 비오틴으로 표지된 후에는, 새로 합성된 DNA를 스트렙타비딘-접합된 비드에 의해 포획한다. 비드를 세척한 후에, 다이티오트레이톨(DTT)을 첨가하여 DNA를 비드로부터 유리시킨다. DNA를 생성한 세균을 확인하기 위하여, 서열분석 라이브러리를 표준 방법(예를 들어, PCR 라이브러리 증폭을 동반하는 Illumina Nextera DNA Flex)을 사용하여 제조하고, 이어서 서열분석한다. 서열의 생물정보학적 분석은 패혈증-유발 세균의 정체를 밝혀준다.
살아있는 미생물을 함유하는 샘플에서 미생물 유전자 발현을 신속하게 분석하기 위한 예시적인 방법. 본 발명의 방법 및 기술은 또한 살아있는 미생물을 함유하는 샘플에서 미생물 유전자 발현을 신속하게 분석하는 데 사용될 수 있다(도 2). EdU와 함께 배양하는 대신에, 샘플을 5-에티닐-우리딘(EU)과 함께 배양하고, 이어서 이를 새로 합성된 미생물 RNA 내로 도입시킨다. RNA의 비오틴 표지화 및 스트렙타비딘-기반 정제 후에, RNA를 cDNA로 역전사시킨다. cDNA로부터, 서열분석 라이브러리를 제조한다. 이어서, 서열분석 및 생물정보학적 분석은 샘플 내의 살아있는 미생물의 유전자 발현을 밝혀준다. 이러한 유전자 발현 분석은 질병 표현형을 야기하는 유전자를 확인하거나 또는 미생물이 항생제에 반응하고 있는지의 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 유전자 발현에 대한 정보에 더하여, RNA 서열 분석이 또한 균주를 확인하는 데 사용될 수 있다. RNA는 살아있는 비증식성 미생물에서 합성되기 때문에, RNA 분석은 생존가능하지만 배양 상태에서 복제되고 있지는 않은 오염성 또는 감염성 미생물을 확인할 수 있었다.
본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 변형들이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시 형태들이 하기의 청구범위의 범주 내에 있다.

Claims (77)

  1. 샘플 내의 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 확인 및 분석을 위한 방법으로서,
    (a) 하나 이상의 유형의 미생물을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 샘플을 획득하는 단계;
    (b) 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 상기 샘플을 인큐베이션하는 단계 - 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 새로 합성된 미생물 핵산 내로 도입됨 -;
    (c) 상기 새로 합성된 미생물 핵산을 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 선택적으로 결합하거나 그와 선택적으로 결합하는 표지화 시약과 접촉시킴으로써 상기 새로 합성된 미생물 핵산을 표지하는 단계;
    (d) 상기 표지된 새로 합성된 미생물 핵산을 단리하거나 정제하는 단계; 및
    (e) 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 서열분석 또는 그의 정체(identity)의 결정에 기초하여 상기 샘플 내의 상기 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 정체를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 미생물 감염을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 획득되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 대상체는 패혈증을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (a)에 대하여, 상기 획득된 샘플은 비미생물 핵산을 선택적으로 제거하기 위하여 (b) 이전에 디호스팅(dehosting) 방법을 사용하여 처리되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 디호스팅 방법은
    비미생물 핵산을 제거하는 단계를 포함하며, 상기 단계는
    (a) 상기 획득된 샘플을 재조합 단백질과 접촉시킴으로써 비미생물 DNA를 선택적으로 절단하는 단계 - 상기 재조합 단백질은 히스톤(들)에 의해 결합된 비미생물 핵산에 또는 메틸화 CpG 잔기를 포함하는 비미생물 핵산에 선택적으로 결합하는 결합 도메인, 및 핵산을 절단하는 활성을 갖는 뉴클레아제 도메인을 포함함 -; 또는
    (b) 히스톤(들)에 의해 결합된 핵산에 선택적으로 결합하거나 또는 비미생물 핵산의 메틸화 CpG 잔기에 선택적으로 결합하는, 고체 기재에 결합된 친화성 작용제(affinity agent)의 사용에 의해 수행되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 환경 검사 현장으로부터 획득된 환경 샘플인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 환경 현장은 미생물 오염에 대해 검사 중인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 미생물 오염으로 의심되는 식료품으로부터 획득된 샘플인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 미생물은 세균, 진균, 바이러스, 조류(algae), 고세균, 및/또는 원생동물인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세균은 악티노미세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바르토넬라 헨셀라이(Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나(Bartonella quintana), 보드데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보르렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보르렐리아 가리니이(Borrelia garinii), 보르렐리아 아프젤리이(Borrelia afzelii), 보르렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캄필로박테르 제주니(Campylobacter jejuni), 클라미디아 뉴모니아이(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 코리네박테리움 디프테리아이(Corynebacterium diphtheriae), 엔테로콕쿠스 파이칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로콕쿠스 파이시움(Enterococcus faecium), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 하이모필루스 인플루엔자이(Haemophilus influenzae), 헬리코박테르 필로리(Helicobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 렙토스피라 산타로사이(Leptospira santarosai), 렙토스피라 웨일리이(Leptospira weilii), 렙토스피라 노구치이(Leptospira noguchii), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 미코박테리움 레프라이(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 미코플라스마 뉴모니아이(Mycoplasma pneumoniae), 나이세리아 고노로에아이(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리케치아 리케치아(Rickettsia rickettsia), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토콕쿠스 아갈락티아이(Streptococcus agalactiae), 스트렙토콕쿠스 뉴모니아이(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 비브리오 콜레라이(Vibrio cholerae), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 및/또는 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로부터 선택되는, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 진균은 아브시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 아브시디아 라모세(Absidia ramose), 아코리온 갈리나이(Achorion gallinae), 악티노마두라 종(Actinomadura spp.), 아젤로미세스 데르마티디디스(Ajellomyces dermatididis), 알레우리스마 브라실리엔시스(Aleurisma brasiliensis), 알레르세리아 보이디이(Allersheria boydii), 아르트로데르마 종(Arthroderma spp.), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가투(Aspergillus fumigatu), 바시디오볼루스 종(Basidiobolus spp.), 블라스토미세스 종(Blastomyces spp.), 카도포라 종(Cadophora spp.), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 세르코스포라 아피이(Cercospora apii), 크리소스포리움 종(Chrysosporium spp.), 클라도스포리움 종(Cladosporium spp.), 클라도트릭스 아스테로이드스(Cladothrix asteroids), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 크립토콕쿠스 알비두스(Cryptococcus albidus), 크립토콕쿠스 가티이(Cryptococcus gattii), 크립토콕쿠스 라우렌티이(Cryptococcus laurentii), 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 쿠닝하멜라 엘레간스(Cunninghamella elegans), 데마티움 웨르넥케(Dematium wernecke), 디스코미세스 이스라엘리이(Discomyces israelii), 에몬시아 종(Emmonsia spp.), 에몬시엘라 캅술라테(Emmonsiella capsulate), 엔도미세스 게오트리쿰(Endomyces geotrichum), 엔토모프토라 코로나테(Entomophthora coronate), 에피데르모피톤 플록코숨(Epidermophyton floccosum), 필로바시디엘라 네오포르만스(Filobasidiella neoformans), 폰세카에아 종(Fonsecaea spp.), 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 글레노스포라 크하르토우멘시스(Glenospora khartoumensis), 김노아스쿠스 깁세우스(Gymnoascus gypseus), 하플로스포란기움 파르붐(Haplosporangium parvum), 히스토플라스마(Histoplasma), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 호르미스시움 데르마티디디스(Hormiscium dermatididis), 호르모덴드럼 종(Hormodendrum spp.), 케라티노미세스 종(Keratinomyces spp.), 란게로니아 소우다넨세(Langeronia soudanense), 렙토스파이리아 세네갈렌시스(Leptosphaeria senegalensis), 리크테이미아 코림비페라(Lichtheimia corymbifera), 로브미세스 로보이(Lobmyces loboi), 로보아 로보이(Loboa loboi), 로보미코시스(Lobomycosis), 마두렐라 종(Madurella spp.), 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur), 미크로콕쿠스 펠레티에리(Micrococcus pelletieri), 미크로스포룸 종(Microsporum spp.), 모닐리아 종(Monilia spp.), 무코르 종(Mucor spp.), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 난니지아 종(Nannizzia spp.), 네오테스투디나 로사티이(Neotestudina rosatii), 노카르디아 종(Nocardia spp.), 오이디움 알비칸스(Oidium albicans), 오오스포라 락티스(Oospora lactis), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 페트리엘리디움 보이디이(Petriellidium boydii), 피알로포라 종(Phialophora spp.), 피에드라이아 호르타이(Piedraia hortae), 피티로스포룸 푸르푸르(Pityrosporum furfur), 뉴모시스티스 지로벡시이(Pneumocystis jirovecii)(또는 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii)), 풀룰라리아 고우게로티이(Pullularia gougerotii), 피레노카이타 로메로이(Pyrenochaeta romeroi), 리노스포리디움 세에베리(Rhinosporidium seeberi), 사보우라우디테스(Sabouraudites)(미크로스포룸(Microsporum)), 사르토리아 푸미가테(Sartorya fumigate), 세페도니움(Sepedonium), 스포로트리쿰 종(Sporotrichum spp.), 스타키보트리스(Stachybotrys), 스타키보트리스 카르타룸(Stachybotrys chartarum), 스트렙토미세스 종(Streptomyces spp.), 티네아 종(Tinea spp.), 토룰라 종(Torula spp.), 트리코피톤 종(Trichophyton spp.), 트리코스포론 종(Trichosporon spp.), 및/또는 좁피아 로사티이(Zopfia rosatii)로부터 선택되는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 바이러스는 심플렉스바이러스(Simplexvirus), 바리셀로바이러스(Varicellovirus), 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 로세올로바이러스(Roseolovirus), 림포-크립토바이러스(Lympho-cryptovirus), 라디노바이러스(Rhadinovirus), 마스타데노바이러스(Mastadenovirus), α-파필로마바이러스(α-Papillomavirus), β-파필로마바이러스(β-Papillomavirus), Χ-파필로마바이러스(Χ-Papillomavirus), γ-파필로마바이러스(γ-Papillomavirus), 무파필로마바이러스(Mupapillomavirus), 누파필로마바이러스(Nupapillomavirus), 알파폴리오마바이러스(Alphapolyomavirus), 베타폴리오마바이러스(Betapolyomavirus), γ-폴리오마바이러스(γ-Polyomavirus), 델타폴리오마바이러스(Deltapolyomavirus), 몰루스시폭스바이러스(Molluscipoxvirus), 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus), 파라폭스바이러스(Parapoxvirus), α-토르쿠에바이러스(α-Torquevirus), β-토르쿠에바이러스(β-Torquevirus), γ-토르쿠에바이러스(γ-Torquevirus), 시클로바이러스(Cyclovirus), 게미시르쿨라르(Gemycircular), 게미키비바이러스(Gemykibivirus), 게미봉바이러스(Gemyvongvirus), 에리트로바이러스(Erythrovirus), 데펜도바이러스(Dependovirus), 보카바이러스(Bocavirus), 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus), 감마레트로바이러스(Gammaretrovirus), 델타레트로바이러스(Deltaretrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus), 시미이스푸마바이러스(Simiispumavirus), 콜티바이러스(Coltivirus), 로타바이러스(Rotavirus), 세아도르나바이러스(Seadornavirus), α-코로나바이러스(α-Coronavirus), β-코로나바이러스(β-Coronavirus), 토로바이러스(Torovirus), 마마스트로바이러스(Mamastrovirus), 노로바이러스(Norovirus), 사포바이러스(Sapovirus), 플라비바이러스(Flavivirus), 헤파시바이러스(Hepacivirus), 페기바이러스(Pegivirus), 오르토헤페바이러스(Orthohepevirus), 카르디오바이러스(Cardiovirus), 코사바이러스(Cosavirus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 헤파토바이러스(Hepatovirus), 코부바이러스(Kobuvirus), 파레코바이러스(Parechovirus), 로사바이러스(Rosavirus), 살리바이러스(Salivirus), 알파바이러스(Alphavirus), 루비바이러스(Rubivirus), 에볼라바이러스(Ebolavirus), 마르부르그바이러스(Marburgvirus), 헤니파바이러스(Henipavirus), 모르빌리바이러스(Morbilivirus), 레스피로바이러스(Respirovirus), 루불라바이러스(Rubulavirus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 오르토뉴모바이러스(Orthopneumovirus), 레단테바이러스(Ledantevirus), 리사바이러스(Lyssavirus), 베시쿨로바이러스(Vesiculovirus), 맘마레나바이러스(Mammarenavirus), 오르토한타바이러스(Orthohantavirus), 오르토나이로바이러스(Orthonairovirus), 오르토부니아바이러스(Orthobunyavirus), 플레보바이러스(Phlebovirus), α-인플루엔자바이러스(α-Influenzavirus), β-인플루엔자바이러스(β-Influenzavirus), γ-인플루엔자바이러스(γ-Influenzavirus), 쿠아란자바이러스(Quaranjavirus), 토고토바이러스(Thogotovirus), 및/또는 델타바이러스(Deltavirus)로부터 선택되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2-에티닐-아데노신, N6-프로파르길-아데노신, 2'-(O-프로파르길)-아데노신, 3'-(O-프로파르길)-아데노신, 5-에티닐-시티딘, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 2'-(O-프로파르길)-시티딘, 3'-(O-프로파르길)-시티딘, 2'-(O-프로파르길)-구아노신, 3'-(O-프로파르길)-구아노신, 5-에티닐-우리딘, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 2'-(O-프로파르길)-우리딘, 3'-(O-프로파르길)-우리딘, (2'S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 2'(S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 8-아지도-아데노신, N6-(6-아지도)헥실-2'데옥시-아데노신, 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 5-아지도메틸-우리딘, 5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사-펜타데카노일-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘, 5-(3-아지도프로필)-우리딘, 5-아지도-PEG4-우리딘, 5-아지도-PEG4-시티딘, 5-아지도-PEG4-2'-데옥시시티딘, 5-브로모-2'데옥시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도-2'데옥시우리딘, 및 5-요오도우리딘으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2-에티닐-아데노신, N6-프로파르길-아데노신, 2'-(O-프로파르길)-아데노신, 3'-(O-프로파르길)-아데노신, 5-에티닐-시티딘, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 2'-(O-프로파르길)-시티딘, 3'-(O-프로파르길)-시티딘, 2'-(O-프로파르길)-구아노신, 3'-(O-프로파르길)-구아노신, 5-에티닐-우리딘, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 2'-(O-프로파르길)-우리딘, 3'-(O-프로파르길)-우리딘, (2'S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 2'(S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 및 (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 8-아지도-아데노신, N6-(6-아지도)헥실-2'데옥시-아데노신으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 5-아지도메틸-우리딘, 5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사-펜타데카노일-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘, 5-(3-아지도프로필)-우리딘, 5-아지도-PEG4-우리딘, 5-아지도-PEG4-시티딘, 및 5-아지도-PEG4-2'-데옥시시티딘으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 5-브로모-2'데옥시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도-2'데옥시우리딘, 및 5-요오도우리딘으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 5분 내지 180분 동안 인큐베이션되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 샘플은 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 30분 내지 120분 동안 인큐베이션되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약은 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 높은 특이성으로 결합하는 항체인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항체는 5-브로모-2'데옥시우리딘, 또는 요오도데옥시우리딘에 높은 특이성으로 결합하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학(click chemistry), 변형된 [3+2] 부가환화 반응, 또는 스타우딩거 라이게이션(Staudinger ligation)을 통해 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하거나 그와 결합하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학을 통해 알키닐 기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하는 아지드 기를 포함하는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학을 통해 아지드 기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하는 알키닐 기를 포함하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약은 비오틴 기를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 비오틴 기를 포함하는 상기 표지화 시약은 하기로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00021
    ,
    Figure pct00022
    ,
    Figure pct00023
    ,
    Figure pct00024
    ,
    및
    Figure pct00025
    .
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약은 화학적으로 절단가능한 링커 또는 효소적으로 절단가능한 링커를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 산-불안정성(acid labile)-기반 링커 또는 다이설파이드-기반 링커인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 산-불안정성-기반 링커는 하이드라존 또는 시스-아코니틸 기를 포함하는, 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 효소적으로 절단가능한 링커는 펩티드-기반 링커 또는 β-글루쿠로니드-기반 링커를 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 풀다운 작용제(pulldown agent)가 상기 표지된 새로 합성된 미생물 핵산을 단리하거나 정제하는 데 사용되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 풀다운 시약은 고체 지지체 상에 고정화된 항체이며, 상기 항체는 표지화 시약에 높은 특이성으로, 또는 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 높은 특이성으로 결합하는, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 풀다운 시약은 고체 지지체 상에 고정화된 스트렙타비딘 또는 아비딘이고, 상기 표지화 시약은 비오틴 기를 포함하는, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 고체 지지체는 나노- 또는 마이크로-재료, 비드 또는 플레이트인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약 또는 표지는 제1항의 (e) 이전에 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산으로부터 제거되거나 절단되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 정체는 상이한 미생물로부터의 핵산에 대한 프로브를 포함하는 마이크로어레이(microarray)를 사용함으로써 결정되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 정체는 하기 단계들에 의해 결정되는, 방법:
    (i) 표지된 산물을 형성하도록 형광 염료를 함유하는 프라이머를 사용하는 제1 PCR-기반 방법을 사용하여 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 증폭시키는 단계 - 상기 프라이머는 보존된 미생물 16S rRNA 유전자 영역에 특이적인 서열을 포함함 -;
    (ii) 상기 표지된 산물을 20개 이상의 미생물로부터의 특유의 16s rRNA 가변 영역 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 마이크로어레이에 적용하는 단계;
    (iii) 형광 혼성화 산물에 대한 상기 마이크로어레이의 이미징에 기초하여 상기 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 정체를 결정하는 단계 및 상기 마이크로어레이 프로브의 서열에 기초하여 상기 미생물의 정체를 결정하는 단계.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 정체는 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 서열분석함으로써 결정되거나 확인되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산은 트랜스포좀-기반 서열분석 방법을 사용하여 서열분석되는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 서열분석은 하기 단계들에 의해 행해지는, 방법:
    (a) 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 비드-연결된 트랜스포좀에 적용하는 단계 - 상기 비드-연결된 트랜스포좀은 미생물 핵산의 단편화 및 서열분석용 프라이머의 부가를 동시에 매개함 -;
    (b) 상기 미생물 핵산 단편을 인덱스 및 어댑터 서열을 포함하는 프라이머로 증폭시켜, 증폭된 산물들의 라이브러리를 형성하는 단계;
    (c) 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 세척하고 풀링하는 단계;
    (d) 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 서열분석하는 단계; 및
    (e) 생물정보학적 분석을 사용하여, 상기 증폭된 산물들의 라이브러리로부터 획득된 서열을 미생물의 기지의 서열의 데이터베이스와 상관시킨 것에 기초하여 상기 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 정체를 결정하는 단계.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 새로 합성된 미생물 핵산은 RNA이며, 상기 미생물 RNA는 제1항의 (e) 이전에 cDNA로 역전사되고, 상기 생존가능한 및/또는 증식성 미생물의 유전자 발현은 서열분석에 의해 그리고/또는 마이크로어레이를 사용하여 새로 합성된 미생물 RNA로부터의 유전자 산물의 발현 수준을 분석하는 것에 기초하여 결정될 수 있는, 방법.
  41. 샘플 내의 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 있어서의 항미생물제의 유효성을 결정하기 위한 방법으로서,
    (a) 하나 이상의 유형의 미생물을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 샘플을 획득하는 단계;
    (b) 상기 샘플을 2개의 샘플, 즉 대조군 샘플 및 처리된 샘플로 나누는 단계;
    (c) 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 상기 대조군 샘플을 인큐베이션하는 단계 - 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 새로 합성된 미생물 핵산 내로 도입됨 -;
    (c') 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 및 항미생물제의 존재 하에서 상기 처리된 샘플을 인큐베이션하는 단계 - 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 새로 합성된 미생물 핵산 내로 도입됨 -;
    (d) 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플의 상기 새로 합성된 미생물 핵산을 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 선택적으로 결합하거나 그와 선택적으로 결합하는 표지화 시약과 접촉시킴으로써 상기 새로 합성된 미생물 핵산을 표지하는 단계;
    (e) 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플로부터 상기 표지된 새로 합성된 미생물 핵산을 단리하거나 정제하는 단계;
    (f) 상기 대조군 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 또는 정체를 결정하는 단계;
    (f') 상기 처리된 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및 정체를 결정하는 단계; 및
    (g) 상기 대조군 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및/또는 정체에 있어서의 어떠한 변화를 상기 처리된 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 또는 정체와 비교하고 결정하는 단계를 포함하며,
    상기 대조군 샘플과 대비하여 상기 처리된 샘플 내의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준이 감소되거나, 또는 상기 대조군 샘플과 대비하여 상기 처리된 샘플 내의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 양 및/또는 정체가 감소되는 경우, 이는 상기 항미생물제가 상기 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 효과적임을 나타내는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 항미생물제는 항생제, 항진균제, 및 항바이러스제로부터 선택되는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 항생제는 아목시실린, 암피실린, 박암피실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 피페라실린, 피밤피실린, 피브메실리남, 티카르실린, 세파세트릴, 세파드록실, 세팔렉신, 세팔로글리신, 세팔로늄, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파피린, 세파트리진, 세파자플루르, 세파제돈, 세파졸린, 세프라딘, 세프록사딘, 세프테졸, 세파클로르, 세팜만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프프로질, 세푸록심, 세푸조남, 세프카펜, 세프달록심, 세프디니르, 세프디토렌, 세페타메트, 세픽심, 세프메녹심, 세포디짐, 세포탁심, 세프피미졸, 세프포독심, 세프테람, 세프티부텐, 세프티오푸르, 세프티올렌, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 세프타지딤, 세프클리딘, 세페핌, 세플루프레남, 세포셀리스, 세포조프란, 세프피롬, 세프퀴놈, 세프토비프롤, 세프타롤린, 세파클로메진, 세팔로람, 카파파롤, 세프카넬, 세페드롤로르, 세펨피돈, 세페트리졸, 세피비트릴, 세프마틸렌, 세프메피듐, 세포벡신, 세폭사졸, 세프로틸, 세푸수미드, 세푸라세팀, 세프티옥사이드, 아즈트레오남, 이미페넴, 도리페넴, 에르타페넴, 메로페넴, 아지트로마이신, 에리트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 록시트로마이신, 텔리트로마이신, 클린다마이신, 린코마이신, 아미카신, 젠타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 플루메퀸, 날리딕산, 옥솔린산, 피로미드산, 피페미드산, 로속사신, 시프로플록사신, 에녹사신, 로메플록사신, 나디플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 페플록사신, 루플록사신, 발로플록사신, 가티플록사신, 그레파플록사신, 레보플록사신, 목시플록사신, 파주플록사신, 스파르플록사신, 테마플록사신, 토수플록사신, 베시플록사신, 델라플록사신, 클리나플록사신, 제미플록사신, 프룰리플록사신, 시타플록사신, 트로바플록사신, 설파메티졸, 설파메톡사졸, 설피속사졸, 트리메토프림-설파메톡사졸, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린, 티게사이클린, 반코마이신, 테이코플라닌, 텔라반신, 리네졸리드, 사이클로세린, 리팜핀, 리파부틴, 리파펜틴, 리팔라질, 비오마이신, 카프레오마이신, 박시트라신, 폴리믹신 B, 클로람페니콜, 메트로니다졸, 티니다졸, 및 니트로푸란토인으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 항진균제는 아모롤핀, 부테나핀, 나프티핀, 테르비나핀, 비포나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 펜티코나졸, 케토코나졸, 이소코나졸, 룰리코나졸, 미코나졸, 오모코나졸, 옥시코나졸, 세르타코나졸, 설코나졸, 티오코나졸, 테르코나졸, 알바코나졸, 에피나코나졸, 플루코나졸, 이사부코나졸, 이트라코나졸, 포사코나졸, 라부코나졸, 테르코나졸, 보리코나졸, 아바펀진, 암포테리신 B, 니스타틴, 나타마이신, 트리코마이신, 아니둘라펀진, 카스포펀진, 미카펀진, 톨나프테이트, 플루시토신, 부테나핀, 그리세오풀빈, 시클로피록스, 황화셀레늄, 타바보롤로부터 선택되는, 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 항바이러스제는 아시클로비르, 브리부딘, 도코사놀, 팜시클로비르, 포스카르넷, 이독수리딘, 펜시클로비르, 트리플루리딘, 비다라빈, 시타라빈, 발아시클로비르, 트로마탄딘, 프리텔리비르, 아만타딘, 리만타딘, 오셀타미비르, 페라미비르, 자나미비르, 아수나프레비르, 보세프레비르, 실루프레비르, 다노프레비르, 팔다프레비르, 글레카프레비르, 그라조프레비르, 나를라프레비르, 파리타프레비르, 시메프레비르, 소바프레비르, 텔라프레비르, 바니프레비르, 베드로프레비르, 복실라프레비르, 다클라타스비르, 엘바스비르, 레디파스비르, 오달라스비르, 옴비타스비르, 피브렌타스비르, 라비다스비르, 루자스비르, 사마타스비르, 벨파타스비르, 베클라부비르, 다사부비르, 델레오부비르, 필리부비르, 세트로부비르, 소포스부비르, 라달부비르, 우프리포스부비르, 라미부딘, 텔비부딘, 클레부딘, 아데포비르, 테노프비르 디소프록실, 테노포비르 알라페나미드, 엔푸비르티드, 마라비록, 비크리비록, 세니크리비록, PRO 140, 이발리주맙, 포스템사비르, 디다노신, 엠트리시타빈, 라미부딘, 스타부딘, 지도부딘, 암독소비르, 아프리시타빈, 센사부딘, 엘부시타빈, 라시비르, 스탐피딘, 4'-에티닐-2-플루오로-2'-데옥시아데노신, 잘시타빈, 에파비렌즈, 네비라핀, 델라비르딘, 에트라비린, 릴피비린, 도라비린, 돌루테그라비르, 엘비테그라비르, 랄테그라비르, BI 224436, 카보테그라비르, 빅테그라비르, MK-2048, 베비리마트, BMS-955176, 암프레나비르, 포삼프레나비르, 인디나비르, 로피나비르, 넬피나비르, 리토나비르, 사퀴나비르, 아타자나비르, 다루나비르, 티프라나비르, 돌루테그라비르, 엘비테그라비르, 랄테그라비르, BI 224436, 카보테그라비르, 빅테그라비르, MK-2048, 코비시스타트, 리토나비르, 인터페론-α, 페그인터페론-α, 메티사존, 리팜피신, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 포도필로톡신, 포미비르센, 시도포비르, 플레코나릴, 파비피라비르, 갈리데시비르, 렘데시비르, 메리시타빈, MK-608, NITD008, 모록시딘, 트로만타딘, 및 트리아자비린으로부터 선택되는, 방법.
    [청구항 45]
    제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 미생물 감염을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 획득되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 대상체는 패혈증을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는, 방법.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 미생물은 세균, 진균, 및/또는 바이러스인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 세균은 악티노미세스 이스라엘리이, 바실루스 안트라시스, 바실루스 세레우스, 바르토넬라 헨셀라이, 바르토넬라 퀸타나, 보드데텔라 페르투시스, 보르렐리아 부르그도르페리, 보르렐리아 가리니이, 보르렐리아 아프젤리이, 보르렐리아 레쿠렌티스, 브루셀라 아보르투스, 브루셀라 카니스, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 캄필로박테르 제주니, 클라미디아 뉴모니아이, 클라미디아 트라코마티스, 클라미도필라 프시타시, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 디피실레, 클로스트리디움 페르프린겐스, 클로스트리디움 테타니, 코리네박테리움 디프테리아이, 엔테로콕쿠스 파이칼리스, 엔테로콕쿠스 파이시움, 에스케리키아 콜리, 프란시셀라 툴라렌시스, 하이모필루스 인플루엔자이, 헬리코박테르 필로리, 레지오넬라 뉴모필라, 렙토스피라 인테로간스, 렙토스피라 산타로사이, 렙토스피라 웨일리이, 렙토스피라 노구치이, 리스테리아 모노시토게네스, 미코박테리움 레프라이, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 미코박테리움 울세란스, 미코플라스마 뉴모니아이, 나이세리아 고노로에아이, 나이세리아 메닝기티디스, 슈도모나스 아에루기노사, 리케치아 리케치아, 살모넬라 티피, 살모넬라 티피무리움, 시겔라 손네이, 스타필로콕쿠스 아우레우스, 스타필로콕쿠스 에피데르미디스, 스타필로콕쿠스 사프로피티쿠스, 스트렙토콕쿠스 아갈락티아이, 스트렙토콕쿠스 뉴모니아이, 스트렙토콕쿠스 피오게네스, 트레포네마 팔리둠, 우레아플라스마 우레아리티쿰, 비브리오 콜레라이, 예르시니아 페스티스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 및/또는 예르시니아 슈도투베르쿨로시스로부터 선택되는, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 진균은 아브시디아 코림비페라, 아브시디아 라모세, 아코리온 갈리나이, 악티노마두라 종, 아젤로미세스 데르마티디디스, 알레우리스마 브라실리엔시스, 알레르세리아 보이디이, 아르트로데르마 종, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 푸미가투, 바시디오볼루스 종, 블라스토미세스 종, 카도포라 종, 칸디다 알비칸스, 세르코스포라 아피이, 크리소스포리움 종, 클라도스포리움 종, 클라도트릭스 아스테로이드스, 콕시디오이데스 이미티스, 크립토콕쿠스 알비두스, 크립토콕쿠스 가티이, 크립토콕쿠스 라우렌티이, 크립토콕쿠스 네오포르만스, 쿠닝하멜라 엘레간스, 데마티움 웨르넥케, 디스코미세스 이스라엘리이, 에몬시아 종, 에몬시엘라 캅술라테, 엔도미세스 게오트리쿰, 엔토모프토라 코로나테, 에피데르모피톤 플록코숨, 필로바시디엘라 네오포르만스, 폰세카에아 종, 게오트리쿰 칸디둠, 글레노스포라 크하르토우멘시스, 김노아스쿠스 깁세우스, 하플로스포란기움 파르붐, 히스토플라스마, 히스토플라스마 캅술라툼, 호르미스시움 데르마티디디스, 호르모덴드럼 종, 케라티노미세스 종, 란게로니아 소우다넨세, 렙토스파이리아 세네갈렌시스, 리크테이미아 코림비페라, 로브미세스 로보이, 로보아 로보이, 로보미코시스, 마두렐라 종, 말라세지아 푸르푸르, 미크로콕쿠스 펠레티에리, 미크로스포룸 종, 모닐리아 종, 무코르 종, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 난니지아 종, 네오테스투디나 로사티이, 노카르디아 종, 오이디움 알비칸스, 오오스포라 락티스, 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스, 페트리엘리디움 보이디이, 피알로포라 종, 피에드라이아 호르타이, 피티로스포룸 푸르푸르, 뉴모시스티스 지로벡시이(또는 뉴모시스티스 카리니이), 풀룰라리아 고우게로티이, 피레노카이타 로메로이, 리노스포리디움 세에베리, 사보우라우디테스(미크로스포룸), 사르토리아 푸미가테, 세페도니움, 스포로트리쿰 종, 스타키보트리스, 스타키보트리스 카르타룸, 스트렙토미세스 종, 티네아 종, 토룰라 종, 트리코피톤 종, 트리코스포론 종, 및/또는 좁피아 로사티이로부터 선택되는, 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 바이러스는 심플렉스바이러스, 바리셀로바이러스, 시토메갈로바이러스, 로세올로바이러스, 림포-크립토바이러스, 라디노바이러스, 마스타데노바이러스, α-파필로마바이러스, β-파필로마바이러스, Χ-파필로마바이러스, γ-파필로마바이러스, 무파필로마바이러스, 누파필로마바이러스, 알파폴리오마바이러스, 베타폴리오마바이러스, γ-폴리오마바이러스, 델타폴리오마바이러스, 몰루스시폭스바이러스, 오르토폭스바이러스, 파라폭스바이러스, α-토르쿠에바이러스, β-토르쿠에바이러스, γ-토르쿠에바이러스, 시클로바이러스, 게미시르쿨라르, 게미키비바이러스, 게미봉바이러스, 에리트로바이러스, 데펜도바이러스, 보카바이러스, 오르토헤파드나바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 렌티바이러스, 시미이스푸마바이러스, 콜티바이러스, 로타바이러스, 세아도르나바이러스, α-코로나바이러스, β-코로나바이러스, 토로바이러스, 마마스트로바이러스, 노로바이러스, 사포바이러스, 플라비바이러스, 헤파시바이러스, 페기바이러스, 오르토헤페바이러스, 카르디오바이러스, 코사바이러스, 엔테로바이러스, 헤파토바이러스, 코부바이러스, 파레코바이러스, 로사바이러스, 살리바이러스, 알파바이러스, 루비바이러스, 에볼라바이러스, 마르부르그바이러스, 헤니파바이러스, 모르빌리바이러스, 레스피로바이러스, 루불라바이러스, 메타뉴모바이러스, 오르토뉴모바이러스, 레단테바이러스, 리사바이러스, 베시쿨로바이러스, 맘마레나바이러스, 오르토한타바이러스, 오르토나이로바이러스, 오르토부니아바이러스, 플레보바이러스, α-인플루엔자바이러스, β-인플루엔자바이러스, γ-인플루엔자바이러스, 쿠아란자바이러스, 토고토바이러스, 및/또는 델타바이러스로부터 선택되는, 방법.
  51. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2-에티닐-아데노신, N6-프로파르길-아데노신, 2'-(O-프로파르길)-아데노신, 3'-(O-프로파르길)-아데노신, 5-에티닐-시티딘, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 2'-(O-프로파르길)-시티딘, 3'-(O-프로파르길)-시티딘, 2'-(O-프로파르길)-구아노신, 3'-(O-프로파르길)-구아노신, 5-에티닐-우리딘, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 2'-(O-프로파르길)-우리딘, 3'-(O-프로파르길)-우리딘, (2'S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 2'(S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 8-아지도-아데노신, N6-(6-아지도)헥실-2'데옥시-아데노신, 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 5-아지도메틸-우리딘, 5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사-펜타데카노일-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘, 5-(3-아지도프로필)-우리딘, 5-아지도-PEG4-우리딘, 5-아지도-PEG4-시티딘, 5-아지도-PEG4-2'-데옥시시티딘, 5-브로모-2'데옥시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도-2'데옥시우리딘, 및 5-요오도우리딘으로부터 선택되는, 방법.
  52. 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2-에티닐-아데노신, N6-프로파르길-아데노신, 2'-(O-프로파르길)-아데노신, 3'-(O-프로파르길)-아데노신, 5-에티닐-시티딘, 5-에티닐-2'-데옥시시티딘, 2'-(O-프로파르길)-시티딘, 3'-(O-프로파르길)-시티딘, 2'-(O-프로파르길)-구아노신, 3'-(O-프로파르길)-구아노신, 5-에티닐-우리딘, 5-에티닐-2'-데옥시우리딘, 2'-(O-프로파르길)-우리딘, 3'-(O-프로파르길)-우리딘, (2'S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 2'(S)-2'-데옥시-2'-플루오로-5-에티닐우리딘, 및 (2'S)-2'-플루오로-5-에티닐우리딘으로부터 선택되는, 방법.
  53. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 8-아지도-아데노신, N6-(6-아지도)헥실-2'데옥시-아데노신으로부터 선택되고, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 2'-아지도-2'-데옥시아데노신, 5-아지도메틸-우리딘, 5-(15-아지도-4,7,10,13-테트라옥사-펜타데카노일-아미노알릴)-2'-데옥시우리딘, 5-(3-아지도프로필)-우리딘, 5-아지도-PEG4-우리딘, 5-아지도-PEG4-시티딘, 및 5-아지도-PEG4-2'-데옥시시티딘으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 5-브로모-2'데옥시우리딘, 5-브로모우리딘, 5-요오도-2'데옥시우리딘, 및 5-요오도우리딘으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플은 둘 모두 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 5분 내지 180분 동안 동일한 기간 동안 인큐베이션되는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플은 둘 모두 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 존재 하에서 30분 내지 120분 동안 동일한 기간 동안 인큐베이션되는, 방법.
  57. 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약은 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 높은 특이성으로 결합하는 항체인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 항체는 5-브로모-2'데옥시우리딘, 또는 요오도데옥시우리딘에 높은 특이성으로 결합하는, 방법.
  59. 제41항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학, 변형된 [3+2] 부가환화 반응, 또는 스타우딩거 라이게이션을 통해 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하거나 그와 결합하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학을 통해 알키닐 기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하는 아지드 기를 포함하는, 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 표지화 시약은 클릭 화학을 통해 아지드 기를 포함하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 결합하는 알키닐 기를 포함하는, 방법.
  62. 제41항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약은 비오틴 기를 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 비오틴 기를 포함하는 상기 표지화 시약은 하기로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00026
    ,
    Figure pct00027
    ,
    Figure pct00028
    ,
    Figure pct00029
    ,
    및
    Figure pct00030
    .
    [청구항 63]
    제41항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약은 화학적으로 절단가능한 링커 또는 효소적으로 절단가능한 링커를 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 절단가능한 링커는 산-불안정성-기반 링커 또는 다이설파이드-기반 링커인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 산-불안정성-기반 링커는 하이드라존 또는 시스-아코니틸 기를 포함하는, 방법.
  66. 제63항에 있어서, 상기 효소적으로 절단가능한 링커는 펩티드-기반 링커 또는 β-글루쿠로니드-기반 링커를 포함하는, 방법.
  67. 제41항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 풀다운 작용제가 상기 표지된 새로 합성된 미생물 핵산을 단리하거나 정제하는 데 사용되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 풀다운 시약은 고체 지지체 상에 고정화된 항체이며, 상기 항체는 표지화 시약에 높은 특이성으로, 또는 상기 하나 이상의 유형의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 높은 특이성으로 결합하는, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 풀다운 시약은 고체 지지체 상에 고정화된 스트렙타비딘 또는 아비딘이고, 상기 표지화 시약은 비오틴 기를 포함하는, 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 고체 지지체는 나노- 또는 마이크로-재료, 비드 또는 플레이트인, 방법.
  71. 제41항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화 시약 또는 표지는 제42항의 (f), (f') 및 (g) 이전에 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산으로부터 제거되거나 절단되는, 방법.
  72. 제41항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및/또는 정체를 결정하는 것은 상이한 미생물로부터의 핵산에 대한 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 사용함으로써 결정되는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 대조군 샘플 및 상기 처리된 샘플 내의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및/또는 정체를 결정하는 것은
    (i) 표지된 산물을 형성하도록 형광 염료를 함유하는 프라이머를 사용하는 제1 PCR-기반 방법을 사용하여 상기 대조군 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 증폭시키는 단계 - 상기 프라이머는 보존된 미생물 16S rRNA 유전자 영역에 특이적인 서열을 포함함 -;
    (i') 표지된 산물을 형성하도록 상기 형광 염료를 함유하는 프라이머를 사용하는 상기 제1 PCR-기반 방법을 사용하여 상기 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 증폭시키는 단계 - 상기 프라이머는 보존된 미생물 16S rRNA 유전자 영역에 특이적인 서열을 포함함 -;
    (ii) 상기 대조군 샘플로부터의 상기 표지된 산물을 20개 이상의 미생물로부터의 특유의 16s rRNA 가변 영역 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 제1 마이크로어레이에 적용하는 단계;
    (ii') 상기 처리된 샘플로부터의 상기 표지된 산물을 제2 마이크로어레이에 적용하는 단계 - 상기 제2 마이크로어레이는 상기 제1 마이크로어레이의 복제물(duplicate)임 -; 및
    (iii) 형광 혼성화 산물에 대한 상기 제1 마이크로어레이의 이미징 및 상기 제2 마이크로어레이의 이미징에 기초하여 상기 샘플 내의 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 있어서의 항미생물제의 유효성을 결정하는 단계 및 상기 마이크로어레이들 사이에 상기 형광 혼성화 산물의 강도, 위치, 또는 부재에 관하여 어떠한 변화가 있는지를 결정하는 단계에 의해 행해지며,
    상기 제1 마이크로어레이와 상기 제2 마이크로어레이 사이에 상기 형광 혼성화 산물의 강도가 감소되는 경우, 또는 제1 마이크로어레이와 제2 마이크로어레이 사이에 형광 혼성화 산물의 위치 또는 부재에 관하여 변화가 있는 경우, 이는 상기 항미생물제가 상기 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 효과적임을 나타내는, 방법.
  74. 제41항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내의 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 있어서의 항미생물제의 유효성은 상기 대조군 샘플로부터의 그리고 상기 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 서열분석함으로써 결정되거나 확인되며,
    상기 대조군 샘플과 대비하여 상기 처리된 샘플 내의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준이 감소되거나, 또는 상기 대조군 샘플과 대비하여 상기 처리된 샘플 내의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 양 및/또는 정체가 감소되는 경우, 이는 상기 항미생물제가 상기 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 효과적임을 나타내는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산은 트랜스포좀-기반 서열분석 방법을 사용하여 서열분석되는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 서열분석은 하기 단계들에 의해 행해지는, 방법:
    (a) 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산을 비드-연결된 트랜스포좀에 적용하는 단계 - 상기 비드-연결된 트랜스포좀은 미생물 핵산의 단편화 및 서열분석용 프라이머의 부가를 동시에 매개함 -;
    (b) 상기 미생물 핵산 단편을 인덱스 및 어댑터 서열을 포함하는 프라이머로 증폭시켜, 증폭된 산물들의 라이브러리를 형성하는 단계;
    (c) 상기 대조군 샘플로부터의 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 세척하고 풀링하는 단계;
    (c') 상기 처리된 샘플로부터의 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 세척하고 풀링하는 단계;
    (d) 상기 대조군 샘플로부터의 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 서열분석하는 단계;
    (d') 상기 처리된 샘플로부터의 상기 증폭된 산물들의 라이브러리를 서열분석하는 단계; 및
    (e) 생물정보학적 분석의 사용에 기반하여, 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 단리되거나 정제된 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준 및/또는 양 및/또는 정체에 있어서의 어떠한 변화를 결정하는 단계.
  77. 제41항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 새로 합성된 미생물 핵산은 RNA이며, 상기 미생물 RNA는 제41항의 (f), (f') 및 (g) 이전에 cDNA로 역전사되고, 상기 미생물(들)의 성장 및 증식을 조절하는 데 있어서의 항미생물제의 유효성은 서열분석에 의해 그리고/또는 마이크로어레이를 사용함으로써 상기 대조군 샘플 및 처리된 샘플로부터의 상기 새로 합성된 미생물 핵산의 유전자 발현 수준에 있어서의 변화를 결정하는 것에 기초하여 결정될 수 있는, 방법.
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