WO2012062043A1 - 神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法 - Google Patents

神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a neuronal amide production promoting agent and/or a glucosylceramide production promoting agent capable of promoting skin production of ceramide and/or glucosylceramide. More particularly, the present invention relates to the production of a ceramide and/or glucosylceramide production promoter capable of promoting skin production of ceramide and/or glucosylceramide by using a specific microorganism, a by-product okara of a food processing industry or the like as a main raw material of a culture medium. method. Background technique
  • the skin has the ability to produce ceramide and glucosylceramide.
  • Ceramide synthesized by epidermal cells is secreted in the skin, especially in the cuticle of the epidermis, and is a major component of intercellular lipids. Ceramide, one of the sphingolipids, is present in the stratum corneum of the skin and accounts for about 50% of the intercellular lipids in the stratum corneum.
  • Sphingolipid is a generic term for a complex lipid having a sphingosine skeleton.
  • Glucosylceramide is a sphingolipid that combines glucose with ceramide.
  • the ceramide synthesized by epidermal cells is temporarily stored in the form of glucosylceramide or sphingomyelin; it is then excreted outside the cell, in glucocerebrosidase and neurophospholipidase (sphingomyelinase). Under the action of ceramide, ceramide is formed again, thereby functioning as an intercellular lipid. Ceramide and glucosylceramide in the skin have physiological effects such as moisturizing function of the skin and barrier function of the skin.
  • Patent Documents 1 to 2 It has been known that sphingolipids such as ceramide, glucosylceramide, and galactosylceramide have effects of promoting the retention of water in the stratum corneum and improving skin roughness (Patent Documents 1 to 2). Although the skin has the ability to produce ceramide and glucosylceramide, the skin tends to become dry due to environmental, climatic, and the like. Therefore, it is not sufficient to produce ceramide by the skin itself to improve the moisturizing function of the skin.
  • Patent Document 3 describes a method for producing glucosylceramide by culturing Candida tropicalis (Owifefe tropicalis) JPCCY0004 strain (NITE P-570) by using Candida (0«3 ⁇ 43 ⁇ 4) It can be applied to the dry skin of the human body to improve the skin. Skin moisturizing function.
  • this method is not a method for ceramide and/or glucosylceramide production promoter, but merely obtains a large amount of glucosylceramide present directly from the cultured cells, and thus the nerve of the synthesized glucosylceramide
  • the amide skeleton is different from the ceramide skeleton of ceramides present in the human body, and has carbon-carbon double bonds at two places and has a branch. Therefore, when such glucosylceramide directly extracted from microorganisms is applied to human skin, there is a possibility that it cannot be adapted to human skin and causes problems in use safety.
  • the method of supplementing ceramide to the skin from the outside has a problem that the moisturizing effect is insufficient in persistence as in the conventionally used moisturizing agent, and the skin in some cases is insufficiently absorbed by the externally supplied ceramide or the like, thereby failing to be performed. Give full play to your moisturizing effect.
  • Patent Document 7 discloses a ceramide synthesis promoter capable of activating ceramide synthesis of epidermal cells themselves in the surface layer of the skin, which comprises a bacterium culture containing nicotinic acid and/or nicotinamide as an active ingredient.
  • the culture of the bacterium may be a lactic acid bacteria culture, a bifidobacterium culture, a lentinus bacillus culture or a yeast culture.
  • the ceramide production amount of the lactic acid bacteria culture or the yeast culture (Comparative Example ⁇ 4) containing no nicotinic acid and/or nicotinamide was not significantly changed from the control group.
  • the ceramide synthesis promoter substantially contains nicotinic acid and/or nicotinamide as an active ingredient, and the effect of promoting ceramide synthesis is not sufficient, and there is still room for improvement.
  • the medium used in the preparation of the accelerator substantially contains nicotinic acid and/or nicotinamide as an active ingredient, the preparation cost of the ceramide synthesis accelerator is high.
  • yeast is a single-celled fungus that is widely distributed in nature and is mainly grown in a slightly acidic, sugary environment. Can survive in an oxygen-deficient environment. Can be used for brewing production.
  • yeasts including yeasts of the genus iSchizosaccharomyces, yeast of the genus Pichia, Candida, yeast of Debaryomyces, and iCryptococcus.
  • Schizosaccharomyces Schi noodles ccharomyces yeast has long been used in food processing, which produces ethanol and is also used as a research material for biology.
  • Pichia genus yeast has the following properties, uses, and the like.
  • Pichia cell lines are spherical, elliptical, elongated, occasionally conical, but do not form a apex.
  • Asexual reproduction is a multilateral budding, and some species can form spores.
  • Each ascus usually contains 1 to 4 ascospores, occasionally more than 4.
  • the spores are cap-shaped, hemispherical or spherical.
  • Both hyphae and pseudohyphae can be used as ascospores, but the morphology does not become large or become spindle-shaped, with the same or different combinations; can be assimilated nitrate, DBB reaction is negative.
  • Pichia The taxonomic status of Pichia is: Ascomycetes (o? > ⁇ to), Semi-Ascomycetes ⁇ Hemiascomycetes, Saccharomycetales, Saccharomycetaceae, Pichia (Combies czz') o).
  • Pichia iPichia is, for example, the use of methanol to produce useful substances such as antibiotics, biological proteins, etc.; or it can also be used as genetically engineered bacteria.
  • Pichia pastoris is used to produce reduced glutathione, and other Pichia pastoris are used to produce some proteins/enzymes.
  • Candida Ccmdick's microorganisms usually have the following uses: for example, Candida crudea (Candida valida is used to produce lipase, Candida tropicalis Candidametapsilosis, Candida utilis (cmdida utilis, etc.) produce Brewing, glycerin, edible yeast, organic acids, and enzyme preparations can also be used in the word industry; and, the microorganisms of Candida Ccmdida can also be used to treat waste from industrial and agricultural by-product processing industries, and to produce edible proteins.
  • the microorganism of Debaryomyces generally has the following industrial uses, for example, fermenting glucose to produce D-arabitol, or converting xylose into xylitol.
  • microorganisms of the genus Hansenula ficm la are capable of producing ethyl acetate, thereby increasing the flavor of the product, and thus are generally used in the wine making and food industries.
  • microorganisms of the genus Bulrush, Bi le are generally used for food fermentation, such as sausage fermentation.
  • Rhodotorula In addition, some studies have been conducted on the microorganisms of Rhodotorula. For example, certain species of the genus Rhodotorula have weak oxidation of hydrocarbons and can synthesize beta-carotene. For example, the sticky red yeast variety can oxidize terpene to produce fat, and the content can reach 50 ⁇ 60% of dry biomass. Under certain conditions, a-alanine and glutamic acid can also be produced, and the ability to produce methionine is also strong, up to 1% of dry biomass.
  • microorganisms of the sporozoite sporobolomyces are useful in industries such as accumulation of coenzyme Q10 in bacteria.
  • the microbes of Sporobo myces are also attracting attention as fungi for carotenoids, L-carnitine and other useful substances.
  • the microorganism of the genus Brettanomyces belongs to yeast, which is widely found in nature and usually multiplies in barrel storage to produce ethyl phenol. Therefore, in the wine industry, it is generally unpopular as a contaminating bacteria that destroys the aroma of beer, wine, and the like.
  • Yarrowia a microorganism such as rra 'a lipolytica, is known to be particularly useful for the production of polyunsaturated fatty acids (PUFAs).
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 61-260008
  • Patent Document 2 Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-271205
  • Patent Document 3 JP-A-2010-22217
  • Patent Document 4 Japanese Special Report No. 2005-194240
  • Patent Document 6 Japanese Special Feature No. 2010-150237
  • Patent Document 7 Japanese Patent Publication No. 9-194383 SUMMARY OF THE INVENTION
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems in the prior art, and an object thereof is to provide a method for producing a ceramide production promoter and/or a glucosylceramide production promoter at low cost and high efficiency.
  • the present inventors conducted intensive studies to solve the above-described technical problems, and as a result, found that: culturing yeast in a medium containing okara and sugar can obtain a ceramide production promoter and/or a glucosylceramide production promoter at low cost and high efficiency.
  • the invention has thus been completed.
  • the present invention provides a method for producing a ceramide production promoter and/or a glucosylceramide production promoter, wherein a yeast is cultured in a medium containing okara and a saccharide, and a ceramide production promoter is obtained from the supernatant thereof. And / or glucosylceramide production enhancer.
  • the present invention also relates to the use of a fermented extract of bean dregs for promoting the production of ceramide and/or glucose amide, which is obtained by culturing yeast in a medium containing okara.
  • the present invention also relates to the use of a fermented extract of bean dregs as a ceramide production promoter and/or a glucosylceramide production promoter, which is obtained by culturing yeast in a medium containing soybean dregs.
  • the present invention also relates to the use of a fermented extract of bean dregs for producing a ceramide production promoter and/or a glucosylceramide production promoter, wherein the fermented extract of the bean dregs is obtained by culturing yeast in a medium containing okara.
  • the yeast may be selected from the group consisting of the yeast of the genus Chinosaccharomyces, the yeast of the genus iPichia, the yeast of Candida ⁇ Can Canida, the yeast of Debaryomyces, the yeast of Cryptococcus i. Saccharomyces (Hans Let La yeast, B. ssp. Bid ra) Yeast, Rhodotorula yeast, Saccharomyces sp. iSporobolomyces yeast, Brettmomyces yeast, Yarrow (rraw) ⁇ ) At least any one of the yeasts.
  • a specific microorganism can be used and a readily available substance such as bean dregs can be used as a main raw material of the medium, whereby a ceramide production promoter and/or a glucosylceramide production promoter can be obtained inexpensively and efficiently.
  • the accelerator can effectively improve the skin's ability to produce ceramide/glucose ceramide, thereby effectively improving the skin's moisturizing ability.
  • yeast is cultured in a medium containing okara and saccharides, and a ceramide production promoter and/or a glucosylceramide production promoter is obtained from the supernatant.
  • the microorganism which can be used in the production of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention may be selected from the group consisting of Schizosaccharomyces yeast, Pichia yeast, Candida iCandidO yeast, Debali. Saccharomyces cerevisiae (Debaryomyces yeast, Cryptocaryon genus (Cr_y;?
  • Examples of the microorganism of the Schizophyllum haromyces which can be used in the present invention include Schizosaccharomyces octo?on «, Schizosaccharomyces pombe, and the like which are commonly used in the food industry. Also included are variants of these microorganisms obtained according to the usual methods.
  • Schizosaccharomyces octoporus is preferred from the viewpoint that the obtained product has a higher ceramide production-promoting effect and/or a glucosylceramide-promoting effect.
  • Examples of the microorganism of the Pichia genus Picic0 which can be used in the present invention include the Pichia pastoris Pichi, which is commonly used in the food industry, and Pichia guilliermondii 5
  • Pichia anomala is preferred, Pichia guilliermondii, Norwegian Bi Pichia norvegensis ⁇ Pichia membranifaciens Pichia burtonii.
  • Pichia membranifaciens is also known as Pichia membranaefaciens, Pi Pilot alcoholophila,
  • Pichia burtonii Also known as Candida (Candida) Dematium chodati, Endomycopsis chodati (Hyphopichia burtonii) or T. chosporon behrendi.
  • Candida parapsilosis Ccmdida magnoliae
  • Candida maltosa Candida steatolyticcd
  • Candida butyri Candida rhagi
  • microorganisms function as follows, and by culturing in a medium containing okara and saccharides, ceramide and/or glucosylceramide which enhance epidermal cells can be obtained from the supernatant thereof. a substance that produces capacity.
  • the product obtained has a higher ceramide
  • Candida zeylanoides Candida boidinii, Candida parapsilosis, Magnolia pseudoacacia Candida magnoliae, Candida maltosa, Candida steatolytica (synonym/previous name: Candida hellenical), Candida butyr (Candida butyr , Candida rhagii or Candida metapsilosis.
  • Examples of the microorganism of the genus Debcuyomyces which can be used in the present invention include Debaryomyces hameniO and Deb ⁇ co/jwo ⁇ which are used from the food field. /n ⁇ At least one microorganism selected from the yeast Debaryomyces vanrijiae, etc.; and a mutant strain of these microorganisms obtained according to a usual method.
  • microorganisms function as follows, by culturing in the presence of okara and sugar The medium is cultured, whereby a substance for increasing the ceramide and/or glucosylceramide production ability of the epidermal cells can be obtained from the supernatant thereof, wherein the obtained product has a higher ceramide production promoting effect and/or glucose.
  • ceramide production promoting effect viewpoint it is preferable Debaryomyces hansenii (Debaryomyces hansenii), or yeast Fanlideba Wo 1 J (Debaryomyces vanrijiae)
  • microorganism of the cryptococcal yptococcus which can be used in the present invention include Cryptococcus hungaric sinensis, Cryptococcus hungaric s, Cryptococcus terreus, and the like; These include mutant strains of these microorganisms obtained according to the usual methods.
  • the product obtained from the viewpoint of having higher ceramide production promoting effect and / or glucose ceramide production promoting effect preferably Cryptococcus laurentii (Cryptococcus laurentii) 1 J Wo Hungary or Cryptococcus (Cryptococcus Hungaricus).
  • microorganism of the genus Hansenula which can be used in the present invention include Ham ula polymorpha and Hansenula sinensis (Ha Song mda ciferrii, sub-membrane Han) used from the food field. "Shen Yeast Hansenu subpelliculosa" ⁇ at least one microorganism selected from Hansenu satumus (iHansenula anomala), etc.; Method for obtaining mutant strains of these microorganisms.
  • microorganisms function as follows, and by culturing in a medium containing okara and saccharides, a substance capable of increasing ceramide and/or glucosylceramide production ability of epidermal cells can be obtained from the supernatant.
  • a substance capable of increasing ceramide and/or glucosylceramide production ability of epidermal cells can be obtained from the supernatant.
  • Hansenula polymorpha or Schwannella Ha-resolved La cifetrif the homologous/previous name of Hansenula polymorpha): Pichia angusta, Hansemda angusta, polymorpha Ogataea polymorpha ).
  • the spruce-sucking yeast Bt m tsugae used in the food field can be cited.
  • Polygonum buckwheat (Bu!lera Cao iabilis) At least one microorganism selected from the genus Bullera albus, etc.; and a mutant strain of these microorganisms obtained according to a usual method.
  • microorganisms function as follows, in a medium containing okara and sugar By culturing, a substance capable of increasing ceramide and/or glucosylceramide production ability of epidermal cells can be obtained from the supernatant thereof, wherein the obtained product has a higher ceramide production promoting effect and/or glucosylceramide. From the viewpoint of producing a promoting effect, Spirogymus sinensis iBulkm tsugae (synonym/previous name: Sporobolomyces tsugae) is preferred.
  • Rhodotorchus Rhocto examples include Rhodotola mucilaginosa, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula minuta, and Rhodotorula pallida. , Rhodotorula rubra, etc.; also includes variants of these microorganisms obtained according to the usual methods.
  • Rhodotorula mucilaginosa or Rhodotorula glutinis is preferred from the viewpoint that the obtained product has a higher ceramide production promoting effect and/or a glucose ceramide production promoting effect.
  • the microorganism of hmy CeS may, for example, list at least one microorganism selected from the group consisting of Spowbohmyces roseus, the genus Sporobolomyces salmonicolor, or the porphyry sporobolomyces ruber; According to A variant of these microorganisms obtained by the usual method.
  • These microorganisms function as follows, and by culturing in a medium containing okara and saccharides, a substance capable of increasing ceramide and/or glucosylceramide production ability of epidermal cells can be obtained from the supernatant. Among them, from the viewpoint that the obtained product has a higher ceramide production-promoting effect and/or a glucosylceramide-promoting effect, Sporozolios roseus is preferred.
  • the microorganism of the genus Brett momyces which can be used in the present invention is selected from the group consisting of Brettanomyces claussenii or Brettanomyces anomalus used in the food field. At least one microorganism; and a variant of these microorganisms obtained according to a usual method. These microorganisms function as follows, and are cultured in a medium containing okara and saccharides, whereby substances capable of increasing ceramide and/or glucosylamide production ability of epidermal cells can be obtained from the supernatant. Among them, Brettanomyces claussenii is preferred from the viewpoint that the obtained product has a higher ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect.
  • microorganisms include yeast Yarrow lipolytica (Y ar that ia lipolytic ⁇ or the like according to conventional method yeast Yarrow lipolytica obtained (Yarn ia lipofytica Such mutants of microorganisms. These microorganisms function as follows, and by culturing in a medium containing okara and saccharides, ceramide and/or glucosylceramide production ability of epidermal cells can be obtained from the supernatant thereof.
  • Yarrowia lipolytic ⁇ is preferred, and its synonym/has The names are: Caw3 ⁇ 4 ⁇ 4 ⁇ 4 lipolytica, (Candida paralipolytica), Saccharomycopsis lipolytica., Endomycopsis lipolytica, Candida albicans (Pseudomonilia deformans).
  • the microorganisms (yeast) to which the present invention relates can be purchased from commercial sources such as the China General Microorganisms Collection and Management Center (CGMCC), the China Center for Type Culture Collection (CCTCC), and the Industrial Microbial Resources and Information Center (CICIM) of Jiangnan University.
  • CGMCC China General Microorganisms Collection and Management Center
  • CTCC China Center for Type Culture Collection
  • CICIM Industrial Microbial Resources and Information Center
  • one type of the above microorganism may be used alone, or two or more types of the above microorganisms (yeast) may be used in combination.
  • Method for producing ceramide and/or glucosylceramide production promoter comprises culturing yeast in a medium containing okara and saccharides, and A ceramide and/or glucosylceramide production promoter is obtained in the supernatant. The specific steps of the method are as follows.
  • the medium used in the present invention is a medium containing bean dregs and sugar as a main component. Both the okara and the saccharide are easily available, and thus, the medium of the present invention has an advantage of being low in cost. Further, in addition to this, for example, 1% peptone, 0.5% yeast powder or the like may be added as appropriate.
  • the bean dregs refers to a substance obtained by immersing soybeans in water to sufficiently absorb water, pulverizing, filtering, removing water, and draining. It is also possible to use soybean residue remaining in the soybean product manufacturing process such as pressing soybean milk in the food industry.
  • the saccharide may be glucose, sucrose or maltose, etc., and they may be used singly or in combination. Further, from the viewpoints of improving the productivity and utilization of the fermentation, and the effect of promoting the ceramide production promoting effect and the glucosylceramide production promoting effect, glucose is preferred.
  • the medium of the present invention is preferably composed of okara, glucose, and water from the viewpoint of enhancing the ceramide production-promoting effect and the glucosylceramide production-promoting effect, and more preferably the content of the bean dregs in the medium is 5 to 20 w/v%, more preferably 8 to 12 w/v%, the content of glucose is 0.2 to 2 w/v%, more preferably 0.8 to 1.2 w/v%.
  • the cells of the above microorganisms are directly inoculated into a ceramide/glucose ceramide production promoter production medium.
  • a culture condition for producing a ceramide and/or a glucosylceramide production promoter the physiological characteristics of the yeast microorganism, the temperature and time necessary for optimizing the growth of the yeast microorganism, and the ceramide production promoting effect and/or glucose
  • it is preferably cultured at a culture temperature of 20 to 40 ° C, more preferably 27 to 35 ° C for 1 to 7 days, preferably for 48 to 96 hours, more preferably for 68 to 76 hours.
  • the purification method can be carried out by a combination of a usual operation such as filtration, centrifugation, ion exchange or adsorption chromatography, solvent extraction, crystallization, or the like as needed.
  • the supernatant is preferably obtained by centrifugation.
  • the speed of the centrifugation is preferably from 2000 to 4000 rpm, more preferably from 2500 to 3500 rpm, and the centrifugation time is preferably from 0 to 20 minutes, more preferably from 5 to 15 minutes.
  • ethanol may be added to the above supernatant obtained after centrifugation for sterilization, and the supernatant to which ethanol is added may be used as a ceramide production promoter and/or a glucosylceramide production promoter.
  • the cells can also be removed from the culture solution by centrifugation, ultrasonically treated, centrifuged, and the supernatant is recovered. Next, the recovered supernatant is filtered to remove impurities and the like, and dried under vacuum to obtain a ceramide and/or glucosylceramide production-promoting agent of the present invention.
  • the soybean residue fermentation extract obtained by culturing the yeast of the present invention and obtained from the culture supernatant has an effect of increasing the amount of ceramide and/or glucosylceramide in keratinocytes of normal humans.
  • the soybean residue fermentation extract obtained by cultivating the yeast of the present invention and obtained from the culture supernatant can be used for promoting therapeutic or non-therapeutic purposes of ceramide and/or glucosylceramide production, and can also be used as a treatment.
  • Use for non-therapeutic purposes is for cosmetic purposes, or for maintaining a healthy state of use.
  • the use of the therapeutic purpose and the use of non-therapeutic purposes can be performed in a completely differentiated manner.
  • the soybean residue fermentation extract obtained by culturing the yeast of the present invention and obtained from the culture supernatant can also be used for producing a ceramide production promoter and/or a glucosylceramide production promoter.
  • the ceramide production promoting agent and/or the glucosylceramide production promoting agent of the present invention can be used as a pharmaceutical or quasi-medicine for increasing and recovering ceramide and/or glucosylceramide in the stratum corneum and improving the barrier function and moisturizing function of the skin.
  • the ceramide production promoter or glucosylceramide production promoter can also be used as The use of quasi-drugs and cosmetics, which is based on the concept of ceramide production promotion or promotion of glucosylceramide production, and which indicates the concept as needed.
  • the form of use of the ceramide production promoter and/or the glucosylceramide production promoter of the present invention may be an additive for addition to cultured cells, or may be incorporated into a skin external preparation such as a skin cleansing agent or a cosmetic.
  • a skin external preparation such as a skin cleansing agent or a cosmetic.
  • various forms such as a lotion, an emulsion, a gel, a cream, an ointment, a powder, and a granule may be mentioned.
  • the base as the external preparation is not particularly limited as long as it is a known external base.
  • the ceramide production promoting agent and/or the glucosylceramide production promoting agent of the present invention or the oily component usually blended with the skin external preparations may be used singly.
  • the amount of the dried product as the accelerator is preferably added. It is 0.0001 to 10 w/v%, more preferably 0.001 to 5 w/v%. When the addition amount is 0.0001 w/v% or more, sufficient promotion effect can be obtained; and when the addition amount is 10% or less, the irritation to epidermal cells is smaller.
  • the blending amount is preferably from 0.01 to 20 w/v%, more preferably from 0.1 to 10 w/v%, based on the total amount of the external preparation for skin, from the viewpoint of the color and odor of the culture.
  • the culture medium was prepared as follows: Soy soybeans were immersed in water for 12 hours to allow the soybeans to sufficiently absorb moisture, and then the soybeans which absorbed the moisture were ground. Broken, filter it The liquid component is removed, and the remaining residue is drained to obtain okara.
  • the okara was mixed with glucose and water, and the concentrations of the okara and glucose in the mixture were respectively 10 w/v ° / ⁇ B lw / v%, and the mixture was used as a medium.
  • the resulting culture was then centrifuged to GOOO rpm for 10 minutes).
  • the remaining supernatant was diluted with 2.5 times absolute ethanol, and the diluted ethanol mixture was sonicated for 10 minutes, centrifuged at 80 rpm for 30 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected.
  • the supernatant was filtered through a filter paper.
  • the filtrate was obtained, and the filtrate was dried to a constant weight in a vacuum dryer, and the dried product was used as the sample 1 - A, 1 - B of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention, and the sample 1 - A, 1 was used.
  • Each of -B was dissolved in 50% ethanol to prepare a solution having a concentration of 1% and 0.1%, and stored in a refrigerator at 4 ° C as an additive for cell culture.
  • Cell culture normal human activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium) at 37 ° C, C0 2 concentration. The cells were cultured to a concentration of 80 to 90% under conditions of 5%. After passage, the cells were passaged into a 175 cm 2 square vial and the cells were cultured to a concentration of 80 to 90%. The passaged human epidermal cells were then inoculated into a 12-well plate at a volume of 2 ml per cell at a cell concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • CHCB CH30H: CH3COOH (190: 9: 1 v/v/v) as a layering agent.
  • the layer is applied to the top of the sheet and the spreader is blown dry with a blower; the above steps are repeated once.
  • CHCB: CH30H: C3H60 76: 20: 4 v/v/v
  • the layering agent wait for the layering agent to travel 2.5 cm from the bottom of the thin plate, stop the layer, and blow the hair with a hair dryer.
  • inventive products 1-A and 1-B have a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect.
  • the ceramide/glucose ceramide amount was directly analyzed without adding it to the above-mentioned 12-well plate containing keratinocytes (that is, without performing the above cell culture).
  • the other operations were carried out in the same manner as in the above Example 1-1. As a result, it was confirmed that no ceramide or glucosylceramide was present in the samples 1-A to 1-B themselves.
  • the culture medium was prepared as follows: Soy soybeans were immersed in water for 12 hours to allow the soybeans to sufficiently absorb moisture, and then the soybeans which absorbed the moisture were ground. It is crushed, filtered and the liquid component is removed, and the remaining residue is drained to obtain okara. The okara was mixed with glucose and water, and the concentrations of the okara and glucose in the mixture were respectively 10 w/ 3 ⁇ 4 ⁇ n lw/v%, and the mixture was used as a medium.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixture was taken as the ceramide/glucosylceramide-producing agent-producing sample 2-A of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use in cell culture. Additives.
  • normal human activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium) at 37 ° C and a CO 2 concentration of 5%. The cells were cultured to a concentration of 80 90%. After passage, the cells were passaged into a 175 cm 2 square vial and the cells were cultured to a concentration of 80 to 90%. The passaged human epidermal cells were then inoculated into a 12-well plate at a volume of 2 ml per well, and the cell concentration was IX 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • the ceramide (or glucosylceramide) standard and sample solution are spotted onto a dry TLC plate and chromatographed with CHC13 : CH30H: CH3COOH (190: 9: 1 v/v/v) as a layering agent.
  • the layer is applied to the top of the sheet, and the layer spreader is blown by a blower; the above steps are repeated once.
  • CHCB: CH30H: C3H60 76: 20: 4 v/v/v
  • Example 2-2 As shown in Table 2, it was confirmed that the product 2-A of the present invention has a ceramide production promoting effect and a glucosylceramide production promoting effect.
  • Example 2-2 As shown in Table 2, it was confirmed that the product 2-A of the present invention has a ceramide production promoting effect and a glucosylceramide production promoting effect.
  • Example 2-1 Pichia norvegensis (CICIM, numbered CICIM Y015 1 deposited at the Jiangnan University Industrial Microbial Resources and Information Center) was used instead of the abnormality. In the same manner as in Example 2-1, except that Pichia anomala was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixture was taken as the sample 2-D of the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use in cell culture. Additives.
  • Samples 2-E and 2-F which are ceramide/glucosylceramide production promoters of the present invention, were prepared by dissolving the samples 2-E and 2-F in 50% ethanol to prepare a solution having a concentration of 1% and 0.1%. It was stored in a refrigerator at 4 °C as an additive for cell culture.
  • the ceramide/glucose ceramide production promoting effect of the samples 2-D, 2-E, and 2-F was evaluated in the same manner as in Example 2-1, and the results are shown in Table 2.
  • Example 2-4 As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-D, 2-E, and 2-F of Example 2-3 had a ceramide-promoting effect.
  • Example 2-4 As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-D, 2-E, and 2-F of Example 2-3 had a ceramide-promoting effect.
  • Example 2-4 As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-D, 2-E, and 2-F of Example 2-3 had a ceramide-promoting effect.
  • Example 2-4 As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-D, 2-E, and 2-F of Example 2-3 had a ceramide-promoting effect.
  • Example 2-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 2-1, the Pichia pastoris (a Pichi discussion! a (preserved at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Jiangnan University, CICIM, No. CICIM Y0297) was used instead. The culture was carried out in the same manner as in Example 2-1 except that Pichia pastoris (No. 360-20-3) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixed solution was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 2-G of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • the supernatant (about 70 ml) was collected, the supernatant was filtered through a filter paper to obtain a filtrate, and the filtrate was dried in a vacuum dryer to a constant weight as a sample of the ceramide/glucose ceramide-producing agent of the present invention.
  • 2-H the sample 2-H was dissolved in 50% ethanol to prepare a 1% strength solution, and stored in a refrigerator at 4 °C as an additive for cell culture.
  • Example 2-5 As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-G and 2-H of Example 2-4 have a ceramide and glucosylceramide production-promoting effect.
  • Example 2-5 As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-G and 2-H of Example 2-4 have a ceramide and glucosylceramide production-promoting effect.
  • Example 2-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 2-1, the anomalous Pichia was used to replace mala (preserved by Jiangnan University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, number CICIM Y0349). In the same manner as in Example 2-1, except that the yeast Pichia anomala) (No. 360-20-3) was used.
  • the mixture of the above diluted ethanol was sonicated for 10 minutes, centrifuged at OOOO rpm for 10 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected. The supernatant was filtered through a filter paper to obtain a filtrate, and the filtrate was dried in a vacuum dryer to a constant weight.
  • 2-J and 2-K As a sample of the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention, 2-J and 2-K, the samples 2-J and 2-K were each dissolved in 50% ethanol to prepare a solution having a concentration of 1% and 0.1%. Stored in a refrigerator at 4 °C as an additive for cell culture.
  • the ceramide/glucose ceramide production promoting effect of the samples 2-1, 2-J, and 2-K was evaluated in the same manner as in Example 2-1, and the results are shown in Table 2 together.
  • Example 2-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 2-1, Pichia membranifaciens ( deposited in the Industrial Microbial Resources and Information Center of Cangnam University, number CICIM Y0360) was used instead of the abnormality. The same was carried out in the same manner as in Example 2-1 except that the yeast (i3 ⁇ 4/ ⁇ "oma/) (No. 360-20-3) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixture was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 2-L of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • Samples 2_M and 2-N which are ceramide/glucosylceramide production promoters of the present invention, were prepared by dissolving the samples 2-M and 2-N in 50% ethanol to prepare a solution having a concentration of 1% and 0.1%. It was used as an additive for cell culture in a refrigerator at 4 °C.
  • Example 2-7 The ceramide/glucose ceramide production promoting effect of the samples 2-L, 2-M, and 2-N was evaluated in the same manner as in Example 2-1, and the results are shown in Table 2 together. As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-L, 2-M, and 2-N of Example 2-6 had a ceramide production promoting effect.
  • Example 2-7 It was confirmed that the samples 2-L, 2-M, and 2-N of Example 2-6 had a ceramide production promoting effect.
  • Example 2-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 2-1, the Pichia pastoris iPichia cmomala (preserved at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Jiangnan University, CICIM Y0420) was substituted for P. angustifolia. In the same manner as in Example 2-1, except that Pichia anomala) (No. 360-20-3) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixed solution was taken as the sample 2-0 of the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • Samples 2-P and 2-Q which are ceramide/glucosylceramide production promoters of the present invention, were prepared by dissolving the samples 2-P and 2-Q in 50% ethanol to prepare a solution having a concentration of 1% and 0.1%. , stored in a refrigerator at 4 ° C as an additive for cell culture
  • Pichia anomala (CICIM, No. CICIM Y0421, deposited in the Industrial Microbial Resources and Information Center of Jiangnan University) was replaced by Pichia anomala In the same manner as in Example 2-1, except that ⁇ lochia anomala) (No. 360-20-3) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times absolute ethanol, and 1 ml of the mixture was taken as the ceramide of the present invention/ Sample 2-R of the glucosylceramide production promoter was stored in a refrigerator at 4 ° C for use as an additive for cell culture.
  • the mixture of the above diluted ethanol was sonicated for 10 minutes, centrifuged at OOOO rpm for 10 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected. The supernatant was filtered through a filter paper to obtain a filtrate, and the filtrate was dried in a vacuum dryer to a constant weight.
  • 2-S, 2-T, the samples 2-S and 2-T were each dissolved in 50% ethanol to prepare a solution having a concentration of 1% and 0.1%. Stored in a refrigerator at 4 °C as an additive for cell culture.
  • Example 2-9 As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-R, 2-S, and 2-T of Example 2-8 had a ceramide-promoting effect.
  • Example 2-9 As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-R, 2-S, and 2-T of Example 2-8 had a ceramide-promoting effect.
  • Example 2-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 2-1, Pichia burtonii (CICIM, No. CICIM Y0424, deposited at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Jiangnan University) was replaced by Abnormal Pichia. The yeast (No. 360-20-3) was cultured in the same manner as in Example 2-1.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixture was taken as the sample 2-U of the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • the mixture of the above diluted ethanol was sonicated for 10 minutes, centrifuged at OOOO rpm for 10 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected. The supernatant was filtered through a filter paper to obtain a filtrate, and the filtrate was dried in a vacuum dryer to a constant weight.
  • the sample 2-V was dissolved in 50% ethanol to prepare a 1% concentration solution, and stored in a refrigerator at 4 ° C for cell culture. Additives.
  • Example 2-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 2-1, Pichia guilliermondii (preserved by Jiangnan University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, number CICIM Y0440) was replaced. The culture was carried out in the same manner as in Example 2-1 except that Pichia pastoris (No. 360-20-3) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixture was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 2-W of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • the ceramide/glucose amide production promoting effect of the sample 2-W was evaluated in the same manner as in Example 2-1, and the results are shown in Table 2 together.
  • Example 2-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 2-1, Pichia guilliermondi (contained at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Cangnam University, CICIM Y0326) was used instead of the abnormality. The same was carried out in the same manner as in Example 2-1 except that the yeast (No. 360-20-3) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixed solution was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 2-X of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • the supernatant (about 70 ml) was collected, the supernatant was filtered through a filter paper to obtain a filtrate, and the filtrate was dried to a constant weight in a vacuum dryer to obtain a sample of the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • the sample 2- ⁇ was dissolved in 50% ethanol to prepare a 0.1% strength solution, and stored in a refrigerator at 4 ° C as an additive for cell culture.
  • Example 2 - 12 The ceramide/glucose ceramide production promoting effect of the sample 2-X, 2-Y was evaluated in the same manner as in Example 2-1, and the results are shown together in Table 2. As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-X and 2-Y of Example 2-11 have a glucosylceramide production-promoting effect.
  • Example 2 - 12 The ceramide/glucose ceramide production promoting effect of the sample 2-X, 2-Y was evaluated in the same manner as in Example 2-1, and the results are shown together in Table 2. As shown in Table 2, it was confirmed that the samples 2-X and 2-Y of Example 2-11 have a glucosylceramide production-promoting effect.
  • Example 2 - 12 Example 2 - 12
  • Example 2-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 2-1, the Pichia guilliermondii) (preserved at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Cangnam University, CICIM Y0329) was used instead of the abnormality. The same was carried out in the same manner as in Example 2-1 except that Pichia pastoris (No. 360-20-3) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixed solution was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 2-Z of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • the mixture diluted with the above anhydrous ethanol was sonicated for 10 minutes, centrifuged (3000 rpm) for 10 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected. The supernatant was filtered through a filter paper to obtain a filtrate, and the filtrate was dried in a vacuum dryer to a constant temperature.
  • the sample 2-a was dissolved in 50% ethanol to prepare a 1% concentration solution, and stored in a refrigerator at 4 ° C as a cell culture. Use additives.
  • Example 2-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 2-1, Pichia guilliermondii (preserved by Jiangnan University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, No. CICIM Y0414) was replaced. The culture was carried out in the same manner as in Example 2-1 except that Pichia pastoris (No. 360-20-3) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes).
  • the remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and the mixture diluted with the above anhydrous ethanol was sonicated for 10 minutes, centrifuged at 80 rpm for 10 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected, and the supernatant was filtered through a filter paper.
  • ceramide or glucosylceramide is not present in the present invention itself, but the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect, and can be used as a ceramide and/or glucosylceramide production promoting effect. Use of the agent.
  • Example 3-1 Manufacture of ceramide and/or glucosylceramide production promoter
  • Candida zeylanoides purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, original number 472) -20-1).
  • the above-mentioned strain obtained by culturing in YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) medium at 30 ° C was inoculated into a conical flask (capacity 300 ml) containing 100 ml of a ceramide/glucosylceramide production promoter production medium, at 30 Incubate at °C for 72 hours.
  • the medium contained 10 w/v% okara and lw/v% glucose.
  • the bean dregs are prepared by immersing the soybeans in water for 12 hours, so that the soybeans sufficiently absorb the water, and then the soybeans which have absorbed the water are ground and crushed, filtered, and the liquid components are removed, and the remaining residue is drained and obtained.
  • the cells are removed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant after centrifugation is recovered, and the culture supernatant after the recovery is collected. After dilution with 2.5 times of absolute ethanol, 1 ml was taken as a crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention (inventive product 3- ⁇ -1).
  • the crude product was treated with an ultrasonic treatment apparatus (manufactured by Branson Co., Ltd.) for 10 minutes, centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was recovered.
  • the supernatant was filtered with a filter paper to a volume of about 70 ml, and the filtrate was dried to a constant weight in a vacuum dryer at 40 ° C or lower to obtain a soybean residue fermentation extract as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract is dissolved in 50% by weight of ethanol, and the concentration of the soybean residue fermentation extract is adjusted to be 1 w/v% (inventive product 3-A-2), and then stored at 4 ° C for use in the subsequent Ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Example 3-2
  • Candida zeylanoides was purchased from Jiangnan University and preserved at CICIM, China University Industrial Microbial Resources and Information Center, original number 406-20 -1 ).
  • the crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 50% by weight of ethanol, and the concentration thereof was adjusted to be 1 w/v% (inventive product 3-B-2) 0.1 w/v% (inventive product 3-B-3). Stored at 4 ° C for subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion assays.
  • Example 3-3
  • Candida parapsilosis was used (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, original number 5 14- 20-3).
  • the crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention (the present invention 3-C-1) was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (%% ethanol), and the concentration thereof was adjusted to 1 w/v% (the present invention 3-C-2), and then stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose. Ceramide production promotion test. Examples 3-4
  • Ccmdi parapsilosis (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, original number 525- 20-2).
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 3-1.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration thereof was adjusted to 1 w/v% (3-D1 of the present invention) and 0.1 w/v% (3-D-2 of the present invention). Stored at 4 ° C for subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion assays. Examples 3-5
  • Candida metapsilosis is used (purchased from Jiangnan University and preserved at CICIM, China University Industrial Microbial Resources and Information Center, original number 510-19 -3 ).
  • the crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention (the present invention 3-E-1) was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration thereof was adjusted to be 1 w/v% (inventive product 3-E-2) and 0.1 w/v% (inventive product 3-E-3). Thereafter, it was stored at 4 ° C for subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Example 3-6
  • Candida parapsilosis purchased from Jiangnan University and deposited in CICIM, China University Industrial Microbial Resources and Information Center, under the accession number CICIM Y0314
  • the crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention (3-F-1 of the present invention) was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean obtained by the crude product was fermented and extracted.
  • the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean obtained by the crude product was fermented and extracted.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration thereof was adjusted to be 1 w/v% (the present invention 3-F-2) and 0.1 w/v% (the present invention 3-F-3). Thereafter, it was stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promoting test.
  • Example 3-7
  • Example 3-1 As a microorganism that produces ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, use Candida parapsilosis ( purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0322 ). In the same manner as in Example 3-1, a crude product of the ceramide and/or glucose ceramide production promoter of the present invention (the present invention 3-G-1) was obtained, and the crude product was further purified by the crude product. As a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration thereof was adjusted to be 1 w/v% (inventive product 3-G-2), 0.1 w/v% (inventive product 3-G-3). Thereafter, it was stored at 4 ° C for subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Candida boidini candida boidini (purchased from Jiangnan University and preserved in China University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, Accession No. CICIM Y0366
  • the crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1 (Inventive product 3-H-1) Further, the soybean residue fermentation extract obtained by purifying the crude product is used as the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration thereof was adjusted to 1 w/v% (the present invention, 3-H-2), and then stored at 4 Torr for use in the subsequent ceramide/glucosylceramide. A boost test was generated. Examples 3-9
  • Candida metapsilosis purchased from Jiangnan University and preserved in CICIM, China University Industrial Microbial Resources and Information Center, with the accession number CICIM Y0439
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 3-1.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 50% by weight of ethanol, and the concentration thereof was adjusted to be 1 w/v% (inventive product 3-1-1) and 0.1 w/v% (inventive product 3-1-2). Stored at 4 ° C for subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion assays.
  • Example 3-10
  • Candida parapsilosis purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number C1CIM Y0443
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 3-1.
  • Candida utilis Ccmdidci magnoli ⁇ (purchased from Jiangnan University and preserved in
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration thereof was adjusted to be 1 w/v% (inventive product 3- ⁇ -1), 0.1 w/v% (inventive product 3-K-2). Thereafter, it was stored at 4 ° C for subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Example 3-12
  • Candida maltoscO Candida maltoscO (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0207) o
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 3-1.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration was adjusted to 0.1 w/v% (3-L-1 of the present invention), and then stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/ Glucose ceramide production promotion test.
  • Example 3-1 As a microorganism that produces a ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, Candida lipolytica (Owi3 ⁇ 43 ⁇ 4 W ⁇ to/_y/c) (purchased from Jiangnan University and deposited in the Industrial Microbial Resources and Information Center of China University of China) CICIM, deposit number CICIM Y0221).
  • a crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention (3- ⁇ -1 of the present invention) was obtained, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention it was stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promoting test.
  • Example 3-14 As a microorganism that produces a ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, Candida lipolytica (Owi3 ⁇
  • Candida butyricum (Ccmdkia imtyrO (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0233)
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 3-1. Further, the soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (%% ethanol), and the concentration was adjusted to 1 w/v% (the present invention 3-N-1), and then stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/ Glucosylceramide production promotion test. Examples 3-15
  • Candida rhagi O Candida rhagi O (purchased from Jiangnan University and deposited at the China University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIMY0248) was used.
  • a crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention (inventive product 3-0-1) was obtained, and the crude soybean product fermentation extract was further purified.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration thereof was adjusted to be 1 w/v% (inventive product 3-0-2) and 0.1 w/v% (inventive product 3-0-3). Thereafter, it was stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promoting test.
  • Example 3-16
  • Candidazeylanoide purchased from Jiangnan University and preserved at the China University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0428
  • the crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 50 ⁇ / ⁇ % ethanol, adjusted to a concentration of lw / v% (3-P-2 of the present invention), and stored at 4 ° C for subsequent ceramide / glucose Ceramide production promotion test.
  • Candida parapsilosis purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM) Y0325.
  • the crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention was obtained in the same manner as in Example 3-1, and the crude soybean product fermentation extract was obtained by further purifying the crude product.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (%% ethanol), and the concentration was adjusted to be lw/v%.
  • normal human activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium) at a concentration of 5% at 37 ° C and C0 2 .
  • the cell culture was carried out under the conditions until the cell converence was 80 to 90%.
  • Cells were passaged to 175cm 2 flasks side cultured cells to a concentration of 80 ⁇ 90%.
  • the cells were passaged to a 12-well plate (2 ml per well) at IX 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • the cells were washed twice with 2 ml PBS (phosphate buffer), and 1 ml of PBS was added to the wells, and the cells were collected into a test tube by a cell harvester (cell shovel) for subsequent ceramide/glucose ceramide and protein analysis.
  • PBS phosphate buffer
  • cell harvester cell shovel
  • the obtained values are respectively divided by the respective protein contents to obtain Cer/Pro and GlyCer/Pro.
  • the relative values of Cer/Pro and GlyCer/Pro of the present invention were determined by using Cer/Pro and GlyCer/Pro of the control as 1. Further, the amount of ceramide and glucosylceramide in each well was determined by taking the amount of protein in each well of the control to 100 (respectively referred to as Cer/Well and GlyCer/Well, relative amounts relative to the control). Also shown in Table 3.
  • Cer/Pro Ceramic amide amount (g/ml) / protein content g/ml)
  • GlyCer/Pro Glucose ceramide amount (g/ml) / protein content ⁇ g/ml) table 3
  • Example 3-1 As shown in Table 3, the inventive product obtained in Example 3-1, Examples 3-6 to 3-7, and Example 3-17 had both a ceramide production promoting effect and a glucosylceramide.
  • the glucosylceramide production-promoting effect of the present invention obtained in Example 3-2, Examples 3-9 to 3-13, and Example 3-15 was remarkable, and Example 3 _3 to 3- 5.
  • the ceramide production promoting effect of the present invention obtained in Examples 3-8, Examples 3-14 and Examples 3-16 was remarkable.
  • the ceramide/glucose ceramide production promoting agent of the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect.
  • the ceramide/glucosylceramide production promoter obtained in the above Examples 3-1 to 3-17 was directly analyzed by TLC without cell culture, and as a result, no ceramide and glucosylceramide were present in the present invention.
  • Debaryomyces hansenii was used (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, original number 476 -20-1).
  • the above-mentioned strain obtained by culturing in YPD (Yast Extract Peptone Dextrose Medium) medium at 30 ° C was inoculated into an Erlenmeyer flask (capacity: 300 ml) containing 100 ml of a ceramide/glucosylceramide production promoter production medium, at 30 Incubate at °C for 72 hours.
  • the medium contained 10 w/v% okara and 1 w/ v % glucose.
  • the bean dregs are prepared by soaking the soybeans in water for 12 hours, so that the soybeans sufficiently absorb the water, and then the soybeans which have absorbed the water are ground and crushed, filtered, and the liquid components are removed, and the remaining residue is drained and obtained.
  • the cells are removed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the cells are recovered after centrifugation.
  • the supernatant was added to the culture supernatant after the recovery, and 2.5 times of absolute ethanol was added thereto, and the mixture was pulverized by an ultrasonic treatment apparatus (manufactured by Branson Co., Ltd.) for 10 minutes, centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was recovered.
  • the supernatant was filtered with a filter paper to a volume of about 70 ml, and the filtrate was dried to a constant weight in a vacuum dryer at 40 ° C or lower to obtain a soybean residue fermentation extract as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 50% by weight of ethanol, and the concentration of the soybean residue fermentation extract was adjusted to be lw/v%, and then stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Example 4-2
  • Example 4-1 As a microorganism that produces ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, Debatyomyces hansenii (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, original number 5) 14-20-4).
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 4-1 as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% ethanol), and the concentration of the soybean residue fermentation extract was adjusted to 1 w/v%, and then stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Example 4-3
  • Example 4-4 As a microorganism that produces a ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, Debaryomyces hansenii (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM) Y0286 A soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 4-1 as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration of the soybean residue fermentation extract was adjusted to 1 w/v%, and then stored at 4 C for subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test. 4-5
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5% ethanol, and the concentration of the soybean residue fermentation extract was adjusted to 1 w/v%, and then stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Example 4-7 As a microorganism that produces ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, use Debaryomyces hansenii) (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0290 ).
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 4-1 as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 50% by weight of ethanol, and the concentration of the soybean residue fermentation extract was adjusted to be lw/v%, and then stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Example 4-8
  • Example 4 - 1 As a microorganism that produces a ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, use B. vannamei ebaryomyces vanrijiae (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0198 adopted and implemented Example 4 - 1 The same method was used to obtain a soybean residue fermentation extract as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration of the soybean residue fermentation extract was adjusted to 0.1 w/v%, and then stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Example 4-9
  • Example 4-1 As a microorganism that produces a ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, Debaiyomyces hansenii (purchased from Jiangnan University and deposited in CICIM, China University Industrial Microbial Resources and Information Center, CICIM) Y035 1 A soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 4-1 as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5% ethanol, and the concentration of the soybean residue fermentation extract was adjusted to 1 w/v%, and then stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test. (ceramide/glucose ceramide production promotion test)
  • ⁇ Keratinocytes culture> activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium), and cells were cultured at 37 ° C and a CO 2 concentration of 5%. The culture is maintained until the cell aggregation density (concentration) is 80 to 90%. Cells were passaged to 175cm 2 flasks side cultured cells to a concentration of 80 ⁇ 90%. Then, the cells were passaged to a 12-well plate (2 ml per well) at 1 ⁇ 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • the obtained values are respectively divided by the respective protein contents to obtain Cer/Pro and GlyCer/Pro.
  • the relative values of Cer Pro and GlyCer/Pro of the present invention were determined by using Cer/Pro and GlyCer/Pro of the control as 1. Further, the amount of ceramide and glucosylceramide in each well was determined by taking the amount of protein in each well of the control to 100 (respectively referred to as Cer/Well and GlyCer/Well, relative amounts relative to the control). Also shown in Table 4.
  • GlyCer/Pro Glucose ceramide amount (g/ml) / protein content (g/ml)
  • Example 4-8 0.99 0.91 1.13 1.04
  • Example 4-9 1.53 1.40 1.35 1.23
  • the inventive product obtained in Example 4-1 and Example 4-9 has both a ceramide production promoting effect and a glucosylceramide production promoting effect;
  • the ceramide production-promoting effect of the present invention obtained in Example 4-2 and Examples 4-4 to 4-7 was remarkable, and the glucose of the present invention obtained in Example 4-3 and Example 4-8 was obtained.
  • the ceramide production promoting effect is remarkable. Therefore, it was confirmed that the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect. (Test for the absence of ceramide and glucosylceramide in the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention)
  • the ceramide/glucosylceramide production promoter obtained in the above Examples 4- 1 to 4-9 was directly analyzed by TLC without cell culture, and the results showed that there was no ceramide and glucosylceramide present in the present invention.
  • the present invention itself has no ceramide or glucosylceramide, but has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect, and can be used as a ceramide and/or glucosylceramide production promoter. .
  • the culture medium was prepared as follows: Soy soybeans were immersed in water for 12 hours to allow the soybeans to sufficiently absorb moisture, and then the soybeans which absorbed the moisture were ground. It is crushed, filtered and the liquid component is removed, and the remaining residue is drained to obtain okara. The okara was mixed with glucose and water, and the concentration of the okara and glucose in the mixture was respectively 10 w/ V . / ⁇ Q lw/v% , the mixture was used as a medium. '
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times absolute ethanol, and 1 ml of the mixture was taken as the ceramide of the present invention.
  • Sample 5-A of the glucosylceramide production promoter was stored in a 4 C refrigerator for use as an additive for cell culture.
  • the diluted ethanol solution was sonicated for 10 minutes, centrifuged at OOOO rpm for 30 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected. The supernatant was filtered through a filter paper to obtain a filtrate, and the filtrate was dried in a vacuum dryer to a constant weight.
  • the dried product was used as the sample 5-B, 5-C of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention, and the samples 5-B and 5-C were each dissolved in 50% ethanol to prepare 1%.
  • a 0.1% strength solution was stored in a refrigerator at 4 ° C as an additive for cell culture.
  • normal human activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium) at 37 ° C and a CO 2 concentration of 5%. The cells were cultured to a concentration of 80 to 90%. After passage, the cells were passaged into a 175 cm 2 square vial and the cells were cultured to a concentration of 80 to 90%. The passaged human epidermal cells were then inoculated into a 12-well plate at a volume of 2 ml per well, and the cell concentration was IX 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • methanol: chloroform 2.5 ml: 1.25 ml of a solvent was added, and the mixture was shaken for 20 minutes, and centrifuged (3000 rpm, 5 minutes) to obtain a supernatant a and a precipitate b.
  • the supernatant a was used for the analysis of the amount of ceramide/glucose amide, and the precipitate b was used for the analysis of the protein content.
  • the ceramide (or glucosylceramide) standard and sample solution are spotted onto a dry TLC plate and chromatographed with CHC13 : CH30H: CH3COOH (190: 9: 1 v/v/v) as a layering agent.
  • the layer is applied to the top of the sheet and the spreader is blown dry with a blower; the above steps are repeated once.
  • CHCB: CH30H: C3H60 76: 20: 4 v/v/v
  • Example 5-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 5-1, the Cryptococcus hungariciis (CICIM deposited in the Industrial Microbial Resources and Information Center of Jiangnan University, number CICIM Y0203) was used instead of the Loren Hidden Ball. The culture was carried out in the same manner as in Example 5-1 except for the yeast Cryptococc laurentii) (No. CICIM Y0232).
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixture was taken as a sample 5-D of the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • Example 5-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 5-1, the C. cerevisiae i Cryptococcus laurentii (preserved at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Cangnam University, CICIM Y0218) was used instead of The culture was carried out in the same manner as in Example 5-1 except that Cryptococcus laurentii (No. CICIM Y0232) was used. The resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes).
  • the remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixed solution was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 5-G of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • Example 5-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 5-1, the Cryptococcus hungaricus (CICIM, numbered CICIM Y0219, deposited at the Jiangnan University Industrial Microbial Resources and Information Center, CICIM Y0219) was used instead of the Loren Hidden Ball.
  • the yeast Cryptococcus laurentii) No. CICIM Y0232 was cultured in the same manner as in Example 5-1.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixture was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 5-1 of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use in cell culture. Additives.
  • ceramide or glucosylceramide is not present in the present invention itself, but the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect, and can be used as a ceramide and/or glucosylceramide production promoting effect. Use of the agent.
  • Example 6-1
  • the above-mentioned strain obtained by culturing in YPD (Yast Extract Peptone Dextrose Medium) medium at 30 ° C was inoculated into an Erlenmeyer flask (capacity: 300 ml) containing 100 ml of a ceramide/glucosylceramide production promoter production medium at 30 Torr.
  • the culture was carried out for 72 hours.
  • the medium contained 10 w/v% okara and lw/v% glucose.
  • the bean dregs are prepared by immersing the soybeans in water for 12 hours to sufficiently absorb the moisture of the soybeans, and then grinding and damaging the water-absorbing sun beans, filtering and removing the liquid components, and then draining the remaining residue to obtain.
  • the cells are removed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant after centrifugation is recovered, and the culture supernatant after the recovery is collected. 2.5 times of absolute ethanol was added, and the mixture was pulverized for 10 minutes by an ultrasonic treatment apparatus (manufactured by Branson Co., Ltd.), centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was blown back.
  • an ultrasonic treatment apparatus manufactured by Branson Co., Ltd.
  • the supernatant was filtered with a filter paper to a volume of about 70 ml, and the filtrate was dried to a constant weight in a vacuum dryer at 40 ° C or lower to obtain a soybean residue fermentation extract as a ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 50% by weight of ethanol, and the concentration of the soybean residue fermentation extract was adjusted to 0.1 w/v% (the present invention 6-A-1), and then stored at 4 ° C for use in the subsequent Ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • Example 6-2
  • Example 6-3 1 001877 As a microorganism for the production of ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, using Hansenula polymorpha iHansenula polymorph ⁇ (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0257).
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 6-1, and the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention was further dissolved in 5 (%% ethanol) to adjust the concentration thereof. After 0.1 w/v% (inventive product 6-C-1), it was stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promoting test.
  • Example 6-4 1 001877 As a microorganism for the production of ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, using Hansenula polymorpha iHansenula polymorph
  • Haemda polymorpha is used (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0122) ).
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 6-1 as a ceramide and/or glucosylceramide production promoter (Inventive product 6-D-1) of the present invention, and further, 50 ⁇ / ⁇ % ethanol was used. Dissolving the soybean residue fermentation extract and adjusting the concentration to lw/v%
  • Example 6-6 As a microorganism that produces a ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, Hansenula polymorpha) (purchased from Jiangnan University and preserved in China Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0135) .
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 6-1, and was stored as a ceramide and/or glucosylceramide production promoter (Inventive product 6-E-1) of the present invention, and stored at 4 ° C, For subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion experiments.
  • Example 6-6
  • Example 6 As a microorganism for producing a ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, Hansenula sylvestris iHansenula ciferrii (purchased from Jiangnan University and deposited at the China University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, accession number CICIM Y0150) was used.
  • the soybean residue fermentation extract was obtained in the same manner as in Example 6-1 as a ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention, and further, the soybean residue fermentation extract was dissolved in 50 v/v% ethanol to adjust the concentration thereof. After lw/v% (product 6-F-1 of the present invention), it was stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promoting test.
  • Example 6-7 As a microorganism for producing a ceramide/glucose ceramide production promoter from bean dregs, Hansenula sy
  • activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium), and cells were cultured at 37 ° C and a CO 2 concentration of 5%. The culture is maintained until the cell aggregation density (confluence) is 80 to 90%. Cells were passaged to 175cm 2 flasks side cultured cells to a concentration of 80 ⁇ 90%. Then, the cells were passaged to a 12-well plate (2 ml per well) at 1 ⁇ 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • GlyCer/Pro Glucose ceramide amount (g/ml) / protein content (g/ml) Table 6
  • Example 6-1, Example 6-3, and Example 6 The ceramide production-promoting effect of the present invention obtained in 6-6 was remarkable, and the glucosylceramide production-promoting effect of the present invention obtained in Example 6-4 and Example 6-7 was remarkable. Therefore, it was confirmed that the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect. (Test for the absence of ceramide and glucosylceramide in the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention)
  • the ceramide and/or glucosylceramide production promoter obtained in the above Examples 6-1 to 6-7 was directly analyzed by TLC without cell culture, and the results showed that there was no ceramide and glucosylceramide in the present invention. presence.
  • Bombyx serrata (Bulle tsugcw (purchased from Jiangnan University and preserved at CICIM, China University Industrial Microbial Resources and Information Center, preserved) No. CICIM Y0259 ) o
  • the above-mentioned strain obtained by culturing in YPD (Yast Extract Peptone Dextrose Medium) medium at 30 ° C was inoculated into an Erlenmeyer flask (capacity: 300 ml) containing 100 ml of a ceramide/glucosylceramide production promoter production medium, at 30 Incubate at °C for 72 hours.
  • the medium contained 10 w/v% okara and l w/v% glucose.
  • the bean dregs are prepared by immersing the soybeans in water for 12 hours, so that the soybeans sufficiently absorb the water, and then the soybeans which have absorbed the water are ground and crushed, filtered, and the liquid components are removed, and the remaining residue is drained and obtained.
  • the cells are removed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant after centrifugation is recovered, and the culture supernatant after the recovery is collected. After diluting with 2.5 times of absolute ethanol, 1 ml was taken as a crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention (inventive product 7-A).
  • the crude product was treated with an ultrasonic treatment apparatus (manufactured by Branson Co., Ltd.) for 10 minutes, centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was recovered. Filter about 70 ml of the supernatant with a filter paper, and then dry the filtrate to a constant weight in a vacuum dryer below 40 ° C to obtain beans.
  • the slag fermentation extract is used as a ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 50 Wv% ethanol, and the concentration thereof was adjusted to 1 w/v% (inventive product 7-B), 0.1 w/v% (inventive product 7-C), and stored at 4°. C, for subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium), and cells were cultured at 37 ° C and a CO 2 concentration of 5%. The culture is maintained until the cell aggregation density (concentration) is 80 to 90%. Cells were passaged to 175cm 2 flasks side cultured cells to a concentration of 80 ⁇ 90%. Then, the cells were passaged to a 12-well plate (2 ml per well) at 1 ⁇ 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • the obtained values are respectively divided by the respective protein contents to obtain Cer/Pro and GlyCer/Pro.
  • the relative values of Cer/Pro and GlyCer/Pro of the present invention were determined by using Cer/Pro and GlyCer/Pro of the control as 1. Further, the amount of ceramide and glucosylceramide in each well was determined by taking the amount of protein in each well of the control to be 100 (respectively referred to as Cer/Well and GlyCer/Well, respectively, relative to the relative amount of the control). Also shown in Table 7.
  • GlyCer/Pro Glucose ceramide amount (g/ml) / protein content (g/ml) Table 7
  • the present invention 7-C 4.23 3.95 0.96 0.90 7-1
  • the ceramide production-promoting effect of the present invention 7-A to 7-C obtained in Example 7-1 was remarkable. Therefore, it has been confirmed that the ceramide and/or glucose amide production promoter of the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect.
  • the amide and/or glucosylceramide production promoter obtained in the above Example 7-1 was directly analyzed by TLC without cell culture, and the results showed that ceramide and glucosylceramide were not present in the present invention.
  • the culture medium was prepared as follows: Soy soybeans were immersed in water for 12 hours to allow the soybeans to sufficiently absorb moisture, and then the soybeans which absorbed the moisture were ground. It is crushed, filtered and the liquid component is removed, and the remaining residue is drained to obtain okara. The okara was mixed with glucose and water, and the concentrations of the okara and glucose in the mixture were respectively 10% and 1 w/v%, and the mixture was used as a medium.
  • Rhodotonda mucilaginosa preserved at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Cangnam University, CICIM Y0250, and cultured at 30 °C. day.
  • the diluted ethanol solution was sonicated for 10 minutes, centrifuged at 80 rpm for 30 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected. The supernatant was filtered through a filter paper to obtain a filtrate, and the filtrate was dried in a vacuum dryer to a constant weight.
  • the dried product was used as the sample of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention 8-B, 8-C, and the samples 8-B and 8-C were each dissolved in 50% ethanol to prepare 1%.
  • a 0.1% strength solution was stored in a refrigerator at 4 ° C as an additive for cell culture.
  • normal human activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium) at 37 ° C and a CO 2 concentration of 5%. The cells were cultured to a concentration of 80 to 90%. After passage, the cells were passaged into a 175 cm 2 square vial and the cells were cultured to a concentration of 80 to 90%. The passaged human epidermal cells were then inoculated into a 12-well plate at a volume of 2 ml per cell at a cell concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • methanol: chloroform 2.5 ml: 1.25 ml of a solvent was added, and the mixture was shaken for 20 minutes, and centrifuged (3000 rpm, 5 minutes) to obtain a supernatant a and a precipitate b.
  • the supernatant a was used for the analysis of the amount of ceramide/glucose amide, and the precipitate b was used for the analysis of the protein content.
  • CHCB CH30H: CH3COOH ( 190: 9: 1 v/v/v) as a layering agent.
  • the layer is applied to the top of the sheet and the spreader is blown dry with a blower; the above steps are repeated once.
  • CHCB: CH30H: C3H60 76: 20: 4 v/v/v
  • Example 8.1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 8.1, the sticky red circle was replaced by Rhodotorula mucilaginosa ( deposited in the Industrial Microbial Resources and Information Center of Cangnam University, CICIM Y0433). The yeast (Rhodotorula mucilaginosa ⁇ ) (No. CICIM Y0250) was cultured in the same manner as in Example 8.1.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixed solution was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 8-D of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • Samples 8-E and 8-F which are ceramide/glucosylceramide production promoters of the present invention, and samples 8-E and 8-F were each dissolved in 50% ethanol to prepare a solution having a concentration of 1% and 0.1%. It was stored in a refrigerator at 4 °C as an additive for cell culture.
  • Example 8.1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 8.1, the viscosity was replaced by Rhodotorula mucilaginosa (preserved at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Cangnam University, CICIM Y0430). The culture was carried out in the same manner as in Example 8-1 except that Rhodotonda mucilaginosa) (No. CICIM Y0250) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). Remaining supernatant
  • the solution was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixed solution was used as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 8-G of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as an additive for cell culture.
  • Example 8-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 8-1, R. erythromycin Rhodoto la glutinis (preserved at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Cangnam University, CICIM Y0148) was used instead of the sticky red yeast. (Rhodotorula mucilaginosa) (No. CICIM Y0250) was cultured in the same manner as in Example 8.1.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes).
  • the remaining supernatant was diluted with 2.5 times absolute ethanol, and the diluted mixture of the above anhydrous ethanol was sonicated for 10 minutes, centrifuged (3000 rpm) for 10 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected, and the supernatant was filtered.
  • the filtrate was filtered, and the filtrate was dried to a constant weight in a vacuum dryer to obtain a sample of the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention.
  • 8-H and the sample 8-H was dissolved in 50% ethanol to prepare a concentration of 1%.
  • the solution was stored in a refrigerator at 4 ° C as an additive for cell culture.
  • Example 8-5 As shown in Table 8, it was confirmed that the sample 8-H of Example 8-4 had a glucosylceramide production promoting effect.
  • Example 8-5 As shown in Table 8, it was confirmed that the sample 8-H of Example 8-4 had a glucosylceramide production promoting effect.
  • Example 8-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 8-1, the viscous red circle was replaced with the viscous red yeast iRhodotonda mucilaginosa ⁇ (preserved at the Industrial Microbial Resources and Information Center of Cangnam University, CICIM Y0324). Yeast Rhodotorula mucilaginos O (No. CICIM Y0250), in addition to Example 8-1 was also cultured in the same manner.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes).
  • the remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and the mixture diluted with the above anhydrous ethanol was sonicated for 10 minutes, centrifuged at 80 rpm for 10 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected, and the supernatant was filtered through a filter paper.
  • the filtrate was obtained, and the filtrate was dried to a constant weight in a vacuum dryer to obtain samples 8-1 and 8-J of the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention, and samples 8-1 and 8-J were respectively 50%.
  • the solution was dissolved in ethanol to prepare a solution having a concentration of 1% and 0.1%, and stored in a refrigerator at 4 °C as an additive for cell culture.
  • Rhodotoru mucilaginosa preserved at Jiangnan University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, number CICIM Y0337
  • the culture was carried out in the same manner as in Example 8-1 except that Rhodotoruh mucilaginosa (No. CICIM Y0250) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged to GOOO rpm for 10 minutes).
  • the remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixed solution was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 8-K of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • Rhodotoruh mucilaginosa (reserved in Jiangnan University)
  • the culture microbial resources and information center CICIM (No. CICIM Y0394) was cultured in the same manner as in Example 8-1 except that Rhodotorula muci ginosa (No. CICIM Y0250) was used.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes).
  • the remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and the mixture diluted with the above anhydrous ethanol was sonicated for 10 minutes, centrifuged at 80 rpm for 10 minutes, and the supernatant (about 70 ml) was collected, and the supernatant was filtered through a filter paper.
  • the filtrate was obtained, and the filtrate was dried to a constant weight in a vacuum dryer to obtain a sample of the ceramide/glucosylceramide production promoter of the present invention.
  • 8-L and the sample 8-L was dissolved in 50% ethanol to prepare a 1% concentration.
  • the solution was stored in a refrigerator at 4 °C as an additive for cell culture.
  • Example 8-1 In the preparation of the ceramide/glucose ceramide production promoter of Example 8-1, R. sylvestris Rhodotoru mucilaginosa (preserved at Jiangnan University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, number CICIMY0418) was used instead of the viscous red yeast (Rhodotonda mucilaginosa (No. CICIM Y0250) was cultured in the same manner as in Example 8-1.
  • the resulting culture was then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes). The remaining supernatant was diluted with 2.5 times of absolute ethanol, and 1 ml of the mixed solution was taken as the ceramide/glucose ceramide production promoter sample 8-M of the present invention, and stored in a refrigerator at 4 ° C for use as a cell culture addition. Things.
  • Samples 8-N and 8-0 which are ceramide/glucosylceramide production promoters of the present invention, and samples 8-N and 8-0 were each dissolved in 50% ethanol to prepare a solution having a concentration of 1% and 0.1%. It was stored in a refrigerator at 4 °C as an additive for cell culture.
  • the ceramide/glucose ceramide production promoting effect of the samples 8-M, 8-N, and 8-0 was evaluated in the same manner as in Example 8.1, and the results are shown in Table 8.
  • Example 8-9 As shown in Table 8, it was confirmed that the samples 8-M, 8-N, and 8-0 of Example 8-8 have a ceramide and glucosylceramide production-promoting effect.
  • Example 8-9 As shown in Table 8, it was confirmed that the samples 8-M, 8-N, and 8-0 of Example 8-8 have a ceramide and glucosylceramide production-promoting effect.
  • Rhodotorula mucilaginosa preserved at Jiangnan University Industrial Microbial Resources and Information Center CICIM, number CICIM Y0423 was used instead of viscous red.
  • the culture was carried out in the same manner as in Example 8-1 except that Rhodotorula mucilaginoscO (No. CICIM Y0250) was used.
  • Rhodotorula The present invention 0.04 0.04 0.94 1.02 mucilaginosa ) 8-E
  • the invention is 0.05 0.07 0.85 1.1 1 8-F
  • the invention is 2.41 1.94 2.52 2.03 8-0
  • ceramide or glucosylceramide is not present in the present invention itself, but the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect, and can be used as a ceramide and/or glucosylceramide production promoting effect. Use of the agent.
  • Example 9-1
  • the above-mentioned strain obtained by culturing in YPD (Yast Extract Peptone Dextrose Medium) medium at 30 ° C was inoculated into an Erlenmeyer flask (capacity: 300 ml) containing 100 ml of a ceramide/glucosylceramide production promoter production medium, at 30 Incubate at °C for 72 hours.
  • the medium contained 10 w/v% okara and lw/v% glucose.
  • the bean dregs are prepared by immersing the soybeans in water for 12 hours, so that the soybeans sufficiently absorb the water, and then the soybeans which have absorbed the water are ground and crushed, filtered, and the liquid components are removed, and the remaining residue is drained and obtained.
  • the cells are removed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant after centrifugation is recovered, and the culture supernatant after the recovery is collected. 2.5 times of absolute ethanol was added to obtain a crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention (inventive product 9-A), which was stored at 4 ° C, and was used for the subsequent ceramide/glucose nerve. Amide production promotion test.
  • Example 9-2 a crude product of the ceramide and/or glucosylceramide production promoter of the present invention
  • the supernatant was filtered by a filter paper to a volume of about 70 ml, and the filtrate was dried in a vacuum dryer at 40 ° C or lower to a constant weight to obtain a bean slag as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention. Fermented extract.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (%% ethanol), adjusted to a concentration of 0.1 w/v% (inventive product 9-B), and stored at 4 ° C for subsequent ceramide/glucose nerves. Amide production promotion test.
  • Example 9-3
  • the present invention product 9-C was obtained in the same manner as in Example 9-1, and then treated with an ultrasonic treatment apparatus (manufactured by Branson Co., Ltd.). The crude product was centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was recovered.
  • the supernatant was filtered through a filter paper to a volume of about 70 ml, and the filtrate was dried to a constant weight in a vacuum dryer at 40 ° C or lower to obtain a soybean residue fermentation extract as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% ethanol), adjusted to a concentration of 1 w/v% (inventive product 9-D), and stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucosylceramide. Produce a boost test.
  • normal human activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium) at a concentration of 5% C0 2 at 37 ° C.
  • the cell culture was carried out under the conditions until the cell converence was 80 to 90%.
  • Cells were passaged to 175cm 2 flasks side cultured cells to a concentration of 80 ⁇ 90%.
  • the cells were passaged to a 12-well plate (2 ml per well) at IX 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • only 5 ( ⁇ % ethanol (without adding ceramide/glucose ceramide production promoter) was added as a control, and cultured for 72 hours under the same culture conditions. After 72 hours of cultivation, the supernatant culture solution was discarded.
  • Cer/Pro amount of amide (g/ml) / protein content (g/ml)
  • GlyCer/Pro Glucose ceramide amount (g/ml) / protein content (g/ml) Table 9
  • Example 9-1 and Example 9-3 As shown in Table 9, the glucosylceramide production-promoting effect of the present invention obtained in Example 9-1 and Example 9-3 was remarkable, and the ceramide production of the present invention obtained in Example 9-2 was promoted. The effect is remarkable.
  • the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect. .
  • the ceramide/glucosylceramide production promoter obtained in the above Examples 9-1 to 9-3 was directly analyzed by TLC without cell culture, and the results showed that there was no ceramide or glucosylceramide present in the present invention.
  • the above-mentioned strain obtained by culturing in YPD (Yast Extract Peptone Dextrose Medium) medium at 30 ° C was inoculated into an Erlenmeyer flask (capacity: 300 ml) containing 100 ml of a ceramide/glucosylceramide production promoter production medium, at 30 Incubate at °C for 72 hours.
  • the medium contained 10 w/v% okara and lw/v% glucose.
  • the bean dregs are prepared by immersing the soybeans in water for 12 hours, so that the soybeans sufficiently absorb the water, and then the soybeans which have absorbed the water are ground and crushed, filtered, and the liquid components are removed, and the remaining residue is drained and obtained.
  • the cells are removed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant after centrifugation is recovered, and the culture supernatant after the recovery is collected. 2.5 times of absolute ethanol was added, followed by treatment with an ultrasonic treatment apparatus (manufactured by Branson Co., Ltd.) for 10 minutes, centrifugation at 3000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was recovered.
  • an ultrasonic treatment apparatus manufactured by Branson Co., Ltd.
  • the supernatant was filtered with a filter paper to a volume of about 70 ml, and the filtrate was dried in a vacuum dryer at 40 ° C or lower to constant weight to obtain a soybean residue fermentation extract as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% ethanol), adjusted to a concentration of 1 w/v% (inventive product 10-A), and stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose nerve. Amide production promotion test.
  • Example 10-2
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 50% by weight of ethanol, adjusted to a concentration of 0.1 w/v% (inventive product 10-B), and stored at 4 ° C for subsequent ceramide/glucosylceramide Produce a boost test.
  • Example 10-3
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 5 (% by weight of ethanol), and the concentration thereof was adjusted to be 1 w/v% (inventive product 10_C) and 0.1 w/v% (inventive product 10-D), and then stored in 4 At °C, it was used in subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion tests.
  • normal human activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium) at 37 °C.
  • the cell culture was carried out under the condition that the concentration of C0 2 was 5% until the cell aggregation density (confluence) was 80 to 90%.
  • Cells were passaged to 175cm 2 flasks side cultured cells to a concentration of 80 ⁇ 90%. Then, the cells were passaged to a 12-well plate (2 ml per well) at IX 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • the cells were washed twice with 2 ml PBS (phosphate buffer), and 1 ml of PBS was added to the wells, and the cells were collected into a test tube by a cell harvester (cell shovel) for subsequent ceramide/glucose ceramide and protein analysis.
  • PBS phosphate buffer
  • cell harvester cell shovel
  • GlyCer/Pro Glucose ceramide amount (g/ml) / protein content g/ml) Table 10
  • Example 10-1 As shown in Table 10, the present invention obtained in Example 10-1 has both a ceramide production promoting effect and a glucosylceramide production promoting effect, and the examples obtained in Examples 10-2 and 10-3.
  • the glucosylceramide production promoting effect of the invention product is remarkable.
  • the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect.
  • the ceramide/glucose ceramide production promoter obtained in the above Examples 10-1 to 10-3 was directly analyzed by TLC without cell culture, and the results showed that there was no ceramide and glucosylceramide present in the present invention.
  • rr OW a lipolytica ( purchased from Jiangnan University and deposited in CICIM, China University Industrial Microbial Resources and Information Center, is used. Deposit number CICIM Y0311)o
  • YPD Yeast Extract Peptone Dextrose Medium
  • the above-mentioned strain obtained by culturing in YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) medium at 30 ° C was inoculated into an Erlenmeyer flask (capacity: 300 ml) containing 100 ml of a ceramide/glucosylceramide production promoter production medium at 30 Torr. The culture was carried out for 72 hours.
  • the medium contains 10 w/v% okara and ⁇ % glucose.
  • the bean dregs are prepared by soaking the soybeans in water for 12 hours, so that the soybeans sufficiently absorb the water, and then the soybeans which have absorbed the water are ground and crushed, filtered, and the liquid components are removed, and the remaining residue is drained and obtained.
  • the cells are removed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant after centrifugation is recovered, and the culture supernatant after the recovery is collected. 2.5 times of absolute ethanol was added, followed by treatment with an ultrasonic treatment apparatus (manufactured by Branson Co., Ltd.) for 10 minutes, centrifugation at 3000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was recovered.
  • an ultrasonic treatment apparatus manufactured by Branson Co., Ltd.
  • the supernatant was filtered through a filter paper to a thickness of about 70 m, and the filtrate was dried in a vacuum dryer at 40 ° C or lower to a constant weight to obtain a soybean residue fermentation extract as a ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention.
  • soybean residue fermentation extract was dissolved in 50 v/v% ethanol, adjusted to a concentration of 1 w/v%, and stored at 4 ° C for the subsequent ceramide/glucose ceramide production promotion test.
  • normal human activated keratinocytes (Cascade Co., Ltd.) were used as primary cells in a 75 cm 2 flask (2 ml of growth factor-containing medium) at a concentration of 5% C0 2 at 37 ° C.
  • the cell culture was carried out under the conditions until the cell aggregation density (concentration) was 80 to 90 ° /. .
  • Cells were passaged to 175cm 2 flasks side cultured cells to a concentration of 80 ⁇ 90%. Then, it was passaged to a 12-well plate (2 ml per well) at 1 ⁇ 10 5 cells/ml, and the cells were further cultured to a concentration of 80 to 90%.
  • the obtained values are respectively divided by the respective protein contents to obtain Cer/Pro and GlyCer/Pro.
  • the relative values of Cer/Pro and GlyCer/Pro of the present invention were determined by using Cer/Pro and GlyCer/Pro of the control as 1. Further, the amount of ceramide and glucosylceramide in each well was determined by taking the amount of protein in each well of the control to 100 (respectively referred to as Cer/Well and GlyCer/Well, relative amounts relative to the control). Also shown in Table 11.
  • GlyCer/Pro Glucose ceramide amount (g/ml) / protein content ( ⁇ ⁇ / ⁇ 1 ) Table 1 1 As shown in Table 11, the glucosylceramide production-promoting effect of the present invention obtained in Example 11-1 was remarkable.
  • the ceramide/glucose ceramide production promoter of the present invention has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect.
  • the amide/glucosylceramide production promoter obtained in the above Example 11-1 was directly analyzed by the TLC method without cell culture, and the results showed that there was no ceramide and glucosylceramide present in the present invention.
  • the present invention itself has no ceramide or glucosylceramide, but has a ceramide production promoting effect and/or a glucosylceramide production promoting effect, and can be used as a ceramide and/or glucosylceramide production promoter. .

Description

神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法 技术领域
'本发明涉及能够促进皮肤产生神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺的神 经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法。 本发 明特别涉及利用特定微生物， 以食品加工业等的副产物豆渣作为培养 基的主原料， 制造能够促进皮肤产生神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺的 神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的方法。 背景技术
皮肤具有产生神经酰胺 （ceramide ) 和葡萄糖神经酰胺 ( glucosylceramide ) 的能力。 在皮肤中、 特别是表皮角质层中聚集着 由表皮细胞合成分泌得到的神经酰胺， 它是细胞间脂质的主要成分。 神经鞘脂类之一的神经酰胺存在于皮肤角质层中， 占角质层中细胞间 脂质的 50 %左右。 神经鞘脂类 （Sphingolipid) 是具有鞘氨醇骨架的复 合脂质的总称。 葡萄糖神经酰胺是在神经酰胺上结合了葡萄糖而成的 一种神经鞘脂类。 而由表皮细胞合成得到的神经酰胺暂时以葡萄糖神 经酰胺或者神经鞘磷脂 （sphingomyelin ) 的形式被储存起来； 之后被 排出至细胞外， 在葡糖脑苷酯酶 （glucocerebrosidase ) 和神经磷脂酶 ( sphingomyelinase ) 的作用下， 再次形成神经酰胺， 从而发挥作为细 胞间脂质的功能。 皮肤中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺具有提高皮肤 的保湿功能和皮肤的屏障功能等的生理作用。
一直以来， 已知神经酰胺、 葡萄糖神经酰胺、 半乳糖神经酰胺等 神经鞘脂类具有促进角质层的保持水分能力、改善皮肤粗糙等效果（专 利文献 1〜2)。 虽然皮肤具有产生神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的能力， 但是， 近来由于环境、 气候等的影响， 皮肤容易变得干燥， 因此由皮 肤自身产生神经酰胺等来改善皮肤的保湿功能就显得不足够。
因而人们尝试了从外部向皮肤补充神经酰胺的方法。 例如， 在专 利文献 3中记载了培养假丝酵母（0« ¾¾)属的热带假丝酵母（Owifefe tropicalis ) JPCCY0004株 （NITE P-570 ) 来制造葡萄糖神经酰胺的方 法， 通过将该葡萄糖神经酰胺涂布在人体的干燥性库肤上能够改善皮 肤的保湿功能。 但是， 该方法并不是关于神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰 胺产生促进剂的方法， 而只不过是直接从培养后的菌体中获取大量存 在的葡萄糖神经酰胺， 因此所合成的葡萄糖神经酰胺的神经酰胺骨架 与人体中存在的神经酰胺类的神经酰胺骨架不同， 其在两处具有碳碳 双键且具有支链。 因此， 将这种从微生物中直接提取得到的葡萄糖神 经酰胺涂布在人体皮肤上的话， 有可能不能与人体皮肤相适应而产生 使用安全性方面的问题。
另外， 从外部向皮肤补充神经酰胺的方法与以往使用的保湿剂等 同样有保湿效果的持续性不够的问题， 而且有些状态的皮肤对从外界 补给的神经酰胺等的吸收不充分， 从而导致不能充分发挥保湿效果。
而另一方面， 如果能够增强或促进皮肤本身的神经酰胺或葡萄糖 神经酰胺的产生能力， 则无需从外部补充神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 而能够通过促进皮肤自身产生神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺来提高皮 肤的屏障功能和保湿功能。 这样， 由于是由皮肤自身产生神经酰胺或 葡萄糖神经酰胺， 所合成的是皮肤所具有的常规结构的神经酰胺等， 因而其不存在与皮肤的适应性不好等的安全性问题。
因此最近关于在皮肤角质层中产生促进表皮神经酰胺等的生成的 物质的研究相当热门。 其中， 作为能够促进神经酰胺生成的物质， 已 报道的有以灵芝、蜂花粉（Bee Pollen )、川芎等的提取物为有效成分的 神经酰胺产生促进剂（专利文献 4〜6)。然而， 由于这些神经酰胺产生 促进剂全都是从植物原料提取轉到， 其提取操作耗费时间长， 且在天 然资源的可利用性方面有限制， 因而其制造成本高。
另外， 在专利文献 7 中， 公开了一种能够活化皮肤表层内部的表 皮细胞自身的神经酰胺合成的神经酰胺合成促进剂， 其以含有烟酸和 / 或烟酰胺的菌培养物为有效成分， 该菌培养物可以是乳酸菌培养物、 双歧杆菌培养物、 香菇菌体培养物或者酵母菌培养物。 然而， 从专利 文献 7的实施例可以看出， 不含有烟酸和 /或烟酰胺的乳酸菌培养物或 者酵母菌培养物 （比较例 〜 4) 的神经酰胺产生量较之对照组并无明 显变化， 因而该神经酰胺合成促进剂实质上含有烟酸和 /或烟酰胺作为 有效成分， 其神经酰胺合成促进效果还不够充分， 尚有改善的余地。 而且， 由于该促进剂的制备过程中使用的培养基实质上以烟酸和 /或烟 酰胺作为有效成分， 因此这种神经酰胺合成促进剂的制备成本较高。
另外， 酵母菌是一些单细胞真菌， 在自然界分布广泛， 主要生长 在偏酸性的潮湿的含糖环境中。 可在缺氧环境中生存。 可用于酿造生 产。 目前已知有 1000 多种酵母， 可以列举出裂殖酵母属 iSchizosaccharomyces) 酵母、 毕赤 Pichia 属酵母、 假丝酵母属 Candida) 酵母、 德巴利酵母属 iDebaryomyces 酵母、 隐球酵母属 iCryptococcus)酵母、 汉逊酵母属 (Hamenu )酵母、 布勒掷抱酵母 属 BuUera 酵母、 红酵母属 ί Rhodotoruki 酵母、 掷孢酵母属 (Sporobolomyces 酵母、 酒香酵母属 <iBrettanomyces> 酵母、 亚罗酵 母属 （ mwa) 酵母等。
裂殖酵母属 Schi麵 ccharomyces 酵母一直以来被用于食品加工 中， 其发酵产生乙醇， 并且也被用作生物学的研究材料。
另外， 毕赤 Pichia 属酵母具有如下性质和用途等。
毕赤酵母属菌种细胞呈球形、 椭圆形、 拉长形， 偶尔呈锥形， 但 不形成尖顶。 无性繁殖方式为多边芽殖， 有些种类可形成节孢子。 每 个子囊通常包含 1〜4个子囊孢子， 偶尔多于 4个。 孢子呈帽状、 半球 形或球形有棱。 子囊成熟后一般裂幵， 少数不裂开， 接合或不接合形 成子囊， 接合在母细胞和芽体或两个独立细胞之间发生。 菌丝和假菌 丝都可作为子囊， 但形态不会变大或变成纺锤形， 同宗或异宗配合； 可同化硝酸盐， DBB反应阴性。
毕赤 Pichia 属酵母的分类地位为： 子囊菌门 ( o? >^to)、 半 子囊菌纲 {Hemiascomycetes)、 酵母目 Saccharomycetales)、 酵母菌禾斗 {Saccharomycetaceae)、 毕赤酵母属 (尸czz'o)。
毕赤 iPichia 属酵母的用途有， 例如， 利用甲醇产生一些有用物 质， 如抗生素， 生物蛋白等； 或者也可以作为基因工程菌运用。 巴斯 德毕赤酵母用于生产还原型谷胱甘肽， 还有别的一些毕赤酵母用于生 产一些蛋白质 /酶类。
另外， 己知假丝酵母属 (Ccmdick 的微生物通常具有以下用途： 例如， 粗状假丝酵母 (Candida valida 用于生产脂肪酶， 热带假丝酵 母 Candidametapsilosis 、产阮假丝酵母 ( cmdida utilis 等用于生产 酿酒、 甘油、 食用酵母、 有机酸以及酶制剂等， 也可用于词料工业； 并且， 假丝酵母属 Ccmdida 的微生物还可用于处理工业和农副产品 加工业的废弃物、 生产可食用的蛋白质。
另外， 已知德巴利酵母属 (Debaryomyces 的微生物一般具有以 下工业用途， 例如， 发酵葡萄糖生产 D-阿拉伯糖醇、 或者将木糖转化 成木糖醇。
另夕卜，人们对隐球酵母属 Cryptococcus 的微生物已有一些研究。 例如， 有文献报道称乳酒隐球酵母变种产生 β-半乳糖苷酶。 另外， 人 们也发现罗伦隐球酵母 Cryptococc laurentii) 菌株具有对贮藏柑橘 酸腐细菌 （Geotrichum citri-aurantii ) 的抑制作用。
另外， 已知汉逊酵母属 ficm歸 la 的微生物大多能产生乙酸乙 酯， 从而增加产品香味， 因此通常用于酿酒和食品工业。
另外， 已知布勒掷孢酵母属 Bi le 的微生物一般用于食品发 酵， 如香肠发酵。
另外， 人们对红酵母属 Rhodotorula 的微生物己有一些研究。 例如， 红酵母属的某些种对烃类有弱氧化作用， 并能合成 β-胡萝卜素。 如粘红酵母粘红变种能氧化垸烃生产脂肪，含量可达干生物量的 50~60 %。 在一定条件下还能产生 a-丙氨酸和谷氨酸， 产蛋氨酸的能力也很 强， 可达干生物量的 1 %。
另外， 已知掷孢酵母属 Sporobolomyces 的微生物在菌体内蓄积 辅酶 Q10等产业上有用。 另夕卜， 掷孢酵母属 Sporobo myces 的微生 物还作为类胡萝卜素类、 L-肉碱等有用物质的生产菌备受关注。
另外， 已知酒香酵母属 Brettanomyces 的微生物属于酵母的一 种， 在自然界中广泛存在， 通常在木桶储藏中繁殖并产生乙基苯酚。 因而， 在酿酒工业上， 其作为破坏啤酒、 葡萄酒等香气的污染菌， 通 常不受欢迎。
另外， 已知解脂亚罗酵母 （ rra 'a lipolytica ) 等亚罗酵母属 ( Yarrowia 的微生物， 对于多不饱和脂肪酸 （PUFA ) 的生成尤为有 用。
但是， 目前还没有利用酵母菌 （特别是上述各属的酵母） 来制备 神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的报道。 专利文献 1 日本特开昭 61 -260008号公报
专利文献 2 : 日本特开昭 61 -271205号公报
专利文献 3 : 日本特开 2010-22217号公报
专利文献 4: 日本特幵 2005-194240号公报
专利文献 曰本特开 2010-70499号公报
专利文献 6 : 日本特幵 2010-150237号公报
专利文献 7: 日本特幵平 9-194383号公报 发明内容
本发明就是为了解决上述现有技术中存在的技术问题而做出的， 目的在于提供一种低成本且高效地制造神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄 糖神经酰胺产生促进剂的方法。
本发明人为了解决上述技术问题进行了专心研究， 结果发现： 在 含有豆渣和糖类的培养基中培养酵母， 能够低成本且高效地获得神经 酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂；从而完成了本发明。
本发明提供一种神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促 进剂的制造方法， 其中， 在含有豆渣和糖类的培养基中培养酵母， 从 其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂。
本发明还涉及豆渣的发酵提取物用于促进神经酰胺和 /或葡萄糖神 经酰胺的产生的用途， 所述豆渣的发酵提取物是在含有豆渣的培养基 中培养酵母得到的。
本发明还涉及豆渣的发酵提取物作为神经酰胺产生促进剂和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂的用途， 所述豆渣的发酵提取物是在含有豆 渣的培养基中培养酵母得到的。
本发明还涉及豆渣的发酵提取物在制造神经酰胺产生促进剂和 /或 葡萄糖神经酰胺产生促进剂中的用途， 所述豆渣的发酵提取物是在含 有豆渣的培养基中培养酵母得到的。
在本发明中， 酵母可以是选自裂殖酵母属 chizosaccharomyces 酵母、 毕赤 iPichia 属酵母、 假丝酵母属 ί Candida 酵母、 德巴利 酵母属 (Debaryomyces) 酵母、 隐球酵母属 i Cryptococcus 酵母、 汉 逊酵母属 (Hans讓 la 酵母、 布勒掷孢酵母属 Bid ra) 酵母、 红酵 母属 (Rhodotorula)酵母、 掷孢酵母属 iSporobolomyces 酵母、 酒香 酵母属 (Brettmomyces) 酵母、 亚罗酵母属 （ rraw^) 酵母中的至少 任意一种。
根据本发明的制造方法， 能够使用特定的微生物并利用豆渣这样 的容易获得的物质作为培养基的主要原料， 从而能够廉价且高效地获 得神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 该促进剂能 够有效提高皮肤所具有的产生神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺的能力， 从而 有效提高皮肤的保湿能力。 具体实施方式
本发明的制造方法是在含有豆渣和糖类的培养基中培养酵母， 并 从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂。
(可以用于神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂制造的微生 物）
作为可以用于本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 制造中的微生物，可以是选自裂殖酵母属 Schizosaccharomyces 酵母、 毕赤 Pichia 属酵母、 假丝酵母属 iCandidO 酵母、 德巴利酵母属 (Debaryomyces 酵母、 隐球酵母属 （Cr_y;?tococc ) 酵母、 汉逊酵母 属 ίΗ賺 nula 酵母、 布勒掷孢酵母属 Bullem 酵母、 红酵母属 (Rhodotorula)酵母、 掷孢酵母属 Sporobolomyces 酵母、 酒香酵母 属 (Brettanomyces) 酵母、 亚罗酵母属 （ wrov a) 酵母中的至少任意 一种。
作为能够在本发明中使用的裂殖酵母属 Schizo露 haromyces 的 微生物， 可以列举出食品工业领域中常用的八孢裂殖酵母 ( Schizosaccharomyces octo?on«)、粟酒裂殖酵母 ( Schizosaccharomyces pombe) 等； 还包括根据通常方法得到的这些微生物的变异株。
其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑， 优选八抱裂殖酵母 ( Schizosaccharomyces octoporus )。 作为能够在本发明中使用的毕赤酵母属 Pichic0 的微生物， 可以 列举出食品工业领域中常用的异常毕赤酵母 Pichi議麵 、季也蒙 毕赤酵母 ( Pichia guilliermondii 扨 |5威毕赤酵母 ( Pichia norvegensis 膜璞毕赤酵母 Pichia membranifaciens ) 伯顿毕赤酵母 ί Pichia burtonii), 粉状毕赤酵母 Pichia farinose), 克鲁弗毕赤酵母 Pichia Kluyveri) 等； 还包括根据通常方法得到的这些微生物的变异株。
其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑， 优选异常毕赤酵母 Pichia anomala), 季也蒙毕赤酵母 (Pichia guilliermondii 、 挪威毕赤酵母 (Pichia norvegensis) ^ 膜撲毕赤酵母 ( Pichia membranifaciens 伯顿 毕赤酵母 ( Pichia burtonii )。
其中， 膜璞毕赤酵母 Pichia membranifaciens 又称为膜醭毕赤酵 母 {Pichia membranaefaciens) 卩耆酒毕赤酵母 i Pichia alcoholophila) 、
(Pichia hyalospora)、 Pichia scaptomyzae^ Willia belgica 或 Zygopichia guilliermondii
伯顿毕赤酵母 Pichia burtonii) 又称为纤维假丝酵母 (Candida
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Dematium chodati 、柯达氏拟内抱霉 ( Endomycopsis chodati) 隐伯顿毕赤酵母 Hyphopichia burtonii) 或贝雷丝孢酵母（ T chosporon behrendi 。
作为能够在本发明中使用的假丝酵母属 (Candida 的微生物， 可 以列举出从食品领域使用的诞沫假丝酵母 (Candida Zey noideS 、博伊 丁假丝酵母 （ Candida boidinii )、 近平滑假丝酵母 （ Candida parapsilosis), 木兰假丝酵母 Ccmdida magnoliae), 麦芽糖假丝酵母 {Candida maltosa), 解脂肪假丝酵母 Candida steatolyticcd、 丁酸假 丝酵母 iCandida butyri)、 鹬虻假丝酵母 (Candida rhagi 、 热带假丝 酵母 Candida metapsilosis 、 白假丝酵母 (Candida albicans 、 霍氏假 丝酵母 (Cmdida holmii)、 粗状假丝酵母 (Candida valida) 等中选出 的至少 1种微生物； 还包括根据通常方法得到的这些微生物的变异株。 这些微生物如下所述发挥作用， 通过在含有豆渣和糖类的培养基中培 养， 从而从其上清液中可以得到提高表皮细胞的神经酰胺和 /或葡萄糖 神经酰胺产生能力的物质。 其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰 胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点出发， 优选 诞沬假丝酵母 （ Candida zeylanoides )、 博伊丁假丝酵母 （ Candida boidinii ) , 近平滑假丝酵母 ( Candida parapsilosis 、 木兰假丝酵母 { Candida magnoliae) ,麦芽糖假丝酵母 Candida maltosa 、解脂肪假 丝酵母 ( Candida steatolytica ) (同物异名 /曾用名： 希腊假丝酵母 { Candida hellenical), 丁酸假丝酵母 ( Candida butyr 、 鹬虻假丝酵母 ( Candida rhagii) 或热带假丝酵母 ( Candida metapsilosis )。
作为能够在本发明中使用的德巴利酵母属 (Debcuyomyces ) 的微 生物， 可以列举出从食品领域使用的汉逊德巴利酵母 Debaryomyces hameniO、 多形德巴利酵母（Deb ^^ c o/jwo^/n^ 范丽德巴禾 Ij 酵母 Debaryomyces vanrijiae 等中选出的至少 1种微生物； 还包括根 据通常方法得到的这些微生物的变异株。 这些微生物如下所述发挥作 用， 通过在含有豆渣和糖类的培养基中培养， 从而从其上清液中可以 得到提高表皮细胞的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生能力的物质。 其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖 神经酰胺产生促进效果的观点出发， 优选汉逊德巴利酵母 ( Debaryomyces hansenii ) 或范丽德巴禾1 J酵母 ( Debaryomyces vanrijiae)
作为能够在本发明中使用的隐球酵母属 yptococcus 的微生物， 可以列举出罗伦隐球酵母 Oyptococc laurentii) , 匈牙利隐球酵母 ( Cryptococcus hungaric s ) >地生隐球酵母 ( Cryptococcus terreus )等； 还包括根据通常方法得到的这些微生物的变异株。
其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑， 优选罗伦隐球酵母 ( Cryptococcus laurentii ) 或匈牙禾1 J隐球酵母 ( Cryptococcus hungaricus )。
作为能够在本发明中使用的汉逊酵母属 an歸 的微生物， 可以列举出从食品领域使用的多形汉逊酵母 （ Ham ula polymorpha )、 西弗汉逊酵母 ( Ha聰 mda ciferrii 、 亚膜汉逊酵母 Hansenu subpelliculosa ) ^ 土星汉逊酵母 (Hansenu satumus 、 异常汉逊酵母 ' iHansenula anomala) 等中选出的至少 1种微生物； 还包括根据通常 方法得到的这些微生物的变异株。 这些微生物如下所述发挥作用， 通 过在含有豆渣和糖类的培养基中培养， 从而从其上清液中可以得到提 高表皮细胞的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生能力的物质。 其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰 胺产生促进效果的观点出发， 优选多形汉逊酵母 Ham纖 polymorpha)或西弗汉逊酵母 Ha 議 la cifetrif), 其中， 多形汉逊酵 母 iHansenula polymorpha) 的同物异名 /曾用名有： 安格斯毕赤酵母 (Pichia angusta ) ,安格斯汉逊酵母 (Hansemda angusta 、 多形欧加铁 菌 ( Ogataea polymorpha )。
作为能够在本发明中使用的布勒掷孢酵母属 Bulk 的微生物， 可以列举出从食品领域使用的铁杉布勒掷抱酵母 Bt m tsugae) 多 形布勒掷孢酵母 (Bu!lera曹 iabilis 、 白布勒弹孢酵母 Bullera albus 等中选出的至少 1 种微生物； 还包括根据通常方法得到的这些微生物 的变异株。 这些微生物如下所述发挥作用， 通过在含有豆渣和糖类的 培养基中培养， 从而从其上清液中可以得到提高表皮细胞的神经酰胺 和 /或葡萄糖神经酰胺产生能力的物质。 其中， 从所获得的产品具有更 高的神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点 出发， 优选铁杉布勒掷孢酵母 iBulkm tsugae (同物异名 /曾用名： 铁 布衫抱霉 ( Sporobolomyces tsugae ) )。
作为能够在本发明中使用的红酵母属 Rhoc to 的微生物， 可以列举出粘性红圆酵母 i Rhodoto la mucilaginosa )、 粘红酵母 (Rhodotorula glutinis 小红酵母 (Rhodotorula minuta ) 、 浅红酵母 ( Rhodotorula pallida )、 深红酵母 ( Rhodotorula rubra ) 等； 还包括根 据通常方法得到的这些微生物的变异株。
其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑， 优选粘性红圆酵母 ( Rhodotorula mucilaginosa ) 或半占红酵母 ( Rhodotorula glutinis )。
作为能够在本发明中使用的掷孢酵母属 iSp講 b。hmyCeS 的微生 物， 可以列举出从食品领域使用的粉红掷抱酵母 Spowbohmyces roseus ) , 赭色掷抱酵母 Sporobolomyces salmonicolor) 或深红掷抱酵 母 Sporobolomyces ruber) 等中选出的至少 1种微生物； 还包括根据 通常方法得到的这些微生物的变异株。这些微生物如下所述发挥作用， 通过在含有豆渣和糖类的培养基中培养， 从而从其上清液中可以得到 提高表皮细胞的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生能力的物质。其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰 胺产生促进效果的观点出发， 优选粉红掷孢酵母 Sporobolomyces roseus )。
作为能够在本发明中使用的酒香酵母属 ( Brett momyces ) 的微生 物， 可以列举出从食品领域使用的克劳森酒香酵母 （ Brettanomyces claussenii )或异酒香酵母 ( Brettanomyces anomalus )等中选出的至少 1 种微生物； 还包括根据通常方法得到的这些微生物的变异株。 这些微 生物如下所述发挥作用， 通过在含有豆渣和糖类的培养基中培养， 从 而从其上清液中可以得到提高表皮细胞的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰 胺产生能力的物质。 其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生 促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点出发， 优选克劳森 酒香酵母 ( Brettanomyces claussenii )。
作为能够在本发明中使用的亚罗酵母属 （ r v « ) 的微生物， 可 以列举出解脂亚罗酵母 ( Yar謂 ia lipolytic^等或根据通常方法得到的 解脂亚罗酵母 ( Yarn ia lipofytica 等微生物的变异株。 这些微生物如 下所述发挥作用， 通过在含有豆渣和糖类的培养基中培养， 从而从其 上清液中可以得到提高表皮细胞的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生 能力的物质。 其中， 从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效 果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点出发， 优选解脂亚罗酵母 { Yarrowia lipolytic^ , 其同物异名 /曾用名有： 解脂假丝酵母（Caw¾¾ lipolytica ) 、 ( Candida paralipolytica ) 、 角军 月旨 复膜孢酵母 ( Saccharomycopsis lipolytica. )、 角军月旨拟内抱霉 ( Endomycopsis lipolytica )、 畸形假念珠菌 ( Pseudomonilia deformans )。
本发明所涉及的微生物 （酵母） 都可以从中国普通微生物保藏管 理中心 （CGMCC)、 中国典型培养物保藏中心 （CCTCC)、 江南大学 工业微生物资源和信息中心 （CICIM) 等商业渠道购买得到。
在本发明的制造方法中， 可以单独使用 1种上述微生物 （酵母）， 也可以组合 2种以上的上述微生物 （酵母） 进行使用。 (神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法） 本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法通 过在含有豆渣和糖类的培养基中， 培养酵母， 并从其上清液中获得神 经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。该方法的具体步骤如下所示。
<培养基 >
在本发明中， 优选在液体培养基中培养上述微生物中的 1 种或 2 种以上。
本发明中使用的培养基是含有豆渣和糖类作为主要成分的培养 基。 豆渣和糖类都是容易获得的物质， 因而， 本发明的培养基具有成 本低的优点。并且，除此之外，也可以适当添加例如 1%的蛋白胨、 0.5% 的酵母粉等。
其中， 豆渣是指， 将大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后粉碎、 再经过滤、 除水、 沥干而得到的物质。 也可以使用食品产业中压搾豆 浆等的豆制品制造工序中残留的大豆残渣。
糖类可以是葡萄糖、 蔗糖或麦芽糖等， 它们可以任意单独使用或 混合使用。 而从提高发酵生产性和利用性的观点、 以及提高神经酰胺 产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑， 其中优选 葡萄糖。
从提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的 观点考虑， 本发明的培养基优选由豆渣、 葡萄糖和水构成， 进一步优 选培养基中豆渣的含量为 5〜20w/v%、 更优选 8〜12w/v%， 葡萄糖的含 量为 0.2~2w/v%、 更优选 0.8〜1.2w/v%。
<培养条件>
将上述微生物的菌体直接接种到神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促 进剂制造培养基中。 作为用于制造神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生 促进剂的培养条件， 从酵母微生物的生理特性、 最优化酵母微生物的 成长所必需的温度和时间、 以及提高神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄 糖神经酰胺产生促进效果的观点出发，优选在 20〜40°C、更优选在 27〜 35 °C的培养温度下， 培养 1〜7天， 优选培养 48〜96小时， 更优选培 养 68〜76小时。 <神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的回收、 精制〉 从得到更纯的产品的观点出发， 优选将通过所述培养获得的培养 物进一步进行精制从而得到上清液。 作为精制的方法， 可以根据需要 适当组合使用过滤、 离心分离、 离子交换或吸附色谱、 溶剂提取、 结 晶化等的常用的操作来进行。 优选通过离心分离获得上清液， 该离心 分离的速度优选为 2000〜4000rpm、更优选为 2500~3500rpm， 离心时间 优选为 0〜20分钟， 更优选为 5〜15分钟。
具体而言， 可以在离心后获得的上述上清液中加入乙醇， 用来进 行灭菌， 并将加入了乙醇的上清液作为神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄 糖神经酰胺产生促进剂。
也可以通过离心分离从培养液中除去菌体， 再超声波处理， 离心 分离， 回收上清液。 接着， 再将回收后的上清液过滤除去杂质等， 真 空下干燥处理后作为本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂。 通过培养本发明的酵母并从培养上清液中得到的大豆残渣发酵提 取物， 具有在正常人体的角化细胞中使神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺 的量增加的作用。
因此， 通过培养本发明的酵母并从培养上清液中得到的大豆残渣 发酵提取物， 可以用于促进神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生的治疗 目的或非治疗目的的使用， 也可以作为治疗目的或非治疗目的的神经 酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。 非治疗目的的 使用是以美容为目的的使用， 或为维持健康状态的使用等。 并且， 所 述治疗目的的使用和非治疗目的的使用是可以完全区分地进行的。
通过培养本发明的酵母并从培养上清液中得到的大豆残渣发酵提 取物， 也可以用于制造神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生 促进剂。
本发明的神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂可 以作为使角质层中的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺增加并恢复和提高 皮肤的屏障功能和保湿功能的医药品、 准医药品、 化妆品等使用。 另 夕卜， 该神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺产生促进剂也可以作为 以神经酰胺产生促进或葡萄糖神经酰胺产生促进为概念的、 并根据需 要标明该概念的准医药品、 化妆品使用。
作为本发明的神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂的使用形态， 可以是用于向培养细胞中添加的添加剂， 也可以是配 合到皮肤洗净剂、 化妆品等皮肤外用剂中使用。 例如， 可以列举化妆 水、 乳液、 凝胶、 霜、 软膏、 粉末、 颗粒等各种形态。 而作为外用剂 的基剂， 只要是公知的外用基剂即可， 没有特别限制。 在配制各种皮 肤外用剂时， 可以单独地使用本发明的神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄 糖神经酰胺产生促进剂， 或与在皮肤洗净剂和化妆品等皮肤外用剂中 通常配合的油性成分、 保湿剂、 粉体、 色素、 乳化剂、 增溶剂、 紫外 线吸收剂、 增稠剂、 药效成分、 香料、 防菌防霉剂、 植物提取物、 醇 类等适当组合来使用。
将本发明的神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 添加到培养的表皮细胞中来促进神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺的情况 下， 作为该促进剂的干燥物的添加量优选为 0.0001〜10 w/v%，更优选 为 0.001〜5 w/v%。 当添加量为 0.0001 w/v%以上时， 能得到充分的促 进效果； 而当添加量为 10 ^^ ％以下时， 对表皮细胞的刺激性更小。
将本发明的神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 配合在皮肤外用剂使用时， 从有效促进神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺 的产生、 从而有效提高皮肤的保湿能力、 而且不易显示出培养物的颜 色和气味的观点出发， 其配合量优选为皮肤外用剂总量的 0.01〜20w/v % , 更优选为 0.1〜10w/v%。 实施例
下面， 基于实施例对本发明进行更详细的说明， 但本发明并不限 定于此。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备 （发酵液处理） > 首先， 按照以下方法制备培养基： 将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将吸收了水分的大豆研磨破碎， 将其过滤 并除去液体成分， 剩余残渣沥干， 得到豆渣。 将该豆渣与葡萄糖以及 水相混合， 并使豆渣和葡萄糖在混合物中的浓度分别达到 10w/v°/^B lw/v% , 将该混合物作为培养基。
然后， 将 100ml 的上述培养基加至三角烧瓶中， 接种一定量的八 孢裂殖酵母 iSchizosaccharomyces octoporus ) (保藏于江南大学工业微 生物资源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0123), 在 30°C下培养 3 天。
然后将所得到的培养物离心分离 GOOOrpm, 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释，对该无水乙醇稀释后的混合液进行超声 处理 10分钟， 离心 GOOOrpm) 30分钟， 收集上清液 （约 70ml)， 上 清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 将此干燥 品作为本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 1 -A、 1 - B， 将样品 1 -A、 1 -B分别以 50%乙醇溶解而配制成 1%、 0.1 % 浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的评价 >
(细胞培养） - 首先， 取正常人的活化角质化细胞 （Cascade Co., Ltd ) 作为原代 细胞， 于 75cm2培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml ) ， 37°C、 C02 浓度为 5%的条件下培养细胞至 80〜90%浓度。 进行传代， 传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细胞至 80〜90%浓度。然后将传代后的人体表皮 细胞接种到 12孔板中，每孔容积为 2ml，细胞浓度为 1 X 105个细胞 /ml， 继续培养细胞至 80〜90%浓度。
然后， 在上述 12 孔板中更换不含有生长因子的培养基， 将样品 1 -A、 1 -B和对照品 （浓度为 5(^ %的乙醇水溶液） 分别加入上述 12 孔板中 （n=2)， 相同培养条件下培养 3天。
3天培养后， 弃去上清培养液， 以 2ml PBS (磷酸盐缓冲液）对细 胞进行 2次清洗， 再加入 lml的 PBS至板孔中， 以细胞收集器 （细胞 铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺和蛋白质 分析。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果的确认） 在回收得到的含有细胞的 PBS 溶液中加入甲醇： 氯仿 =2.5ml: 1.25ml的溶剂， 进行振动 20分钟， 进行离心 （3000rpm， 5分钟） 分 离， 从而得到上清液 a和沉淀 b。 将上清液 a用于神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺量的分析， 将沉淀 b用于蛋白质含量的分析。
( 1 ) 神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量的分析
在由此得到的上清液 a中加入 PBS:氯仿 =1.25ml: 1.25ml的溶剂， 进行振动 20分钟，进行离心（3000rpm， 5分钟）分离，得到上下两相。 回收下相， 并在 30Ό、氮气保护下进行干燥 40分钟。在得到的干燥品 中加入 100 / l的氯仿： 甲醇 =2ml: 1ml的溶剂进行溶解， 并用下述薄 板层析 （TLC) 法对其进行神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记 为 Cer和 GlyCer, 单位为 ut g/ml) 的解析。
将神经酰胺（或葡萄糖神经酰胺）标准品与样品溶液点至干燥 TLC 板上， 以 CHCB: CH30H: CH3COOH ( 190： 9： 1 v/v/v) 为展层剂 进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹干展层剂； 重复 以上步骤一次。 然后以 CHCB : CH30H: C3H60 (76： 20： 4 v/v/v) 为展层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展 层， 以吹风机吹千。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180 °C烘烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡 萄糖神经酰胺） 分析。
(2) 蛋白质含量的分析
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述沉淀 b中加入 90 ^ 1的 SDS (十二烷基磺酸钠） 溶液并 进行混合， 在 60°C下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却后在其中添 加 ΙΟΟμΙ的 2N的 HC1溶液， 按照 BCA Kit (蛋白质定量分析试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。
(3 ) 分析结果
对于本发明品和对照品的样品，分别测定 Cer/Pro和 GlyCer Pro(见 下式） 。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer Pro为 1， 在表 1中表示本发明 品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro的相对值。另外， 以对照品每孔中的蛋白质 的量为 100，求出本发明品的每孔中的蛋白质的量的相对值（Pro.(%))， 并据此求出每孔的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （相对于对照品的 相对量）， 即， Cer/Well=Cer/Pro X Pro.(%), GlyCer/Well=GlyCer/Pro X Pro.(%)c 一并在表 1中表示。
如果 Cer Pro (或 Cer/Well) 大于 1 (对照品的值） ， 则表明该样 品具有神经酰胺产生促进效果； 如果 GlyCer/Pro (或 GlyCer/Well) 大 于 1 (对照品的值），则表明该样品具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。
如表 1所示， 确认了本发明品 1-A、 1-B具有神经酰胺产生促进效 果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。 表 1
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另外， 对于样品 1-A〜1-B, 不将其加入到上述含角质化细胞的 12 孔板中 （即， 不进行上述细胞培养） 而直接进行神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺量的分析，除此以外的操作与上述实施例 1-1同样进行。结果确认 了样品 1-A〜1-B本身中没有神经酰胺或葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 但本发明品具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。 实施例 2-1
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备 （发酵液处理） > 首先， 按照以下方法制备培养基： 将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将吸收了水分的大豆研磨破碎， 将其过滤 并除去液体成分， 剩余残渣沥干， 得到豆渣。 将该豆渣与葡萄糖以及 水相混合， 并使豆渣和葡萄糖在混合物中的浓度分别达到 10w/ ¾^n lw/v%， 将该混合物作为培养基。 然后， 将 100ml的上述培养基加至三角烧瓶中， 接种一定量的异 常毕赤酵母 (Pichia an醒 (保藏于江南大学工业微生物资源和信息 中心 CICIM, 编号 360-20-3)， 在 30°C下培养 3天。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟）。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 lml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促迸剂的样品 2-A, 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的评价〉
(细胞培养）
首先， 取正常人的活化角质化细胞 （Cascade Co., Ltd) 作为原代 细胞， 于 75cm2培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml ) ， 37°C、 C02 浓度为 5%的条件下培养细胞至 80 90%浓度。 进行传代， 传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细胞至 80〜90%浓度。然后将传代后的人体表皮 细胞接种到 12孔板中，每孔容积为 2ml，细胞浓度为 I X 105个细胞 /ml， 继续培养细胞至 80〜90%浓度。
然后，在上述 12孔板中更换不含有生长因子的培养基，将样品 2-A 和对照品 （浓度为 5(^ ％的乙醇水溶液） 加入上述 12孔板中 （n=2 )， 相同培养条件下培养 3天。
3天培养后， 弃去上清培养液， 以 2ml PBS (磷酸盐缓冲液）对细 胞进行 2次清洗， 再加入 lml的 PBS至板孔中， 以细胞收集器 （细胞 铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺和蛋白质 分析。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果的确认）
在回收得到的含有细胞的 PBS 溶液中加入甲醇： 氯仿 =2.5ml :
1.25ml的溶剂， 进行振动 20分钟， 进行离心 （3000rpm， 5分钟） 分 离， 从而得到上清液 a和沉淀 b。 将上清液 a用于神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺量的分析， 将沉淀 b用于蛋白质含量的分析。
( 1 ) 神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量的分析
在由此得到的上清液 a中加入 PBS:氯仿 =1.25ml : 1.25ml的溶剂， 进行振动 20分钟，迸行离心 ΟΟΟΟ ΐη, 5分钟）分离，得到上下两相。 回收下相， 并在 30 C、氮气保护下进行干燥 40分钟。在得到的干燥品 中加入 ΙΟΟ μ Ι的氯仿： 甲醇 =2ml: 1ml的溶剂进行溶解， 并用下述薄 板层析 （TLC) 法对其进行神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记 为 Cer和 GlyCer, 单位为 μ g/ml) 的解析。
将神经酰胺（或葡萄糖神经酰胺）标准品与样品溶液点至干燥 TLC 板上， 以 CHC13 : CH30H: CH3COOH ( 190： 9： 1 v/v/v) 为展层剂 进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹千展层剂； 重复 以上步骤一次。 然后以 CHCB : CH30H: C3H60 ( 76： 20： 4 v/v/v) 为展层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展 层， 以吹风机吹干。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180 °C烘烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡 萄糖神经酰胺） 分析。
(2) 蛋白质含量的分析
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述沉淀 b中加入 90 μ 1的 SDS (十二烷基磺酸钠） 溶液并 进行混合， 在 60°C下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却后在其中添 加 ΙΟΟμΙ的 2Ν的 HC1溶液， 按照 BCA Kit (蛋白质定量分析试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。
(3 ) 分析结果 '
对于本发明品和对照品的样品，分别测定 Cer/Pro和 GlyCer/Pro(见 下式） 。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro为 1， 在表 2中表示本发明 品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro的相对值。另夕卜， 以对照品每孔中的蛋白质 的量为 100，求出本发明品的每孔中的蛋白质的量的相对值（Pro.(%))， 并据此求出每孔的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （相对于对照品的 相对量）， SP , Cer/Well=Cer/Pro X Pro.(%), GlyCer/Well=GlyCer/Pro X Pro.(%) o 一并在表 2中表示。
如果 Cer/Pro (或 Cer/Wdl) 大于 1 (对照品的值） ， 则表明该样 品具有神经酰胺产生促进效果； 如果 GlyCer/Pro (或 GlyCer/Well) 大 于 1 (对照品的值），则表明该样品具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。
如表 2所示， 确认了本发明品 2-A具有神经酰胺产生促进效果和 葡萄糖神经酰胺产生促进效果。 实施例 2-2
在实施例 2-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用季也蒙毕赤酵母 Pichia guilliermondiO (保藏于江南大学工业 微生物资源和信息中心 CICIM , 编号 422- 19-3)代替异常毕赤酵母 (Pichia anomala ) ， 并且在豆渣发酵后得到的上清液中加入 2.5倍的 无水乙醇稀释后， 混合液超声处理 10分钟， 离心 GOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机 中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的 样品 2-B、 2-C , 干燥样品以 50%乙醇溶解， 将样品 2-B、 2-C分别配制 成 1%、 0.1%浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。 除 此之外， 与实施例 2-1同样进行操作， 并评价样品 2-B、 2-C的神经酰 胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果如表 2所示。
如表 2所示， 确认了本发明品 2-B、 2-C具有神经酰胺产生促进效 果。 实施例 2-3
在实施例 2- 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用挪威毕赤酵母 ( Pichia norvegensis ) (保藏于江南大学工业微生 物资源和信息中心 CICIM , 编号 CICIM Y015 1 )代替异常毕赤酵母 (Pichia anomala) ， 除此以外， 与实施例 2-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1 ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-D , 存于 4 °C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 OOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 2-E、 2-F, 将样品 2-E、 2-F分别以 50%乙 醇溶解而配制成 1%、 0.1 %浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培养 用添加物。 按照与实施例 2-1同样的方法评价样品 2-D、 2-E、 2-F的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。
如表 2所示， 确认了实施例 2-3的样品 2-D、 2-E、 2-F具有神经酰 胺产生促进效果。 实施例 2-4
在实施例 2-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用异常毕赤酵母 (Pichi議麵 !a (保藏于江南大学工业微生物资 源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0297)代替异常毕赤酵母 （编号 360-20-3 ) ， 除此以外， 与实施例 2-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-G， 存于 4 °C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心
GOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促迸剂的样品 2-H， 将样品 2- H以 50%乙醇溶解而配制 成 1 %浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 2-1同样的方法评价样品 2-G、 2-H的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。
如表 2所示， 确认了实施例 2-4的样品 2-G、 2-H具有神经酰胺和 葡萄糖神经酰胺产生促进效果。 实施例 2-5
在实施例 2- 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用异常毕赤酵母 Pichici画 mala (保藏于江南大学工业微生物资 源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0349)代替异常毕赤酵母 Pichia anomala ) (编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 2-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。 剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-1， 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 OOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 2-J、 2-K, 将样品 2-J、 2-K分别以 50%乙 醇溶解而配制成 1%、 0.1%浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞培养 用添加物。
按照与实施例 2- 1同样的方法评价样品 2-1、 2-J、 2-K的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。
如表 2所示， 确认了实施例 2-5的样品 2-1、 2-J、 2-K具有神经酰 胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。 实施例 2-6
在实施例 2-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用膜璞毕赤酵母 Pichia membranifaciens ) (保藏于江南大学工业 微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0360)代替异常毕赤酵母 (i¾/^ "oma/ ) (编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 2- 1同样进行 培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-L， 存于 4 °C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 OOOOrpm) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 2_M、 2-N， 将样品 2-M、 2-N分别以 50% 乙醇溶解而配制成 1%、 0.1 %浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞培 养用添加物。
按照与实施例 2-1 同样的方法评价样品 2-L、 2-M、 2-N的神经酰 胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。 如表 2所示， 确认了实施例 2-6的样品 2-L、 2-M、 2-N具有神经 酰胺产生促进效果。 实施例 2-7
在实施例 2-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用异常毕赤酵母 iPichia cmomala (保藏于江南大学工业微生物资 源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0420)代替异常毕赤酵母 Pichia anomala) (编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 2- 1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-0, 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 OOOOrpm) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 2-P、 2-Q, 将样品 2-P、 2-Q分别以 50%乙 醇溶解而配制成 1%、 0.1%浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培养 用添加物
按照与实施例 2- 1同样的方法评价样品 2-0、 2-P、 2-Q的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。
如表 2所示， 确认了实施例 2-7的样品 2-0、 2-P、 2-Q具有神经酰 胺产生促进效果。 实施例 2-8
在实施例 2-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用异常毕赤酵母 Pichia anomala (保藏于江南大学工业微生物资 源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0421)代替异常毕赤酵母 ί lochia anomala) (编号 360-20-3)， 除此以外， 与实施例 2-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟）。 剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-R, 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 OOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 2-S、 2-T, 将样品 2-S、 2-T分别以 50%乙 醇溶解而配制成 1 %、 0.1%浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞培养 用添加物。
按照与实施例 2- 1同样的方法评价样品 2-R、 2-S、 2-T的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。
如表 2所示， 确认了实施例 2-8的样品 2-R、 2-S、 2-T具有神经酰 胺产生促进效果。 实施例 2-9
在实施例 2- 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用伯顿毕赤酵母 Pichia burtonii (保藏于江南大学工业微生物资 源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0424)代替异常毕赤酵母 （编号 360-20-3 ) ， 除此以外， 与实施例 2- 1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。 剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-U， 存于 4 °C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 OOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 2-V, 将样品 2-V以 50%乙醇溶解而配制 成 1 %浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 2-1同样的方法评价样品 2-U、 2-V的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。
如表 2所示， 确认了实施例 2-9的样品 2-U、 2-V具有神经酰胺产 生促进效果。 实施例 2- 10
在实施例 2- 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用季也蒙毕赤酵母 (Pichia guilliermondii) (保藏于江南大学工业 微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0440)代替异常毕赤酵母 (编号 360-20-3 ) ， 除此以外， 与实施例 2- 1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟）。 剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-W,存于 4 °C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
按照与实施例 2-1同样的方法评价样品 2-W的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。
如表 2所示，确认了实施例 2-10的样品 2-W具有葡萄糖神经酰胺 产生促进效果。 实施例 2- 1 1
在实施例 2_ 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用季也蒙毕赤酵母 (Pichia guilliermondiO (保藏于江南大学工业 微生物资源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0326)代替异常毕赤酵母 (编号 360-20-3 ) ， 除此以外， 与实施例 2-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟）。 剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-X， 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心
OOOOrpm) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 2-Y， 将样品 2-Υ以 50%乙醇溶解而配制 成 0.1%浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 2- 1同样的方法评价样品 2-X、 2-Y的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。 如表 2所示， 确认了实施例 2- 1 1 的样品 2-X、 2-Y具有葡萄糖神 经酰胺产生促进效果。 实施例 2- 12
在实施例 2- 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用季也蒙毕赤酵母 Pichia guilliermondii) (保藏于江南大学工业 微生物资源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0329)代替异常毕赤酵母 (编号 360-20-3 ) ， 除此以外， 与实施例 2- 1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-Z， 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 ( 3000rpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 2-a， 将样品 2-a以 50%乙醇溶解而配制成 1 %浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 2-1同样的方法评价样品 2-Z、 2-a的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。
如表 2所示， 确认了实施例 2-12的样品 2-Z、 2-a具有神经酰胺和
/或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。 实施例 2- 13
在实施例 2- 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用季也蒙毕赤酵母 ( Pichia guilliermondii) (保藏于江南大学工业 微生物资源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0414)代替异常毕赤酵母 (编号 360-20-3 ) ， 除此以外， 与实施例 2-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释，对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超 声处理 10分钟， 离心 GOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液 （约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 2-b，将样品 2-b以 50%乙醇溶解而配制成 1%浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培养 用添加物。
按照与实施例 2-1 同样的方法评价样品 2-b的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 2中。
如表 2所示， 确认了实施例 2-13的样品 2-b具有神经酰胺和葡萄 糖神经酰胺产生促进效果。 表 2
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guilliermondii) 另夕卜， 对于样品 2-A~2-Z和 2-a、 2-b, 不将其加入到上述含角质 化细胞的 12孔板中 （即， 不进行上述细胞培养） 而直接进行神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量的分析， 除此以外的操作与上述实施例 2-1 同样进 行。 结果确认了样品 2-A〜2-Z和 2-a、 2-b本身中没有神经酰胺或葡萄 糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 但本发明品具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。 实施例 3-1 (神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造）
作为从豆渣制造神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生 物， 使用诞沫假丝酵母 ( Candida zeylanoides (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM,原始编号 472-20-1 )。
将在 YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培养基中 30°C 下培养后得到的上述菌株接种到含有神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促 进剂制造培养基 100ml的三角烧瓶 （容量 300ml ) 中， 在 30°C下培养 72小时。 该培养基含有 10w/v%豆渣和 lw/v%葡萄糖。 其中， 豆渣的 制备通过将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将 吸收了水分的大豆研磨破碎， 过滤并除去液体成分后， 将剩余残渣沥 干来得到。
然后， 为了从得到的培养液中回收神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺 产生促进剂， 以 3000rpm离心分离 10分钟除去菌体， 回收离心分离后 的上清液， 在回收后的培养上清液中加入 2.5 倍的无水乙醇稀释后取 lml , 作为本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品 (本发明品 3-Α-1 )。
接着， 再用超声波处理装置 （Branson 公司制造） 处理该粗品 10 分钟， 以 3000rpm离心分离 30分钟， 回收上清液。 用滤纸过滤该上清 液约 70ml， 再在 40°C以下真空干燥机中千燥该过滤液至恒重， 得到豆 渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 50\^%乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物的浓度为 lw/v% (本发明品 3-A-2 ) 后， 保存在 4°C下， 用于之后的 神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-2
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用诞沫假丝酵母 ^ Candida zeylanoides (从江南大学购入， 并保藏于 中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 原始编号 406-20-1 )。 采 用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰 胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-B-1 ) , 进而将该粗品精制得到的豆 渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。 进而， 用 50\^¼乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-B-2 ) 0.1 w/v% (本发明品 3-B-3 )后， 保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-3
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用近平滑假丝酵母 Candida parapsilosis ) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM，原始编号 5 14-20-3 )。 采用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经 酰胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-C-1 ) , 进而将该粗品精制得到的 豆渣发酵提取物，作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而，用 5(^ %乙醇溶解该豆渣发酵提取物，调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-C-2 )后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进试验。 实施例 3-4
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用近平滑假丝酵母 ( Ccmdi parapsilosis ) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM，原始编号 525-20-2)。 采用与实施例 3-1相同的方法得到豆渣发酵提取物。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-D-l )、 0.1w/v% (本发明品 3-D-2 )后， 保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-5
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用热带假丝酵母 i Candida metapsilosis ) (从江南大学购入， 并保藏 于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 原始编号 510-19-3 )。 采用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经 酰胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-E- 1 ) , 进而将该粗品精制得到的 豆渣发酵提取物，作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。 进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-E-2)、 0.1w/v% (本发明品 3-E-3 )后， 保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-6
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用近平滑假丝酵母 ( Candida parapsilosis) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0314 ) o 采用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-F- 1 ) , 进而将该粗品精 制得到的豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产 生促进剂。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-F-2)、 0.1 w/v% (本发明品 3-F-3 )后， 保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-7
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用近平滑假丝酵母 ί Candida parapsilosis ) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0322)。 采用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡 萄糖神经酖胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-G-1 ) , 进而将该粗品精 制得到的豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产 生促进剂。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-G-2)、 0.1 w/v% (本发明品 3-G-3 )后， 保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-8
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用博伊丁假丝酵母 ( Candida boidini (从江南大学购入， 并保藏于 中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0366 采用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-H-1 ) , 进而将该粗品精 制得到的豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产 生促进剂。
进而，用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物，调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-H-2 )后， 保存在 4Ό下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进试验。 实施例 3-9
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用热带假丝酵母 ( Candida metapsilosis ) (从江南大学购入， 并保藏 于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0439 采用与实施例 3-1相同的方法得到豆渣发酵提取物。
进而， 用 50 ^%乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-1-1 )、 0.1 w/v% (本发明品 3-1-2 ) 后， 保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-10
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用近平滑假丝酵母 ( Candida parapsilosis ) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 C1CIM Y0443 采用与实施例 3-1相同的方法得到豆渣发酵提取物。
进而， 用 50V/v°/。乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-J-l )、 0.1 w/v% (本发明品 3-J-2 ) 后， 保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-11
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用木兰假丝酵母 Ccmdidci magnoli ^ (从江南大学购入， 并保藏于
】 中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0184)o 采用与实施例 3-1相同的方法得到豆渣发酵提取物。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-Κ-1 )、 0.1 w/v% (本发明品 3-K- 2)后， 保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-12
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用麦芽糖假丝酵母 ( Candida maltoscO (从江南大学购入， 并保藏于 中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0207) o 采用与实施例 3-1相同的方法得到豆渣发酵提取物。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整其浓度为 0.1 w/v% (本发明品 3-L-1 ) 后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡 萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-13
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用解脂肪假丝酵母（Owi¾¾ W^to/_y/ c ) (从江南大学购入， 并保藏 于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0221 )。 采用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-Μ- 1 )， 进而将该粗品精 制得到的豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产 生促进剂， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生 促进试验。 实施例 3-14
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用丁酸假丝酵母 ( Ccmdkia imtyrO (从江南大学购入， 并保藏于中国 高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0233 )。采 用与实施例 3-1相同的方法得到豆渣发酵提取物。 进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整其浓度为 1 w/v% (本发明品 3-N-1) 后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡 萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-15
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用鹬虻假丝酵母 (Candida rhagiO (从江南大学购入， 并保藏于中国 高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIMY0248)。采 用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰 胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-0-1)， 进而将该粗品精制得到的豆 渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-0-2)、 0.1 w/v% (本发明品 3-0-3)后， 保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 3-16
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用诞沬假丝酵母 Candidazeylanoide (从江南大学购入， 并保藏于 中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0428)。 采用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-P-1), 进而将该粗品精 制得到的豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产 生促进剂。
进而，用 50ν/ν%乙醇溶解该豆渣发酵提取物，调整其浓度为 lw/v% (本发明品 3-P-2) 后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进试验。 实施例 3-17
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用近平滑假丝酵母 (Candida parapsilosis) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0325 )。 采用与实施例 3-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品 （本发明品 3-Q-1 ) , 进而将该粗品精 制得到的豆渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产 生促进剂。
进而，用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物，调整其浓度为 lw/v%
(本发明品 3-Q-2)后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进试验。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验）
<角质细胞 （Keratinocytes) 培养〉
首先， 取正常人的活化角质化细胞 （Cascade Co., Ltd) 作为原代 细胞， 于 75cm2培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml) ， 在 37°C、 C02浓度为 5%的条件下进行细胞培养， 直至培养到细胞聚集密度 ( confluence) 为 80〜90%。 再传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细 胞至 80〜90%浓度。 然后以 I X 105个细胞 /ml传代至 12孔板 （每孔容 积为 2ml) 中， 继续培养细胞至 80〜90%浓度。
然后， 更换不含有生长因子的培养基， 在上述 12孔板中 （n=2 ) 分别以 20μ1/孔的量添加上述实施例 3-1〜3-17中得到的豆渣发酵提取 物的乙醇水溶液。 另外， 只添加 50Wv%乙醇（没有添加神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进剂） 作为对照品， 相同培养条件下培养 72小时。 培养 72小时后， 弃去上清培养液，
用 2ml PBS (磷酸盐缓冲液） 清洗细胞两次， 再加入 1ml PBS至 板孔中， 以细胞收集器 （细胞铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经 酰胺 /葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。
<脂质提取〉
脂质提取采用 Bligh & Dyer法进行。 具体而言， 首先， 在上述回 收得到的含细胞的 PBS液中加入甲醇： 氯仿 =2.5ml: 1.25ml的溶剂， 振荡混合 20分钟， 进行离心分离 GOOOrpm, 5分钟） ， 从而得到上清 液和沉淀。将上清液 A转移至另外试管中用于神经酰胺 /葡萄糖神经酰 胺量的分析， 将沉淀 B用于蛋白质含量的分析。 <蛋白质含量分析〉
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述回收的沉淀 B中加入 900μ1的 SDS (十二烷基硫酸钠） 溶液并进行混合， 在 60°C水浴下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却 后在其中添加 ΙΟΟμΙ的 2N HC1溶液， 按照 BCA Kit (BCA蛋白浓度测 定^剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量分析〉
在残留的上清液 A中加入 PBS: 氯仿 =1.25mh 1.25ml的溶剂， 振 荡混合 20分钟， 3000rpm进行离心分离 5分钟， 分离、 回收作为下相 的氯仿层， 并在 30°C、氮气保护下干燥氯仿层 40分钟得到干燥品， 加 入 ΙΟΟμΙ的氯仿： 甲醇 =2.5ml: 1.25ml的溶剂进行溶解， 并用下述薄板 层析 （TLC) 法对神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记为 Cer和 GlyCer, 单位为 g/ml) 进行定量。
采用干燥 TLC板， 以氯仿： 甲醇：醋酸 （190: 9： 1 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹干展层剂； 重复以上步骤一次。 然后以氯仿： 甲醇： 丙酮 （76: 20： 4 v/v/v)为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展层， 以吹风机吹干。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180°C烘 烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡萄糖 神经酰胺） 分析。 '
然后， 根据下述公式（1 )， 将所得值分别除以各自的蛋白质含量， 得到 Cer/Pro和 GlyCer/Pro。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro为 1， 求出本发明的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro的相对值。并且， 以对照品每孔中 的蛋白质的量为 100， 求出每孔中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 (分别记为 Cer/Well和 GlyCer/Well, 相对于对照品的相对量） 。 一并 在表 3中表示。
公式 （1 )
Cer/Pro=神经酰胺量 （ g/ml) /蛋白质含量 g/ml)
GlyCer/Pro=葡萄糖神经酰胺量 （ g/ml) /蛋白质含量 ^g/ml) 表 3
Figure imgf000037_0001
如表 3所示， 实施例 3-1、 实施例 3-6〜3-7以及实施例 3-17中得 到的本发明品既具有神经酰胺产生促进效果， 又具有葡萄糖神经酰胺 产生促进效果， 另外， 实施例 3-2、 实施例 3-9〜3-13以及实施例 3- 15 中得到的本发明品的葡萄糖神经酰胺产生促进效果显著， 而实施例 3_3〜3-5、 实施例 3-8、 实施例 3-14以及实施例 3-16中得到的本发明 品的神经酰胺产生促进效果显著。
因此， 确 了本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂具有 神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。
(本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂中不存在神经酰 胺和葡萄糖神经酰胺的试验）
不经过细胞培养， 直接采用 TLC法对上述实施例 3-1〜3- 17中得 到的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂进行分析， 结果表明本发明 品中没有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中虽然不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰 胺，但具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酖胺产生促进剂使用。 实施例 4- 1
(神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造）
作为从豆渣制造神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生 物， 使用汉逊德巴利酵母 Debaryomyces hansenii (从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 原始编号 476-20-1 )。
将在 YPD ( Yeast Extract Peptone Dextrose Medium )培养基中 30°C 下培养后得到的上述菌株接种到含有神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促 进剂制造培养基 100ml的三角烧瓶 （容量 300ml ) 中， 在 30 °C下培养 72小时。 该培养基含有 10w/v%豆渣和 lw/V%葡萄糖。 其中， 豆渣的 制备通过将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将 吸收了水分的大豆研磨破碎， 过滤并除去液体成分后， 将剩余残渣沥 干来得到。
然后， 为了从得到的培养液中回收神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺 产生促进剂， 以 3000rpm离心分离 10分钟除去菌体， 回收离心分离后 的上清液， 在回收后的培养上清液中加入 2.5倍的无水乙醇， 再用超声 波处理装置 （Branson公司制造） 粉碎 10分钟， 以 3000rpm离心分离 30分钟， 回收上清液。用滤纸过滤该上清液约 70ml， 再在 40°C以下真 空干燥机中干燥该过滤液至恒重， 得到豆渣发酵提取物， 作为本发明 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 50 ^%乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 lw/v%后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。 实施例 4-2
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用汉逊德巴利酵母 (Debatyomyces hansenii) (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 原始编号 5 14-20-4)。 采用与实施例 4-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为 本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 lw/v%后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。 实施例 4-3
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用汉逊德巴利酵母 (Debaryomyces hansenii) (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0356 ) o 采用与实施例 4-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 lw/v%后， 保存在 4 °C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。 实施例 4-4 作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用汉逊德巴利酵母 (Debaryomyces hansenii) (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0286 采用与实施例 4-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 lw/v%后， 保存在 4 C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。 实施例 4-5
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用汉逊德巴利酵母 Debaryomyces hansenii) (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 iciM Y0287 ) . 采用与实施例 4-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 5 ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 lw/v%后， 保存在 4 °C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。 实施例 4-6
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用汉逊德巴利酵母 (Debaryomyces hansenii) (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0289 采用与实施例 4-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 50\^%乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 lw/v%后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。 实施例 4-7 作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用汉逊德巴利酵母 Debaryomyces hansenii) (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0290)。 采用与实施例 4- 1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 50\^%乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 lw/v%后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。 实施例 4-8
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用范丽德巴利酵母 ebaryomyces vanrijiae (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0198 采用与实施例 4- 1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 5(^ %乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 0.1w/v%后，保存在 4°C下，用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。 实施例 4-9
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用汉逊德巴利酵母 (Debaiyomyces hansenii) (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y035 1 采用与实施例 4-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 5 ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 lw/v%后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。 (神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验）
<角质细胞 （Keratinocytes ) 培养〉 首先，活化角质化细胞（Cascade Co., Ltd)作为原代细胞，于 75cm2 培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml) ， 在 37°C、 C02浓度为 5%的 条件下进行细胞培养， 直至培养到细胞聚集密度（confluence)为 80〜 90%。 再传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细胞至 80〜90%浓度。 然 后以 1 X 105个细胞 /ml传代至 12孔板 （每孔容积为 2ml ) 中， 继续培 养细胞至 80〜90%浓度。
然后， 更换不含有生长因子的培养基， 在上述 12孔板中 （n=2 ) 分别以 20μ1/孔的量添加上述实施例 4-1〜4-9中的含 lw/v%豆渣发酵提 取物的乙醇水溶液。 另外， 只添加 50v/v%乙醇 （没有添加神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂）作为对照品， 相同培养条件下培养 72小 时。 培养 72小时后， 弃去上清培养液， 用 2ml PBS (磷酸盐缓冲液） 清洗细胞两次 （2ml/孔） ， 再加入 1ml PBS至板孔中， 以细胞收集器 (细胞铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺和 蛋白质分析。
<脂质提取〉
脂质提取采用 Bligh & Dyer法进行。 具体而言， 首先， 在上述回 收得到的含细胞的 PBS液中加入甲醇： 氯仿 =2.5mh 1.25ml的溶剂， 振荡 20分钟， 进行离心分离 ( 3000rpm， 5分钟） ， 从而得到上清液和 沉淀。将上清液 A转移至另外试管中用于神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量 的分析， 将沉淀 B用于蛋白质含量的分析。
<蛋白质含量分析〉
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述回收的沉淀 B中加入 900μ1的 SDS (十二垸基硫酸钠） 溶液并进行混合， 在 60°C水浴下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却 后在其中添加 ΙΟΟμΙ的 2N HC 溶液， 按照 BCA Kit (BCA蛋白浓度测 定试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。 <神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量分析> 在残留的上清液 A中加入 PBS: 氯仿 =1.25ml: 1.25ml的溶剂， 振 动 20分钟， 3000rpm进行离心分离 5分钟， 分离、 回收作为下相的氯 仿层， 并在 3(TC、 氮气保护下干燥氯仿层 40分钟得到干燥品， 加入 ΙΟΟμΙ的氯仿： 甲醇 =2.5ml: 1.25ml的溶剂， 并用下述薄板层析（TLC) 法对神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记为 Cer和 GlyCe 单位 为 g/ml) 进行定量。
采用干燥 TLC板， 以氯仿： 甲醇：醋酸 （190: 9： 1 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹干展层剂； 重复以上步骤一次。 然后以氯仿： 甲醇： 丙酮 （76: 20： 4 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展层， 以吹风机吹干。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180°C烘 烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡萄糖 神经酰胺） 分析。
然后， 根据下述公式 （1 )， 将所得值分别除以各自的蛋白质含量， 得到 Cer/Pro和 GlyCer/Pro。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro为 1， 求出本发明的 Cer Pro和 GlyCer/Pro的相对值。并且， 以对照品每孔中 的蛋白质的量为 100， 求出每孔中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 (分别记为 Cer/Well和 GlyCer/Well, 相对于对照品的相对量） 。 一并 在表 4中表示。
公式 （1 )
Cer/Pro=神经酰胺量 g/ml) /蛋白质含量 （ g/ml )
GlyCer/Pro=葡萄糖神经酰胺量 （ g/ml ) /蛋白质含量 （ g/ml )
4
Cer Pro Cer/Well GlyCer/Pro GlyCer/Well
对照品 1 1 1 1
实施例 4-1 2.68 3.17 2.29 2.70
实施例 4-2 2.57 3.02 0.61 0.71
实施例 4-3 0.09 0.12 1.32 1.66
实施例 4-4 3.77 4.99 0.36 0.48
实施例 4-5 3.05 3.71 0.20 0.25
实施例 4-6 1.55 1.46 0.34 0.32
实施例 4-7 1.03 1.38 0.07 0.10
实施例 4-8 0.99 0.91 1.13 1.04 实施例 4-9 1.53 1.40 1.35 1.23 如表 4所示，实施例 4- 1以及实施例 4-9中得到的本发明品既具有 神经酰胺产生促进效果， 又具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果； 另外， 实施例 4-2以及实施例 4-4〜4-7中得到的本发明品的神经酰胺产生促 进效果显著，而实施例 4-3以及实施例 4-8中得到的本发明品的葡萄糖 神经酰胺产生促进效果显著。 因此， 确认了本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺 产生促进效果。 (本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂中不存在神经酰 胺和葡萄糖神经酰胺的试验）
不经过细胞培养， 直接采用 TLC法对上述实施例 4- 1〜4-9中得到 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂进行分析， 结果表明本发明品 中没有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中虽然不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰 胺，但具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备 （发酵液处理） > 首先， 按照以下方法制备培养基： 将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将吸收了水分的大豆研磨破碎， 将其过滤 并除去液体成分， 剩余残渣沥干， 得到豆渣。 将该豆渣与葡萄糖以及 水相混合， 并使豆渣和葡萄糖在混合物中的浓度分别达到 10w/V。/^Q lw/v% , 将该混合物作为培养基。'
然后， 将 100ml的上述培养基加至三角烧瓶中， 接种一定量的罗 伦隐球酵母 Cryptococcus laurentii (保藏于江南大学工业微生物资源 和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0232), 在 30 °C下培养 3天。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释，取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 5-A，存于 4 C冰箱中以备用作细 胞培养用添加物。
对该无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 OOOOrpm) 30分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 将此干燥品作为本发明的神经 酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 5-B、 5-C， 将样品 5-B、 5-C分别以 50%乙醇溶解而配制成 1%、 0.1%浓度的溶液， 存于 4°C冰 箱中作为细胞培养用添加物。 <神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的评价 >
(细胞培养）
首先， 取正常人的活化角质化细胞 （Cascade Co., Ltd) 作为原代 细胞， 于 75cm2培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml) ， 37°C、 C02 浓度为 5%的条件下培养细胞至 80〜90%浓度。 进行传代， 传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细胞至 80〜90%浓度。然后将传代后的人体表皮 细胞接种到 12孔板中，每孔容积为 2ml,细胞浓度为 I X 105个细胞 /ml, 继续培养细胞至 80〜90%浓度。
然后， 在上述 12 孔板中更换不含有生长因子的培养基， 将样品 5-A、 5-B、 5-C和对照品 （浓度为 5(^ ％的乙醇水溶液) 分别加入上 述 12孔板中 （n=2)， 相同培养条件下培养 3天。
3天培养后， 弃去上清培养液， 以 2ml PBS (磷酸盐缓冲液）对细 胞进行 2次清洗， 再加入 lml的 PBS至板孔中， 以细胞收集器 （细胞 铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺和蛋白质 分析。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果的确认）
在回收得到的含有细胞的 PBS 溶液中加入甲醇： 氯仿 =2.5ml: 1.25ml的溶剂， 进行振动 20分钟， 进行离心 （3000rpm， 5分钟） 分 离， 从而得到上清液 a和沉淀 b。 将上清液 a用于神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺量的分析， 将沉淀 b用于蛋白质含量的分析。
( 1 ) 神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量的分析 在由此得到的上清液 a中加入 PBS:氯仿 =1.25ml: 1.25ml的溶剂， 进行振动 20分钟，进行离心（3000rpm， 5分钟）分离，得到上下两相。 回收下相， 并在 30°C、氮气保护下进行干燥 40分钟。在得到的干燥品 中加入 100 /i l的氯仿： 甲醇 =2ml: 1ml的溶剂进行溶解， 并用下述薄 板层析 （TLC) 法对其进行神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记 为 Cer和 GlyCer, 单位为 / g/ml) 的解析。
将神经酰胺（或葡萄糖神经酰胺）标准品与样品溶液点至干燥 TLC 板上， 以 CHC13 : CH30H: CH3COOH ( 190： 9： 1 v/v/v) 为展层剂 进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹干展层剂； 重复 以上步骤一次。 然后以 CHCB : CH30H: C3H60 (76： 20： 4 v/v/v) 为展层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展 层， 以吹风机吹干。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180 °C烘烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡 萄糖神经酰胺） 分析。
(2) 蛋白质含量的分析
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述沉淀 b中加入 90 μ 1的 SDS (十二烷基磺酸钠） 溶液并 进行混合， 在 60°C下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却后在其中添 加 ΙΟΟμΙ的 2Ν的 HC1溶液， 按照 BCA Kit (蛋白质定量分析试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 μβ/ηι1)。
(3 ) 分析结果
对于本发明品和对照品的样品，分别测定 Cer/Pro和 GlyCer/Pro(见 下式） 。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro为 1， 在表 5中表示本发明 品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro的相对值。另夕卜， 以对照品每孔中的蛋白质 的量为 100，求出本发明品的每孔中的蛋白质的量的相对值（Pm.(%))， 并据此求出每孔的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （相对于对照品的 相对量）， 即， Cer/Well=Cer/Pro X Pro.(%) , GlyCer/Well=GlyCer/Pro X Pro.(%)0 一并在表 5中表示。
如果 Cer/Pro (或 Cer/Well) 大于 1 (对照品的值） ， 则表明该样 品具有神经酰胺产生促进效果； 如果 GlyCer/Pro (或 GlyCer/Well) 大 于 1 (对照品的值），则表明该样品具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。 如表 5所示， 确认了本发明品 5-A、 5-B和 5-C具有^ 3经酰胺产生 促进效果。 实施例 5-2
在实施例 5-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用匈牙利隐球酵母 Cryptococcus hungariciis (保藏于江南大学工 业微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0203)代替罗伦隐球酵 母 Cryptococc laurentii) (编号 CICIM Y0232), 除此以外， 与实施 例 5-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 5-D， 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 OOOOrpm) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 5-E、 5-F , 将样品 5-E、 5-F分别以 50%乙 醇溶解而配制成 1%、 0.1%浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培养 用添加物。
按照与实施例 5-1同样的方法评价样品 5-D、 5-E、 5-F的神经酰胺
/葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 5中。
如表 5所示， 确认了实施例 5-2的样品 5-D、 5-E、 5-F具有葡萄糖 神经酰胺产生促进效果。 实施例 5-3
在实施例 5-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用罗伦隐球酵母 i Cryptococcus laurentii (保藏于江南大学工业微 生物资源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0218)代替异罗伦隐球酵母 ( Cryptococcus laurentii) (编号 CICIM Y0232), 除此以外， 与实施例 5-1同样进行培养。 然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 5-G， 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心
( 3000rpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 5-H, 将样品 5-H以 50%乙醇溶解而配制 成 1%浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 5- 1同样的方法评价样品 5-G、 5-H的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 5中。
如表 5所示， 确认了实施例 5-3的样品 5-G、 5-H具有葡萄糖神经 酰胺产生促进效果。 实施例 5-4
在实施例 5- 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用匈牙利隐球酵母 Cryptococcus hungaricus (保藏于江南大学工 业微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0219)代替罗伦隐球酵 母 Cryptococcus laurentii) (编号 CICIM Y0232) , 除此以外， 与实施 例 5- 1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。 剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1 ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 5-1， 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心
( 3000rpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 5-J， 将样品 5-J以 50%乙醇溶解而配制成 1 %浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 5-1 同样的方法评价样品 5-1、 5-J的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 5中。 如表 5所示， 确认了实施例 5-4的样品 5-J具有葡萄糖神经酰胺产 生促进效果。
Figure imgf000049_0001
另外， 对于样品 5-A~5-J， 不将其加入到上述含角质化细胞的 12 孔板中 （即， 不进行上述细胞培养） 而直接迸行神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺量的分析，除此以外的操作与上述实施例 5- 1同样进行。结果确认 了样品 5-A〜5-J本身中没有神经酰胺或葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 但本发明品具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。 实施例 6-1
(神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促迸剂的制造) 作为从豆渣制造神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生 物， 使用多形汉逊酵母 Hansenula polymorpha) (从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0234 ) .
将在 YPD ( Yeast Extract Peptone Dextrose Medium )培养基中 30 °C 下培养后得到的上述菌株接种到含有神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促 进剂制造培养基 100ml的三角烧瓶 （容量 300ml ) 中， 在 30Ό下培养 72小时。 该培养基含有 10w/v%豆渣和 lw/v%葡萄糖。 其中， 豆渣的 制备通过将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将 吸收了水分的太豆研磨破碎， 过滤并除去液体成分后， 将剩余残渣沥 干来得到。
然后， 为了从得到的培养液中回收神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺 产生促进剂， 以 3000rpm离心分离 10分钟除去菌体， 回收离心分离后 的上清液， 在回收后的培养上清液中加入 2.5倍的无水乙醇， 再用超声 波处理装置 （Branson公司制造） 粉碎 10分钟， 以 3000rpm离心分离 30分钟， 回吹上清液。用滤纸过滤该上清液约 70ml， 再在 40°C以下真 空干燥机中干燥该过滤液至恒重， 得到豆渣发酵提取物， 作为本发明 的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 50\^%乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整豆渣发酵提取 物浓度为 0.1w/v% (本发明品 6-A-1 ) 后， 保存在 4°C下， 用于之后的 神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 6-2
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊酵母 amenula polymorpha) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0205 ) o 采用与实施例 6-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂（本发明品 6-B-1 )后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 6-3 1 001877 作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊酵母 iHansenula polymorph^ (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0257)。 采用与实施例 6-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 进而， 用 5(^ %乙 醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整其浓度为 0.1w/v% (本发明品 6-C-1 ) 后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试 验。 实施例 6-4
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊酵母 Ha emda polymorpha) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0122)。 采用与实施例 6-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 （本发明品 6-D-1 ) , 进而，用 50ν/ν%乙醇溶解该豆渣发酵提取物，分别调整其浓度为 lw/v%
(本发明品 6-D-2)、 0.1 w/v% (本发明品 6-D-3 ) 后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 6-5
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊酵母 Hansenula polymorpha) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0135 )。 采用与实施例 6-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂（本发明品 6-E-1 )后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 6-6
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用西弗汉逊酵母 iHansenula ciferrii (从江南大学购入， 并保藏于中 国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0150)。 采用与实施例 6-1相同的方法得到豆渣发酵提取物，作为本发明的神经 酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂， 进而， 用 50v/v%乙醇溶解该豆 渣发酵提取物，调整其浓度为 lw/v% (本发明品 6-F-1 )后，保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 6-7
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用多形汉逊酵母 Hans醒 la polymorpha) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0197) o 采用与实施例 6-1 相同的方法得到豆渣发酵提取物， 作为本 发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 （本发明品 6-G-1 ) , 进而，用 50Wv%乙醇溶解该豆渣发酵提取物，分别调整其浓度为 lw/v%
(本发明品 6-G-2)、 0.1 w/v% (本发明品 6-G-3 ) 后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验）
<角质细胞 （Keratinocytes) 培养 >
首先，活化角质化细胞（Cascade Co., Ltd)作为原代细胞，于 75cm2 培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml ) ， 在 37°C、 C02浓度为 5%的 条件下进行细胞培养， 直至培养到细胞聚集密度（confluence )为 80〜 90%。 再传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细胞至 80〜90%浓度。 然 后以 1 X 105个细胞 /ml传代至 12孔板 （每孔容积为 2ml ) 中， 继续培 养细胞至 80〜90%浓度。
然后， 更换不含有生长因子的培养基， 在上述 12孔板中 （n=2 ) 分别以 20μ1/孔的量添加上述实施例 6-1〜6-7中得到的豆渣发酵提取物 的乙醇水溶液。 另外， 只添加 50ν/ν%乙醇（没有添加神经酰胺和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂）作为对照品，相同培养条件下培养 72小时。 培养 72小时后， 弃去上清培养液， 用 2ml PBS (磷酸盐缓冲液） 清洗 细胞两次 （2ml/孔） ， 再加入 1ml PBS至板孔中， 以细胞收集器 （细 胞铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺和蛋白 质分析。 <脂质提取>
脂质提取采用 Bligh & Dyer法进行。 具体而言， 首先， 在上述回 收得到的含细胞的 PBS液中加入甲醇： 氯仿 =2.5ml: 1.25ml的溶剂， 振荡 20分钟， 进行离心分离（3000rpm， 5分钟） ， 从而得到上清液和 沉淀。将上清液 A转移至另外试管中用于神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量 的分析， 将沉淀 B用于蛋白质含量的分析。
<蛋白质含量分析〉
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述回收的沉淀 B中加入 900μ1的 SDS (十二垸基硫酸钠） 溶液并进行混合， 在 60°C水浴下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却 后在其中添加 ΙΟΟμΙ的 2N HC1溶液， 按照 BCA Kit (BCA蛋白浓度测 定试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量分析〉
在残留的上清液 A中加入 PBS: 氯仿 =1.25mh 1.25ml的溶剂， 振 动 20分钟， 3000rpm进行离心分离 5分钟， 分离、 回收作为下相的氯 仿层， 并在 30°C、 氮气保护下干燥氯仿层 40分钟得到干燥品， 加入 ΙΟΟμΙ的氯仿： 甲醇 =2.5ml: 1.25ml的溶剂， 并用下述薄板层析（TLC) 法对神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记为 Cer和 GlyCer, 单位 为 g/ml) 进行定量。
采用干燥 TLC板， 以氯仿： 甲醇：醋酸 （190: 9： v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹千展层剂； 重复以上步骤一次。 然后以氯仿： 甲醇： 丙酮（76: 20： 4 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展层， 以吹风机吹干。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180°C烘 烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡萄糖 神经酰胺） 分析。
然后， 根据下述公式 （1 )， 将所得值分别除以各自的蛋白质含量， 得到 Cer/Pro和 GlyCer/Pro。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro为 1， 求出本发明的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro的相对值。并且， 以对照品每孔中 的蛋白质的量为 100， 求出每孔中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 (分别记为 Cer/Wdl和 GlyCer/Well， 相对于对照品的相对量） 。 一并 在表 6中表示。
公式 （1 )
Cer/Pro=神经酰胺量 （ g/ml) /蛋白质含量 （ g/ml)
GlyCer/Pro=葡萄糖神经酰胺量 （ g/ml) /蛋白质含量 （ g/ml) 表 6
Figure imgf000054_0001
如表 6所示，实施例 6-2中得到的本发明品既具有神经酰胺产生促 进效果， 又具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果； 另外， 实施例 6-1、 实 施例 6-3以及实施例 6-6中得到的本发明品的神经酰胺产生促进效果显 著，而实施例 6-4以及实施例 6-7中得到的本发明品的葡萄糖神经酰胺 产生促进效果显著。 因此， 确认了本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经 酰胺产生促进剂具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生 促进效果。 (本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂中不存在神 经酰胺和葡萄糖神经酰胺的试验）
不经过细胞培养， 直接采用 TLC法对上述实施例 6- 1〜6-7中得到 的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂进行分析， 结果表明本发 明品中没有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中虽然不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰 胺，但具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。 实施例 7-1
(神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造）
作为从豆渣制造神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生 物， 使用铁杉布勒掷孢酵母 (Bulle tsugcw (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0259 ) o
将在 YPD ( Yeast Extract Peptone Dextrose Medium )培养基中 30°C 下培养后得到的上述菌株接种到含有神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促 进剂制造培养基 100ml的三角烧瓶 （容量 300ml ) 中， 在 30 °C下培养 72小时。 该培养基含有 10w/v%豆渣和 l w/v%葡萄糖。 其中， 豆渣的 制备通过将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将 吸收了水分的大豆研磨破碎， 过滤并除去液体成分后， 将剩余残渣沥 干来得到。
然后， 为了从得到的培养液中回收神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺 产生促进剂， 以 3000rpm离心分离 10分钟除去菌体， 回收离心分离后 的上清液， 在回收后的培养上清液中加入 2.5 倍的无水乙醇稀释后取 l ml , 作为本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品 (本发明品 7-A)。
接着， 再用超声波处理装置 （Branson 公司制造） 处理该粗品 10 分钟， 以 3000rpm离心分离 30分钟， 回收上清液。 用滤纸过滤该上清 液约 70ml， 再在 40°C以下真空干燥机中干燥该过滤液至恒重， 得到豆 渣发酵提取物， 作为本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂。
进而， 用 50Wv%乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 lw/v% (本发明品 7-B)、 0.1 w/v% (本发明品 7-C )后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验）
<角质细胞 （Keratinocytes) 培养〉
首先，活化角质化细胞（Cascade Co., Ltd)作为原代细胞，于 75cm2 培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml) ， 在 37°C、 C02浓度为 5%的 条件下进行细胞培养， 直至培养到细胞聚集密度（confluence)为 80〜 90%。 再传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细胞至 80〜90%浓度。 然 后以 1 X 105个细胞 /ml传代至 12孔板 （每孔容积为 2ml ) 中， 继续培 养细胞至 80〜90%浓度。
然后， 更换不含有生长因子的培养基， 在上述 12孔板中 （n=2 ) 分别以 20μ1/孔的量添加上述实施例 7-1 中得到的豆渣发酵提取物的乙 醇水溶液 （本发明品 7-A〜7-C)。 另外， 只添加 50v/V。/。乙醇 （没有添 加神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂） 作为对照品， 相同培养 条件下培养 72小时。 培养 72小时后， 弃去上清培养液， 用 2ml PBS (磷酸盐缓冲液） 清洗细胞两次 （2ml/孔） ， 再加入 1ml PBS至板孔 中， 以细胞收集器 （细胞铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。
<脂质提取〉
脂质提取采用 Bligh & Dyer法进行。 具体而言， 首先， 在上述回 收得到的含细胞的 PBS液中加入甲醇： 氯仿 =2.5ml: 1.25ml的溶剂， 振荡 20分钟， 进行离心分离（3000rpm， 5分钟） ， 从而得到上清液和 沉淀。将上清液 A转移至另外试管中用于神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量 的分析， 将沉淀 B用于蛋白质含量的分析。
<蛋白质含量分析〉 为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述回收的沉淀 B中加入 900μ1的 SDS (十二垸基硫酸钠） 溶液并进行混合， 在 60°C水浴下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却 后在其中添加 ΙΟΟμΙ的 2N HC1溶液， 按照 BCA Kit (BCA蛋白浓度测 定试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量分析〉
在残留的上清液 A中加入 PBS: 氯仿 =L25ml: 1.25ml的溶剂， 振 动 20分钟， 3000rpm进行离心分离 5分钟， 分离、 回收作为下相的氯 仿层， 并在 30°C、 氮气保护下干燥氯仿层 40分钟得到千燥品， 加入 ΙΟΟμΙ的氯仿： 甲醇 =2.5ml: 1.25ml的溶剂， 并用下述薄板层析（TLC) 法对神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记为 Cer和 GlyCer, 单位 为 g/ml) 进行定量。
采用干燥 TLC板， 以氯仿： 甲醇：醋酸 （190: 9： 1 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹干展层剂； 重复以上步骤一次。 然后以氯仿： 甲醇： 丙酮 （76: 20： 4 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展层， 以吹风机吹干。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180°C烘 烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡萄糖 神经酰胺） 分析。
然后， 根据下述公式 （1 )， 将所得值分别除以各自的蛋白质含量， 得到 Cer/Pro和 GlyCer/Pro。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro为 1， 求出本发明的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro的相对值。并且， 以对照品每孔中 的蛋白质的量为 100， 求出每孔中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 (分别记为 Cer/Well和 GlyCer/Well， 相対于对照品的相对量） 。 一并 在表 7中表示。
公式 （1 )
Cer/Pro=神经酰胺量 （ g/ml) /蛋白质含量 （ g/ml)
GlyCer/Pro=葡萄糖神经酰胺量 （ g/ml) /蛋白质含量 （ g/ml) 表 7
Figure imgf000057_0001
No. 对照品 1 1 1 1 实 本发明品 7-A 1.01 1.12 0.78 0.86 施 本发明品 7-B 1.74 2.03 1.07 1.26 例
本发明品 7-C 4.23 3.95 0.96 0.90 7-1 如表 7所示， 实施例 7-1中得到的本发明品 7-A〜7-C的神经酰胺 产生促进效果都显著。 因此， 确认了本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神 经酰胺产生促进剂具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产 生促进效果。
(本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂中不存在神 经酰胺和葡萄糖神经酰胺的试验）
不经过细胞培养， 直接采用 TLC法对上述实施例 7-1中得到的神 经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂进行分析， 结果表明本发明品 中没有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中虽然不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰 胺，但具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。 实施例 8-1
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备 （发酵液处理） > 首先， 按照以下方法制备培养基： 将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将吸收了水分的大豆研磨破碎， 将其过滤 并除去液体成分， 剩余残渣沥干， 得到豆渣。 将该豆渣与葡萄糖以及 水相混合， 并使豆渣和葡萄糖在混合物中的浓度分别达到 10^ %和 lw/v%, 将该混合物作为培养基。
然后， 将 100ml的上述培养基加至三角烧瓶中， 接种一定量的粘 性红圆酵母 Rhodotonda mucilaginosa) (保藏于江南大学工业微生物 资源和信息中心 CICIM, 编号 CICIM Y0250), 在 30°C下培养 3天。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释，取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-A，存于 4 C冰箱中以备用作细 胞培养用添加物。
对该无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 GOOOrpm) 30分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液 真空干燥机中干燥至恒重， 将此干燥品作为本发明的神经 酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-B、 8-C, 将样品 8-B、 8-C分别以 50%乙醇溶解而配制成 1%、 0.1%浓度的溶液， 存于 4°C冰 箱中作为细胞培养用添加物。 <神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的评价 >
(细胞培养）
首先， 取正常人的活化角质化细胞 （Cascade Co., Ltd) 作为原代 细胞， 于 75cm2培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml) ， 37°C、 C02 浓度为 5%的条件下培养细胞至 80〜90%浓度。 进行传代， 传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细胞至 80〜90%浓度。然后将传代后的人体表皮 细胞接种到 12孔板中，每孔容积为 2ml，细胞浓度为 1 X 105个细胞 /ml， 继续培养细胞至 80〜90%浓度。
然后，在上述 12孔板中更换不含有生长因子的培养基，将样品 8-A、 8-B、 8-C和对照品 （浓度为 5(^ %的乙醇水溶液） 分别加入上述 12 孔板中 （n=2)， 相同培养条件下培养 3天。
3天培养后， 弃去上清培养液， 以 2ml PBS (磷酸盐缓冲液）对细 胞进行 2次清洗， 再加入 lml的 PBS至板孔中， 以细胞收集器 （细胞 铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺和蛋白质 分析。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果的确认）
在回收得到的含有细胞的 PBS 溶液中加入甲醇： 氯仿 =2.5ml : 1.25ml的溶剂， 进行振动 20分钟， 进行离心 （3000rpm， 5分钟） 分 离， 从而得到上清液 a和沉淀 b。 将上清液 a用于神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺量的分析， 将沉淀 b用于蛋白质含量的分析。
( 1 ) 神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量的分析 在由此得到的上清液 a中加入 PBS:氯仿 =1.25ml: 1.25ml的溶剂， 进行振动 20分钟，进行离心（3000rpm， 5分钟）分离，得到上下两相。 回收下相， 并在 30°C、氮气保护下进行干燥 40分钟。 在得到的干燥品 中加入 ΙΟΟ μ Ι的氯仿： 甲醇 =2mh 1ml的溶剂进行溶解， 并用下述薄 板层析 （TLC) 法对其进行神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记 为 Cer和 GlyCer, 单位为 g/ml) 的解析。
将神经酰胺（或葡萄糖神经酰胺 )标准品与样品溶液点至干燥 TLC 板上， 以 CHCB : CH30H: CH3COOH ( 190： 9： 1 v/v/v) 为展层剂 进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹干展层剂； 重复 以上步骤一次。 然后以 CHCB : CH30H: C3H60 (76： 20： 4 v/v/v) 为展层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展 层， 以吹风机吹干。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180 °C烘烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡 萄糖神经酰胺） 分析。
(2) 蛋白质含量的分析
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述沉淀 b中加入 90 μ 1的 SDS (十二垸基磺酸钠） 溶液并 进行混合， 在 60°C下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却后在其中添 加 ΙΟΟμΙ的 2Ν的 HC1溶液， 按照 BCA Kit (蛋白质定量分析试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。
(3 ) 分析结果
对于本发明品和对照品的样品，分别测定 Cer/Pro和 GlyCer/Pro(见 下式） 。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer Pro为 1， 在表 8中表示本发明 品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro的相对值。另夕卜， 以对照品每孔中的蛋白质 的量为 100，求出本发明品的每孔中的蛋白质的量的相对值（Pro.(%))， 并据此求出每孔的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （相对于对照品的 相对量）， 即， Cer/Well=Cer/Pro X Pro.(%) , GlyCer/Well=GlyCer/Pro X Pro.(%)0 一并在表 8中表示。
如果 Cer/Pro (或 Cer/Well) 大于 1 (对照品的值） ， 则表明该样 品具有神经酰胺产生促进效果； 如果 GlyCer/Pro (或 GlyCer/Well) 大 于 1 (对照品的值），则表明该样品具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。 如表 8所示， 确认了本发明品 8-A、 8-B和 8-C具有神经酰胺产生 促进效果。 实施例 8-2
在实施例 8- 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用粘性红圆酵母 Rhodotorula mucilaginosa ) (保藏于江南大学工 业微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0433)代替粘性红圆酵 母 (Rhodotorula mucilaginosa ^) (编号 CICIM Y0250) , 除此以外， 与实 施例 8- 1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。 剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-D， 存于 4 °C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 GOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 8-E、 8-F , 将样品 8-E、 8-F分别以 50%乙 醇溶解而配制成 1 %、 0.1%浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培养 用添加物。
按照与实施例 8- 1同样的方法评价样品 8-D、 8-E、 8-F的神经酰胺
/葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 8中。
如表 8所示， 确认了实施例 8-2的样品 8-E、 8-F具有葡萄糖神经 酰胺产生促进效果。 实施例 8-3
在实施例 8- 1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用用粘性红圆酵母 (Rhodotorula mucilaginosa ) (保藏于江南大学 工业微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0430)代替粘性红圆 酵母 Rhodotonda mucilaginosa) (编号 CICIM Y0250), 除此以外， 与 实施例 8-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-G， 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
按照与实施例 8-1同样的方法评价样品 8-G的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 8中。
如表 8所示， 确认了实施例 8-3的样品 8-G具有神经酰胺和葡萄 糖神经酰胺产生促进效果。 实施例 8-4
在实施例 8-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用粘红酵母 Rhodoto la glutinis (保藏于江南大学工业微生物资 源和信息中心 CICIM , 编号 CICIM Y0148)代替粘性红圆酵母 (Rhodotorula mucilaginosa ) (编号 CICIM Y0250), 除此以外， 与实施 例 8- 1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释，对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超 声处理 10分钟， 离心 （3000rpm) 10分钟， 收集上清液 （约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-H， 将样品 8-H 以 50%乙醇溶解而配制成 1%浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培 养用添加物。
按照与实施例 8- 1 同样的方法评价样品 8-H的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 8中。
如表 8所示， 确认了实施例 8-4的样品 8-H具有葡萄糖神经酰胺 产生促进效果。 实施例 8-5
在实施例 8-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用粘性红圆酵母 iRhodotonda mucilaginosa} (保藏于江南大学工 业微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0324)代替粘性红圆酵 母 Rhodotorula mucilaginos O (编号 CICIM Y0250), 除此以外， 与实 施例 8-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释，对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超 声处理 10分钟， 离心 GOOOrpm) 10分钟， 收集上清液 （约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-1、 8-J, 将样品 8-1、 8-J分别以 50%乙醇溶解而配制成 1%、. 0.1%浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞培养用添加物。
按照与实施例 8-1 同样的方法评价样品 8-1、 8-J的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 8中。
如表 8所示， 确认了实施例 8-5的样品 8-1、 8-J具有葡萄糖神经酰 胺产生促进效果。 实施例 8-6
在实施例 8-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用粘性红圆酵母 (Rhodotoru mucilaginosa ) (保藏于江南大学工 业微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0337)代替粘性红圆酵 母 (Rhodotoruh mucilaginosa ) (编号 CICIM Y0250), 除此以外， 与实 施例 8-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离 GOOOrpm, 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-K, 存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
按照与实施例 8-1同样的方法评价样品 8-K的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 8中。
如表 8所示， 确认了实施例 8-6的样品 8-K具有葡萄糖神经酰胺 产生促进效果。 实施例 8-7
在实施例 8-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用粘性红圆酵母 (Rhodotoruh mucilaginosa) (保藏于江南大学工 业微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0394)代替粘性红圆酵 母 Rhodotorula muci ginosa (编号 CICIM Y0250), 除此以外， 与实 施例 8-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释，对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超 声处理 10分钟， 离心 GOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液 （约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-L， 将样品 8-L 分别以 50%乙醇溶解而配制成 1%浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细 胞培养用添加物。
按照与实施例 8-1 同样的方法评价样品 8-L的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 8中。
如表 8所示，确认了实施例 8-7的样品 8-L具有神经酰胺和葡萄糖 神经酰胺产生促进效果。 实施例 8-8
在实施例 8-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用粘性红圆酵母 Rhodotoru mucilaginosa) (保藏于江南大学工 业微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIMY0418)代替粘性红圆酵 母 (Rhodotonda mucilaginosa (编号 CICIM Y0250), 除此以外， 与实 施例 8-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释， 取 1ml混合液作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-M，存于 4°C冰箱中以备用作细胞 培养用添加物。
对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理 10 分钟， 离心 GOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液（约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤 液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂的样品 8-N、 8-0， 将样品 8-N、 8-0分别以 50% 乙醇溶解而配制成 1%、 0.1%浓度的溶液， 存于 4°C冰箱中作为细胞培 养用添加物。 按照与实施例 8- 1同样的方法评价样品 8-M、 8-N、 8-0的神经酰 胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 8中。
如表 8所示， 确认了实施例 8-8的样品 8-M、 8-N、 8-0具有神经 酰胺和葡萄糖神经酰胺产生促进效果。 实施例 8-9
在实施例 8-1 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程 中， 用粘性红圆酵母 (Rhodotorula mucilaginosa ) (保藏于江南大学工 业微生物资源和信息中心 CICIM,编号 CICIM Y0423)代替粘性红圆酵 母 (Rhodotorula mucilaginoscO (编号 CICIM Y0250) , 除此以外， 与实 施例 8-1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离（3000rpm， 10分钟） 。剩余上清 液加入 2.5倍的无水乙醇稀释，对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超 声处理 10分钟， 离心 GOOOrpm ) 10分钟， 收集上清液 （约 70ml)， 上清液以滤纸过滤得滤液， 滤液于真空干燥机中干燥至恒重， 作为本 发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品 8-P， 将样品 8-P 以 50%乙醇溶解而配制成 0.1%浓度的溶液， 存于 4 °C冰箱中作为细胞 培养用添加物。
按照与实施例 8-1 同样的方法评价样品 8-P的神经酰胺 /葡萄糖神 经酰胺产生促进效果， 结果一并表示在表 8中。
如表 8所示，确认了实施例 8-9的样品 8-P具有神经酰胺和葡萄糖 神经酰胺产生促进效果。
表 8
Figure imgf000065_0001
( Rhodotorula 本发明品 0.04 0.04 0.94 1.02 mucilaginosa ) 8-E
本发明品 0.05 0.07 0.85 1.1 1 8-F
粘性红圆酵母
- CICIM 本发明品
( Rhodotorula 1.20 1.13 1.24 1.16 Y0430 8-G
mucilaginosa )
粘红酵母
- CICIM 本发明品
( Rhodotorula 0.44 0.43 1.06 1 .05 Y0148 8-H
glutinis )
本发明品
粘性红圆酵母 0.24 0.28 1 .08 1.26- CICIM 8-1
( Rhodotorula
Y0324 本发明品
mucilaginosa ) 0.57 0.47 1.50 1.23
8-J
粘性红圆酵母
- CICIM 本发明品
{ Rhodotorula 0.45 0.41 1.69 1.54 Y0337 8-K
mucilaginosa)
粘性红圆酵母
- CICIM 本发明品
( Rhodotorula 3.19 2.48 4.62 3.60 Y0394 8-L
mucilaginosa )
本发明品 4.27 3.20 3.51 2.63 8-M
粘性红圆酵母
- CICIM 本发明品
( Rhodotorula 2.06 1.77 2.59 2.23 Y0418 8-N
mucilaginosa )
本发明品 2.41 1.94 2.52 2.03 8-0
粘性红圆酵母
- CICIM 本发明品
( Rhodotorula 1.96 2.12 2.38 2.58 Y0423 8-P
mucilaginosa ) 另外， 对于样品 8-A~8-P， 不将其加入到上述含角质化细胞的 12 孔板中 （即， 不进行上述细胞培养） 而直接进行神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺量的分析，除此以外的操作与上述实施例 8-1同样进行。结果确认 了样品 8-A〜8- P本身中没有神经酰胺或葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰胺， 但本发明品具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。 实施例 9-1
(神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造） 作为从豆渣制造神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生 物， 使用粉红掷抱酵母 Sporobolomyces msew ) (从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0247
将在 YPD ( Yeast Extract Peptone Dextrose Medium )培养基中 30 °C 下培养后得到的上述菌株接种到含有神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促 进剂制造培养基 100ml的三角烧瓶 （容量 300ml ) 中， 在 30°C下培养 72小时。 该培养基含有 10w/v%豆渣和 lw/v%葡萄糖。 其中， 豆渣的 制备通过将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将 吸收了水分的大豆研磨破碎， 过滤并除去液体成分后， 将剩余残渣沥 干来得到。
然后， 为了从得到的培养液中回收神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺 产生促进剂， 以 3000rpm离心分离 10分钟除去菌体， 回收离心分离后 的上清液， 在回收后的培养上清液中加入 2.5倍的无水乙醇， 得到本发 明的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品 （本发明品 9-A)， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进 试验。 实施例 9-2
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用粉红掷孢酵母 Sporobolomyces roseus ) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0193 采用与实施例 9- 1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品，接着，再用超声波处理装置（Branson 公司制造） 处理该粗品 10分钟， 以 3000rpm离心分离 30分钟， 回收 上清液。 用滤纸过滤该上清液约 70ml， 再在 40°C以下真空干燥机中干 燥该过滤液至恒重， 得到作为本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生 促进剂的豆渣发酵提取物。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整其浓度为 0.1 w/v% (本发明品 9-B ) 后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 9-3
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用粉红掷孢酵母 Sporobolomyces wseus ) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0132)。 采用与实施例 9-1相同的方法得到本发明的神经酰胺和 /或葡 萄糖神经酰胺产生促进剂的粗品 （本发明品 9-C)， 接着， 再用超声波 处理装置 （Branson公司制造） 处理该粗品 10分钟， 以 3000rpm离心 分离 30分钟， 回收上清液。 用滤纸过滤该上清液约 70ml， 再在 40°C 以下真空干燥机中干燥该过滤液至恒重， 得到作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的豆渣发酵提取物。
进而，用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物，调整其浓度为 lw/v% (本发明品 9-D)后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进试验。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促迸试验）
<角质细胞 （Keratinocytes ) 培养 >
首先， 取正常人的活化角质化细胞 （Cascade Co., Ltd) 作为原代 细胞， 于 75cm2培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml ) ， 在 37°C、 C02浓度为 5%的条件下进行细胞培养， 直至培养到细胞聚集密度 ( confluence) 为 80〜90%。 再传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细 胞至 80〜90%浓度。 然后以 I X 105个细胞 /ml传代至 12孔板 （每孔容 积为 2ml ) 中， 继续培养细胞至 80〜90%浓度。
然后， 更换不含有生长因子的培养基， 在上述 12孔板中 （n=2 ) 分别以 20μ1/孔的量添加上述实施例 9-1〜9-3中得到的豆渣发酵提取物 的乙醇水溶液。 另外， 只添加 5(^ %乙醇（没有添加神经酰胺 /葡萄糖 神经酰胺产生促进剂） 作为对照品， 相同培养条件下培养 72小时。 培 养 72小时后， 弃去上清培养液，
用 2ml PBS (磷酸盐缓冲液） 清洗细胞两次， 再加入 1ml PBS至 板孔中， 以细胞收集器 （细胞铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经 酰胺 /葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。 <脂质提取〉
脂质提取采用 Bligh & Dyer法进行。 具体而言， 首先， 在上述回 收得到的含细胞的 PBS液中加入甲醇： 氯仿 =2.5ml: 1.25ml的溶剂， 振荡混合 20分钟， 进行离心分离（3000rpm， 5分钟） ， 从而得到上清 液和沉淀。将上清液 A转移至另外试管中用于神经酰胺 /葡萄糖神经酰 胺量的分析， 将沉淀 B用于蛋白质含量的分析。
<蛋白质含量分析>
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述回收的沉淀 B中加入 900μ1的 SDS (十二垸基硫酸钠） 溶液并进行混合， 在 60°C水浴下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却 后在其中添加 ΙΟΟμΙ的 2N HC1溶液， 按照 BCA Kit (BCA蛋白浓度测 定试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量分析>
在残留的上清液 A中加入 PBS: 氯仿 =1.25ml: 1.25ml的溶剂， 振 荡混合 20分钟， 3000rpm进行离心分离 5分钟， 分离、 回收作为下相 的氯仿层， 并在 30°C、氮气保护下干燥氯仿层 40分钟得到干燥品， 加 入 ΙΟΟμΙ的氯仿： 甲醇 =2.5ml: 1.25ml的溶剂进行溶解， 并用下述薄板 层析 （TLC) 法对神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记为 Cer和 GlyCer, 单位为 g/ml) 进行定量。
采用干燥 TLC板， 以氯仿： 甲醇：醋酸 （190: 9： 1 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹千展层剂； 重复以上步骤一次。 然后以氯仿： 甲醇： 丙酮 （76: 20： 4 v/v/v ) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展层， 以吹风机吹干。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180Ό烘 烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡萄糖 神经酰胺） 分析。
然后， 根据下述公式 （1 )， 将所得值分别除以各自的蛋白质含量， 得到 Cer/Pro和 GlyCer/Pro。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro为 1， 求出本发明的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro的相对值。并且， 以对照品每孔中 的蛋白质的量为 100， 求出每孔中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 (分别记为 Cer/Wdl和 GlyCer/Well， 相对于对照品的相对量） 。 一并 在表 9中表示。
公式 （1 )
Cer/Pro=申经酰胺量 （ g/ml ) /蛋白质含量 （ g/ml )
GlyCer/Pro=葡萄糖神经酰胺量 （ g/ml ) /蛋白质含量 （ g/ml) 表 9
Figure imgf000070_0001
如表 9所示， 实施例 9-1、 实施例 9-3中得到的本发明品的葡萄糖 神经酰胺产生促进效果显著，而实施例 9-2中得到的本发明品的神经酰 胺产生促迸效果显著。
因此， 确认了本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酖胺产生促进剂具有 神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。.
(本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂中不存在神经酰 胺和葡萄糖神经酰胺的试验）
不经过细胞培养， 直接采用 TLC法对上述实施例 9-1〜9-3中得到 的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂进行分析， 结果表明本发明品 中没有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中虽然不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰 胺，但具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。 实施例 10-1
(神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造） 作为从豆渣制造神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生 物，使用克劳森酒香酵母 (Brettanomyces clausseni (从江南大学购入， 并保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM , 保藏编号 CICIM Y0125
将在 YPD ( Yeast Extract Peptone Dextrose Medium )培养基中 30°C 下培养后得到的上述菌株接种到含有神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促 进剂制造培养基 100ml的三角烧瓶 （容量 300ml ) 中， 在 30°C下培养 72小时。 该培养基含有 10w/v%豆渣和 lw/v%葡萄糖。 其中， 豆渣的 制备通过将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将 吸收了水分的大豆研磨破碎， 过滤并除去液体成分后， 将剩余残渣沥 干来得到。
然后， 为了从得到的培养液中回收神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺 产生促进剂， 以 3000rpm离心分离 10分钟除去菌体， 回收离心分离后 的上清液， 在回收后的培养上清液中加入 2.5倍的无水乙醇， 接着， 再 用超声波处理装置 （Branson公司制造） 处理 10分钟， 以 3000rpm离 心分离 30分钟， 回收上清液。用滤纸过滤该上清液约 70ml，再在 40 °C 以下真空干燥机中干燥该过滤液至恒重， 得到作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的豆渣发酵提取物。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整其浓度为 1 w/v% (本发明品 10-A)后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 10-2
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用克劳森酒香酵母 iBrettanomyces clausseniO (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y025 1 采用与实施例 10- 1 相同的方法得到作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的豆渣发酵提取物。
进而， 用 50^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整其浓度为 0.1 w/v% (本发明品 10-B )后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进试验。 实施例 10-3
作为从豆渣制造神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生物， 使用克劳森酒香酵母 Brettanomyces claussenii (从江南大学购入， 并 保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0127 ) o 采用与实施例 10-1 相同的方法得到作为本发明的神经酰胺 / 葡萄糖神经酰胺产生促进剂的豆渣发酵提取物。
进而， 用 5(^ ％乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 分别调整其浓度为 为 lw/v% (本发明品 10_C)、 0.1 w/v% (本发明品 10-D )后，保存在 4°C 下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验）
<角质细胞 （Keratinocytes ) 培养 >
首先， 取正常人的活化角质化细胞 （Cascade Co., Ltd) 作为原代 细胞， 于 75cm2培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml ) ， 在 37 °C、
C02浓度为 5%的条件下进行细胞培养， 直至培养到细胞聚集密度 ( confluence ) 为 80〜90%。 再传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细 胞至 80〜90%浓度。 然后以 I X 105个细胞 /ml传代至 12孔板 （每孔容 积为 2ml ) 中， 继续培养细胞至 80〜90%浓度。
然后， 更换不含有生长因子的培养基， 在上述 12孔板中 （n=2 ) 分别以 20μ1/孔的量添加上述实施例 10- 1〜10-3中得到的豆渣发酵提取 物的乙醇水溶液。 另外， 只添加 50ν/ν%乙醇（没有添加神经酰胺 /葡萄 糖神经酰胺产生促进剂） 作为对照品， 相同培养条件下培养 72小时。 培养 72小时后， 弃去上清培养液，
用 2ml PBS (磷酸盐缓冲液） 清洗细胞两次， 再加入 1ml PBS至 板孔中， 以细胞收集器 （细胞铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经 酰胺 /葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。
<脂质提取>
脂质提取采用 Bligh & Dyer法进行。 具体而言， 首先， 在上述回 收得到的含细胞的 PBS液中加入甲醇： 氯仿 =2.5m 1.25ml的溶剂， 振荡混合 20分钟， 进行离心分离（3000rpm， 5分钟） ， 从而得到上清 液和沉淀。将上清液 A转移至另外试管中用于神经酰胺 /葡萄糖神经酰 胺量的分析， 将沉淀 B用于蛋白质含量的分析。 <蛋白质含量分析>
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述回收的沉淀 B中加入 900μ1的 SDS (十二垸基硫酸钠） 溶液并进行混合， 在 60°C水浴下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却 后在其中添加 ΙΟΟμΙ的 2N HC1溶液， 按照 BCA Kit (BCA蛋白浓度测 定试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量分析〉
在残留的上清液 A中加入 PBS: 氯仿 =1.25ml: 1.25ml的溶剂， 振 荡混合 20分钟， 3000rpm进行离心分离 5分钟， 分离、 回收作为下相 的氯仿层， 并在 30°C、氮气保护下干燥氯仿层 40分钟得到干燥品， 加 入 ΙΟΟμΙ的氯仿： 甲醇 =2.5mh 1.25ml的溶剂进行溶解， 并用下述薄板 层析 （TLC) 法对神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记为 Cer和 GlyCer, 单位为 g/ml) 进行定量。
. 采用干燥 TLC板， 以氯仿： 甲醇：醋酸 （190: 9： 1 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹干展层剂； 重复以上步骤一次。 然后以氯仿： 甲醇： 丙酮（76: 20： 4 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展层， 以吹风机吹干。 喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180°C烘 烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡萄糖 神经酰胺） 分析。
然后， 根据下述公式 （1 )， 将所得值分别除以各自的蛋白质含量， 得到 Cer/Pro和 GlyCer/Pro。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro为 1， 求出本发明的 Cer/Pro和 GlyCer Pro的相对值。并且， 以对照品每孔中 的蛋白质的量为 100， 求出每孔中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 (分别记为 Cer/Well和 GlyCer/Well， 相对于对照品的相对量） 。 一并 在表 10中表示。 公式 （1)
Cer/Pro=神经酰胺量 （ g/ml) /蛋白质含量 （ g/ml)
GlyCer/Pro=葡萄糖神经酰胺量 （ g/ml) /蛋白质含量 g/ml) 表 10
Figure imgf000074_0001
如表 10所示，实施例 10-1中得到的本发明品既具有神经酰胺产生 促进效果， 又具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 而实施例 10-2、 实 施例 10-3中得到的本发明品的葡萄糖神经酰胺产生促进效果显著。
因此， 确认了本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂具有 神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。
(本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂中不存在神经酰 胺和葡萄糖神经酰胺的试验）
不经过细胞培养， 直接采用 TLC法对上述实施例 10-1〜10-3中得 到的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂进行分析， 结果表明本发明 品中没有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中虽然不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰 胺，但具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。 实施例 11-1
(神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造）
作为从豆渣制造神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的微生 物， 使用解脂亚罗酵母 （ rrOWa lipolytica) (从江南大学购入， 并保 藏于中国高校工业微生物资源和信息中心 CICIM, 保藏编号 CICIM Y0311)o 将在 YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培养基中 30°C 下培养后得到的上述菌株接种到含有神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促 进剂制造培养基 100ml的三角烧瓶 （容量 300ml ) 中， 在 30Γ下培养 72小时。 该培养基含有 10w/v%豆渣和 ^ %葡萄糖。 其中， 豆渣的 制备通过将大豆放入水中浸泡 12小时， 使大豆充分吸收水分， 然后将 吸收了水分的大豆研磨破碎， 过滤并除去液体成分后， 将剩余残渣沥 干来得到。
然后， 为了从得到的培养液中回收神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺 产生促进剂， 以 3000rpm离心分离 10分钟除去菌体， 回收离心分离后 的上清液， 在回收后的培养上清液中加入 2.5倍的无水乙醇， 接着， 再 用超声波处理装置 （Branson公司制造） 处理 10分钟， 以 3000rpm离 心分离 30分钟，回收上清液。用滤纸过滤该上清液约 70m】，再在 40°C 以下真空干燥机中干燥该过滤液至恒重， 得到豆渣发酵提取物， 作为 本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
进而， 用 50v/v%乙醇溶解该豆渣发酵提取物， 调整其浓度为 1 w/v%后， 保存在 4°C下， 用于之后的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促 进试验。
(神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进试验）
<角质细胞 （Keratinocytes) 培养 >
首先， 取正常人的活化角质化细胞 （Cascade Co., Ltd) 作为原代 细胞， 于 75cm2培养瓶中 （含有生长因子的培养基 2ml ) ， 在 37°C、 C02浓度为 5%的条件下进行细胞培养， 直至培养到细胞聚集密度 (confluence) 为 80〜90°/。。 再传代细胞至 175cm2方瓶中继续培养细 胞至 80〜90%浓度。 然后以 1 X 105个细胞 /ml传代至 12孔板 （每孔容 积为 2ml) 中， 继续培养细胞至 80〜90%浓度。
然后， 更换不含有生长因子的培养基， 在上述 12孔板中 （n=2 ) 分别以 20μ1/孔的量添加上述实施例 11-1中得到的豆渣发酵提取物的乙 醇水溶液。 另外， 只添加 50ν/ν%乙醇（没有添加神经酰胺 /葡萄糖神经 酰胺产生促进剂）作为对照品， 相同培养条件下培养 72小时。培养 72 小时后， 弃去上清培养液， 用 2ml PBS (磷酸盐缓冲液） 清洗细胞两次， 再加入 1ml PBS至 板孔中， 以细胞收集器 （细胞铲） 收集细胞至试管中， 以备后续神经 酰胺 /葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。 <脂质提取〉
脂质提取采用 Bligh & Dyer法进行。 具体而言， 首先， 在上述回 收得到的含细胞的 PBS液中加入甲醇： 氯仿 =2.5m 1.25ml的溶剂， 振荡混合 20分钟， 进行离心分离 GOOOrpm, 5分钟） ， 从而得到上清 液和沉淀。将上清液 A转移至另外试管中用于神经酰胺 /葡萄糖神经酰 胺量的分析， 将沉淀 B用于蛋白质含量的分析。
<蛋白质含量分析>
为了表征细胞中的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量， 进行蛋白质含量 分析。 在上述回收的沉淀 B中加入 900μ1的 SDS (十二烷基硫酸钠） 溶液并进行混合， 在 60°C水浴下加热 2小时使蛋白质变性降解， 冷却 后在其中添加 ΙΟΟμΙ的 2N HC1溶液， 按照 BCA Kit (BCA蛋白浓度测 定试剂盒） 法测定其中蛋白质的量 （记为 Pro, 单位为 g/ml)。
<神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺量分析〉
在残留的上清液 A中加入 PBS: 氯仿 =1.25m 1.25ml的溶剂， 振 荡混合 20分钟， 3000rpm进行离心分离 5分钟， 分离、 回收作为下相 的氯仿层， 并在 30°C、氮气保护下干燥氯仿层 40分钟得到干燥品， 加 入 ΙΟΟμΙ的氯仿： 甲醇 =2.5ml: 1.25ml的溶剂进行溶解， 并用下述薄板 层析 （TLC) 法对神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 （分别记为 Cer和 GlyCer, 单位为 g/ml) 进行定量。
采用干燥 TLC板， 以氯仿： 甲醇：醋酸 （190: 9： 1 v/v/v) 为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至薄板顶端， 以吹风机吹干展层剂； 重复以上步骤一次。 然后以氯仿： 甲醇： 丙酮 （76: 20： 4 v/v/v)为展 层剂进行薄板层析， 待展层剂行至距薄板底端 2.5cm处， 停止展层， 以吹风机吹干。喷以硫酸铜磷酸溶液， 吹干， 将层析板放置于 180°C烘 烤板上烘烤 7分钟显色。 扫描显色 TLC板并进行神经酰胺 （或葡萄糖 神经酰胺） 分析。
然后， 根据下述公式 （1 )， 将所得值分别除以各自的蛋白质含量， 得到 Cer/Pro和 GlyCer/Pro。 以对照品的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro为 1， 求出本发明的 Cer/Pro和 GlyCer/Pro的相对值。并且， 以对照品每孔中 的蛋白质的量为 100， 求出每孔中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量 (分别记为 Cer/Well和 GlyCer/Well， 相对于对照品的相对量） 。 一并 在表 11中表示。
公式 ( 1 )
Cer/Pro-神经酰胺量 （ g/ml) /蛋白质含量 （ g/ml )
GlyCer/Pro=葡萄糖神经酰胺量 （ g/ml ) /蛋白质含量 ( μδ/πι1 ) 表 1 1
Figure imgf000077_0001
如表 11所示，实施例 11-1中得到的本发明品的葡萄糖神经酰胺产 生促进效果显著。
因此， 确认了本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂具有 神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。
(本发明的神经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂中不存在神经酰 胺和葡萄糖神经酰胺的试验）
不经过细胞培养，直接采用 TLC法对上述实施例 11-1中得到的神 经酰胺 /葡萄糖神经酰胺产生促进剂进行分析， 结果表明本发明品中没 有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺存在。
由此表明， 本发明品本身中虽然不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰 胺，但具有神经酰胺产生促进效果和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进效果， 可以作为神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。

Claims

权利要求
1.一种神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其 中，
在含有豆渣和糖类的培养基中培养酵母， 从其培养上清液中获得 神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
2.如权利要求 1所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 的制造方法， 其中，
所述酵母是是选自裂殖酵母属 chizosaccharomyces 酵母、 毕赤
( Pichia ) 属酵母、 假丝酵母属 ( Ccmdkia 酵母、 德巴利酵母属 (Debaryomyces) 酵母、 隐球酵母属 iCryptococcus 酵母、 汉逊酵母 属 (H聽 enula) 酵母、 布勒掷孢酵母属 iBullercO 酵母、 红酵母属 (Rhodotorula 酵母、 掷孢酵母属 Sporobolomyces 酵母、 酒香酵母 属 (Brettanomyces) 酵母、 亚罗酵母属 （ rrm «) 酵母中的至少任意 一种酵母。
3.如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 的制造方法， 其中，
所述裂殖酵母属 Schizosaccharomyces 酵母是八孢裂殖酵母
( Schizosaccharomyces octoporus )。
4.如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 的制造方法， 其中，
所述毕赤酵母属 Pichia 酵母是异常毕赤酵母（/^/H' iwoma/a 季也蒙毕赤酵母 Pichia guiUiermondii ) , 挪威毕赤酵母 Pichia norvegensis) ^ 膜撲毕赤酵母 (Pichia membranifaciens ) 或伯顿毕赤酵 母 ( Pichia burtonii )。
5.如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 的制造方法， 其中， 所述假丝酵母属 Candida 酵母是诞沫假丝酵母 Ccmdi h zeylanoides ) , 博伊丁假丝酵母 ( Candida boidinii ) , 近平滑假丝酵母 ( Candida parapsilosis ) > 木兰假丝酵母 ( Candida magnoliae ) > 麦芽糖 假丝酵母 Candida maltose^ 解脂肪假丝酵母 Candida steatolytica 、 丁酸假丝酵母 ( Candida butyri 、 鹬虻假丝酵母 ( Candida rhagiO或热 带假丝酵母 ( Candida metapsilosis )。
6.如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 的制造方法， 其中，
所述德巴利酵母属 Debaryomyce 酵母是汉逊德巴利酵母
( Debaryomyces hansenii ) 或范 Ιϊ]β德巴禾 [J酵母 ( Debaryomyces vanrijiae ) 0
7.如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 的制造方法， 其中，
所述隐球酵母属 （ Cryptococc ) 酵母是罗伦隐球酵母 ( Cryptococcus laurentii ) 或匈牙禾1 J隐球酵母 ( Cryptococcus hungaricus )。
8.如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 的制造方法， 其中，
所述汉逊酵母属 Hansenula 酵母是多形汉逊酵母 ( Ha emda polymorpha) 或西弗汉逊酵母 Hansenula ciferrif)。
9.如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂 的制造方法， 其中，
所述布勒掷抱酵母属 Bidle 酵母是铁杉布勒掷孢酵母 滅 em tsugae )。
10. 如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂的制造方法， 其中， 所述红酵母属 Rhodotorula ) 酵母是粘性红圆酵母 Rhodotonda mucilaginosa ) 或半占红酵母 (Rhodotorula glutinis
1 1 . 如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂的制造方法， 其中，
所述掷孢酵母属 ( Spowbohmyce 酵母是粉红掷孢酵母 ( Sporobolomyces roseus
12. 如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂的制造方法， 其中，
所述酒香酵母属 Brettcmomyce 酵母是克劳森酒香酵母 (Brettanomyces claussenii 。
13 . 如权利要求 2所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂的制造方法， 其中，
所述亚罗酵母属 （ rrow ) 酵母是解脂亚罗酵母 （ rraW lipolytica 。
14. 如权利要求 1〜13中的任一项所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神 经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中，
所述糖类是葡萄糖。
15 .如权利要求 14所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂的制造方法， 其中，
所述培养基由豆渣、 葡萄糖和水构成。
16.如权利要求 15所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂的制造方法， 其中，
所述培养基中所述豆渣的含量为 8〜12w/v%， 所述糖类的含量为 0.8〜1.2w/v%。
17. 如权利要求 1〜16中的任一项所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神 经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中，
在 27〜35 °C下进行所述培养。
18. 如权利要求 1〜17中的任一项所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神 经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中，
所述培养时间为 1〜7天。
19. 如权利要求 1〜18中的任一项所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神 经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中，
将通过所述培养获得的培养物进行离心， 从而得到所述上清液。
20.如权利要求 19所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂的制造方法， 其中，
在离心后获得的所述上清液中加入乙醇后， 将其作为神经酰胺产 生促进剂和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
21 .如权利要求 20所述的神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺产生促进 剂的制造方法，
其中， 进一步对所述加入了乙醇后得到的物质通过超声波处理、 离心分离、 过滤、 真空干燥处理进行精制后， 得到神经酰胺和 /或葡萄 糖神经酰胺产生促进剂。
22. 豆渣的发酵提取物用于促进神经酰胺和 /或葡萄糖神经酰胺的 产生的用途，
所述豆渣的发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养酵母得到 的。
23 . 豆渣的发酵提取物作为神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神经 酰胺产生促进剂的用途，
所述豆渣的发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养酵母得到 的。
24. 豆渣的发酵提取物在制造神经酰胺产生促进剂和 /或葡萄糖神 经酰胺产生促进剂中的用途，
所述豆渣的发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养酵母得到 的。
25. 如权利要求 22~24中的任一项所述的用途， 其中，
所述酵母是是选自裂殖酵母属 Schizosaccharomyces 酵母、 毕赤 ( Pichia ) 属酵母、 假丝酵母属 (Candida 酵母、 德巴利酵母属 iDebaryomyces) 酵母、 隐球酵母属 Cryptococcus 酵母、 汉逊酵母 属 Ha enula 酵母、 布勒掷孢酵母属 (Bull 酵母、 红酵母属 (Rhodotorula)酵母、 掷孢酵母属 (Sporobo myces 酵母、 酒香酵母 属 Bre nomyces 酵母、 亚罗酵母属 （ rro '«) 酵母中的至少任意 一种酵母。
26. 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述裂殖酵母属 iSchizosaccharomyces 酵母是八孢裂殖酵母 ( Schizosaccharomyces octoporus )。
27. 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述毕赤酵母属 (Pichia)酵母是异常毕赤酵母 Pichia anomala), 季也蒙毕赤酵母 （ Pichia guilliermondii )、 挪威毕赤酵母 （ Pichia norvegensis ) 膜璞毕赤酵母 (Pichia membranifaciens ) 或伯顿毕赤酵 母 (Pick ia b urton ii )。
28. 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述假丝酵母属 Candida 酵母是诞沫假丝酵母 Candida zeylanoides), 博伊丁假丝酵母 (Candida boidinii), 近平滑假丝酵母 ( Candida parapsilosis ) 木兰假丝酵母 ( Candida magnoliae ) > 麦芽糖 假丝酵母 iCandidamaltoscd、 解脂肪假丝酵母 ί Candida steatolytic 丁酸假丝酵母 (Candida butyri)~、 鹬虻假丝酵母 (Candida rhagi 或热 带假丝酵母 ( Candida metapsilosis )。
29. 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述德巴利酵母属 Debaryomyce 酵母是汉逊德巴利酵母 ( Debaryomyces hansenii ) 或范丽德巴禾 Ll酵母 ( Debaryomyces vanrijiae )。
30. 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述隐球酵母属 ( Cryptococcus ) 酵母是罗伦隐球酵母 ( Cryptococcus laurentii ) 或匈牙禾1 J隐球酵母 ( Cryptococcus hungaricus )。
3 1 . 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述汉逊酵母属 ( H ms ula ) 酵母是多形汉逊酵母 Hansenula polymorpha ) 或西弗汉逊酵母 Hansenula ciferrii 。
32. 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述布勒掷抱酵母属 Bullera 酵母是铁杉布勒掷孢酵母 Bi kra tsugae ) o
33 . 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述红酵母属 (Rhodoton a 酵母是粘性红圆酵母 ( Rhodotorula mucilaginosa ) 或粘红酵母 ( Rhodotorula glutinis )。
34. 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述掷孢酵母属 ί Sporobohmyce 酵母是粉红掷抱酵母
( Sporobolomyces roseus )。
35. 如权利要求 25所述的用途， 其中，
所述酒香酵母属 Bretta醒 yces 酵母是克劳森酒香酵母 ( Brettanomyces claussenii )。
36. 如权利要求 25所述的用途， 其中， 所述亚罗酵母属 （ rraw ) 酵母是解脂亚罗酵母 （ rraw lipolytica)
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