WO2019042306A1 - Method for inactivating cellulase - Google Patents

Abstract

Provided herein is a method for inactivating a cellulase with a serine protease and a method for treating a textile.

Description

[Title established by the ISA under Rule 37.2] METHOD FOR INACTIVATING CELLULASE

Reference to a Sequence Listing

This application contains a Sequence Listing in computer readable form, which is incorporated herein by reference.

BACKGROUND OF THE INVENTION Field of the Invention

The present invention relates to a method for inactivating a cellulase and a method for treating a textile.

Description of the Related Art

“Cellulase” or “cellulolytic enzyme” is a group of glycoside hydrolase enzymes that catalyze the hydrolysis of beta-1, 4-glycosidic linkages in the cellulose polymer. Such enzymes include endoglucanase (s) , cellobiohydrolase (s) , beta-glucosidase (s) , or combinations thereof.

In textile industry, cellulases are widely used to improve the appearance and softness of cellulose-containing fabrics. A widespread application of cellulase enzymes is to remove cotton fuzz and loose surface fibers in or on the fabric. This process referred to as “biopolishing” smoothes the surface of the fabric, which in turn improves its softness and appearance. Cellulase treatment also aids in the prevention of subsequent formation of fiber pills that make the garments appear worn. During biopolishing it is desirable to minimize weight loss and/or strength loss of the fabric due to the hydrolytic action of the cellulases.

Another industrial application of cellulase enzymes is for treating denim fabrics so as to impart to them a “stone-washed” appearance. Such a process is known in the industry as “biostoning” . The term biostoning was adopted, as pumice stones were traditionally used to treat the fabric. Cellulases have largely replaced pumice stones in recent years. Biostoning aims to remove colour from denim and control its re-deposition on the fabric.

After “biopolishing” or “biostoning” , some cellulases may still work and catalytic hydrolysis may continues. To avoid too much cellulase activity, residual cellulases are conventionally inactivated by an increase of treatment temperature and/or an adjustment of pH, and washed with a large amount of water.

There is a need for inactivating a cellulase in an environmentally-friendly way. Furthermore, there is a need for treating textile in an environmentally-friendly way.

SUMMARY OF THE INVENTION

The present invention relates to a method for inactivating a cellulase, comprising treating the cellulease with a serine protease.

The present invention further relates to a method for treating a textile, comprising (a) treating the textile with a cellulase; and (b) treating the textile with a serine protease to inactivate the cellulase.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figure 1 shows a result of SDS-PAGE gel. The lanes from left to right are marker; protease-1; protease-2; cellulase-A; cellulase-A and protease-1; cellulase-A and protease-2; cellulase-B; cellulase-B and protease-1; cellulase-B and protease-2; cellulase-C; cellulase-C and protease-1; cellulase-C and protease-2; cellulase-D; cellulase-D and protease-1; cellulase-D and protease-2.

Figure 2 shows a result of SDS-PAGE gel. The lanes from left to right are marker; protease-3; protease-4; cellulase-A; cellulase-A and protease-3; cellulase-A and protease-4; cellulase-B; cellulase-B and protease-3; cellulase-B and protease-4; cellulase-C; cellulase-C and protease-3; cellulase-C and protease-4; cellulase-D; cellulase-D and protease-3; cellulase-D and protease-4.

Figure 3 shows a result of SDS-PAGE gel. The lanes from left to right are marker; protease-5; protease-6; cellulase-A; cellulase-A and protease-5; cellulase-A and protease-6; cellulase-B; cellulase-B and protease-5; cellulase-B and protease-6; cellulase-C; cellulase-C and protease-5; cellulase-C and protease-6; cellulase-D; cellulase-D and protease-5; cellulase-D and protease-6.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

In one aspect, the present invention relates to a method for inactivating a cellulase, comprising treating the cellulease with a serine protease.

Cellulase is widely used in different industries. According to the present invention, a serine protease can effectively inactivate a cellulase. In one embodiment, the protese is a family S8 protease. In another embodiment, the cellulase is GH45 cellulase. In another embodiment, the cellulase is an acid cellulase or neutral cellulase.

In another aspect, the present invention relates to a method for treating a textile, comprising:

(a) contacting the textile with a cellulase; and

(b) contacting the textile with a serine protease to inactivate the cellulase.

In one embodiment, the textile is contacted with a serine protease to inactivate the cellulase. The method of the present invention reduces chemicals, saves energy and resources, and reduces a waste stream. In another embodiment, the method of the present invention has a reduced weight loss of textile, and/or a reduced loss in textile strength, relative to a method without step (b) . In a further embodiment, the method of the present invention has reduced about 5%to about 100%, preferably from about 10%to about 100%, more preferably from  about 20%to about 90%weight loss of textile, and/or a loss in textile strength, relative to a method without step (b) .

In an embodiment, the textile is treated with the cellulase for a period of time to allow the cellulase work sufficiently on the textile in step (a) . In an embodiment, the textile is treated with the protease for a period of time to allow the protease inactivate the cellulase in step (b) . Step (a) and step (b) can be carried out sequentially. As used herein, the term "sequential" with reference to a plurality of enzymatic treatments of a textile, means that a second specified enzymatic treatment is performed after a first specified enzymatic treatment is performed. Sequential treatments may be separated by intervening wash steps. Where specified, sequential enzymatic treatments may be performed "in a same bath, " meaning in the substantially the same liquid medium without intervening wash steps. Single-bath sequential treatment may include pH adjustments, temperature adjustment, and/or the addition of salts, activators, mediators, and the like, but should not include washes or rinses. In a further embodiment, step (a) and step (b) are carried out in a single bath or two sequential baths.

Proteases

Polypeptides having protease activity, or proteases, are sometimes also designated peptidases, proteinases, peptide hydrolases, or proteolytic enzymes. Proteases may be of the exo-type that hydrolyses peptides starting at either end thereof, or of the endo-type that act internally in polypeptide chains (endopeptidases) . Endopeptidases show activity on N-and C-terminally blocked peptide substrates that are relevant for the specificity of the protease in question.

The term “protease” includes any enzyme belonging to the EC 3.4 enzyme group (including each of the thirteen subclasses thereof) . The EC number refers to Enzyme Nomenclature 1992 from NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, including supplements 1-5 published in Eur. J. Bio-chem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; and Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectively. The nomenclature is regularly supplemented and updated; see e.g. the World Wide Web (WWW) at http: //www. chem. qmw. ac. uk/iubmb/enzyme/index. html.

Serine proteases are a subgroup of proteases characterized by having a serine in the active site, which forms a covalent adduct with the substrate.

For determining whether a given protease is a serine protease, and a family S8 protease, reference is made to Biochem. J. 290: 205-218 (1993) and MEROPS protease database, release, 9.4 (www. merops. ac. uk) . The database is described in Rawlings, N.D., Barrett, A.J. &Bateman, A. (2010) MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res 38, D227-D233. The family S8 proteases contain the catalytic triad in the order Asp, His, Ser. Mutation of any of the amino acids of the catalytic triad will result in change or loss of enzyme activity. The amino acids of the  catalytic triad of the S8 protease 1 from Bacillus sp-13231 are probably positions Asp32, His62 and Ser215. In one embodiment, the serine protease is a family S8 protease.

Protease activity can be measured using any assay, in which a substrate is employed, that includes peptide bonds relevant for the specificity of the protease in question. Assay-pH and assay-temperature are likewise to be adapted to the protease in question. Examples of assay-pH-values are  pH  2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12. Examples of assay-temperatures are 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, or 95℃. Examples of protease substrates are casein, such as Azurine-Crosslinked Casein (AZCL-casein) , or suc-AAPF-pNA.

Suitable proteases include those of bacterial, fungal, plant, viral or animal origin e.g. vegetable or microbial origin. Microbial origin is preferred. Chemically modified or protein engineered mutants are included.

The term "subtilases" refers to a sub-group of serine protease according to Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 and Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. The subtilases may be divided into 6 sub-divisions, i.e. the Subtilisin family, the Thermitase family, the Proteinase K family, the Lantibiotic peptidase family, the Kexin family and the Pyrolysin family. In one embodiment, the serine protease is subtilase, especially subtilisin.

Examples of subtilases are those derived from Bacillus such as Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus and Bacillus gibsonii described in; US7262042 and WO09/021867, and subtilisin lentus, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisin BPN’, subtilisin 309, subtilisin 147 and subtilisin 168 described in WO89/06279 and protease PD138 described in (WO93/18140) .

In an embodiment, the subtilisin comprises or consists of Bacillus Lentus protease shown in SEQ ID NO: 1 of the present invention.

Examples of useful proteases are the variants described in: WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, especially the variants with mutations in one or more of the following positions: 3, 4, 9, 15, 24, 27, 42, 55, 59, 60, 66, 74, 85, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 104, 116, 118, 121, 126, 127, 128, 154, 156, 157, 158, 161, 164, 176, 179, 182, 185, 188, 189, 193, 198, 199, 200, 203, 206, 211, 212, 216, 218, 226, 229, 230, 239, 246, 255, 256, 268 and 269 wherein the positions correspond to the positions of the Bacillus Lentus protease shown in SEQ ID NO: 1 of the present invention. More preferred the subtilase variants may comprise one or more of the mutations: S3T, V4I, S9R, S9E, A15T, S24G, S24R, K27R, N42R, S55P, G59E, G59D, N60D, N60E, V66A, N74D, N85S, N85R, G96S, G96A, S97G, S97D, S97A, S97SD, S99E, S99D, S99G, S99M, S99N, S99R, S99H, S101A, V102I, V102Y, V102N, S104A, G116V, G116R, H118D, H118N, N120S, S126L, P127Q, S128A, S154D, A156E, G157D, G157P, S158E, Y161A, R164S, Q176E, N179E, S182E, Q185N, A188P, G189E, V193M, N198D, V199I, Y203W, S206G, L211Q, L211D, N212D, N212S, M216S, A226V, K229L, Q230H, Q239R, N246K, N255W, N255D, N255E, L256E, L256D T268A, R269H. The protease variants are preferably variants of the Bacillus  lentus protease shown in SEQ ID NO: 1 of the present invention, the Bacillus amylolichenifaciens protease (BPN’) shown in SEQ ID NO: 2 of WO2016/001449. The protease variants preferably have at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 1 of the present invention.

Suitable commercially available protease enzymes include those sold under the trade names

Duralase ^Tm, Durazym ^Tm, 

Ultra, 

Ultra, 

Ultra, 

Ultra, 

Blaze

100T, Blaze

125T, Blaze

150T, 

and

 (Novozymes A/S) , those sold under the tradename

Purafect

Purafect

Excellenz P1000 ^TM, Excellenz P1250 ^TM, 

Preferenz P100 ^TM, Purafect

Preferenz P110 ^TM, Effectenz P1000 ^TM, 

Effectenz P1050 ^TM, Purafect

Effectenz P2000 ^TM, 

and 

 (Danisco/DuPont) , Axapem ^TM (Gist-Brocases N.V. ) , BLAP (sequence shown in Figure 29 of US5352604) and variants hereof (Henkel AG) and KAP (Bacillus alkalophilus subtilisin) from Kao.

Cellulases

“Cellulase” or “cellulolytic enzyme” is a group of glycoside hydrolase enzymes that catalyze the hydrolysis of beta-1, 4-glycosidic linkages in the cellulose polymer. In an embodiment, the cellulase is GH45 cellulase.

The GH Family 45 cellulase enzymes (formerly Family K) act with inversion of anomeric configuration to generate the alpha-D anomer of the oligosaccharide as a product. It has been elucidated that, in the active site, one aspartic acid amino acid acts as a general acid and another as a general base.

The three dimensional structure of Family 45 enzymes has been elucidated (see, for example, the structure of Humicolainsolens in Davies et al, 1996, ActaCrystallographica Section D-Biological Crystallography 52: 7-17 Part 1) . The enzymes contain a six-stranded beta-barrel to which a seventh strand is appended. The structure contains both parallel and anti-parallel beta-strands. The active center is located in an open substrate-binding groove.

As used herein, the term “GH45 cellulase” , “Family 45 cellulase” or “Cel45” means a carbohydrate active cellulase enzyme that contains a glycoside hydrolase Family 45 catalytic domain that is classified under EC 3.2.1.4. The term encompasses a carbohydrate active enzyme that hydrolyzes cellulose and cello-oligosaccharides using an inverting mechanism, and has either of the following two signature sequences in the vicinity of the catalytic aspartic acid amino acids: (i) both a first conserved signature sequence of A/S/T -T -R/N/T -Y/F/T -X -D -X -X -X -X -X -C/A-A/G/S-W/C and a second conserved signature sequence of H/Q/D/N - F/L -D -I/L/F; or (ii) has the second conserved signature sequence of H/Q/D/N -F/L -D -I/L/F but lacks said first conserved sequence. In one embodiment, the second conserved signature sequence is H-F-D-I.

Family 45 cellulase subfamily B members:

Organism	Abreviated Name	GenBank Accession Number
Trichoderma reesei	TrCel45A	CAA83846.1
Trichomderma viride	TvEGV	AAQ21385.1
Penicillium decumbens	PdCel 45A	ACF33814.1
Aspergillus nidulans	AnAN6786.2	EAA58604.1
Hadiotis discus discus	HddEG1	ABO26608.1
Ampullaria crossean	AcEG27I	ABR92637.1
Ampullaria crossean	AcEG27II	ABR92638.1
Mytilus edulis	MeEG	CAC59695.1
Phanerochaete chrysosporium	PcCel45A	BAG68300.1

Family 45 cellulase subfamily A members:

*Uniprot entry

The cellulase of the present invention may be obtained from microorganisms or plants or animals of any genus. For purposes of the present invention, the term “obtained from” as used herein in connection with a given source shall mean that the polypeptide encoded by a polynucleotide is produced by the source or by a strain in which the polynucleotide from the source has been inserted. In one aspect, the polypeptide obtained from a given source is secreted extracellularly.

The cellulase may be a bacterial polypeptide. For example, the cellulase may be a Gram-positive bacterial polypeptide such as a Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, or Streptomyces polypeptide having cellulase activity, or a Gram-negative bacterial polypeptide such as a Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, or Ureaplasma polypeptide.

In one aspect, the cellulase is a Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, or Bacillus thuringiensis polypeptide.

In another aspect, the cellulase is a Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, or Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus polypeptide.

In another aspect, the cellulase is a Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, or Streptomyces lividans polypeptide.

The cellulase may be a fungal polypeptide. For example, the polypeptide may be a yeast polypeptide such as a Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, or Yarrowia polypeptide; or a filamentous fungal polypeptide such as an Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes,  Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Sordaria, Staphylotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, orXylaria polypeptide.

In another aspect, the cellulase is a Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, or Saccharomyces oviformis polypeptide.

In another aspect, the cellulase is an Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora tetrasperma, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Sordaria fimicola, Staphylotrichum coccosporum, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, or Trichoderma viride polypeptide.

It will be understood that for the aforementioned species, the invention encompasses both the perfect and imperfect states, and other taxonomic equivalents, e.g., anamorphs, regardless of the species name by which they are known. Those skilled in the art will readily recognize the identity of appropriate equivalents.

Strains of these species are readily accessible to the public in a number of culture collections, such as the American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) , and Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .

The cellulase may be identified and obtained from other sources including microorganisms isolated from nature (e.g., soil, composts, water, etc. ) or DNA samples obtained  directly from natural materials (e.g., soil, composts, water, etc. ) using the above-mentioned probes. Techniques for isolating microorganisms and DNA directly from natural habitats are well known in the art. A polynucleotide encoding the polypeptide may then be obtained by similarly screening a genomic DNA or cDNA library of another microorganism or mixed DNA sample. Once a polynucleotide encoding a polypeptide has been detected with the probe (s) , the polynucleotide can be isolated or cloned by utilizing techniques that are known to those of ordinary skill in the art (see, e.g., Sambrook et al., 1989, supra) .

In an embodiment, the cellulase has at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 5, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 7, or the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8 of the present invention. In a further embodiment, the cellulase comprises or consists of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 5, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 7, or the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8.

In an embodiment, the cellulase can be an acid cellulase, neutral cellulase, or alkaline cellulase. The term “acid cellulase” means a cellulase which has an optimum activity at a pH below 7, preferably from 2 to 6, more preferably from 3.5 to 5.5. The term “neutral cellulase” means a cellulase which has an optimum activity at a pH around 7, for example 5.5 to 8.5, preferably from 6 to 8. The term “alkaline cellulase” means a cellulase which has an optimum activity at a pH above 8, for example 8 to 12, preferably from 8 to 10. In a preferable embodiment, the cellulase is an acid cellulase, or neutral cellulase. In a further embodiment, the acid cellulase is an enzyme mixture composed of three major enzymes (Trichoderma reesei cellobiohydrolase I, II and endoglucanase II) expressed in Trichoderma reesei cellulase background. Trichoderma reesei cellobiohydrolase I is a 54.1 kDa enzyme (EC 3.2.1.176) . Trichoderma reesei cellobiohydrolase II is a 49.6 kDa enzyme (EC 3.2.1.91) . Trichoderma reesei endoglucanase II is a 44.1 kDa enzyme (EC 3.2.1.21) .

Sequence identity: The relatedness between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences is described by the parameter “sequence identity” .

For purposes of the present invention, the sequence identity between two amino acid sequences is determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as implemented in the Needle program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) , preferably version 5.0.0 or later. The parameters used are gap open penalty of 10, gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 (EMBOSS version of BLOSUM62) substitution matrix. The output of Needle labeled “longest identity” (obtained using the –nobrief option) is used as the percent identity and is calculated as follows: (Identical Residues x 100) / (Length of Alignment –Total Number of Gaps in Alignment)

Textile

As used herein, the term “textile” refers to fibers, yarns, fabrics, garments, and non-wovens. The term encompasses textiles made from natural, synthetic (e.g., manufactured) , and various natural and synthetic blends. Textiles may be unprocessed or processed fibers, yarns, woven or knit fabrics, non-wovens, and garments and may be made using a variety of materials, some of which are mentioned, herein.

The process of the invention is most beneficially applied to cellulose-containing textile or cellulosic fabrics, such as cotton, viscose, rayon, ramie, linen, Tencel, or mixtures thereof, or mixtures of any of cellulose-containing fibres, or mixtures of any of these fibres together with synthetic fibres such as mixtures of cotton and spandex (stretch-denim) . In particular, the fabric is dyed fabric. In an embodiment, the fabric is denim. The denim fabric may be dyed with vat dyes such as indigo, or indigo-related dyes such as thioindigo.

In an embodiment of the process of the invention, textile is cotton-containing textile or man-made cellulose-containing textile.

Measurement of the biofinishing activity of cellulase

In order to determine the biofinishing activity of the cellulase, they are typically purified using known techniques.

The term “biofinishing” as used herein refers to the treatment of textile using cellulases and includes, but not limited to, biopolishing and biostoning.

The “biofinishing activity” , especially “biopolishing activity” , as used herein, is determined as set forth in Examples. The biopolishing effectiveness of the cellulases can be measured by the activity in removing fuzz, or small balls of fuzz (referred to as pills) , from fabric. The depilling can be expressed as the depilling activity per unit of protein (i.e., specific depilling activity) . According to one embodiment of the invention, an assay that measures biofinishing activity is a pilling note test for biopolishing activity.

Textile manufacturing process

The processing of a fabric, such as of a cellulosic material, into material ready for garment manufacture involves several steps: spinning of the fiber into a yarn; construction of woven or knit fabric from the yarn; and subsequent preparation processes, dyeing/printing and finishing operations. Preparation processes are necessary for removing natural and man-induced impurities from fibers and for improving their aesthetic appearance and processability prior to for instance dyeing/printing and finishing. Common preparation processes comprise desizing (for woven goods) , scouring, and bleaching, which produce a fabric suitable for dyeing or finishing.

Woven fabric is constructed by weaving “filling” or “weft” yarns between warp yarns stretched in the longitudinal direction on the loom. The warp yarns must be sized before  weaving in order to lubricate and protect them from abrasion at the high speed insertion of the filling yarns during weaving. Common size agents are starches (or starch derivatives and modified starches) , poly (vinyl alcohol) , carboxyl methyl cellulose (i.e., CMC) where starches are dominant. Paraffin, acrylic binders and variety of lubricants are often included in the size mix. The filling yarn can be woven through the warp yarns in a “over one -under the next” fashion (plain weave) or by “over one -under two” (twill) or any other myriad of permutations. Generally, dresses, shirts, pants, sheeting’s, towels, draperies, etc. are produced from woven fabric. After the fabric is made, size on the fabric must be removed again (i.e., desizing) .

Knitting is forming a fabric by joining together interlocking loops of yarn. As opposed to weaving, which is constructed from two types of yarn and has many “ends” , knitted fabric is produced from a single continuous strand of yarn. As with weaving, there are many different ways to loop yarn together and the final fabric properties are dependent both upon the yarn and the type of knit. Underwear, sweaters, socks, sport shirts, sweat shirts, etc. are derived from knit fabrics.

Desizing

Desizing is the degradation and/or removal of sizing compounds from warp yarns in a woven fabric. Starch is usually removed by an enzymatic desizing procedure. In addition, oxidative desizing and chemical desizing with acids or bases are sometimes used.

In some embodiments, the desizing enzyme is an amylolytic enzyme, such as an alpha-amylase, a beta-amylase, a mannanase, a glucoamylase, or a combination thereof.

Suitable alpha and beta-amylases include those of bacterial or fungal origin, as well as chemically or genetically modified mutants and variants of such amylases. Suitable alpha-amylases include alpha-amylases obtainable from Bacillus species. Suitable commercial amylases include but are not limited to

NEXT, 

FLEX and

COOL (all from Genencor International Inc. ) , and DURAMYL ^TM, ERMAMYL ^TM, FUNGAMYL ^TM TERMAMYL ^TM, AQUAZYME ^TM and BAN ^TM (all available from Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) .

Other suitable amylolytic enzymes include the CGTases (cyclodextrin glucanotransferases, EC 2.4.1.19) , e.g., those obtained from species of Bacillus, Thermoanaerobactoror Thermoanaero-bacterium.

Scouring

Scouring is used to remove impurities from the fibers, to swell the fibers and to remove seed coat. It is one of the most critical steps. The main purposes of scouring is to a) uniformly clean the fabric, b) soften the motes and other trashes, c) improve fabric absorbency, d) saponify and solubilize fats, oils, and waxes, and e) minimize immature cotton. Sodium hydroxide scouring at about boiling temperature is the accepted treatment for 100%cotton, while calcium hydroxide and sodium carbonate are less frequently used. Synthetic fibers are scoured at much milder conditions. Surfactant and chelating agents are essential for alkaline scouring. Enzymatic scouring  has been introduced, wherein cellulase, hemicellulase, pectinase, lipase, and protease are all reported to have scouring effects.

Bleaching

Bleaching is the destruction of pigmented color and/or colored impurities as well as seed coat fragment removal. Bleaching is performed by the use of oxidizing or reducing chemistry. Oxidizing agents can be further subdivided into those that employ or generate: a) hypochlorite (OCl ^-) , b) chloride dioxide (ClO ₂) , c) permanganate (MnO ₄-) , d) ozone, and hydroperoxide species (OOH ^-and/or OOH) . Reducing agents are typical sulfur dioxide, hydrosulfite salts, etc. Enzymatic bleaching using glucose oxidase or peroxidase (for example, see WO 2013/040991) has been reported. Traditionally, hydrogen peroxide is used in this process.

Printing or dyeing

Printing and dyeing of textiles is carried out by applying dyes to the textile by any appropriate method for binding the dyestuff to the fibres in the textiles. The dyeing of textiles may for example be carried out by passing the fabric through a concentrated solution of dye, followed by storage of the wet fabric in a vapour tight enclosure to permit time for diffusion and reaction of the dye with the fabric substrate prior to rinsing off un-reacted dye. Alternatively, the dye may be fixed by subsequent steaming of the textile prior to rinsing. The dyes include synthetic and natural dyes. Typical dyes are those with anionic functional groups (e.g., acid dyes, direct dyes, Mordant dyes and reactive dyes) , those with cationic groups (e.g., basic dyes) , those requiring chemical reaction before application (e.g., vat dyes, sulphur dyes and azoic dyes) , disperse dyes and solvent dyes.

Excess soluble dyestuff not bound to the fibres must be removed after dyeing to ensure fastness of the dyed textiles and to prevent unwanted dye transfer during laundering of the textiles by the consumer. Generally, a large amount of water is required for complete removal of excess dye. In a conventional process, the printed or dyed textile is first rinsed with cold water, then washed at high temperature with the addition of a suitable additive to decrease back-staining, like poly (vinylpyrrolidone) (PVP) .

An enzymatic process for removal of excess dye from dyed fabric with a rinse liquor comprising at least one peroxidase, an oxidase agent and at least one mediator, such as liquor comprising a peroxidase, hydrogen peroxidise and a mediator like 1-hydroxy-benzotriazole is disclosed in WO 99/34054.

Biopolishing

Most cotton fabrics and cotton blend fabrics have a hand-feeling problem that is rather hard and stiff without the application of finishing components. The fabric surface also is not smooth because small fuzzy microfibrils protrude from it. In addition, after a relatively short period of wear, pilling appears on the fabric surface thereby giving it an unappealing, worn look.

Biopolishing is a method to treat cellulosic fabrics during their manufacture by enzymes such as cellulases, which improves fabric quality with respect to “reduced pilling formation” . The  most important effects of biopolishing can be characterized by less fuzz and pilling, increased gloss/luster, improved fabric handle, increased durable softness and/or improved water absorbency. Biopolishing usually takes place in the wet processing of the manufacture of knitted and woven fabrics or garments. Wet processing comprises such steps as e.g., desizing, scouring, bleaching, washing, dying/printing and finishing. Biopolishing could be performed as a separate step after any of the wetting steps or in combination with any of those wetting steps. In the present invention, the step of biofinishing is carried out before, during or after step of desizing, bleaching, or printing/dyeing.

To achieve effective biopolishing, the concentration of enzyme in an aqueous solution (CMCU/ml) , the temperature or pH to which the fabric is subjected, and the total incubation time, will vary, depending on:

(i) the nature of the fabric;

(ii) the cellulase activity;

(iii) the time during which the fabric is contacted with the bulk solution; and

(iv) the presence of other components in the aqueous solution.

Determination of suitable temperature or pH of the the aqueous solution, as well as optimization of other variables, can be achieved using routine experimentation by establishing a matrix of conditions and testing different points in the matrix. For example, the enzyme concentration, the temperature or pH at which the contacting occurs, and the time of contact can be varied, after which the resulting fiber or textile is evaluated for (a) one or more biopolished properties, such as, e.g., fabric handle, appearance, or pilling resistance, and, optionally, (b) potential loss in fabric strength and/or weight.

Fabric handle and appearance are evaluated by panel testing, using a rating of 1-3 (worst to best) .

Pilling can be measured using any conventional method, such as, e.g., according to American Society for Testing and Materials protocol ASTM D 4970-89, using a Martindale Abrasion and Pilling Tester (James H. Heal &Co, UK) . In this method, pilling is evaluated visually on a scale of 1 to 5, where 1 signifies severe pilling and 5 signifies no pilling.

Fabric strength is measured using any conventional method, such as, e.g., according to ASTM protocol D 3786-87, using a Mullen Burst tester (Model C, B. F. Perkins, Chicopee MA) .

In a preferred embodiment of the present invention, biopolishing is carried out at a temperature of between about 20℃ and about 75 ℃, preferably between about 25 ℃ to about 70 ℃, and most preferably between about 25 ℃ and about 60 ℃; and at a pH of between about 4 and 12, preferably between about 5 and 10, and most preferably between about 5 and 8.

After “biopolishing” , some cellulases may still work and catalytic hydrolysis may continues. The excess cellulase activity results in unwanted biopolishing effect and a great weight loss and/or strength loss of the textile. In a conventional textile mill or laundry, residual cellulases are inactivated by an increase of treatment temperature and/or an adjustment of pH  by harsh chemicals, for example, Na ₂CO ₃, and washed with a large amount of water. The temperature can be raised to a temperature higher than the biopolishing temperature. In one embodiment, the temperature is raised to between about 75℃ and about 100 ℃. The pH can be adjusted to pH lower or higher than the pH for biopolishing. In one embodiment, pH is adjusted to between about 0 and 3 or about 10 and 14. However, high treatment temperature or adjustment of pH may need a lot of energy, and harsh chemials, and it may cause low fabric handle and softness, and change the color tone.

The present invention can effectively inactivate a cellulase by the action of a serine protease. It is mild and environmentally friendly by saving energy and water, and reducing comsumption of harsh chemials. It can work at biopolishing temperature and pH, and lead to a better fabric handle and softness and brighter fabric color.

In one embodiment, residual cellulase after biopolishing step further delivers about 1%, about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, 30%, about 50%, about 70%, about 80%, about 90%, about 95%, or about 100%, for example, from about 10%to about 100%, preferably from about 20%to about 90%, more preferably from about 30%to about 80%, lower cellulase activity with a serine protease inactivation than the cellulases without a serine protease inactivation after biopolishing. In one embodiment, a serine protease inactivates or inhibits from about 10%to about 100%, preferably from about 20%to about 90%, more preferably from about 30%to about 80%cellulase activity. In a pilling notes test, a residual cellulase after biopolishing step further delivers about 0.1, about 0.2, about 0.5, about 0.8, about 1.0 pilling note lower than residual cellulase without a serine protease inactivation.

Manufacturing of Denim Fabric

Some dyed fabric such as denim fabric, requires that the yarns are dyed before weaving. For denim fabric, the warp yarns are dyed for example with indigo, and sized, before weaving. Preferably the dyeing of the denim yarn is a ring-dyeing. A preferred embodiment of the invention is ring-dyeing of the yarn with a vat dye such as indigo, or an indigo-related dye such as thioindigo, or a sulfur dye, or a direct dye, or a reactive dye, or a naphthol. The yarn may also be dyed with more than one dye, e.g., first with a sulphur dye and then with a vat dye, or vice versa.

Preferably, the yarns undergo scouring and/or bleaching before they are dyed, in order to achieve higher quality of denim fabric. In general, after woven into dyed fabric, such as denim, the dyed fabric or garment proceeds to a desizing stage, preferably followed by a stoning or abrasion step and/or a color modification step.

The desizing process as used herein is the same process as mentioned above in the text.

After desizing, the dyed fabric undergoes a biostoning step. The biostoning step can be performed with enzymes or pumice stones or both. As used herein, the term “biostoning” , “stone washing” and “abrasion” are interchangeable, which means agitating the denim in an aqueous  medium containing a mechanical abrasion agent such as pumice, an abrading cellulase or a combination of these, to provide a “stone-washed” look. In all cases, mechanical action is needed to remove the dye, and the treatment is usually carried out in washing machines, like drum washers, belly washers. As a result of uneven dye removal there are contrasts between dyed areas and areas from which dye has been removed. Treatment with cellulase can completely replace treatment with pumice stones. However, cellulase treatment can also be combined with pumice stone treatment, when it is desired to produce a heavily abraded finish. For denim manufacture, “biofinishing” includes “biostoning” .

To achieve effective biostoning, the concentration of enzyme in an aqueous solution (CMCU/ml) , the temperature or pH to which the fabric is subjected, and the total incubation time, will vary, depending on:

(i) the nature of the fabric;

(ii) the cellulase activity;

(iii) the time during which the fabric is contacted with the bulk solution; and

(iv) the presence of other components in the aqueous solution.

Determination of suitable temperature or pH of the the aqueous solution, as well as optimization of other variables, can be achieved using routine experimentation by establishing a matrix of conditions and testing different points in the matrix. For example, the enzyme concentration, the temperature or pH at which the contacting occurs, and the time of contact can be varied, after which the resulting fiber or textile is evaluated for (a) one or more biostoned properties, such as, e.g., “stone-washed” look, and, optionally, (b) potential loss in fabric strength and/or weight.

In a preferred embodiment of the present invention, biostoning is carried out at a temperature of between about 20℃ and about 75 ℃, preferably between about 25 ℃ to about 70 ℃, and most preferably between about 25 ℃ and about 60 ℃; and at a pH of between about 4 and 12, preferably between about 5 and 10, and most preferably between about 5 and 8.

After “biostoning” , some cellulases may still work and catalytic hydrolysis may continues. The excess cellulase activity results in unwanted biostoning effect and a great weight loss and/or strength loss of the textile. In a conventional textile mill or laundry, residual cellulases are inactivated by an increase of treatment temperature and/or an adjustment of pH by harsh chemicals, for example, Na ₂CO ₃, and washed with a large amount of water. The temperature can be raised to a temperature higher than the biostoning temperature. In one embodiment, the temperature is raised to between about 75℃ and about 100 ℃. The pH can be adjusted to pH lower or higher than the pH for biostoning. In one embodiment, pH is adjusted to between about 0 and 3 or about 12 and 14. However, high treatment temperature or adjustment of pH may need a lot of energy and harsh chemials, and it may cause low fabric handle and softness, and dark fabric color.

The present invention can effectively inactivate a cellulase by the action of a serine  protease. It is mild and environmentally friendly by saving energy and water, and reducing harsh chemials. It can work at biostoning temperature and pH, and lead to a better fabric handle and softness and brighter fabric color.

In one embodiment, a residual cellulase further delivers about 1%, about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, 30%, about 50%, about 70%, about 80%, about 90%, about 95%, or about 100%, for example, from about 10%to about 100%, preferably from about 20%to about 90%, more preferably from about 30%to about 80%, lower cellulase activity than a cellulase without a serine protease inactivation after biostoning. In one embodiment, a serine protease inactivates or inhibits from about 10%to about 100%, preferably from about 20%to about 90%, more preferably from about 30%to about 80%cellulase activity.

Preferably, the abrasion is followed by a color modification step. As used herein, the terms “color modification” or “color adjustment” are used without distinction to refer to any change to the color of a textile resulting from the destruction, modification, or removal of a dyestuff associated with the textile. Without being limited to a theory, it is proposed that color modification results from the modification of chromaphores associated with a textile material, thereby changing its visual appearance. The chromophores may be naturally-associated with the material used to manufacture a textile (e.g., the white color of cotton) or associated with special finishes, such as dying or printing. Color modification encompasses chemical modification to a chromophore as well as chemical modification to the material to which a chromophore is attached.

Getting faded or bleached look in certain areas on textile especially denim, is an important part in textile manufacturing. This is normally achieved by applying KMnO ₄ (or KMnO ₄/H ₃PO ₄) solution (via brushing, rubbing or spray) onto dried denim after abrasion step. The stained area would get bleached after drying and washing with Na ₂S ₂O ₅ solution. During this process indigo/sulphur dyes are destroyed by KMnO ₄ through oxidation, and then Na ₂S ₂O ₅ washing is applied to get rid of the brown colour caused by products of the oxidation. Such treatment will form a local color modification, i.e., a specific bleached pattern on denim to meet the customers’needs.

The invention is further defined in the following paragraphs:

[1] A method for inactivating a cellulase, comprising treating the cellulease with a serine protease.

[2] The method of paragraph 1, wherein the protease is a family S8 protease.

[3] The method of paragraph 1 or 2, wherein the protease is a subtilase, preferably a subtilisin.

[4] The method of paragraph 3, wherein the subtilase is derived from Bacillus such as Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus and Bacillus gibsonii, and subtilisin lentus, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, Bacillus licheniformis,  subtilisin BPN’, subtilisin 309, subtilisin 147 and subtilisin 168 and protease PD138.

[5] The method of paragraph 4, wherein the subtilase comprises or consists of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof having at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 1.

[6] The method of paragraph 5, wherein the variant is comprises mutations in one or more of the following positions: 3, 4, 9, 15, 24, 27, 42, 55, 59, 60, 66, 74, 85, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 104, 116, 118, 121, 126, 127, 128, 154, 156, 157, 158, 161, 164, 176, 179, 182, 185, 188, 189, 193, 198, 199, 200, 203, 206, 211, 212, 216, 218, 226, 229, 230, 239, 246, 255, 256, 268 and 269 wherein the positions correspond to the positions of the Bacillus Lentus protease shown in SEQ ID NO: 1.

[7] The method of paragraph 6, wherein the variant comprises one or more of the mutations: S3T, V4I, S9R, S9E, A15T, S24G, S24R, K27R, N42R, S55P, G59E, G59D, N60D, N60E, V66A, N74D, N85S, N85R, G96S, G96A, S97G, S97D, S97A, S97SD, S99E, S99D, S99G, S99M, S99N, S99R, S99H, S101A, V102I, V102Y, V102N, S104A, G116V, G116R, H118D, H118N, N120S, S126L, P127Q, S128A, S154D, A156E, G157D, G157P, S158E, Y161A, R164S, Q176E, N179E, S182E, Q185N, A188P, G189E, V193M, N198D, V199I, Y203W, S206G, L211Q, L211 D, N212D, N212S, M216S, A226V, K229L, Q230H, Q239R, N246K, N255W, N255D, N255E, L256E, L256D T268A, R269H.

[8] The method of any of paragraphs 1-7, wherein the cellulase is GH45 cellulase.

[9] The method of any of paragraphs 1-8, wherein the cellulase is a Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, or Streptomyces polypeptide, or a Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, or Ureaplasma polypeptide.

[10] The method of paragraph 9, wherein the cellulase is a Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, or Bacillus thuringiensis polypeptide.

[11] The method of any of paragraphs 1-8, wherein the cellulase is Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor,  Schizophyllum, Scytalidium, Sordaria, Staphylotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, or Xylaria polypeptide.

[12] The method of paragraph 11, wherein the cellulase is an Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora tetrasperma, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Sordaria fimicola, Staphylotrichum coccosporum, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, or Trichoderma viride polypeptide.

[13] The method of any of paragraphs 1-12, where the cellulase has at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 5, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 7, or the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8.

[14] The method of paragraph 13, wherein the cellulase comprises or consists of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 5, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 7, or the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8.

[15] The method of any of paragraphs 1-14, wherein the cellulase is an acid cellulase or neutral cellulase.

[16] A method for treating a textile, comprising:

(a) contacting the textile with a cellulase; and

(b) contacting the textile with a serine protease to inactivate the cellulase.

[17] The method of paragraph 16, which has a reduced weight loss and/or strength losss of textile, relative to a method without step (b) .

[18] The method of paragraph 16 or 17, wherein step (a) and step (b) are carried out in a single bath or in two sequential baths.

[19] The method of any of paragraphs 16-18, wherein the protese is a family S8 protease.

[20] The method of any of paragraph 16-19, wherein the protease is a subtilase, preferably a subtilisin.

[21] The method of paragraph 20, wherein the subtilase is derived from Bacillus such as Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus and Bacillus gibsonii, and subtilisin lentus, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisin BPN’, subtilisin 309, subtilisin 147 and subtilisin 168 and protease PD138.

[22] The method of paragraph 21, wherein the subtilase comprises or consists of SEQ ID NO: 1 or the variants thereof having at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 1.

[23] The method of paragraph 22, wherein the variant comprises mutations in one or more of the following positions: 3, 4, 9, 15, 24, 27, 42, 55, 59, 60, 66, 74, 85, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 104, 116, 118, 121, 126, 127, 128, 154, 156, 157, 158, 161, 164, 176, 179, 182, 185, 188, 189, 193, 198, 199, 200, 203, 206, 211, 212, 216, 218, 226, 229, 230, 239, 246, 255, 256, 268 and 269 wherein the positions correspond to the positions of the Bacillus Lentus protease shown in SEQ ID NO: 1.

[24] The method of paragraph 23, wherein the variant comprises one or more of the mutations: S3T, V4I, S9R, S9E, A15T, S24G, S24R, K27R, N42R, S55P, G59E, G59D, N60D, N60E, V66A, N74D, N85S, N85R, G96S, G96A, S97G, S97D, S97A, S97SD, S99E, S99D, S99G, S99M, S99N, S99R, S99H, S101A, V102I, V102Y, V102N, S104A, G116V, G116R, H118D, H118N, N120S, S126L, P127Q, S128A, S154D, A156E, G157D, G157P, S158E, Y161A, R164S, Q176E, N179E, S182E, Q185N, A188P, G189E, V193M, N198D, V199I, Y203W, S206G, L211Q, L211 D, N212D, N212S, M216S, A226V, K229L, Q230H, Q239R, N246K, N255W, N255D, N255E, L256E, L256D T268A, R269H.

[25] The method of any of paragraphs 16-24, wherein the cellulase is GH45 cellulase.

[26] The method of any of paragraphs 16-25, wherein the cellulase is a Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, or Streptomyces polypeptide, or a Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, or Ureaplasma polypeptide.

[27] The method of paragraph 26, wherein the cellulase is a Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, or Bacillus thuringiensis polypeptide.

[28] The method of any of paragraphs 16-25, wherein the cellulase is Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Sordaria, Staphylotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, orXylaria polypeptide.

[29] The method of paragraph 28, wherein the cellulase is an Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora tetrasperma, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Sordaria fimicola, Staphylotrichum coccosporum, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, or Trichoderma viride polypeptide.

[30] The method of any of paragraphs 16-29, where the cellulase has at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 5, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 7, or the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8.

[31] The method of paragraph 30, where the cellulase comprises or consists of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 5, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 7, or the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8.

[32] The method of any of paragraphs 16-31, wherein the cellulase is an acid cellulase or neutral cellulase.

[33] The method of any of paragraphs 16-32, which is biofinishing.

[34] The method of paragraph 33, which is biopolishing or biostoning.

[35] The method of any of paragraphs 16-34, wherein step (a) and/or step (b) is carried out at a temperature of between about 20℃ and about 75 ℃, preferably between about 25 ℃ to about 70 ℃, and most preferably between about 25 ℃ and about 60 ℃.

[36] The method of any of paragraphs 16-35, wherein step (a) and/or step (b) is carried out at a pH of between about 4 and 12, preferably between about 5 and 10, and most preferably between about 5 and 8.

[37] The method of any of paragraphs 16-36, wherein textile is cellulose-containing textile or a mixture of cellulose-containing fibres with synthetic fibres.

[38] The method of paragraph 37, wherein the textile is cotton, viscose, rayon, ramie, linen, Tencel, or mixtures thereof.

[39] The method of any of paragraphs 16-38, wherein the textile is selected from fibers, yarns, fabrics, garments, and non-wovens.

EXAMPLES

Enzymes

Fabric

-40S bleached Interlock Knits (HM Cotton, Guangzhou, China)

Buffer

Buffer-1: 2.135g of potassium dihydrogen phosphate and 0.37g sodium hydroxide dissolved in 1L de-ionized water to pH 7

Buffer-2: 3.052g of potassium dihydrogen phosphate and 0.102g sodium hydroxide dissolved in 1L de-ionized water to pH 6

Buffer-3: 1g/l sodium acetate adjusted with acetic acid to pH 5

Weight loss determination

The swatches were placed in the conditioned room (65%+/-5%humidity, 20+/-1℃) for 24 hours before they were numbered, weighed by the analytical balance (for samples below 100 g) or a precision balance (for samples over 100 g) and recorded. After treatment, all samples were tumbled dried for 1 hour and conditioned for 24 hours in the conditioned room mentioned as above. For each sample, the weight loss was defined as below:

Pilling notes test

Fabrics including treated and untreated which had been pre-conditioned in norm climate (65%humidity, 21℃) for at least 24 hours were tested for the pilling notes with Nu-Martindale Tester (James H. Heal Co. Ltd, England) , with untreated fabrics of the same type as the abraded fabrics. A standard pilling test (Swiss Norm (SN) 198525) was carried out after 2000 Revolutions by marking from 1-5, with the meaning defined as below, where 1 shows poor anti-pilling and 5 shows excellent anti-pilling property. Thus the higher the Martindale pilling notes score the more effective the endo-glucanase biopolishing treatment.

Note 5:  No pilling

Note 4:  Slight Pilling

Note 3:  Moderate Pilling

Note 2:  Distinct Pilling

Note 1:  Heavy Pilling

1/2, 1/4 notes are allowed

To make the test result more reliable, 3 separate readings were carried out by different persons for each sample, and the average of the 3 readings was adopted as the final result of pilling notes.

Strength determination

The Bursting Strength Tester is used for determination of strength referring to GB/T19976-2005 or BS ISO 13938 -2: 1999. The area of the sample to be tested is clamped between steel rings. An increasing steel ball pressure is applied until the specimen burst. Test is conducted with Marble Bursting Strength Tester (commercially available from Darong Textile Instrument) and TruBurst (commercially available from James Heal) .

Protein Content

The enzyme protein in an enzyme product can be measured with BCA ^TM Protein Assay Kit (product number 23225, commercial available from Thermo Fisher Scientific Inc. ) according to the product manual.

Cellulase activity assay (CNUR/g)

The substrate carboxymethyl cellulose (CMC) was hydrolyzed with cellulase at pH 7.5, 50℃ for 30 min. The reaction is stopped by an alkaline reagent containing PAHBAH and bismuth which forms complexes with reducing sugar. The complex formation results in color production which can be read at 405 nm by a spectrophotometer. The produced color is proportional to the cellulase activity. Enzymatic reaction and measurement of absorbance proceed automatically in the Konelab analyzer. Cellulase activity is determined relative to a Novozymes enzyme standard. A detailed description of the assay, as well as a sample of the Renozyme ^TM standard, is available on request from Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark (EB-SM-0787.02-D) .

Example 1 Electrophoresis method for inactivation confirmation

1. Enzyme samples (cellulase; protease; cellulase and protease) were diluted to a concentration of 1 mg/ml enzyme.

2. Around 200 μl each enzyme sample was filled into a 96-well Cell Culture Plate (commercially available from Eppendorf) .

3. The plate was sealed and transferred to a pre-heated Thermomixer Comfort and kept stirring at 600rpm for 60min at the temperature specified: cellulase-A, cellulase-B and cellulase-C at 55℃, and cellulase-D at 40℃.

4. 21 μl sample was taken out and mixed with 7 μl 4 × loading buffer, and added into a tube, and heated at 100℃ for 5 min on the heat block.

5. SDS-PAGE gels (

Gel 1.5mm*15well from Invitrogen) were run according to

Technical Guide. Marker (

Plus 2 Prestained, commercially available from Invitrogen) had a molecular weight of 198KDa, 98KDa, 62KDa, 49KDa, 38KDa, 28KDa, 17KDa, 14KDa, 6KDa, 3KDa.

The results of the test were shown in figure 1-3. As can be seen from the figures, protease-1 and protease-6 degraded all tested cellulases, while protease-2 and protease-3 degraded cellulase-D, protease-4 and protease-5 could not degrade cellulase-A.

Example 2  Chromogenic substrate assay for cellulase activity

In this study, 0.1 g/L cellulase and 2.0 g/L protease were used. Buffer-2 was used for cellulase-D, cellulase-A, and cellulase-B. Buffer-3 was used for cellulase-C.

1. 10ml of each enzyme sample (cellulase; protease; cellulase and protease) were filled into a well of a 24-well plate.

2. The plate was sealed and transferred to a pre-heated Thermomixer Comfort and kept stirring at 600 rpm for 60min at the temperature specified: cellulase-A, cellulase-B and cellulase-C at 55℃, and cellulase-D at 40℃.

3. 6 ml assay buffer (preheated) plus 200 μl enzyme sample after 60 min running were filled in a 15ml-tube.

4. One Cellazyme C tablet (commercially available from Megazyme) was filled in and the tube was capped and whirl mixed strongly.

5. The tubes were incubated for 60min at 40℃, mixed by inversion every 15 minutes.

6. 60 minutes later, the tubes were placed on ice for 5 minutes and then centrifuged for 15min at 4000rpm.

7. The supernatant was measeured at OD ₅₉₀, with water as blank=0.

For the assays, 0, 50, 100, 200 μl of cellulase standard stock solutions were used.

The results of the testing were shown in Table 1.

Table 1 Residual activity of cellulases after inactivation by different proteases

As can be seen from the table 1, cellulases had reduced activities by the addition of a protease. Protease-1 had a strong inactivating effect.

Example 3  Application test of protease inactivated cellulase-D in LaunderOmeter

In this study, 0.1g/L cellulase-D and 2g/L protease were used. Each sample repeated with 2 beakers.

1. Fabric swatches were weighted to 5g each after balanced in the constant temperature and humidity environment.

2. Main biopolishing. the beaker was filled with 100ml buffer-1, 0.1g/L cellulase-D (buffer without a cellulase as blank) , and two pieces of pre-weight fabric were filled in and run for 1 hour at 40℃.

3. Inactivation of blank and cellulase. The experiments were conducted in the following three groups.

3-1. Buffer and cellulase sample were drained and 2 g/l Sodium carbonate were added to the beaker with boiling water (>80℃) and stayed for 10min, drained, rinsed with cold water and spinned off the water on the fabrics and tumble dryer.

3-2. Blank and cellulase sample were run continuously for 1 hour at 40℃. After that, step 3-1 was carried out.

3-3. Protease was added to the cellulase sample and then run for 1 hour at 40℃. After that, step 3-1 was carried out.

4. Weight and bursting strength on the treated fabrics were measured.

The results of the test were shown in Table 2.

Table 2 Weight loss and strength evaluations for fabrics from different proteases on a cellulase

As can be seen from the above table, protease-1 and protease-6 had a better inactivating effect on a cellulase-D than protease-2, protease-3, protease-4 and protease-5, indicating by less weight loss and strength loss of fabric.

%weight/strength loss to ref. = 100* (weight/strength loss-sample -weight/strength loss-1h) / (weight/strength loss-2h -weight/strength loss-1h)

Example 4  Application test of Bio-polishing with cellulase-B in LaunderOmeter

The procedures were the same as described in Example 3 while the cellulase used was cellulase-B and main biopolishing temperature was 55℃. The result of the test was shown in Table 3.

Table 3 Weight loss evaluations for fabrics from different proteases on a cellulase

samples	%weight loss	%weight loss to ref.
Cellulase-B -1h	2.2±0.0	0
Cellulase-B -2h	5.3±0.2	100
Cellulase-B + Protease-1	3.1±0.1	31
Cellulase-B + Protease-2	5.1±0.2	96
Cellulase-B + Protease-3	5.2±0.6	97
Cellulase-B + Protease-4	4.9±0.4	89
Cellulase-B + protease-5	5.0±0.3	92
Cellulase-B + Protease-6	3.4±0.2	39

As can be seen from the above table, protease-1 and protease-6 had a better inactivating effect on a cellulase-B than protease-2, protease-3, protease-4 and protease-5, indicating by less weight loss of fabric.

Example 5  Application test of Bio-polishing with cellulase-E in LaunderOmeter

The procedures were the same as described in Example 3 while the cellulase used was cellulase-E and main biopolishing temperature was 55℃. The result of the test was shown in Table 4.

Table 4 Weight loss evaluations for fabrics from different proteases on a cellulase

Samples	%weight loss	%weight loss to ref.
Cellulase-E -1h	2.3±0.0	0
Cellulase-E -2h	5.2±0.2	100
Cellulase-E + Protease-1	3.3±0.4	34
Cellulase-E + Protease-2	5.0±0.3	92
Cellulase-E + Protease-3	5.0±0.3	93
Cellulase-E + Protease-4	4.8±0.3	85
Cellulase-E + protease-5	5.0±0.4	92
Cellulase-E + Protease-6	3.6±0.2	46

As can be seen from the above table, protease-1 and protease-6 had a better inactivating effect on a cellulase-E than protease-2, protease-3, protease-4 and protease-5, indicating by less weight loss of fabric.

Example 6  Protease inactivation of cellulase-D after biopolishing in wascator

To evaluate whether protease can be an effective method to inactive cellulase after the biopolishing process, the cellulase treatment was done in Wascator FOM71 followed by water rinse only, traditional inactivation or protease treatment, and the resulting fabrics were further  divided into two parts from each inactivation method: one immediately dried and the other part further washed in Wascator FOM71 for 10 hours.

Step 1: biopolishing with 0.2 %cellulase-D on weight of fabric in Wascator:

Fabric weight: about 60 g*24 pieces = 1.5 kg

LR: 1: 8;

35 ℃, pH 6.5, 60 min;

pH: 6.5.

Step 2: Fabrics were divided into 3 groups and cellulase inactivation was done in 3 ways. For group 1, 8 pieces of fabrics were rinsed twice for 10 and 5 min respectively at room temperature; drained; centrifuged.

For group 2, 8 pieces of fabrics were treated with 1 g/L Na ₂CO ₃ at 80℃ for 10 min and followed by two rinses with fresh water at 50 and 25℃, with 10 min in each rinse; rained; centrifuged.

For group 3, 8 pieces of fabrics were treated with 1 g/L protease-1 at 35℃ for 20 min and followed by one rinse with fresh water 25℃ for 10 min; rained; centrifuged.

Step 3: the fabrics from step 2 were dried immediately, and 1 piece of fabric from each group was set as the reference of 100%bursting strength for each group.

Step 4: 7 pieces of fabrics from each group were post washed separately at 40 ℃ for 10 h, drained by water and re-filled every 2 h.

Step 5: fabric conditioning and evaluation for bursting strength was conducted with TruBurst.

Table 5 Bursting strength evaluations for fabrics from different inactivation methods

The results clearly indicated that after biopolishing, simple washing with water can not completely remove the cellulase while protease-1 effectively inactivated the cellulase and therefore greatly reduced the risk in fabric damage after biopolishing. Protease inactivation effects were comparable to the traditional way with Na ₂CO ₃ at high temperature.

It will be understood that various modifications may be made to the embodiments disclosed herein. Therefore, the above description should not be construed as limiting, but merely as exemplifications of embodiments. Those skilled in art will envision other modifications  within the scope and spirit of the claims appended hereto. Moreover, terms should not be interpreted as implying any particular order among or between various steps herein disclosed unless and except when the order of individual steps is explicitly described.

Claims (17)

1. A method for inactivating a cellulase, comprising treating the cellulease with a serine protease.
2. The method of claim 1, wherein the protease is a family S8 protease.
3. The method of claim 1 or 2, wherein the protease is a subtilase, preferably a subtilisin.
4. The method of claim 3, wherein the subtilase is derived from Bacillus such as Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus and Bacillus gibsonii, and subtilisin lentus, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisin BPN’, subtilisin 309, subtilisin 147 and subtilisin 168 and protease PD138.
5. The method of claim 4, wherein the subtilase comprises or consists of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof having at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 1.
6. The method of any of claims 1-5, wherein the cellulase is GH45 cellulase.
7. A method for treating a textile, comprising:

   (a) contacting the textile with a cellulase; and

   (b) contacting the textile with a serine protease to inactivate the cellulase.
8. The method of claim 7, which has a reduced weight loss and/or strength losss of textile, relative to a method without step (b) .
9. The method of any of claims 7-8, wherein the protese is a family S8 protease.
10. The method of any of claim 7-9, wherein the protease is a subtilase, preferably a subtilisin.
11. The method of claim 10, wherein the subtilase is derived from Bacillus such as Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus and Bacillus gibsonii, and subtilisin lentus, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisin BPN’, subtilisin 309, subtilisin 147 and subtilisin 168 and protease PD138.
12. The method of claim 11, wherein the subtilase comprises or consists of SEQ ID NO: 1 or  the variants thereof having at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 1.
13. The method of any of claims 7-12, wherein the cellulase is GH45 cellulase.
14. The method of any of claims 7-13, wherein the cellulase is a Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, or Streptomyces polypeptide, or a Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, or Ureaplasma polypeptide; or wherein the cellulase is Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Sordaria, Staphylotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, or Xylaria polypeptide.
15. The method of any of claims 7-14, where the cellulase has at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%sequence identity to the mature polypeptide of SEQ ID NO: 5, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 6, the mature polypeptide of SEQ ID NO: 7, or the mature polypeptide of SEQ ID NO: 8.
16. The method of any of claims 7-15, which is biofinishing, preferably biopolishing or biostoning.
17. The method of any of claims 7-16, wherein step (a) and/or step (b) is carried out at a temperature of between about 20 ℃ and about 75 ℃, preferably between about 25 ℃ to about 70 ℃, and most preferably between about 25 ℃ and about 60 ℃; or wherein step (a) and/or step (b) is carried out at a pH of between about 4 and 12, preferably between about 5 and 10, and most preferably between about 5 and 8.

Images