CN113957103A - 甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法 - Google Patents

甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法。具体为，一种由作为碳源和/或能源的、可再生原料和/或利用该可再生原料所产生的生物质，使用能够由包含异丁酸或缬氨酸的有机物生成甲基丙烯酸的天然的微生物或它们的衍生株，制造甲基丙烯酸和/或其酯的方法，所述微生物为能够代谢异丁酰辅酶A的天然的微生物或它们的衍生株，所述衍生株为使烯酰辅酶A水合酶基因、3‑羟基异丁酰辅酶A水解酶基因和/或3‑羟基异丁酸脱氢酶基因缺失或失活而得的基因改变株。

Description

甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法
本申请是申请日为2013年9月10日，申请号为201380047196.3，发明名 称为《甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法》的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法。更详细而言，涉及使用具 有甲基丙烯酸生成能力的微生物的甲基丙烯酸等的制造方法及该微生物以及 利用该制造方法获得的甲基丙烯酸等。
背景技术
甲基丙烯酸作为涂料及树脂改性剂等的原料使用，其酯为丙烯酸系树脂的 原料，是工业上极其重要的化合物。
作为通过化学方式制造甲基丙烯酸衍生物的方法，以氰酸和丙酮为原料经 由丙酮合氰化氢的ACH法、以异丁烯或叔丁醇为原料的C4氧化法等已经得 到实用化。这些化学方式的制造方法依赖于化石原料，且需要大量的能量。
近年来，从防止地球温暖化及环境保护的观点出发，使用可再生的生物来 源的资源(可再生原料)代替目前的化石原料作为碳源已经受到关注。例如， 提出了利用天然存在的微生物由糖等天然物质生产作为甲基丙烯酸的前体的 2-羟基异丁酸及3-羟基异丁酸的方法(参照专利文献1、2及非专利文献1)。 但是，这些方法中，使前体脱水生成甲基丙烯酸的工序依然依赖于化学方法。
此外，虽然已经提出了使用导入有多种酶基因的、非天然存在的重组微生 物由葡萄糖生产甲基丙烯酸的方法，但是这些不过是将已知的酶反应及由此类 推的假想酶反应简单组合并提出的，并未进行实际验证(参照专利文献3～5)。
另一方面，天然存在的微生物中，具有生产甲基丙烯酸的能力的光合细菌 是已知的(非专利文献2)。但是，该光合细菌仅仅是将3-巯基异丁酸这一非 天然存在的特殊的化合物转化为甲基丙烯酸。
进而，专利文献6中公开了在丙烯酰辅酶A和醇的存在下用水解酶进行 作用制造丙烯酸酯的方法。该文献中给出了甲基丙烯酸酯也可以同样制造的技 术启示。但是，若考虑酶的多样性、底物特异性，则其仅仅公开了通过一部分 水解酶能够制造丙烯酸酯，而结构不同的甲基丙烯酸酯是否能够同样地通过水 解酶制造则不清楚。进而，是否能够通过反应机理不同的其它种类的酶来制造 也完全不清楚。此外，通过专利文献6所述的水解酶合成酯时，可以预想生成 的酯直接由于水解活性而被分解，很难认为是有效的制造方法。
另一方面，醇酰基转移酶(以下AAT)作为果味(fruity flavor)合成酶 而广为人知。专利文献7中提出了，鉴定了特定果实中包含的该酶的基因，作 为果实味道的各种酯的合成方法。但是，关于甲基丙烯酸酯是否能够通过这些 酶来合成则没有报道，因此这点并不清楚。
如上所述，虽然提出若干方案或者进行了若干研究，但并不存在实际利用 微生物制造甲基丙烯酸衍生物的例子，期待建立有效的制造方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2007/110394号小册子
专利文献2：国际公开第2008/145737号小册子
专利文献3：国际公开第2009/135074号小册子
专利文献4：国际公开第2011/031897号小册子
专利文献5：国际公开第2012/135789号小册子
专利文献6：国际公开第2007/039415号小册子
专利文献7：国际公开第00/32789号小册子
专利文献8：日本特表2011-519561号公报
专利文献9：日本特开2011-200133号公报
专利文献10：日本特开平5-64589号公报
专利文献11：日本特开平10-337185号公报
非专利文献
非专利文献1：Green Chemistry，2012，14，1942-1948
非专利文献2：Bioorganic&MedicinalChemistry，1994，7，589-593
非专利文献3：Methods in Enzymology，2000，324，241-258
非专利文献4：Fungal Genet.Biol.，2008，45，180-189
非专利文献5：Microbiology，1999，145，2323-2334
非专利文献6：Bacteriol.Review，1976，40，42-54(1976)
非专利文献7：J.Mol.Evol.，2009，69，176-193
非专利文献8：Methods in Enzymology，2000，324，129-138
发明内容
发明要解决的课题
现有的通过化学方式制造的方法、例如ACH法中，需要利用酸进行丙酮 合氰化氢的酸化处理，会产生大量的废酸。此外，各步骤中需要分离、纯化， 存在能量消耗大的问题。因此，正在寻求一种能够利用微生物的、由作为碳源 和/或能源的可再生原料和/或利用该可再生原料所产生的生物质直接通过单一 工序高效生产甲基丙烯酸的甲基丙烯酸的制造方法。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明人等对具有通过微生物生成甲基丙烯酸衍生物 能力的微生物进行了广泛探索，发现多种微生物能够生成甲基丙烯酸。
此外，如以下所示，发现这些具有生成甲基丙烯酸衍生物能力的微生物为 具有某种特点功能的微生物群，具有一定的共通性，并且还成功发现了对其进 行探索的方法。
首先，本发明人等尝试制作导入了缬氨酸代谢途径上的基因(支链酮酸脱 氢酶(以下记作BCKAD)及异丁酰辅酶A脱氢酶(以下记作ACD))的大 肠杆菌重组体、通过菌体反应由2-氧代异戊酸生成作为缬氨酸代谢通路的中间 体的甲基丙烯酸衍生物。但是，未确认到作为目标物的甲基丙烯酸衍生物的生 成而确认到异丁酸的生成。此外，由该重组体制备细胞提取液，添加辅酶等， 测定BCKAD及ACD的体外活性，结果确认到两者均有活性。由此判断，在 体内进行BCKAD反应但不进行ACD反应。
已知的是，在哺乳类中，支链氨基酸的代谢或脂肪酸的β-氧化中已知的脱 氢反应在线粒体内进行，脱离的电子经电子传递黄素蛋白(electron transferringflavoprotein)向着呼吸链传递。即推定仅仅对于不具有与功能同等的功能的微 生物导入外来ACD的情况下，该反应并不能进行。实际上，如上所述，在大 肠杆菌重组体中ACD反应并未进行。
本发明人等对于该需要解决的新课题、即具有通过微生物生产甲基丙烯酸 衍生物能力的微生物进行了广泛探索，发现通过使用能够通过微生物生成甲基 丙烯酸及、进而能够代谢ACD的底物即异丁酰辅酶A的微生物能够解决该课 题。能够代谢异丁酰辅酶A的微生物可以列举缬氨酸同化活菌及异丁酸同化 活菌等。这些微生物例如可以以缬氨酸为唯一碳源和/或氮源或以异丁酸为唯 一碳源使其生育而由自然界获得。
进而，本发明人等发现，上述通过对具有甲基丙烯酸生产能力的微生物追 加AAT的作用，能够在醇存在下制造甲基丙烯酸酯。
进而，本发明人等对于上述微生物来源的甲基丙烯酸合成相关酶及编码该 酶的基因进行了深入研究，结果明确了对甲基丙烯酸衍生物的生产有用的酶是 存在的，成功鉴定了该酶蛋白。然后发现，通过将这些酶蛋白组合能够合成甲 基丙烯酸衍生物。由此完成了本发明。即，本发明如下所述。
(1)一种使用具有甲基丙烯酸生成能力的微生物制造甲基丙烯酸和/或其 酯的方法。
(2)根据(1)的制造方法，积累0.04ppm以上的甲基丙烯酸和/或其酯。
(3)根据(1)或(2)的制造方法，使用具有甲基丙烯酸生成能力的微 生物，由作为碳源和/或能源的、可再生原料和/或利用该可再生原料所产生的 生物质生成甲基丙烯酸和/或其酯。
(4)根据(1)～(3)中任一项的制造方法，具有甲基丙烯酸生成能力 的微生物为能够由包含异丁酸或缬氨酸的有机物生成甲基丙烯酸的微生物。
(5)根据(1)～(4)中任一项的制造方法，具有甲基丙烯酸生成能力 的微生物为具有如下16S rRNA基因的微生物，所述16S rRNA基因由相对于 序列号1～41中所述的碱基序列中的任一者显示81％以上的同源性的碱基序 列组成。
(6)根据(1)～(4)中任一项的制造方法，具有甲基丙烯酸生成能力 的微生物为具有如下LSUrRNA基因的微生物，所述LSUrRNA基因由相对于 序列号42～49中所述的碱基序列中的任一者显示81％以上的同源性的碱基序 列组成。
(7)根据(1)～(6)中任一项的制造方法，具有甲基丙烯酸生成能力 的微生物为属于以下属的微生物：假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌 (Bacillus)属、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)属、丛毛单胞菌(Comamonas) 属、短波单胞菌(Brevundimonas)属、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)属、 苍白杆菌(Ochrobactrum)属、土地杆菌(Pedobacter)属、类芽孢杆菌 (Paenibacillus)属、无色小杆菌(Achromobacter)属、不动杆菌(Acinetobacter) 属、希瓦氏菌(Shewanella)属、利斯顿氏菌(Listonella)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、中间根瘤菌(Mesorhizobium)属、根瘤菌(Rhizobium) 属、副球菌(Paracoccus)属、黄色杆菌(Xanthobacter)属、链霉菌(Streptomyces) 属、地芽孢杆菌(Geobacillus)属、红球菌(Rhodococcus)属、酵母 (Saccharomyces)属、假丝酵母(Candida)属或曲霉(Aspergillus)属。
(8)根据(1)～(7)中任一项的制造方法，在AAT的存在下使醇或酚 类作用于甲基丙烯酰辅酶A从而制造甲基丙烯酸酯。
(9)根据(8)的制造方法，AAT来源于植物。
(10)(7)中的具有甲基丙烯酸生成能力的微生物。
(11)来源于(10)的微生物的甲基丙烯酸合成相关酶。
(12)编码(11)的酶的基因。
(13)通过具有甲基丙烯酸生成能力的微生物由作为碳源和/或能源的、 可再生原料和/或利用该可再生原料所产生的生物质产生的、甲基丙烯酸和/或 其酯。
(14)包含具有甲基丙烯酸生成能力的微生物、和甲基丙烯酸和/或其酯 的该微生物的培养物。
(15)根据(11)所述的酶，其包含选自以下的(a)～(c)组成的组中 的蛋白质。
(a)由序列号50或52所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
(b)与由序列号50或52所示的氨基酸序列组成的蛋白质显示45％以上 的同源性的氨基酸序列组成且具有ACD活性的蛋白质。
(c)由在序列号50或52所示的氨基酸序列中缺失、置换和/或附加1或 多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有ACD活性的蛋白质。
(16)包含使用(15)的酶的甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法。
(17)根据(1)～(7)中任一项的制造方法，具有甲基丙烯酸生成能力 的微生物为属于下述属的微生物：鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)属、丛毛单 胞菌(Comamonas)属、短波单胞菌(Brevundimonas)属、鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas)属、苍白杆菌(Ochrobactrum)属、土地杆菌(Pedobacter) 属、类芽孢杆菌(Paenibacillus)属、无色小杆菌(Achromobacter)属、不动 杆菌(Acinetobacter)属、希瓦氏菌(Shewanella)属、利斯顿氏菌(Listonella) 属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、中间根瘤菌(Mesorhizobium)属、副球 菌(Paracoccus)属、黄色杆菌(Xanthobacter)属、地芽孢杆菌(Geobacillus) 属、红球菌(Rhodococcus)属或假丝酵母(Candida)属。
此外，本发明人等发现AAT具有能够合成甲基丙烯酸酯的活性。即，本 发明另一方面如下所述。
(1A)甲基丙烯酸酯的制造方法，包含在AAT的存在下使醇或酚类作用 于甲基丙烯酰辅酶A从而合成甲基丙烯酸酯的工序。
(2A)根据(1A)的甲基丙烯酸酯的制造方法，积累0.001mM以上的甲 基丙烯酸酯。
(3A)根据(1A)或(2A)的甲基丙烯酸酯的制造方法，进而包含由异 丁酰辅酶A或3-羟基异丁酰辅酶A制造甲基丙烯酰辅酶A的工序。
(4A)根据(3A)的甲基丙烯酸酯的制造方法，其特征在于，异丁酰辅 酶A为由2-氧代异戊酸制造的。
(5A)根据(1A)～(4A)中任一项所述的甲基丙烯酸酯的制造方法， AAT来源于植物。
(6A)根据(5A)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为属于选自以下的 目所组成的组中的任一目的植物：姜(Zingiberales)目、蔷薇(Rosales)目、 杜鹃花(Ericales)目、葫芦(Cucurbitales)目、十字花(Brassicales)目及樟 (Laurales)目。
(7A)根据(5A)的甲基丙烯酸酯的制造方法植物，植物为属于选自以 下的科所组成的组中的任一科的植物：芭蕉(Musa)科、蔷薇(Rosales)科、 杜鹃花(Ericales)科、猕猴桃(Actinidia)科、葫芦(Cucurbitales)科、番木 瓜(Carica)科及樟(Laurales)科。
(8A)根据(5A)的甲基丙烯酸酯的制造方法植物，植物为属于选自以 下的属所组成的组中的任一属的植物：芭蕉(Musa)属、荷兰草莓(Fragaria) 属、苹果(Malus)属、杏(Armeniaca)属、梨(Pyrus)属、越桔(Vaccinium) 属、猕猴桃(Actinidia)属、黄瓜(Cucumis)属、番木瓜(Carica)属及鳄梨 (Persea)属。
(9A)根据(5A)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为选自香蕉、草莓、 苹果、梅子、西洋梨、蓝莓、猕猴桃、甜瓜、番木瓜及鳄梨组成的组中的任一 者。
(10A)根据(1A)～(9A)中任一项所述的甲基丙烯酸酯的制造方法， 使用按照表达AAT的方式导入了基因的基因重组微生物。
(11A)根据(5A)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为选自属于芭蕉属、 苹果属、李属、梨属、越桔属、猕猴桃属、黄瓜属、番木瓜属或鳄梨属的植物 中的任一者。
(12A)根据(5A)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为选自属于芭蕉属、 苹果属、梨属、猕猴桃属、黄瓜属、番木瓜属或鳄梨属的植物中的任一者。
(13A)根据(5A)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为选自香蕉、苹果、 梅子、西洋梨、蓝莓、猕猴桃、甜瓜、番木瓜及鳄梨组成的组中的任一者。
(14A)根据(5A)的甲基丙烯酸酯的制造方法，植物为选自香蕉、苹果、 西洋梨、猕猴桃、甜瓜、番木瓜及鳄梨组成的组中的任一者。
进而，本发明人等发现微生物来源的、具有ACD的功能的特定蛋白质具 有高效率地将异丁酰辅酶A转化为甲基丙烯酰辅酶A的能力。进而发现，1) 通过组合生成异丁酰辅酶A的酶即BCKAD能够由2-氧代异戊酸合成甲基丙 烯酰辅酶A、2)通过组合AAT能够由异丁酰辅酶A合成甲基丙烯酸酯、3) 通过组合具有甲基丙烯酰辅酶A水解活性的酶能够由异丁酰辅酶A合成甲基 丙烯酸。即，本发明的又一方面如下所述。
(1B)导入了选自下述(a)～(d)组成的组中的ACD基因的转化体。
(a)编码由序列号50或52所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因、
(b)由序列号51或53所示的碱基序列组成的基因、
(c)编码与由序列号50或52所示的氨基酸序列组成的蛋白质显示45％ 以上的同源性的氨基酸序列组成的、且具有ACD活性的蛋白质的基因、及
(d)编码由在序列号50或52所示的氨基酸序列中缺失、置换、附加和/ 或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列组成的、具有ACD活性的蛋白质的基因。
(2B)根据(1B)的转化体，除了ACD基因外还导入了BCKAD复合体 基因。
(3B)根据(2B)的转化体，BCKAD复合体基因为选自下述(e)～(h) 组成的组的基因。
(e)编码具有序列号54、56、58及60所示的氨基酸序列的4个多肽的 基因。
(f)由序列号55、57、59及61所示的碱基序列组成的基因。
(g)与编码具有序列号54、56、58及60所示的氨基酸序列的4个多肽 的基因的互补链在严格条件下杂交、且编码具有BCKAD活性的蛋白质的基 因。
(h)由在序列号54、56、58及60所示的氨基酸序列中缺失、置换、附 加和/或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且编码具有BCKAD活性的 蛋白质的基因。
(4B)根据(2B)的转化体，BCKAD复合体基因为选自下述(i)～(l) 组成的组中的基因。
(i)编码具有序列号62、64、66及68所示的氨基酸序列的4个多肽的 基因。
(j)由序列号63、65、67及69所示的碱基序列组成的基因。
(k)与编码具有序列号62、64、66及68所示的氨基酸序列的4个多肽 的基因的互补链在严格条件下杂交、且编码具有BCKAD活性的蛋白质的基 因。
(l)由在序列号62、64、66及68所示的氨基酸序列中缺失、置换、附 加和/或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且编码具有BCKAD活性的 蛋白质的基因。
(5B)根据(2B)的转化体，BCKAD复合体基因为选自下述(m)～(p) 组成的组中的基因。
(m)编码具有序列号70、72及74所示的氨基酸序列的3个多肽的基因。
(n)由序列号71、73及75所示的碱基序列组成的基因。
(o)与编码具有序列号70、72及74所示的氨基酸序列的3个多肽的基 因的互补链在严格条件下杂交、且编码具有BCKAD活性的蛋白质的基因。
(p)由在序列号70、72及74所示的氨基酸序列中缺失、置换、附加和/ 或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且编码具有BCKAD活性的蛋白质 的基因。
(6B)根据(1B)～(5B)中任一项的转化体，转化体为对具有由葡萄 糖到2-氧代异戊酸的代谢通路的宿主进行基因导入而得的转化体。
(7B)根据(1B)～(6B)中任一项的转化体，进而导入了具有AAT 活性的酶基因。
(8B)根据(1B)～(7B)中任一项的转化体，进而导入了具有水解甲 基丙烯酰辅酶A的活性的酶基因。
(9B)一种甲基丙烯酰辅酶A的制造方法，其包含：使用(1B)的转化 体表达具有ACD活性的蛋白质并使用该蛋白。
(10B)一种甲基丙烯酰辅酶A的制造方法，其包含：使用(2B)～(5B) 任一项的转化体表达具有ACD活性和异戊酸脱氢酶活性的蛋白质并使用这些 蛋白质。
(11B)甲基丙烯酰辅酶A的制造方法，其包含：向宿主导入选自(1B) 的(a)～(d)组成的组中的ACD基因，对与上述宿主相同或不同宿主导入 选自(3B)～(5B)的(e)～(h)、(i)～(l)及(m)～(p)组成的组 中的BCKAD复合体基因，表达具有ACD活性和异戊酸脱氢酶活性的蛋白质 并使用这些蛋白质。
以下对本发明中的用语进行说明。
“甲基丙烯酸”(IUPAC名：2-甲基-2-丙烯酸)是指具有化学式CH2＝C (CH3)COOH的化合物，也包含其任意的盐或离子化的形态。作为甲基丙烯 酸的盐，可以列举例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐等。
“甲基丙烯酸酯”是指式1表示的化合物。式1中，R表示直链或支链的 碳原子数1～20的烃基。烃基可以是饱和或不饱和的非环式，也可以是饱和或 不饱和的环式。优选直链或支链的碳原子数1～10的无取代的烷基、芳烷基或 芳基。特别优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、 叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基、异己基、2-己基、二甲基丁基、 乙基丁基、庚基、辛基及2-乙基己基的碳原子数1～8的烷基、苄基或苯基。
CH2＝C(CH3)COO-R (式1)
“甲基丙烯酸衍生物”是除了上述甲基丙烯酸及甲基丙烯酸酯以外的包含 甲基丙烯酰基(CH2＝CCH3COO-)的化合物的总称。作为包含甲基丙烯酰基 的化合物，可以列举甲基丙烯酰辅酶A。
“甲基丙烯酸生成能力”是指以可再生原料作为碳源和/或能源生成甲基 丙烯酸的能力。“生成”是指生物体中的甲基丙烯酸的合成和分解的总和(即平 衡)，并非仅限于合成。
“可再生原料”是指天然资源，例如来源于动物、植物或微生物的资源， 该资源能够通过自然的过程超过人类等的利用速度进行再构建。该资源必须能 够在其自身内以与其消耗速度尽可能相同的速度再生。例如，植物性物质具有 以下优点：能够进行栽培，且栽培中不会以引起天然的材料源显著减少那样的 程度地消耗植物性物质。
“生物质”是指可再生的、能够作为生物来源的有机性能量等利用的全部资 源。生物质包含植物性材料、动物性材料及生物降解性废弃物等。
“碳源”是指微生物能够同化的、能够用于产生新细胞的有机化合物。
“能源”是指用于生成在碳源经代谢中间体被同化而成为细胞构成成分中 必须的能量分子(ATP)的全部化合物。当由各种化合物的氧化反应，来提供 微生物在用于生成ATP的代谢即异化的过程中需要的能源时，这些化合物即 为“能源”。
“可再生原料的利用”是指：包含用于由可再生原料获得燃料成分及各种有 机物等的气化、液化、糖化、酶处理、发酵、发酵产物蒸馏、水解、脱水、浓 缩及干燥等各种处理工序中的至少一种的、可再生原料的综合利用方法。
“微生物”按照一般性定义是指全部种类的细菌、古细菌、蓝藻等原核生 物、酵母、丝状菌、粘菌、原生生物等真核生物、及病毒等，进而还包含未分 化为动物及植物的细胞、以及组织培养物。本发明中的“微生物”特别是指具有 甲基丙烯酸生成能力的微生物。进而，还作为包含甲基丙烯酸生成能力的培养 物、培养基(由培养物除去菌体后的培养基)、菌体(也包含培养菌体及洗涤 菌体)、对菌体进行破碎或溶菌而得的菌体处理物、对上述培养基和/或细胞 进行纯化处理而获得的具有甲基丙烯酸生成活性的组合物(粗酶液、纯化酶) 等的概念使用。
“衍生株”通常是指通过天然或化学处理或物理处理由某一微生物株衍生 而得的菌株。本发明中，特别是指由具有甲基丙烯酸生成能力的微生物株衍生 的、依然保持以可再生原料作为碳源和/或能源生成甲基丙烯酸的能力的菌株。
“接触”是指将微生物和物质(可再生原料)进行一定时间的曝露处理。 具体是指在包含可再生原料的水性介质中添加微生物并悬浮混合。此时，即使 存在微生物的增殖也无妨。
“水性介质”是指水、或以水为主成分的水溶液及凝胶(琼脂)，也包含分 散有未溶解的液体、固体的情况。
“气相”是指培养槽(培养微生物的容器)或反应槽(进行反应的容器)中 除了液体(培养基等)所占的部分以外的由气体、水蒸气等占据的部分。
“培养”是指使微生物或多细胞生物的细胞在人工环境下增殖。
“培养物”是指菌体、培养液、无细胞提取液、细胞膜等通过培养而获得的 物质。无细胞提取液可以如下获得，即，对培养后的菌体加入例如磷酸钠缓冲 液用均化器等进行物理破碎后，离心(15,000rpm，10min，4℃)，将去除了 未破碎菌、细胞膜的上清液回收，从而获得。
“酯化”是指由醇和脂肪酸通过脱水生成酯的反应。进而，包含生成通过 与其它醇的醇交换反应生成新的酯时的酯、多元醇的部分酯的反应。
发明的效果
根据本发明，提供一种由作为碳源和/或能源的、可再生原料和/或利用该 可再生原料所产生的生物质直接通过单一工序高效生产甲基丙烯酸的方法。
附图说明
图1为示出由2-氧代异戊酸制造甲基丙烯酸酯的工序的图。
图2为示出甲基丙烯酸产生菌的培养液中产生的甲基丙烯酸的CG/MS分 析结果的总离子色谱(实施例2)。
图3为示出甲基丙烯酸产生菌的培养液中产生的甲基丙烯酸的CG/MS分 析结果的质谱(实施例2)。
图4为示出LigD同源基因缺失用质粒的结构的图。
图5为说明使用In Fusion法的基因缺失用质粒的制作方法的图。
图6为示出ACD-AAT双表达用质粒的结构的图。
图7为示出利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行的重组蛋白质表达的图。 箭头表示目标蛋白的位置。(A)宿主为大肠杆菌JM109、使用pTrc99A作为 载体的导入有标记基因的重组体的细胞提取液。(B)宿主为大肠杆菌BL21 (DE3)、使用pET19b作为载体的导入有标记基因的重组体的细胞提取液。 (C)导入有acdH基因的重组体的细胞提取液。
具体实施方式
以下说明用于实施本发明的优选方式。另外，以下说明的实施方式是表示 本发明的代表性实施方式的一例，不可基于此对本发明的范围作限定性解释。
1.甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法
本发明的甲基丙烯酸和/或其酯的制造方法(以下也简称为“甲基丙烯酸的 制造方法”)中，使用具有甲基丙烯酸生成能力的微生物，由作为碳源和/或能 源的、可再生原料和/或利用该可再生原料所产生的生物质制造甲基丙烯酸。 具体而言，通过使具有甲基丙烯酸生成能力的微生物与可再生原料和/或生物 质接触的工序制造甲基丙烯酸。更具体而言，通过在包含可再生原料和/或生 物质的水性介质中培养上述微生物而在水性介质中获得甲基丙烯酸。
(1)微生物
本发明的甲基丙烯酸的制造方法中使用的微生物只要是具有甲基丙烯酸 生成能力的微生物则没有特别限定。微生物可以利用例如以下那样的微生物。 关于微生物，可以单独使用由以下的微生物中选择的1种，或者将由以下的微 生物中选择的2种以上组合使用。
[原核生物的优选目]
作为适用于本发明的原核微生物，具体而言，可以列举属于例如红螺菌目(Rhodospirillales)、红细菌目(Rhodobacterales)、鞘氨醇单胞菌目(Sphingomonadales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、 短小盒菌目(Parvularculales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、嗜氢菌目 (Hydrogenophilales)、奈瑟菌目(Neisseriales)、亚硝化单胞菌目 (Nitrosomonadales)、红环菌目(Rhodocyclales)、着色菌目(Chromatiales)、 酸硫杆状菌目(Acidithiobacillales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、硫发 菌目(Thiotrichales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、假单胞菌目 (Pseudomonadales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、弧菌目(Vibrionales)、 气单胞菌目(Aeromonadales)、盐水球形菌目(Salinisphaerales)、军团菌目 (Legionellales)、脱硫杆菌目(Desulfobacterales)、脱硫盒菌目(Desulfarculales)、 脱硫单胞菌目(Desulfuromonadales)、互营杆菌目(Syntrophobacterales)、 蛭弧菌目(Bdellovibrionales)、黏球菌目(Myxococcales)、酸杆菌目 (Acidobacteriales)、放线菌目(Actinomycetales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、红色杆形菌目(Rubrobacterales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、乳酸杆菌目(Lactobacillales)、 梭菌目(Clostridiales)、热厌氧杆菌目(Thermoanaerobacterales)、盐碱厌氧 菌目(Natranaerobiales)、鞘氨醇杆菌目(Sphingobacteriales)、拟杆菌目 (Bacteroidales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、 奇异球菌目(Deinococcales)、栖热菌目(Thermales)、出芽单胞菌目 (Gemmatimonadales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、绿弯菌目(Chloroflexales)、 爬管菌目(Herpetosiphonales)、热微菌目(Thermomicrobiales)、热袍菌目 (Thermotogales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、硫化叶菌目(Sulfolobales)、 脱硫球菌目(Desulfurococcales)、热变形菌目(Thermoproteales)、酸叶菌 目(Acidilobales)、盐杆菌目(Halobacteriales)、热原体目(Thermoplasmatales) 及古生球菌目(Archaeoglobales)的微生物。
其中，优选的微生物为属于红螺菌目(Rhodospirillales)、红细菌目(Rhodobacterales)、鞘氨醇单胞菌目(Sphingomonadales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、短小盒菌目(Parvularculales)、 伯克氏菌目(Burkholderiales)、嗜氢菌目(Hydrogenophilales)、奈瑟菌目 (Neisseriales)、亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadales)、红环菌目(Rhodocyclales)、 着色菌目(Chromatiales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、硫发菌目 (Thiotrichales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、假单胞菌目 (Pseudomonadales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、弧菌目(Vibrionales)、 气单胞菌目(Aeromonadales)、盐水球形菌目(Salinisphaerales)、军团菌目 (Legionellales)、脱硫杆菌目(Desulfobacterales)、脱硫盒菌目(Desulfarculales)、 脱硫单胞菌目(Desulfuromonadales)、互营杆菌目(Syntrophobacterales)、 蛭弧菌目(Bdellovibrionales)、黏球菌目(Myxococcales)、酸杆菌目 (Acidobacteriales)、放线菌目(Actinomycetales)、红色杆形菌目(Rubrobacterales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、芽孢杆菌目 (Bacillales)、乳酸杆菌目(Lactobacillales)、梭菌目(Clostridiales)、热厌 氧杆菌目(Thermoanaerobacterales)、盐碱厌氧菌目(Natranaerobiales)、鞘 氨醇杆菌目(Sphingobacteriales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、噬纤维菌目 (Cytophagales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、奇异球菌目(Deinococcales)、 栖热菌目(Thermales)、出芽单胞菌目(Gemmatimonadales)、梭杆菌目 (Fusobacteriales)、绿弯菌目(Chloroflexales)、爬管菌目(Herpetosiphonales)、 热微菌目(Thermomicrobiales)、热袍菌目(Thermotogales)、脱铁杆菌目 (Deferribacterales)、硫化叶菌目(Sulfolobales)、脱硫球菌目 (Desulfurococcales)、热变形菌目(Thermoproteales)、酸叶菌目(Acidilobales)、 盐杆菌目(Halobacteriales)、热原体目(Thermoplasmatales)及古生球菌目 (Archaeoglobales)的微生物。
此外，实验上确认能够生成甲基丙烯酸衍生物的特别优选微生物为属于红 细菌目(Rhodobacterales)、鞘氨醇单胞菌目(Sphingomonadales)、柄杆菌 目(Caulobacterales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、 假单胞菌目(Pseudomonadales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、弧菌目(Vibrionales)、放线菌目(Actinomycetales)、芽孢杆菌目(Bacillales)及 鞘氨醇杆菌目(Sphingobacteriales)的微生物。
[原核生物的优选科]
属于红螺菌目(Rhodospirillales)的优选科可以列举红螺菌科(Rhodospirillaceae)及醋杆菌科(Acetobacteraceae)；属于红细菌目(Rhodobacterales)的优选科可以列举红细菌科(Rhodobacteraceae)及生丝单 胞菌科(Hyphomonadaceae)；属于鞘氨醇单胞菌目(Sphingomonadales)的 优选科可以列举鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)及红色杆菌科 (Erythrobacteraceae)；属于柄杆菌目(Caulobacterales)的优选科可以列举柄 杆菌科(Caulobacteraceae)；属于根瘤菌目(Rhizobiales)的优选科可以列举 根瘤菌科(Rhizobiaceae)、黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)、布鲁氏菌科 (Brucellaceae)、叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)、橙单胞菌科 (Aurantimonadaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、红菌科 (Rhodobiaceae)及甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)；属于短小盒菌目 (Parvularculales)的优选科可以列举短小盒菌科(Parvularculaceae)；属于伯 克氏菌目(Burkholderiales)的优选科可以列举伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、 产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)及草酸杆 菌科(Oxalobacteraceae)；属于嗜氢菌目(Hydrogenophilales)的优选科可以 列举嗜氢菌科(Hydrogenophilaceae)、奈瑟菌目(Neisseriales)的优选科可以 列举奈瑟菌科(Neisseriaceae)；属于亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadales)的 优选科可以列举亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)；属于红环菌目 (Rhodocyclales)的优选科可以列举红环菌科(Rhodocyclaceae)；属于着色 菌目(Chromatiales))的优选科可以列举着色菌科(Chromatiaceae)及外硫 红螺旋菌科(Ectothiorhodospiraceae)；属于酸硫杆状菌目(Acidithiobacillales) 的优选科可以列举酸硫杆状菌科(Acidithiobacillaceae)；属于黄单胞菌目 (Xanthomonadales)的优选科可以列举黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)；属 于硫发菌目(Thiotrichales)的优选科可以列举弗郎西斯氏菌科(Francisellaceae) 及鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)；属于海洋螺菌目(Oceanospirillales) 的优选科可以列举海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、河氏菌科(Hahellaceae)、 盐单胞菌科(Halomonadaceae)及食烷菌科(Alcanivoracaceae)；属于假单胞 菌目(Pseudomonadales)的优选科可以列举假单胞菌科(Pseudomonadaceae) 及莫拉氏菌科(Moraxellaceae)；属于交替单胞菌目(Alteromonadales)的优 选科可以列举交替单胞菌科(Alteromonadaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、 铁还原单胞菌科(Ferrimonadaceae)、源海菌科(Idiomarinaceae)、科维尔氏 菌科(Colwelliaceae)及假交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)；属于弧 菌目(Vibrionales)的优选科可以列举弧菌科(Vibrionaceae)；属于气单胞菌 目(Aeromonadales)的优选科可以列举气单胞菌科(Aeromonadaceae)；属 于盐水球形菌目(Salinisphaerales)的优选科可以列举盐水球形菌科 (Salinisphaeraceae)；属于军团菌目(Legionellales)的优选科可以列举军团 菌科(Legionellaceae)及考克斯氏体科(Coxiellaceae)；属于脱硫杆菌目 (Desulfobacterales)的优选科可以列举脱硫盒菌科(Desulfobulbaceae)；属 于脱硫盒菌目(Desulfarculales)的优选科可以列举脱硫盒菌科(Desulfarculaceae)；属于脱硫单胞菌目(Desulfuromonadales)的优选科可 以列举地杆菌科(Geobacteraceae)；属于互营杆菌目(Syntrophobacterales) 的优选科可以列举互营杆菌科(Syntrophobacteraceae)及共养菌科 (Syntrophaceae)；属于蛭弧菌目(Bdellovibrionales)的优选科可以列举蛭弧 菌科(Bdellovibrionaceae)及噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae)；属于黏球菌 目(Myxococcales)的优选科可以列举孢囊杆菌科(Cystobacteraceae)、黏球 菌科(Myxococcaceae)、多囊黏菌科(Polyangiaceae)及克夫勒氏菌科 (Kofleriaceae)；属于酸杆菌目(Acidobacteriales)的优选科可以列举酸杆菌 科(Acidobacteriaceae)；属于酸微菌目(Acidimicrobiales)的优选科可以列 举酸微菌科(Acidimicrobiaceae)；属于放线菌目(Actinomycetales)的优选 科可以列举链孢囊菌科(Streptosporangiaceae)、拟诺卡氏菌科 (Nocardiopsaceae)、高温单孢菌科(Thermomonosporaceae)、假诺卡氏菌 科(Pseudonocardiaceae)、束丝放线菌科(Actinosynnemataceae)、小单孢菌 科(Micromonosporaceae)、放线多孢菌科(Actinopolysporaceae)、丙酸杆菌 科(Propionibacteriaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、 迪茨氏菌科(Dietziaceae)、分支杆菌科(Mycobacteriaceae)、束村氏菌科 (Tsukamurellaceae)、慢反应脂肪酸菌科(Segniliparaceae)、小杆菌科(Microbacteriaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、皮杆菌科 (Dermabacteraceae)、嗜皮菌科(Dermatophilaceae)、短杆菌科 (Brevibacteriaceae)、纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)、间孢囊菌科 (Intrasporangiaceae)、琼斯氏菌科(Jonesiaceae)、稀有杆菌科(Rarobacteraceae)、 弗兰克氏菌科(Frankiaceae)、热酸菌科(Acidothermaceae)、中村氏菌科 (Nakamurellaceae)、隐孢囊菌科(Cryptosporangiaceae)、地嗜皮菌科 (Geodermatophilaceae)、糖霉菌科(Glycomycetaceae)、放线菌科 (Actinomycetaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、细小链孢菌科 (Catenulisporaceae)及动孢囊菌科(Kineosporiaceae)；属于双歧杆菌目(Bifidobacteriales)的优选科可以列举双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)；属 于红色杆形菌目(Rubrobacterales)的优选科可以列举红色杆形菌科 (Rubrobacteraceae)；属于土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)的优选科可以 列举束缚菌科(Conexibacteraceae)；属于芽孢杆菌目(Bacillales)的优选科 可以列举芽孢杆菌科(Bacillaceae)、脂环酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、 类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、球菌科(Planococcaceae)、芽孢乳杆菌科 (Sporolactobacillaceae)及高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae)；属于乳 酸杆菌目(Lactobacillales)的优选科可以列举乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、 明串珠菌科(Leuconostocaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、肉杆菌科 (Carnobacteriaceae)及链球菌科(Streptococcaceae)；属于梭菌目(Clostridiales) 的优选科可以列举梭菌科(Clostridiaceae)、共养单胞菌科(Syntrophomonadaceae)、真杆菌科(Eubacteriaceae)、消化球菌科 (Peptococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、毛螺旋菌科 (Lachnospiraceae)及颤螺旋菌科(Oscillospiraceae)；属于热厌氧杆菌目 (Thermoanaerobacterales)的优选科可以列举热厌氧杆状菌科 (Thermoanaerobacteraceae)；属于盐碱厌氧菌目(Natranaerobiales)的优选 科可以列举需碱厌氧菌科(Natranaerobiaceae)；属于鞘氨醇杆菌目(Sphingobacteriales)的优选科可以列举鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae) 及腐螺旋菌科(Saprospiraceae)；属于拟杆菌目(Bacteroidales)的优选科可 以列举拟杆菌科(Bacteroidaceae)、海滑菌科(Marinilabiliaceae)、普雷沃氏 菌科(Prevotellaceae)及卟啉单胞菌科(Porphyromonadaceae)、噬纤维菌目 (Cytophagales)的优选科可以列举噬纤维菌科(Cytophagaceae)及火色杆菌 科(Flammeovirgaceae)；属于黄杆菌目(Flavobacteriales)的优选科可以列 举黄杆菌科(Flavobacteriaceae)；属于奇异球菌目(Deinococcales)的优选科 可以列举奇异球菌科(Deinococcaceae)；属于栖热菌目(Thermales)的优选 科可以列举栖热菌科(Thermaceae)；属于出芽单胞菌目(Gemmatimonadales) 的优选科可以列举出芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)；属于梭杆菌目 (Fusobacteriales)的优选科可以列举梭杆菌科(Fusobacteriaceae)；属于绿弯 菌目(Chloroflexales)的优选科可以列举绿弯菌科(Chloroflexaceae)；属于 爬管菌目(Herpetosiphonales)的优选科可以列举爬管菌科 (Herpetosiphonaceae)；属于热微菌目(Thermomicrobiales)的优选科可以列 举热微菌科(Thermomicrobiaceae)、热袍菌目(Thermotogales)的优选科可 以列举热袍菌科(Thermotogaceae)；属于脱铁杆菌目(Deferribacterales)的 优选科可以列举脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)；属于硫化叶菌目 (Sulfolobales)的优选科可以列举硫化叶菌科(Sulfolobaceae)；属于脱硫球 菌目(Desulfurococcales)的优选科可以列举脱硫球菌科(Desulfurococcaceae)； 属于热变形菌目(Thermoproteales)的优选科可以列举热变形菌科 (Thermoproteaceae)；属于酸叶菌目(Acidilobales)的优选科可以列举酸叶 菌科(Acidilobaceae)；属于盐杆菌目(Halobacteriales)的优选科可以列举盐 杆菌科(Halobacteriaceae)；属于热原体目(Thermoplasmatales)的优选科可 以列举热原体科(Thermoplasmataceae)、嗜酸古菌科(Picrophilaceae)及亚 铁原体科(Ferroplasmaceae)；属于古生球菌目(Archaeoglobales)的优选科 可以列举古生球菌科(Archaeoglobaceae)。
其中，优选的微生物为属于红螺菌科(Rhodospirillaceae)、醋杆菌科(Acetobacteraceae)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、生丝单胞菌科 (Hyphomonadaceae)、鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)、红色杆菌科(Erythrobacteraceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、 黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、叶杆菌科 (Phyllobacteriaceae)、橙单胞菌科(Aurantimonadaceae)、慢生根瘤菌科 (Bradyrhizobiaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、生丝微菌科 (Hyphomicrobiaceae)、红菌科(Rhodobiaceae)、甲基孢囊菌科 (Methylocystaceae)、短小盒菌科(Parvularculaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、丛毛单胞菌科 (Comamonadaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、 亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、着色 菌科(Chromatiaceae)、外硫红螺旋菌科(Ectothiorhodospiraceae)、黄单胞 菌科(Xanthomonadaceae)、弗郎西斯氏菌科(Francisellaceae)、鱼立克次体 科(Piscirickettsiaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、河氏菌科 (Hahellaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、食烷菌科(Alcanivoracaceae)、 假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、交替单胞 菌科(Alteromonadaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、铁还原单胞菌科(Ferrimonadaceae)、源海菌科(Idiomarinaceae)、科维尔氏菌科(Colwelliaceae)、 假交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、气单 胞菌科(Aeromonadaceae)、盐水球形菌科(Salinisphaeraceae)、军团菌科 (Legionellaceae)、考克斯氏体科(Coxiellaceae)、脱硫盒菌科 (Desulfobulbaceae)、脱硫盒菌科(Desulfarculaceae)、地杆菌科 (Geobacteraceae)、互营杆菌科(Syntrophobacteraceae)、共养菌科 (Syntrophaceae)、蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)、噬菌弧菌科 (Bacteriovoracaceae)、孢囊杆菌科(Cystobacteraceae)、黏球菌科(Myxococcaceae)、多囊黏菌科(Polyangiaceae)、克夫勒氏菌科(Kofleriaceae)、 酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、酸微菌科(Acidimicrobiaceae)、链孢囊菌科(Streptosporangiaceae)、拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)、高温单孢菌科(Thermomonosporaceae)、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、束丝放线 菌科(Actinosynnemataceae)、小单孢菌科(Micromonosporaceae)、类诺卡 氏菌科(Nocardioidaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、 分支杆菌科(Mycobacteriaceae)、束村氏菌科(Tsukamurellaceae)、慢反应 脂肪酸菌科(Segniliparaceae)、小杆菌科(Microbacteriaceae)、微球菌科 (Micrococcaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、纤维单胞菌科 (Cellulomonadaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、弗兰克氏菌科(Frankiaceae)、热酸菌科(Acidothermaceae)、中村氏菌科(Nakamurellaceae)、 地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、糖霉菌科(Glycomycetaceae)、链霉菌 科(Streptomycetaceae)、细小链孢菌科(Catenulisporaceae)、红色杆形菌科(Rubrobacteraceae)、束缚菌科(Conexibacteraceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、 脂环酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、 乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)梭菌科 (Clostridiaceae)、共养单胞菌科(Syntrophomonadaceae)、真杆菌科 (Eubacteriaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、 颤螺旋菌科(Oscillospiraceae)、热厌氧杆状菌科(Thermoanaerobacteraceae)、 需碱厌氧菌科(Natranaerobiaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、 腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、卟啉单胞菌科(Porphyromonadaceae)、噬纤 维菌科(Cytophagaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、奇异球菌科 (Deinococcaceae)、栖热菌科(Thermaceae)、出芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、绿弯菌科 (Chloroflexaceae)、爬管菌科(Herpetosiphonaceae)、热微菌科 (Thermomicrobiaceae)、热袍菌科(Thermotogaceae)、脱铁杆菌科 (Deferribacteraceae)、硫化叶菌科(Sulfolobaceae)、脱硫球菌科 (Desulfurococcaceae)、热变形菌科(Thermoproteaceae)、酸叶菌科(Acidilobaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、热原体科(Thermoplasmataceae)、 嗜酸古菌科(Picrophilaceae)、亚铁原体科(Ferroplasmaceae)及古生球菌科(Archaeoglobaceae)的微生物。
此外，实验上确认能够生成甲基丙烯酸衍生物的特别优选的微生物为属于 红细菌科(Rhodobacteraceae)、鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)、柄 杆菌科(Caulobacteraceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、叶杆菌科 (Phyllobacteriaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、丛毛单胞菌科 (Comamonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、莫拉氏菌科 (Moraxellaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)及鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)的微生物。
[原核生物的优选属]
属于红螺菌科(Rhodospirillaceae)的优选属可以列举磁螺菌属(Magnetospirillum)、红螺菌属(Rhodospirillum)、固氮螺菌属(Azospirillum) 及替斯崔纳菌属(Tistrella)；属于醋杆菌科(Acetobacteraceae)的优选属可 以列举醋菌属(Acetobacter)、嗜酸菌属(Acidiphilium)及葡糖醋杆菌属 (Gluconacetobacter)；属于红细菌科(Rhodobacteraceae)的优选属可以列举 红细菌属(Rhodobacter)、副球菌属(Paracoccus)、鲁杰氏菌属(Ruegeria)、 简纳西氏菌属(Jannaschia)、玫瑰杆菌属(Roseobacter)、沟鞭藻玫瑰杆菌 属(Dinoroseobacter)、假弧菌属(Pseudovibrio)、暗棕色杆菌属(Phaeobacter)、 十八杆菌属(Octadecabacter)及阿赫兰氏菌属(Ahrensia)；属于生丝单胞菌 科(Hyphomonadaceae)的优选属可以列举生丝单胞菌属(Hyphomonas)、 海茎状菌属(Maricaulis)、海氏菌属(Hirschia)；属于鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)的优选属可以列举鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、 新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、鞘氨醇 菌属(Sphingobium)、烂泥杆菌属(Lutibacterium)及发酵单胞菌属 (Zymomonas)；属于红色杆菌科(Erythrobacteraceae)的优选属可以列举红 色杆菌属(Erythrobacter)；属于柄杆菌科(Caulobacteraceae)的优选属可以 列举短波单胞菌属(Brevundimonas)、柄杆菌属(Caulobacter)、苯基杆菌 属(Phenylobacterium)及不黏柄菌属(Asticcacaulis)；属于根瘤菌科 (Rhizobiaceae)的优选属可以列举土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)及中华根瘤菌属(Sinorhizobium)；属于黄色杆菌科 (Xanthobacteraceae)的优选属可以列举黄色杆菌属(Xanthobacter)及固氮根 瘤菌属(Azorhizobium)；属于布鲁氏菌科(Brucellaceae)的优选属可以列举 布鲁氏菌属(Brucella)及苍白杆菌属(Ochrobactrum)；属于叶杆菌科 (Phyllobacteriaceae)的优选属可以列举中间根瘤菌属(Mesorhizobium)及根 瘤菌属(Chelativorans)；属于橙单胞菌科(Aurantimonadaceae)的优选属可 以列举橙单胞菌属(Aurantimonas)；属于慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)的优选属可以列举慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、农单胞菌属(Agromonas)、 红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)及硝化杆菌属(Nitrobacter)；属于甲基 杆菌科(Methylobacteriaceae)的优选属可以列举甲基杆菌属 (Methylobacterium)；属于生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)的优选属可以 列举生丝微菌属(Hyphomicrobium)、红微菌属(Rhodomicrobium)及外海 芽孢杆菌属(Pelagibacterium)；属于红菌科(Rhodobiaceae)的优选属可以 列举细小棒状菌属(Parvibaculum)；属于甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)的优选属可以列举甲基孢囊菌属(Methylocystis)；属于短小盒菌科 (Parvularculaceae)的优选属可以列举短小盒菌属(Parvularcula)；属于伯克 氏菌科(Burkholderiaceae)的优选属可以列举伯克氏菌属(Burkholderia)、 青枯菌属(Ralstonia)、贪铜菌属(Cupriavidus)及多核杆菌属 (Polynucleobacter)；属于产碱杆菌科(Alcaligenaceae)的优选属可以列举无 色小杆菌属(Achromobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、鲍特氏菌属(Bordetella)、泰勒氏菌属(Taylorella)、极小单胞菌属(Pusillimonas)及 寡源菌属(Oligella)；属于丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)的优选属可以 列举丛毛单胞菌(Comamonas)、嗜脂环物菌属(Alicycliphilus)、戴尔福特 菌属(Delftia)、沙壤土杆菌属(Ramlibacter)、红育菌属(Rhodoferax)、 贪噬菌属(Variovorax)、极单胞菌属(Polaromonas)、食酸菌属(Acidovorax) 及蚯蚓肾杆菌属(Verminephrobacter)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)的优 选属可以列举赫山单胞菌属(Herminiimonas)、草螺菌属(Herbaspirillum) 及山冈单胞菌属(Collimonas)；属于嗜氢菌科(Hydrogenophilaceae)的优选 属可以列举嗜氢菌属(Hydrogenophilus)及硫杆菌属(Thiobacillus)；属于奈 瑟菌科(Neisseriaceae)的优选属可以列举色杆菌属(Chromobacterium)、鸥 杆菌属(Laribacter)及假高炳根氏菌属(Pseudogulbenkiania)；属于亚硝化 单胞菌科(Nitrosomonadaceae)的优选属可以列举亚硝化单胞菌属 (Nirosomonas)及亚硝化螺菌属(Nitrosospira)；属于红环菌科 (Rhodocyclaceae)的优选属可以列举固氮弧菌属(Aromatoleum)、固氮弯曲 菌属(Azoarcus)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、索氏菌属(Thauera) 及固氮螺形菌(脱氯弯杆菌)属(Azospira(Dechlorosoma))；属于着色菌科(Chromatiaceae)的优选属可以列举莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、硫球 形菌属(Thiosphaera)及亚硝化球菌属(Nitrosococcus)；属于外硫红螺旋菌 科(Ectothiorhodospiraceae)的优选属可以列举需盐红螺菌属 (Halorhodospira)；属于酸硫杆状菌科(Acidithiobacillaceae)的优选属可以 列举酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)的 优选属可以列举黄单胞菌属(Xanthomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、 假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)及罗河杆菌属(Rhodanobacter)；属 于弗郎西斯氏菌科(Francisellaceae)的优选属可以列举弗郎西斯氏菌属 (Francisella)；属于鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)的优选属可以列举解 环菌属(Cycloclasticus)；属于海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)的优选属可 以列举海洋螺菌属(Oceanospirillum)及海螺菌属(Marinospirillum)；属于 河氏菌科(Hahellaceae)的优选属可以列举河氏菌属(Hahella)；属于盐单胞 菌科(Halomonadaceae)的优选属可以列举盐单胞菌属(Halomonas)；属于 食烷菌科(Alcanivoracaceae)的优选属可以列举食烷菌属(Alcanivorax)及康 氏菌属(Kangiella)；属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的优选属可以列 举假单胞菌属(Pseudomonas)及固氮菌属(Azotobacter)；属于莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的优选属可以列举不动杆菌属(Acinetobacter)及嗜冷杆菌 属(Psychrobacter)；属于交替单胞菌科(Alteromonadaceae)的优选属可以 列举别样谢瓦氏菌属(Alishewanella)、交替单胞菌属(Alteromonas)、冰居 菌属(Glaciecola)、海杆状菌属(Marinobacter)、海杆菌属(Marinobacterium) 及噬糖菌属(Saccharophagus)；属于希瓦氏菌科(Shewanellaceae)的优选属 可以列举希瓦氏菌属(Shewanella)；属于铁还原单胞菌科(Ferrimonadaceae) 的优选属可以列举铁还原单胞菌属(Ferrimonas)；属于源海菌科 (Idiomarinaceae)的优选属可以列举源海菌属(Idiomarina)；属于科维尔氏 菌科(Colwelliaceae)的优选属可以列举科维尔氏菌属(Colwellia)；属于假 交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)的优选属可以列举假交替单胞菌属 (Pseudoalteromonas)；属于弧菌科(Vibrionaceae)的优选属可以列举利斯顿 氏菌属(Listonella)、弧菌属(Vibrio)及发光杆菌属(Photobacterium)； 属于气单胞菌科(Aeromonadaceae)的优选属可以列举气单胞菌属(Aeromonas) 及海洋单胞菌属(Oceanimonas)；属于盐水球形菌科(Salinisphaeraceae)的 优选属可以列举盐水球形菌属(Salinisphaera)；属于军团菌科(Legionellaceae) 的优选属可以列举军团菌属(Legionella)；属于考克斯氏体科(Coxiellaceae) 的优选属可以列举考克斯氏体属(Coxiella)；属于脱硫盒菌科(Desulfobulbaceae)的优选属可以列举脱硫球菌属(Desulfococcus)、脱硫杆 菌属(Desulfobacterium)及脱硫酸盐杆菌属(Desulfatibacillum)；属于脱硫 盒菌科(Desulfarculaceae)的优选属可以列举脱硫盒菌属(Desulfobulbus)及 脱硫盒菌属(Desulfarculus)；属于地杆菌科(Geobacteraceae)的优选属可以 列举地杆菌属(Geobacter)；属于互营杆菌科(Syntrophobacteraceae)的优选 属可以列举互营杆菌属(Syntrophobacter)；属于共养菌科(Syntrophaceae) 的优选属可以列举共养菌属(Syntrophus)及脱硫念珠菌属(Desulfomonile)； 属于蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)的优选属可以列举蛭弧菌属 (Bdellovibrio)；属于噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae)的优选属可以列举噬 菌属(Bacteriovorax)；属于孢囊杆菌科(Cystobacteraceae)的优选属可以列 举标桩菌属(Stigmatella)；属于黏球菌科(Myxococcaceae)的优选属可以列 举黏球菌属(Myxococcus)及厌氧黏杆细菌属(Anaeromyxobacter)；属于多 囊黏菌科(Polyangiaceae)的优选属可以列举堆囊菌属(Sorangium)；属于 克夫勒氏菌科(Kofleriaceae)的优选属可以列举海无柄孢囊黏细菌属 (Haliangium)；属于酸杆菌科(Acidobacteriaceae)的优选属可以列举酸杆菌 属(Acidobacterium)及短链小球菌属(Granulicella)；属于酸微菌科 (Acidimicrobiaceae)的优选属可以列举水沉积物杆菌属(Ilumatobacter)；属 于链孢囊菌科(Streptosporangiaceae)的优选属可以列举链孢囊菌属 (Streptosporangium)、端果孢菌属(Acrocarpospora)、草状孢菌属 (Herbidospora)、小双孢菌属(Microbispora)、野野村菌属(Nonomuraea)、 游动双孢菌属(Planobispora)及游动单胞菌属(Planomonospora)；属于拟诺 卡氏菌科(Nocardiopsaceae)的优选属可以列举拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis) 及喜热裂孢菌属(Thermobifida)；属于高温单孢菌科(Thermomonosporaceae) 的优选属可以列举珊瑚状放线菌属(Actinocorallia)、马杜拉放线菌属 (Actinomadura)及高温单孢菌属(Thermomonospora)；属于假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)的优选属可以列举假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、 异壁放线菌属(Actinoalloteichus)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、拟孢囊 菌属(Kibdelosporangium)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、糖丝菌属(Saccharothrix)、链异壁菌属 (Streptoalloteichus)、嗜热双孢菌属(Thermobispora)及热密卷菌属 (Thermocrispum)；属于束丝放线菌科(Actinosynnemataceae)的优选属可 以列举动孢放线菌属(Actinokineospora)及束丝放线菌属(Actinosynnema)； 属于小单孢菌科(Micromonosporaceae)的优选属可以列举小单孢菌属 (Micromonospora)、游动放线菌属(Actinoplanes)、链孢菌属(Catellatospora)、科氏游动菌属(Couchioplanes)、指孢囊菌属(Dactylosporangium)、发仙菌 属(Pilimelia)、盐水孢菌属(Salinispora)及疣孢菌属(Verrucosispora)； 属于放线多孢菌科(Actinopolysporaceae)的优选属可以列举放线多孢菌属 (Actinopolyspora)；属于丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)的优选属可以列 举丙酸杆菌属(Propionibacterium)及黄球菌属(Luteococcus)；属于类诺卡 氏菌科(Nocardioidaceae)的优选属可以列举类诺卡氏菌属(Nocardioides)、 气微菌属(Aeromicrobium)、韩国生工菌属(Kribbella)及脂肪杆菌属 (Pimelobacter)；属于棒杆菌科(Corynebacteriaceae)的优选属可以列举棒 杆菌属(Corynebacterium)；属于诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的优选属可以 列举诺卡氏菌属(Nocardia)及红球菌属(Rhodococcus)；属于戈登氏菌科 (Gordoniaceae)的优选属可以列举戈登氏菌属(Gordonia)；属于迪茨氏菌科 (Dietziaceae)的优选属可以列举迪茨氏菌属(Dietzia)；属于分支杆菌科 (Mycobacteriaceae)的优选属可以列举分支杆菌属(Mycobacterium)及分枝 菌酸球菌属(Amycolicicoccus)；属于束村氏菌科(Tsukamurellaceae)的优 选属可以列举束村氏菌属(Tsukamurella)；属于慢反应脂肪酸菌科(Segniliparaceae)的优选属可以列举慢反应脂肪酸菌属(Segniliparus)；属 于小杆菌科(Microbacteriaceae)的优选属可以列举小杆菌属(Microbacterium)、 壤霉菌属(Agromyces)、棍状杆菌属(Clavibacter)、短小杆菌属(Curtobacterium) 及拉氏杆菌属(Rathayibacter)；属于微球菌科(Micrococcaceae)的优选属可 以列举微球菌属(Micrococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、柠檬球菌属 (Citricoccus)、肾杆菌属(Renibacterium)、考克氏菌属(Kocuria)及罗斯 拜瑞氏菌属(Rothia)；属于皮杆菌科(Dermabacteraceae)的优选属可以列举 短状杆菌属(Brachybacterium)、皮生球菌属(Dermacoccus)、肥沃菌属 (Demetria)及皮肤球菌属(Kytococcus)；属于嗜皮菌科(Dermatophilaceae) 的优选属可以列举嗜皮菌属(Dermatophilus)；属于短杆菌科(Brevibacteriaceae) 的优选属可以列举短杆菌属(Brevibacterium)；属于纤维单胞菌科(Cellulomonadaceae)的优选属可以列举纤维单胞菌属(Cellulomonas)及厄 氏菌属(Oerskovia)；属于间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)的优选属可以列 举间孢囊菌属(Intrasporangium)、两面神菌属(Janibacter)、地杆菌属 (Terrabacter)及丝氨酸球菌属(Serinicoccus)；属于琼斯氏菌科(Jonesiaceae) 的优选属可以列举琼斯氏菌属(Jonesia)；属于稀有杆菌科(Rarobacteraceae) 的优选属可以列举稀有杆菌属(Rarobacter)；属于弗兰克氏菌科(Frankiaceae) 的优选属可以列举弗兰克氏菌属(Frankia)；属于热酸菌科(Acidothermaceae) 的优选属可以列举热酸菌属(Acidothermus)；属于中村氏菌科 (Nakamurellaceae)的优选属可以列举中村氏菌属(Nakamurella)；属于隐孢 囊菌科(Cryptosporangiaceae)的优选属可以列举隐孢囊菌属(Cryptosporangium)；属于地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)的优选属可 以列举地嗜皮菌属(Geodermatophilus)；属于糖霉菌科(Glycomycetaceae)的 优选属可以列举糖霉菌属(Glycomyces)及斯塔克布朗氏菌属(Stackebrandtia)； 属于放线菌科(Actinomycetaceae)的优选属可以列举隐秘杆菌属 (Arcanobacterium)；属于链霉菌科(Streptomycetaceae)的优选属可以列举 链霉菌属(Streptomyces)及北里孢菌属(Kitasatospora)；属于细小链孢菌科 (Catenulisporaceae)的优选属可以列举细小链孢菌属(Catenulispora)；属于 动孢囊菌科(Kineosporiaceae)的优选属可以列举动孢囊菌属(Kineosporia) 及动球菌属(Kineococcus)；属于双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)的优选属 可以列举双歧杆菌属(Bifidobacterium)；属于红色杆形菌科(Rubrobacteraceae)的优选属可以列举红色杆形菌属(Rubrobacter)；属于束缚菌科 (Conexibacteraceae)的优选属可以列举束缚菌属(Conexibacter)；属于芽孢杆 菌科(Bacillaceae)的优选属可以列举芽孢杆菌属(Bacillus)、地芽孢杆菌属 (Geobacillus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属 (Lysinibacillus)及喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)；属于脂环酸芽孢杆菌科 (Alicyclobacillaceae)的优选属可以列举脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus) 及Kyrpidia属；属于类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)的优选属可以列举类芽 孢杆菌属(Paenibacillus)及短芽孢杆菌属(Brevibacillus)；属于球菌科 (Planococcaceae)的优选属可以列举球菌属(Planococcus)及库特氏菌属 (Kurthia)；属于芽孢乳杆菌科(Sporolactobacillaceae)的优选属可以列举芽 孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)；属于高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae) 的优选属可以列举高温放线菌属(Thermoactinomyces)；属于乳杆菌科 (Lactobacillaceae)的优选属可以列举乳杆菌属(Lactobacillus)及片球菌属(Pediococcus)；属于明串珠菌科(Leuconostocaceae)的优选属可以列举明 串珠菌属(Leuconostoc)及魏斯氏菌属(Weissella)；属于气球菌科 (Aerococcaceae)的优选属可以列举气球菌属(Aerococcus)及格鲁比卡氏菌 属(Globicatella)；属于肉杆菌科(Carnobacteriaceae)的优选属可以列举差 异球菌属(Alloiococcus)及肉杆菌属(Carnobacterium)；属于链球菌科 (Streptococcaceae)的优选属可以列举链球菌属(Streptococcus)；属于梭菌 科(Clostridiaceae)的优选属可以列举梭菌属(Clostridium)及嗜碱菌属 (Alkaliphilus)；属于共养单胞菌科(Syntrophomonadaceae)的优选属可以列 举共养单胞菌属(Syntrophomonas)及互养栖热菌属(Syntrophothermus)； 属于真杆菌科(Eubacteriaceae)的优选属可以列举真杆菌属(Eubacterium)； 属于消化球菌科(Peptococcaceae)的优选属可以列举消化球菌属(Peptococcus)、 脱亚硫酸杆菌属(Desulfitobacterium)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum) 及暗色厌氧香肠状菌属(Pelotomaculum)；属于消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)的优选属可以列举消化链球菌属(Peptostreptococcus)；属于毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)的优选属可以列 举丁酸弧菌属(Butyrivibrio)及罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)；属于颤螺旋菌 科(Oscillospiraceae)的优选属可以列举颤螺旋菌属(Oscillibacter)；属于热 厌氧杆状菌科(Thermoanaerobacteraceae)的优选属可以列举热厌氧杆状菌属 (Thermoanaerobacter)及一氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)；属于需碱 厌氧菌科(Natranaerobiaceae)的优选属可以列举需碱厌氧菌属(Natranaerobius)；属于鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)的优选属可以 列举鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、土地杆菌属(Pedobacter)及黏液杆 菌属(Mucilaginibacter)；属于腐螺旋菌科(Saprospiraceae)的优选属可以列 举束缚杆菌属(Haliscomenobacter)；属于拟杆菌科(Bacteroidaceae)的优选 属可以列举拟杆菌科属(Bacteroides)；属于海滑菌科(Marinilabiliaceae)的 优选属可以列举海滑菌属(Marinilabilia)；属于普雷沃氏菌科(Prevotellaceae) 的优选属可以列举普雷沃氏菌属(Prevotella)；属于卟啉单胞菌科 (Porphyromonadaceae)的优选属可以列举卟啉单胞菌属(Porphyromonas)及 臭气杆菌属(Odoribacter)；属于噬纤维菌科(Cytophagaceae)的优选属可以 列举屈挠杆菌属(Flexibacter)、螺状菌属(Spirosoma)及古字状菌属(Runella)； 属于火色杆菌科(Flammeovirgaceae)的优选属可以列举火色杆菌属(Flammeovirga)；属于黄杆菌科(Flavobacteriaceae)的优选属可以列举黄杆 菌属(Flavobacterium)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)及海菌属(Maribacter)； 属于奇异球菌科(Deinococcaceae)的优选属可以列举奇异球菌属 (Deinococcus)；属于栖热菌科(Thermaceae)的优选属可以列举栖热菌属 (Thermus)、稍栖热菌属(Meiothermus)、大洋栖热菌属(Oceanithermus) 及海栖热菌属(Marinithermus)；属于出芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae) 的优选属可以列举出芽单胞菌属(Gemmatimonas)；属于梭杆菌科(Fusobacteriaceae)的优选属可以列举梭杆菌属(Fusobacterium)及泥杆菌属(Ilyobacter)；属于绿弯菌科(Chloroflexaceae)的优选属可以列举玫瑰弯菌 属(Roseiflexus)；属于爬管菌科(Herpetosiphonaceae)的优选属可以列举滑柱 菌属(Herpetosiphon)；属于热微菌科(Thermomicrobiaceae)的优选属可以 列举热微菌属(Thermomicrobium)；属于热袍菌科(Thermotogaceae)的优 选属可以列举热袍菌属(Thermotoga)、栖热腔菌属(Thermosipho)及高温 杆菌属(Fervidobacterium)；属于脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)的优选属 可以列举脱铁杆菌属(Deferribacter)、热土弧菌属(Calditerrivibrio)及弯枝 菌属(Flexistipes)；属于硫化叶菌科(Sulfolobaceae)的优选属可以列举生金 球菌属(Metallosphaera)及酸菌属(Acidianus)；属于脱硫球菌科(Desulfurococcaceae)的优选属可以列举气火菌属(Aeropyrum)；属于热变 形菌科(Thermoproteaceae)的优选属可以列举热棒菌属(Pyrobaculum)、高 温分枝菌属(Caldivirga)及火山热泉杆菌属(Vulcanisaeta)；属于酸叶菌科 (Acidilobaceae)的优选属可以列举酸叶菌属(Acidilobus)；属于盐杆菌科 (Halobacteriaceae)的优选属可以列举盐杆菌属(Halobacterium)、盐球菌属 (Halococcus)、盐盒菌属(Haloarcula)、盐方形菌属(Haloquadratum)、 嗜盐碱单孢菌属(Natronomonas)、盐红菌属(Halorubrum)、盐土生古菌属 (Haloterrigena)、无色需碱菌属(Natrialba)、盐碱球菌属(Halalkalicoccus) 及盐几何形菌属(Halogeometricum)；属于热原体科(Thermoplasmataceae) 的优选属可以列举热原体属(Thermoplasma)；属于嗜酸古菌科(Picrophilaceae) 的优选属可以列举嗜酸古菌属(Picrophilus)；属于亚铁原体科 (Ferroplasmaceae)的优选属可以列举亚铁原体属(Ferroplasma)；属于古生 球菌科(Archaeoglobaceae)的优选属可以列举古生球菌属(Archaeoglobus) 及铁古球菌属(Ferroglobus)。此外，分类上目未定的微生物，可以列举Polymorphum属、云母弧菌属(Micavibrio)、多贺氏菌属(Simiduia)、纤发 菌属(Leptothrix)、硫单胞菌属(Thiomonas)、红长命菌属(Rubrivivax) 及甲基养菌属(Methylibium)；属于芽孢杆菌目(Bacillales)，但分类上科 未定的微生物，可以列举微小杆菌属(Exiguobacterium)；属于梭菌目 (Clostridiales)，但分类上科未定的微生物，可以列举厌氧球菌属 (Anaerococcus)。
其中，优选微生物为被指出具有支链氨基酸代谢途径中的酶的磁螺菌属(Magnetospirillum)、红螺菌属(Rhodospirillum)、固氮螺菌属(Azospirillum)、 替斯崔纳菌属(Tistrella)、嗜酸菌属(Acidiphilium)、红细菌属(Rhodobacter)、 副球菌属(Paracoccus)、鲁杰氏菌属(Ruegeria)、简纳西氏菌属(Jannaschia)、 玫瑰杆菌属(Roseobacter)、沟鞭藻玫瑰杆菌属(DinoRoseobacter)、假弧菌 属(Pseudovibrio)、暗棕色杆菌属(Phaeobacter)、十八杆菌属(Octadecabacter)、 生丝单胞菌属(Hyphomonas)、海茎状菌属(Maricaulis)、海氏菌属(Hirschia)、 鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)、鞘氨 醇盒菌属(Sphingopyxis)、鞘氨醇菌属(Sphingobium)、红色杆菌属 (Erythrobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、柄杆菌属(Caulobacter)、苯基杆菌属(Phenylobacterium)、不黏柄菌属(Asticcacaulis)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、 黄色杆菌属(Xanthobacter)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、布鲁氏菌属 (Brucella)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、 根瘤菌属(Chelativorans)、橙单胞菌属(Aurantimonas)、慢生根瘤菌属 (Bradyrhizobium)、农单胞菌属(Agromonas)、红假单胞菌属 (Rhodopseudomonas)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、红微菌属(Rhodomicrobium)、外海芽孢杆菌属 (Pelagibacterium)、细小棒状菌属(Parvibaculum)、甲基孢囊菌属 (Methylocystis)、短小盒菌属(Parvularcula)、伯克氏菌属(Burkholderia)、 青枯菌属(Ralstonia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、 无色小杆菌属(Achromobacter)、鲍特氏菌属(Bordetella)、泰勒氏菌属 (Taylorella)、极小单胞菌属(Pusillimonas)、丛毛单胞菌(Comamonas)、 嗜脂环物菌属(Alicycliphilus)、戴尔福特菌属(Delftia)、沙壤土杆菌属 (Ramlibacter)、红育菌属(Rhodoferax)、贪噬菌属(Variovorax)、极单 胞菌属(Polaromonas)、食酸菌属(Acidovorax)、蚯蚓肾杆菌属 (Verminephrobacter)、赫山单胞菌属(Herminiimonas)、草螺菌属 (Herbaspirillum)、山冈单胞菌属(Collimonas)、色杆菌属(Chromobacterium)、 鸥杆菌属(Laribacter)、假高炳根氏菌属(Pseudogulbenkiania)、亚硝化单 胞菌属(Nirosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、固氮弧菌属(Aromatoleum)、固氮弯曲菌属(Azoarcus)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、 索氏菌属(Thauera)、固氮螺形菌(脱氯弯杆菌)属(Azospira(Dechlorosoma))、 莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、亚硝化球菌属(Nitrosococcus)、需盐红 螺菌属(Halorhodospira)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、寡养单胞菌属 (Stenotrophomonas)、假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、罗河杆菌属 (Rhodanobacter)、弗郎西斯氏菌属(Francisella)、解环菌属(Cycloclasticus)、 海洋螺菌属(Oceanospirillum)、河氏菌属(Hahella)、盐单胞菌属(Halomonas)、 食烷菌属(Alcanivorax)、康氏菌属(Kangiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、 固氮菌属(Azotobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、别样谢瓦氏菌属(Alishewanella)、交替单胞菌属 (Alteromonas)、冰居菌属(Glaciecola)、海杆状菌属(Marinobacter)、海 杆菌属(Marinobacterium)、噬糖菌属(Saccharophagus)、希瓦氏菌属 (Shewanella)、铁还原单胞菌属(Ferrimonas)、源海菌属(Idiomarina)、 科维尔氏菌属(Colwellia)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、利斯顿 氏菌属(Listonella)、弧菌属(Vibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、气 单胞菌属(Aeromonas)、海洋单胞菌属(Oceanimonas)、盐水球形菌属 (Salinisphaera)、军团菌属(Legionella)、考克斯氏体属(Coxiella)、脱硫 球菌属(Desulfococcus)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、脱硫酸盐杆菌属 (Desulfatibacillum)、脱硫盒菌属(Desulfobulbus)、脱硫盒菌属(Desulfarculus)、 地杆菌属(Geobacter)、互营杆菌属(Syntrophobacter)、共养菌属(Syntrophus)、 脱硫念珠菌属(Desulfomonile)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、噬菌属 (Bacteriovorax)、标桩菌属(Stigmatella)、黏球菌属(Myxococcus)、厌 氧黏杆细菌属(Anaeromyxobacter)、堆囊菌属(Sorangium)、海无柄孢囊黏 细菌属(Haliangium)、酸杆菌属(Acidobacterium)、短链小球菌属(Granulicella)、 水沉积物杆菌属(Ilumatobacter)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、拟诺 卡氏菌属(Nocardiopsis)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)、高温单孢菌属 (Thermomonospora)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、拟无枝酸菌属 (Amycolatopsis)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、糖多孢菌属 (Saccharopolyspora)、嗜热双孢菌属(Thermobispora)、束丝放线菌属 (Actinosynnema)、小单孢菌属(Micromonospora)、盐水孢菌属(Salinispora)、 疣孢菌属(Verrucosispora)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、韩国生工菌属 (Kribbella)、棒杆菌属(Corynebacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红 球菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、分支 杆菌属(Mycobacterium)、分枝菌酸球菌属(Amycolicicoccus)、束村氏菌 属(Tsukamurella)、慢反应脂肪酸菌属(Segniliparus)、小杆菌属 (Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、 柠檬球菌属(Citricoccus)、肾杆菌属(Renibacterium)、考克氏菌属(Kocuria)、 皮肤球菌属(Kytococcus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、间孢囊菌属(Intrasporangium)、丝氨酸球菌属(Serinicoccus)、弗兰克氏菌属(Frankia)、 热酸菌属(Acidothermus)、中村氏菌属(Nakamurella)、地嗜皮菌属 (Geodermatophilus)、斯塔克布朗氏菌属(Stackebrandtia)、链霉菌属 (Streptomyces)、细小链孢菌属(Catenulispora)、红色杆形菌属(Rubrobacter)、 束缚菌属(Conexibacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、 大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、喜 盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、Kyrpidia 属、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肉杆菌属 (Carnobacterium)、梭菌属(Clostridium)、嗜碱菌属(Alkaliphilus)、共 养单胞菌属(Syntrophomonas)、互养栖热菌属(Syntrophothermus)、真杆 菌属(Eubacterium)、脱亚硫酸杆菌属(Desulfitobacterium)、脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)、暗色厌氧香肠状菌属(Pelotomaculum)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)、颤螺旋菌属(Oscillibacter)、 热厌氧杆状菌属(Thermoanaerobacter)、一氧化碳嗜热菌属 (Carboxydothermus)、需碱厌氧菌属(Natranaerobius)、鞘氨醇杆菌属 (Sphingobacterium)、土地杆菌属(Pedobacter)、束缚杆菌属 (Haliscomenobacter)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、臭气杆菌属(Odoribacter)、螺状菌属(Spirosoma)、古字状菌属(Runella)、海菌属 (Maribacter)、奇异球菌属(Deinococcus)、栖热菌属(Thermus)、稍栖热 菌属(Meiothermus)、大洋栖热菌属(Oceanithermus)、海栖热菌属 (Marinithermus)、出芽单胞菌属(Gemmatimonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、 泥杆菌属(Ilyobacter)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)、滑柱菌属(Herpetosiphon)、 热微菌属(Thermomicrobium)、热袍菌属(Thermotoga)、栖热腔菌属(Thermosipho)、高温杆菌属(Fervidobacterium)、脱铁杆菌属(Deferribacter)、 热土弧菌属(Calditerrivibrio)、弯枝菌属(Flexistipes)、生金球菌属 (Metallosphaera)、气火菌属(Aeropyrum)、热棒菌属(Pyrobaculum)、高 温分枝菌属(Caldivirga)、火山热泉杆菌属(Vulcanisaeta)、酸叶菌属 (Acidilobus)、盐盒菌属(Haloarcula)、盐方形菌属(Haloquadratum)、嗜 盐碱单孢菌属(Natronomonas)、盐红菌属(Halorubrum)、盐土生古菌属 (Haloterrigena)、无色需碱菌属(Natrialba)、盐碱球菌属(Halalkalicoccus)、 盐几何形菌属(Halogeometricum)、热原体属(Thermoplasma)、嗜酸古菌 属(Picrophilus)、亚铁原体属(Ferroplasma)、古生球菌属(Archaeoglobus)、 铁古球菌属(Ferroglobus)、Polymorphum属、云母弧菌属(Micavibrio)、 多贺氏菌属(Simiduia)、纤发菌属(Leptothrix)、硫单胞菌属(Thiomonas)、 红长命菌属(Rubrivivax)、甲基养菌属(Methylibium)、微小杆菌属 (Exiguobacterium)及厌氧球菌属(Anaerococcus)的微生物。
此外，实验上确认能够生成甲基丙烯酸衍生物的特别优选微生物为属于副 球菌属(Paracoccus)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、短波单胞菌属 (Brevundimonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、 黄色杆菌属(Xanthobacter)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、中间根瘤菌属 (Mesorhizobium)、无色小杆菌属(Achromobacter)、丛毛单胞菌(Comamonas)、 假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、希瓦氏菌属 (Shewanella)、利斯顿氏菌属(Listonella)、红球菌属(Rhodococcus)、链 霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)及土地杆 菌属(Pedobacter)的微生物。
[原核生物的优选种]
〔假单胞菌属〕
作为分类在假单胞菌属(Pseudomonas)的微生物，可以列举例如绿脓杆 菌(Pseudomonas aeruginosa)、伞菌假单胞菌(Pseudomonas agarici)、产碱假单胞 菌(Pseudomonas alcaligenes)、杏仁核假单胞菌(Pseudomonas amygdale)、病鳝 假单胞菌(Pseudomonas anguiliseptica)、抗微生物假单胞菌(Pseudomonas antimicrobica)、铁角蕨假单胞菌(Pseudomonas aspleni)、桔黄假单胞菌 (Pseudomonas aurantiaca)、金色假单胞菌(Pseudomonas aureofaciens)、榛色假单 胞菌(Pseudomonas avellanae)、产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、巴利 阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)、拜氏假单胞菌(Pseudomonas beijerinsckii)、甜菜假单胞菌(Pseudomonas beteli)、北城假单胞菌(Pseudomonas boreopolis)、氢碳酸假单胞菌(Pseudomonas carboxyhydrogena)、番木瓜假单胞 菌(Pseudomonas caricapapayae)、菊苣假单胞菌(Pseudomonascichorii)、青紫葛 假单胞菌(Pseudomonas cissicola)、香茅醇假单胞菌(Pseudomonascitronellolis)、 燕麦晕斑病假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugate)、杜氏假单胞菌(Pseudomonas doudoroffii)、刺状鞘氨醇假单胞菌 (Pseudomonas echinoides)、延长假单胞菌(Pseudomonas elongate)、天仙果假单胞菌(Pseudomonas ficuserectae)、变黄假单胞菌(Pseudomonas flavescens)、铜绿 假单胞菌(Pseudomonas flectens)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、草 莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)、黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)、褐鞘假单 胞菌(Pseudomonas fuscovaginae)、石花菜假单胞菌(Pseudomonas gelidicola)、屈 曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)、格氏假单胞菌(Pseudomonas glathei)、嗜 盐假单胞菌(Pseudomonas halophila)、栖木槿假单胞菌(Pseudomonas hibiscicola)、哈特假单胞菌(Pseudomonas huttiensis)、懒惰假单胞菌 (Pseudomonas iners)、柳叶状弯钩菌(Pseudomonas lancelota)、勒氏假单胞菌 (Pseudomonas lemoignei)、隆德假单胞菌(Pseudomonas lundensis)、浅黄假单胞 菌(Pseudomonas luteola)、边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)、苦楝假单胞 菌(Pseudomonas meliae)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、霉味假单 胞菌(Pseudomonas mucidolens)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilli)、航海假 单胞菌(Pseudomonas nautica)、硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)、 食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、穿孔假单胞菌(Pseudomonas pertucinogena)、吩嗪假单胞菌 (Pseudomonas phenazinium)、皮氏假单胞菌(Pseudomonas pictorum)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、 吡咯菌素假单胞菌(Pseudomonas pyrrocinia)、食树脂假单胞菌(Pseudomonasresinovorans)、罗氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)、嗜糖假单胞菌 (Pseudomonassaccharophila)、萨氏假单胞菌(Pseudomonas savastanoi)、多刺假 单胞菌(Pseudomonasspinosa)、斯塔氏假单胞菌(Pseudomonas stanieri)、稻草假 单胞菌(Pseudomonasstraminae)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、类黄假 单胞菌(Pseudomonassynxantha)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、蒲桃 假单胞菌(Pseudomonassyzygii)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)、托拉 氏假单胞菌(Pseudomonastolaasii)、威隆假单胞菌(Pseudomonas veronii)、绿黄 假单胞菌(Pseudomonasviridiflava)、变形假单胞菌(Pseudomonas vulgaris)、威 斯康星假单胞菌(Pseudomonaswisconsinensis)等。
〔芽孢杆菌属〕
作为分类在芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，可以列举例如蜡状芽孢杆 菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、酸快生芽孢杆菌(Bacillus acidiceler)、酸居芽孢杆菌(Bacillusacidicola)、伊奥利亚岛芽孢杆菌(Bacillus aeolius)、空气芽孢杆菌(Bacillusaerius)、嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)、黏琼脂芽孢杆菌(Bacillusagaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(Bacillus akibai)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)、藻居芽孢杆菌(Bacillus algicola)、嗜碱固氮芽孢杆菌(Bacillusalkalidiazotrophicus)、碱土芽孢杆菌(Bacillus alkalitelluris)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、香鱼海槽芽孢杆菌(Bacillus alveayuensis)、解淀粉 芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、 海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)、沙地芽孢杆菌(Bacillus arenosi)、黄硒 芽孢杆菌(Bacillusarseniciselenatis)、砷芽孢杆菌(Bacillus arsenicus)、田 间芽孢杆菌(Bacillusarvi)、风井氏芽孢杆菌(Bacillus asahii)、萎缩芽孢杆 菌(Bacillus atrophaeus)、金橙色芽孢杆菌(Bacillus aurantiacus)、太阳海岸 芽孢杆菌(Bacillus axarquiensis)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、 栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、罕见芽孢杆菌(Bacillus barbaricus)、巴达 维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)、食苯芽孢杆菌(Bacillus benzoevorans)、 博戈里亚芽孢杆菌(Bacillus bogoriensis)、嗜硼芽孢杆菌(Bacillus boroniphilus)、 食丁酸芽孢杆菌(Bacillus butanolivorans)、嗜碳芽孢杆菌(Bacillus carboniphilus)、科研中心芽孢杆菌(Bacillus cecembensis)、解纤维芽孢杆菌 (Bacillus cellulosilyticus)、恰甘诺湖芽孢杆菌(Bacillus chagannorensis)、 食物芽孢杆菌(Bacillus cibi)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克氏芽 孢杆菌(Bacillus clarkii)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝固芽孢杆 菌(Bacilluscoagulans)、考卉纳芽孢杆菌(Bacillus coahuilensis)、科氏芽孢 杆菌(Bacilluscohnii)、腐叶芽孢杆菌(Bacillus decisifrondis)、脱色芽孢杆 菌(Bacillusdecolorationis)、钻特省芽孢杆菌(Bacillus drentensis)、土中芽 孢杆菌(Bacillusedaphicus)、植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)、混 料芽孢杆菌(Bacillusfarraginis)、苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)、坚 强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)、小孔芽孢杆 菌(Bacillus foraminis)、福氏芽孢杆菌(Bacillus fordii)、强壮芽孢杆菌(Bacillus fortis)、气孔芽孢杆菌(Bacillusfumarioli)、绳索状芽孢杆菌(Bacillus funiculus)、 解半乳糖苷芽孢杆菌(Bacillusgalactosidilyticus)、明胶芽孢杆菌(Bacillus gelatini)、吉氏芽孢杆菌(Bacillusgibsonii)、盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)、 耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、嗜盐芽孢杆菌(Bacillus halophilus)、 解半纤维素芽孢杆菌(Bacillushemicellulosilyticus)、黑布施泰因芽孢杆菌 (Bacillus herbersteinensis)、堀越氏芽孢杆菌(Bacillus horikoshii)、花园芽 孢杆菌(Bacillus horti)、土地芽孢杆菌(Bacillus humi)、花津滩芽孢杆菌 (Bacillus hwajinpoensis)、病研所芽孢杆菌(Bacillus idriensis)、印度芽孢 杆菌(Bacillus indicus)、婴儿芽孢杆菌(Bacillusinfantis)、深层芽孢杆菌 (Bacillus infernus)、异常芽孢杆菌(Bacillus insolitus)、伊氏芽孢杆菌(Bacillus isabeliae)、咸海鲜芽孢杆菌(Bacillus jeotgali)、韩国芽孢杆菌(Bacillus koreensis)、克鲁氏芽孢杆菌(Bacillus krulwichiae)、列城芽孢杆菌(Bacillus lehensis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、 岸滨芽孢杆菌(Bacillus litoralis)、坎德玛斯岛芽孢杆菌(Bacillusluciferensis)、 澳门芽孢杆菌(Bacillus macauensis)、马氏芽孢杆菌(Bacillusmacyae)、马 拉加芽孢杆菌(Bacillus malacitensis)、解甘露醇糖芽孢杆菌(Bacillusmannanilyticus)、海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)、黄海芽孢杆菌(Bacillusmarisflavi)、马赛芽孢杆菌(Bacillus massiliensis)、巨兽芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)、莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)、胶胨样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、壁芽孢杆菌(Bacillusmuralis)、马丁教堂芽孢杆菌(Bacillus murimartini)、蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、尼氏芽孢杆菌(Bacillus nealsonii)、农研所芽孢杆菌(Bacillusniabensis)、烟酸芽孢杆菌(Bacillus niacini)、休闲地芽孢杆菌(Bacillus novalis)、奥德赛芽孢杆菌(Bacillus odysseyi)、奥哈芽孢杆菌(Bacillus okhensis)、奥 飞驒温泉芽孢杆菌(Bacillus okuhidensis)、蔬菜芽孢杆菌(Bacillusoleronius)、 大岛芽孢杆菌(Bacillus oshimensis)、淡粉色芽孢杆菌(Bacillus pallidus)、 人参地块芽孢杆菌(Bacillus panaciterrae)、巴塔哥尼亚芽孢杆菌(Bacillus patagoniensis)、海绵芽孢杆菌(Bacillus plakortidis)、抱川芽孢杆菌(Bacillus pocheonensis)、蓼属植物芽孢杆菌(Bacillus polygoni)、假嗜碱芽孢杆菌 (Bacillus pseudalcaliphilus)、假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)、假 真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、耐冷芽孢杆菌(Bacillus psychrodurans)、冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)、忍冷芽 孢杆菌(Bacillus psychrotolerans)、短芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、厚壁芽孢杆菌(Bacillus pycnus)、青岛芽孢杆菌(Bacillus qingdaonensis)、农庄芽 孢杆菌(Bacillus ruris)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、盐芽孢杆菌(Bacillussalarius)、喜盐芽孢杆菌(Bacillus saliphilus)、施氏芽孢杆菌(Bacillusschlegelii)、 硒芽孢杆菌(Bacillus selenatarsenatis)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西岸芽孢杆菌(Bacillus seohaeanensis)、沙氏芽孢杆菌(Bacillus shackletonii)、森林芽孢杆菌(Bacillus silvestris)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、青贮窖芽孢杆菌(Bacillus siralis)、史氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)、土壤芽孢杆菌(Bacillus soli)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、耐热芽孢芽孢杆菌(Bacillussporothermodurans)、平流层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)、地下芽孢 杆菌(Bacillus subterraneus)、大安芽孢杆菌(Bacillus taeanensis)、特基拉 芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、热南极芽孢杆菌(Bacillus thermantarcticus)、 热噬淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)、热阴沟芽孢杆菌(Bacillus thermocloacae)、产硫芽孢杆菌(Bacillus thioparans)、热泉芽孢杆菌(Bacillus tusciae)、死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)、威氏芽孢杆菌(Bacillus vedderi)、 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、越南芽孢杆菌(Bacillus vietnamensis)、 原野芽孢杆菌(Bacillus vireti)、和光芽孢杆菌(Bacillus wakoensis)、韦施 泰凡芽孢杆菌(Bacillusweihenstephanensis)等。
〔鞘氨醇杆菌属〕
作为分类在鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)的微生物，可以列举例如 多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)、食醇鞘氨醇杆菌 (Sphingobacteriumspiritivorum)、Sphingobacterium alimentarium、安徽鞘氨 醇杆菌(Sphingobacteriumanhuiense)、南极鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium antarcticum)、Sphingobacteriumbambusae、加拿大鞘氨醇杆菌 (Sphingobacterium canadense)、堆肥鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium composti)、 大田市鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium daejeonense)、屎鞘氨醇杆菌 (Sphingobacterium faecium)、肝素鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumheparinum)、 北广岛鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium kitahiroshimense)、Sphingobacterium lactis、 水氏鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium mizutaii)、杀线虫鞘氨醇杆菌、鱼土地杆 菌(Sphingobacterium piscium)、Sphingobacterium shayense、泗阳鞘氨醇杆菌 (Sphingobacterium siyangense)、嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriumthalpophilum)、Sphingobacterium wenxiniae等。
〔丛毛单胞菌〕
作为分类在丛毛单胞菌(Comamonas)的微生物，可以列举例如食酸丛毛 单胞菌(Comamonas acidovorans)、水丛毛单胞菌(Comamonas aquatica)、 微红褐丛毛单胞菌(Comamonas badia)、堆肥丛毛单胞菌(Comamonas composti)、脱氮丛毛单胞菌(Comamonasdenitrificans)、Comamonas granuli、 克氏丛毛单胞菌(Comamonas kerstersii)、韩国丛毛单胞菌(Comamonas koreensis)、食硝酸盐丛毛单胞菌(Comamonas nitrativorans)、白蚁丛毛单胞 菌(Comamonas odontotermites)、土地丛毛单胞菌(Comamonas terrae)、土生丛毛单胞菌(Comamonas terrigena)、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)、氧化硫丛毛单胞菌(Comamonas thiooxydans)、Comamonas zonglianii等。
〔短波单胞菌属〕
作为分类在短波单胞菌属(Brevundimonas)的微生物，可以列举例如白 色短波单胞菌(Brevundimonas alba)、橙色短波单胞菌(Brevundimonas aurantiaca)、拟杆状短波单胞菌(Brevundimonas bacteroides)、玄武岩短波 单胞菌(Brevundimonas basaltis)、泡状短波单胞菌(Brevundimonas bullata)、 缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、中间短波单胞菌(Brevundimonas intermedia)、光村短波单胞菌(Brevundimonas kwangchunensis)、黏菌短波 单胞菌(Brevundimonas lenta)、地中海短波单胞菌(Brevundimonas mediterranea)、纳斯达短波单胞菌(Brevundimonas nasdae)、Brevundimonas olei、近弧状短波单胞菌(Brevundimonas subvibrioides)、土壤短波单胞菌 (Brevundimonas terrae)、范式短波单胞菌(Brevundimonas vancanneytii)、 变异短波单胞菌(Brevundimonas variabilis)、泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)、黏性短波单胞菌(Brevundimonas viscosa)等。
〔鞘氨醇单胞菌〕
作为分类在鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)的微生物，可以列举例如桌鞘 氨醇单胞菌(Sphingomonas abaci)、黏连鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas adhaesiva)、气生鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas aerolata)、水生鞘氨醇单胞 菌(Sphingomonas aquatilis)、不解糖鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas asaccharolytica)、产虾青素鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas astaxanthinifaciens)、 橙色鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasaurantiaca)、固氮鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas azotifigens)、Sphingomonasazotofornans、荚膜鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas capsulata)、长白山新鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas changbaiensis)、氯酚鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas chlorophenolica)、Sphingomonas cynarae、可干鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas desiccabilis)、独 岛鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas dokdonensis)、刺状鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas echinoides)、植物内鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas endophytica)、 干草鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasfaeni)、芬兰鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas fennica)、Sphingomonas ginsenosidimutans、嗜卤芳香族物鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas haloaromaticamans)、食除草剂鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas herbicidovorans)、土地鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas humi)、岛鞘氨醇单胞 菌(Sphingomonas insulae)、日本鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas japonica)、 雅士普西鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas jaspsi)、Sphingomonas jejuensis、韩 国鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas koreensis)、解聚乙二醇鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonasmacrogoltabidus)、苹果酸鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas mali)、 瓜类鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas melonis)、软体动物鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas molluscorum)、黏膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas mucosissima)、泳池鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasnatatoria)、寡酚鞘氨醇单 胞菌(Sphingomonas oligophenolica)、抹布鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas panni)、 类少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas parapaucimobilis)、少动鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas paucimobilis)、叶球鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasphyllosphaerae)、黏液鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas pituitosa)、Sphingomonaspolyaromaticivorans、桃鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas pruni)、玫瑰鞘氨醇单 胞菌(Sphingomonas rosa)、玫瑰黄鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas roseiflava)、 Sphingomonasrubra、血红鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanguinis)、土壤鞘 氨醇单胞菌(Sphingomonassoli)、木塞味鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas suberifaciens)、亚北极鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas subterranea)、土生鞘氨 醇盒菌(Sphingomonas terrae)、楚氏鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas trueperi)、 伴熊鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas ursincola)、维氏鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas wittichii)、薮内鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasyabuuchiae)、 矢野氏鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas yanoikuyae)、云南鞘氨醇单胞菌(sphingomonas yunnanensis)等。
〔苍白杆菌属〕
作为分类在苍白杆菌属(Ochrobactrum)的微生物，可以列举例如人苍白 杆菌(Ochrobactrum anthropi)、金雀儿根瘤苍白杆菌(Ochrobactrum cytisi)、 大田苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)、鸡粪苍白杆菌(Ochrobactrum gallinifaecis)、贵格纳苍白杆菌(Ochrobactrum grignonense)、嗜血苍白杆菌 (Ochrobactrum haemophilum)、中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)、 羽扇豆苍白杆菌(Ochrobactrum lupini)、水稻苍白杆菌(Ochrobactrum oryzae)、 假中间苍白杆菌(Ochrobactrum pseudintermedium)、假贵格纳苍白杆菌 (Ochrobactrum pseudogrignonense)、噻吩苍白杆菌(Ochrobactrumthiophenivorans)、小麦苍白杆菌(Ochrobactrum tritici)等。
〔土地杆菌属〕
作为分类在土地杆菌属(Pedobacter)的微生物，可以列举例如非洲土地 杆菌(Pedobacter africanus)、野土地杆菌(Pedobacter agri)、冲积地土地杆 菌(Pedobacteralluvius)、水生土地杆菌(Pedobacter aquatilis)、北方土地杆 菌(Pedobacterborealis)、污水土地杆菌(Pedobacter caeni)、堆肥土地杆菌 (Pedobacter composti)、极地冰尘土地杆菌(Pedobacter cryoconitis)、大青 土地杆菌(Pedobacterdaechungensis)、硬水土地杆菌(Pedobacter duraquae)、 人参土地杆菌(Pedobacterginsengisoli)、哈茨山土地杆菌(Pedobacter hartonius)、肝素土地杆菌(Pedobacterheparinus)、喜马拉雅土地杆菌 (Pedobacter himalayensis)、Pedobacterjeongneungensis、韩国土地杆菌 (Pedobacter koreensis)、慢生土地杆菌(Pedobacterlentus)、寡代谢土地杆 菌(Pedobacter metabolipauper)、尼亚克土地杆菌(Pedobacternyackensis)、 人参地土地杆菌(Pedobacter panaciterrae)、鱼土地杆菌(Pedobacterpiscium)、 Pedobacter roseus、舞蹈土地杆菌(Pedobacter saltans)、斯氏土地杆菌(Pedobacter steynii)、水原市土地杆菌(Pedobacter suwonensis)、栖土土地杆菌(Pedobacter terricola)等。
〔类芽孢杆菌属〕
作为分类在类芽孢杆菌(Paenibacillus)的微生物，可以列举例如类湿地 芽孢杆菌(Paenibacillus aestuarii)、解藻朊类芽孢杆菌(Paenibacillus alginolyticus)、Paenibacillus algorifonticola、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)、蜜蜂类芽孢杆菌 (Paenibacillus apiarius)、阿萨姆类芽孢杆菌(Paenibacillus assamensis)、还 原偶氮类芽孢杆菌(Paenibacillusazoreducens)、固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)、巴塞罗那类芽孢杆菌(Paenibacillus barcinonensis)、巴伦氏类 芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)、坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)、解纤维素类芽孢杆菌(Paenibacillus cellulosilyticus)、千叶 类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)、嗜几丁质类芽孢杆菌(Paenibacillus chitinolyticus)、软骨素类芽孢杆菌(Paenibacilluschondroitinus)、解凝乳类 芽孢杆菌(Paenibacillus curdlanolyticus)、大田类芽孢杆菌(Paenibacillus daejeonensis)、坚韧类芽孢杆菌(Paenibacillus durus)、爱媛类芽孢杆菌 (Paenibacillus ehimensis)、埃吉类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)、蕨类类芽孢杆菌(Paenibacillus filicis)、Paenibacillus frigoriresistens、甘肃类芽孢杆菌(Paenibacillus gansuensis)、人参地类芽孢杆菌(Paenibacillus ginsengihumi)、 解葡聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glucanolyticus)、解聚糖类芽孢杆菌 (Paenibacillusglycanilyticus)、草类芽孢杆菌(Paenibacillus graminis)、保 土谷类芽孢杆菌(Paenibacillus hodogayensis)、Paenibacillus hordei、腐殖质 类芽孢杆菌(Paenibacillus humicus)、伊利诺斯类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)、加米那类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)、哥本类芽孢杆菌 (Paenibacillus kobensis)、食鞘类芽孢杆菌(Paenibacillus koleovorans)、康 赛德类芽孢杆菌(Paenibacilluskonsidensis)、胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)、幼虫类芽孢杆菌幼虫larvae亚种(Paenibacillus larvae subsp.larvae)、 幼虫类芽孢杆菌尘埃亚种(Paenibacillus larvae subsp.pulvifaciens)、灿烂类芽 孢杆菌(Paenibacilluslautus)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、 马阔里类芽孢杆菌植保亚种(Paenibacillus macquariensis subsp.defensor)、孟 氏类芽孢杆菌(Paenibacillusmendelii)、本部类芽孢杆菌(Paenibacillus motobuensis)、食萘类芽孢杆菌(Paenibacillus naphthalenovorans)、嗜线虫 类芽孢杆菌(Paenibacillusnematophilus)、Paenibacillus oceanisediminis、异味 类芽孢杆菌(Paenibacillusodorifer)、饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)、 帕萨迪纳类芽孢杆菌(Paenibacillus pasadenensis)、皮尔瑞俄类芽孢杆菌 (Paenibacillus peoriae)、海枣类芽孢杆菌(Paenibacillus phoenicis)、 Paenibacillus pini、松树类芽孢杆菌(Paenibacillus pinihumi)、多黏类芽孢杆 菌(Paenibacillus polymyxa)、普洱茶类芽孢杆菌(Paenibacillus pueri)、 Paenibacillus rigui、星孢类芽孢杆菌(Paenibacillusstellifer)、台湾类芽孢杆菌 (Paenibacillus taiwanensis)、地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)、土地类芽 孢杆菌(Paenibacillus terrigena)、嗜热类芽孢杆菌(Paenibacillus thermophilus)、 解硫胺素类芽孢杆菌(Paenibacillusthiaminolyticus)、冻原类芽孢杆菌 (Paenibacillus tundrae)、强壮类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)、Paenibacillus vulneris)、Paenibacillus wooponensis、解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylaniclasticus)等。
〔无色小杆菌属〕
作为分类在无色小杆菌属(Achromobacter)的微生物，可以列举例如砷 氧化菌无色小杆菌(Achromobacter arsenitoxydans)、Achromobacter cholinophagum、裂环无色小杆菌(Achromobacter cycloclastes)、反硝化无色 小杆菌(Achromobacterdenitrificans)、费氏无色小杆菌(Achromobacter fischeri)、 Achromobacterhartlebii、静止无色小杆菌(Achromobacter immobilis)、罕见 无色小杆菌(Achromobacter insolitus)、解乳消化无色小杆菌(Achromobacter lactolyticus)、水解无色小杆菌(Achromobacter lyticus)、Achromobacter methanolophila、运动无色小杆菌(Achromobacter pestifer)、皮氏无色小杆菌 (Achromobacter piechaudii)、拉氏无色小杆菌(Achromobacter ruhlandii)、 少见无色小杆菌(Achromobacter spanios)、黏无色小杆菌(Achromobacter viscosus)、干燥无色小杆菌(Achromobacter xerosis)、木糖氧化无色小杆菌 (Achromobacter xylosoxidans)、木糖氧化无色小杆菌反硝化亚种(Achromobacter xylosoxidans subsp.denitrificans)、木糖氧化无色小杆菌木糖 氧化亚种(Achromobacter xylosoxidans subsp.xylosoxidans)等。
〔不动杆菌属〕
作为分类在不动杆菌属(Acinetobacter)的微生物，可以列举例如鲍氏不 动杆菌(Acinetobacter baumannii)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、 拜氏不动杆菌(Acinetobacter beijerinckii)、Acinetobacter bereziniae、包氏不 动杆菌(Acinetobacter boubetii)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、 格尔纳不动杆菌(Acinetobacter gerneri)、格氏不动杆菌(Acinetobacter grimontii)、Acinetobacter guilouiae、吉氏不动杆菌(Acinetobacter gyllenbergii)、 溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)、Acinetobacter kyonggiensis、 鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、Acinetobacter oleivorans、帕氏不动杆 菌(Acinetobacterparvus)、耐冷不动杆菌(Acinetobacter psychrotolerans)、 抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)、申氏不动杆菌(Acinetobacter schindleri)、土壤不动杆菌(Acinetobacter soli)、坦氏不动杆菌(Acinetobacter tandoii)、产酒石酸不动杆菌(Acinetobacter tartarogenes)、谢氏不动杆菌 (Acinetobacter tjernbergiae)、汤氏不动杆菌(Acinetobacter towneri)、邬氏 不动杆菌(Acinetobacter ursingii)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus) 等。
〔希瓦氏菌属〕
作为分类在希瓦氏菌属(Shewanella)的微生物，可以列举例如耐压希瓦 氏菌(Shewanella piezotolerans)、深渊希瓦氏菌(Shewanella abyssi)、邻近 希瓦氏菌(Shewanella affinis)、海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)、栖冷鱼 希瓦氏菌(Shewanella algidipiscicola)、亚马逊希瓦氏菌(Shewanella amazonensis)、海水希瓦氏菌(Shewanella aquimarina)、北极希瓦氏菌 (Shewanella arctica)、大西洋希瓦氏菌(Shewanella atlantica)、波罗的海希 瓦氏菌(Shewanella baltica)、玄武岩希瓦氏菌(Shewanella basaltis)、深海 希瓦氏菌(Shewanella benthica)、加拿大希瓦氏菌(Shewanella candadensis)、 吉尔卡湖希瓦氏菌(Shewanella chilikensis)、科氏希瓦氏菌(Shewanella colwelliana)、珊瑚希瓦氏菌(Shewanella corallii)、脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)、反硝化希瓦氏菌(Shewanella denitrificans)、东海希瓦氏菌 (Shewanella donghaensis)、真实希瓦氏菌(Shewanella fidelis)、Shewanellafodinae、冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)、潮汐希瓦氏菌(Shewanellagaetbuli)、冰海希瓦氏菌(Shewanella gelidimarina)、栖水鱼希瓦氏菌 (Shewanellaglacialipiscicola)、Shewanella gopherii、哈夫尼希瓦氏菌 (Shewanellahafniensis)、哈利法克斯希瓦氏菌(Shewanella halifaxensis)、 鲍希瓦氏菌(Shewanella haliotis)、羽田氏希瓦氏菌(Shewanella hanedai)、 日本希瓦氏菌(Shewanella japonica)、开氏希瓦氏菌(Shewanella kaireitica)、 利文斯顿岛希瓦氏菌(Shewanella ivingstonensis)、光伏希瓦氏菌(Shewanella loihica)、海洋希瓦氏菌(Shewanella marina)、海动物肠希瓦氏菌(Shewanella marinintestina)、黄海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)、鳕鱼希瓦氏菌(Shewanella morhuae)、奥氏希瓦氏菌(Shewanella olleyana)、奥奈达湖希 瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、太平洋希瓦氏菌(Shewanella pacifica)、乌 贼希瓦氏菌(Shewanella pealeana)、肺鲐希瓦氏菌(Shewanella pneumatophori)、 深海希瓦氏菌(Shewanella profunda)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、 竹刀鱼希瓦氏菌(Shewanella sairae)、真鲴希瓦氏菌(Shewanella schlegeliana)、 沉积物希瓦氏菌(Shewanella sediminis)、骏河湾希瓦氏菌(Shewanella surugensis)、水泡希瓦氏菌(Shewanella vesiculosa)、紫色希瓦氏菌(Shewanella violacea)、瓦氏希瓦氏菌(Shewanella waksmanii)、武氏希瓦氏菌(Shewanella woodyi)、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)等。
〔利斯顿氏菌属〕
作为分类在利斯顿氏菌属(Listonella)的微生物，可以列举例如Listonellaanguillara、鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)、海利斯顿氏菌(Listonellapelagia)等。
〔土壤杆菌属〕
作为分类在土壤杆菌属(Agrobacterium)的微生物，可以列举例如活跃土 壤杆菌(Agrobacterium agile)、金黄色土壤杆菌(Agrobacterium aureum)、 嗜氮土壤杆菌(Agrobacterium azotophilum)、石头花土壤杆菌(Agrobacterium gypsophilae)、藤黄土壤杆菌(Agrobacterium luteum)、黄杉土壤杆菌 (Agrobacterium pseudotsugae)、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、 诱色土壤杆菌(Agrobacterium ferrugineum)、血红土壤杆菌(Agrobacterium sanguineum)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、黏土壤杆菌 (Agrobacterium viscosum)、葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)等。
〔中间根瘤菌属〕
作为分类在中间根瘤菌属(Mesorhizobium)的微生物，可以列举例如合 欢中间根瘤菌(Mesorhizobium albiziae)、紫穗槐中间根瘤菌(Mesorhizobium amorphae)、澳大利亚中间根瘤菌(Mesorhizobium australicum)、锦鸡儿中 间根瘤菌(Mesorhizobiumcaraganae)、埃尔查柯中间根瘤菌(Mesorhizobium chacoense)、鹰嘴豆中间根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、戈壁中间根瘤菌 (Mesorhizobium gobiense)、百脉根中间根瘤菌(Mesorhizobium loti)、地中 海中间根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)、耐金属中间根瘤菌 (Mesorhizobium metallidurans)、机会中间根瘤菌(Mesorhizobiumopportunistum)、多源中间根瘤菌(Mesorhizobium plurifarium)、华癸中间根 瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、北方中间根瘤菌(Mesorhizobium septentrionale)、 香格里拉中间根瘤菌(Mesorhizobium shangrilense)、塔里木中间根瘤菌 (Mesorhizobiumtarimense)、温暖区中间根瘤菌(Mesorhizobium temperatum)、 流恒河中间根瘤菌(Mesorhizobium thiogangeticum)、天山中间根瘤菌 (Mesorhizobium tianshanense)等。
〔根瘤菌属〕
作为分类在根瘤菌属(Rhizobium)的微生物，可以列举例如阿氏根瘤菌(Rhizobium alamii)、碱土根瘤菌(Rhizobium alkalisoli)、解纤维素根瘤菌 (Rhizobiumcellulosilyticum)、大田市根瘤菌(Rhizobium daejeonense)、植 物内根瘤菌(Rhizobiumendophyticum)、菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)、蚕 豆根瘤菌(Rhizobium fabae)、高卢根瘤菌(Rhizobium gallicum)、吉氏根瘤 菌(Rhizobium giardinii)、贾尔迪尼根瘤菌(Rhizobium grahamii)、海南根 瘤菌(Rhizobium hainanense)、华特拉根瘤菌(Rhizobiumhuautlense)、山羊 豆根瘤菌(Rhizobium galegae)、印度根瘤菌(Rhizobium indica)、印度根瘤 菌(Rhizobium indicus)、木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)、拉氏根瘤菌(Rhizobium larrymoorei)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、银合 欢根瘤菌(Rhizobium leucaenae)、黄土根瘤菌(Rhizobium loessense)、羽扇 豆根瘤菌(Rhizobiumlupini)、葡萄牙根瘤菌(Rhizobium lusitanum)、中部 根瘤菌(Rhizobium mesosinicum)、汩罗河根瘤菌(Rhizobium miluonense)、 蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、多宿主根瘤菌(Rhizobium multihospitium)、Rhizobium nagarjuna nagarensis、水稻根瘤菌(Rhizobium oryzae)、菜豆根瘤菌(Rhizobium phaseoli)、豌豆根瘤菌(Rhizobium pisi)、菩萨根瘤菌(Rhizobium pusense)、放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、 生根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)、悬钩子根瘤菌(Rhizobium rubi)、还 原硒根瘤菌(Rhizobiumselenitireducens)、土壤根瘤菌(Rhizobium soli)、 炎黄芪根瘤菌(Rhizobium sullae)、西藏根瘤菌(Rhizobium tibeticum)、三 叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、Rhizobium tuxtlense、居水根瘤菌(Rhizobium undicola)、强壮根瘤菌(Rhizobium validum)、 葡萄根瘤菌(Rhizobium vitis)等。
〔副球菌属〕
作为分类在副球菌属(Paracoccus)的微生物，可以列举例如艾氏副球菌(Paracoccus aestuarii)、嗜碱副球菌(Paracoccus alcaliphilus)、不饱和烃副 球菌(Paracoccus alkenifer)、嗜胺副球菌(Paracoccus aminophilus)、噬氨副 球菌(Paracoccus aminovorans)、Paracoccus beibuensis、孟加拉副球菌 (Paracoccusbengalensis)、中华副球菌(Paracoccus chinensis)、脱氮副球菌 (Paracoccusdenitrificans)、盐脱氮副球菌(Paracoccus halophilus)、海角副 球菌(Paracoccushomiensis)、科氏副球菌(Paracoccus kocurii)、污泥副球 菌(Paracoccus caeni)、康氏副球菌(Paracoccus kondratievae)、韩国副球菌 (Paracoccus koreensis)、海副球菌(Paracoccus marinus)、用甲基副球菌 (Paracoccus methylutens)、海洋副球菌(Paracoccus oceanense)、全食副球 菌(Paracoccus pantotrophus)、嗜丝氨酸副球菌(Paracoccus seriniphilus)、 食溶剂副球菌(Paracoccus solventivorans)、氧化硫副球菌(Paracoccus sulfuroxidans)、硫氰酸副球菌(Paracoccus thiocyanatus)、易变副球菌(Paracoccus versutus)、伊氏副球菌(Paracoccus yeei)、产玉米黄素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)等。
〔黄色杆菌属〕
作为分类在黄色杆菌属(Xanthobacter)的微生物，可以列举例如敏捷黄 色杆菌(Xanthobacter agilis)、氧化胺黄色杆菌(Xanthobacter aminoxidans)、 自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus)、 万寿菊黄色杆菌(Xanthobacter tagetidis)、黏黄色杆菌(Xanthobacter viscosus) 等。
〔链霉菌属〕
作为分类在链霉菌属(Streptomyces)的微生物，可以列举例如阿孙链霉 菌(Streptomyces abikoensis)、油日链霉菌(Streptomyces aburaviensis)、油 日链霉菌成丛亚种(Streptomyces aburaviensis subsp.tuftformis)、不产色链霉 菌(Streptomycesachromogenes)、不产色链霉菌不产色亚种(Streptomyces achromogenessubsp.achromogenes)、不产色链霉菌红虹菌素亚种(Streptomyces achromogenessubsp.rubradiris)、不产色链霉菌链佐菌素亚种(Streptomyces achromogenessubsp.streptozoticus)、不产色链霉菌茅屋霉素亚种(Streptomyces achromogenessubsp.tomaymyceticus)、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)、抗酸链霉菌(Streptomyces acidoresistans)、吖啶霉素链霉菌 (Streptomyces acrimycini)、活力链霉菌(Streptomyces actuosus)、针孢链霉 菌(Streptomyces aculeolatus)、非脱磷链霉菌(Streptomyces adephospholyticus)、 阿富汗链霉菌(Streptomyces afghaniensis)、非洲链霉菌(Streptomyces africanus)、 团孢链霉菌(Streptomyces agglomeratus)、不吸水链霉菌(Streptomyces ahygroscopicus)、秋吉链霉菌(Streptomycesakiyoshiensis)、丙氨菌素链霉 菌(Streptomyces alanosinicus)、白钩链霉菌(Streptomyces albaduncus)、白 轴链霉菌(Streptomyces albiaxialis)、微白产色链霉菌(Streptomyces albidochromogenes)、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)、微白链霉 菌(Streptomyces albidus)、白网链霉菌(Streptomyces albireticuli)、白色产色链霉菌(Streptomyces albochromogenes)、白浅烬灰链霉菌(Streptomycesalbocinerescens)、生白链霉菌(Streptomyces albofaciens)、白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)、白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)、白 腊黄链霉菌(Streptomyces albohelvatus)、白长链链霉菌(Streptomyces albolongus)、白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)、白刺链霉菌(Streptomyces albospinus)、白孢链霉菌(Streptomyces albosporeus)、白孢链霉菌白孢亚种 (Streptomyces albosporeussubsp.labilomyceticus)、白酒链霉菌(Streptomyces albovinaceus)、白绿链霉菌(Streptomyces alboviridis)、小白链霉菌 (Streptomyces albulus)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、白色链霉菌白 色亚种(Streptomyces albus subsp.albus)、白色链霉菌科尔霉素亚种 (Streptomyces albus subsp.coleimyceticus)、白色链霉菌杀病亚种 (Streptomyces albus subsp.pathocidicus)、嗜碱链霉菌(Streptomycesalcalophilus)、阿木氏链霉菌(Streptomyces almquistii)、桤木链霉菌 (Streptomycesalni)、异硫霉素链霉菌(Streptomyces althioticus)、尼崎链霉 菌(Streptomycesamagasakensis)、天草岛链霉菌(Streptomyces amakusaensis)、 产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、嗜氨基链霉菌(Streptomyces aminophilus)、阿嫩德链霉菌(Streptomyces anandii)、狭霉素链霉菌 (Streptomyces angustmyceticus)、圈卷产色链霉菌圈卷产色亚种(Streptomyces ansochromogenes subsp.ansochromogenes)、花青蓝链霉菌(Streptomyces anthocyanicus)、抗生素链霉菌(Streptomyces antibioticus)、抗解纤维链霉菌 (Streptomyces antifibrinolyticus)、抗霉菌链霉菌(Streptomycesantimycoticus)、 环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)、Streptomyces aomiensis、阿拉伯链霉菌 (Streptomyces arabicus)、艰难链霉菌(Streptomyces ardus)、沙场链霉菌(Streptomyces arenae)、银样链霉菌(Streptomyces argenteolus)、银样链霉 菌丰中亚种(Streptomyces argenteolus subsp.toyonakensis)、泥质链霉菌 (Streptomycesargillaceus)、亚美尼亚链霉菌(Streptomyces armeniacus)、 畜群链霉菌(Streptomycesarmentosus)、Streptomyces arsitiensis、Streptomyces ascomycinicus、亚洲链霉菌(Streptomyces asiaticus)、星孢链霉菌(Streptomyces asterosporus)、暗黑链霉菌(Streptomyces atratus)、暗橘色链霉菌(Streptomyces atroaurantiacus)、暗黑蓝链霉菌(Streptomyces atrocyaneus)、生暗黑链霉菌 (Streptomyces atrofaciens)、暗黑链霉菌(Streptomyces atrolaccus)、暗黑橄 榄色链霉菌(Streptomyces atroolivaceus)、暗黑紫链霉菌(Streptomyces atroviolaceus)、暗黑微绿链霉菌(Streptomycesatrovirens)、橙灰紫旋链霉菌 (Streptomyces aurantiacogriseus)、桔橙链霉菌(Streptomyces aurantiacus)、 橙灰链霉菌(Streptomyces aurantiogriseus)、金色链霉菌(Streptomyces auratus)、 金色辐旋链霉菌(Streptomyces aureocirculatus)、生金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金单枝链霉菌(Streptomycesaureomonopodiales)、金直丝链 霉菌(Streptomyces aureorectus)、金黄回旋链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)、金色素链霉菌(Streptomyces aureus)、微金链霉菌 (Streptomyces aurigineus)、榛色链霉菌(Streptomyces avellaneus)、产阿维 菌素链霉菌(Streptomyces avermectinius)、阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis)、白骨壤链霉菌(Streptomyces avicenniae)、亲和素链霉菌 (Streptomyces avidinii)、海洋海绵链霉菌(Streptomyces axinellae)、远青链 霉菌(Streptomyces azureus)、巴恩链霉菌(Streptomyces baarnensis)、杆菌 状链霉菌(Streptomyces bacillaris)、栗褐链霉菌(Streptomyces badius)、巴 厘链霉菌(Streptomyces baliensis)、班堡链霉菌(Streptomyces bambergiensis)、 孟加拉链霉菌(Streptomyces bangladeshensis)、Streptomyces bangladeshiensis、 北疆链霉菌(Streptomyces beijiangensis)、美丽链霉菌(Streptomyces bellus)、 美丽链霉菌西罗亚种(Streptomyces bellussubsp.cirolerosus)、伯尔尼链霉菌 (Streptomyces bernensis)、二色链霉菌(Streptomyces bicolor)、分枝链霉菌 (Streptomyces bifurcus)、比基尼链霉菌(Streptomyces bikiniensis)、比基尼 链霉菌佐博亚种(Streptomyces bikiniensissubsp.zorbonensis)、稻瘟霉素链霉 菌(Streptomyces blastmyceticus)、蓝链霉菌(Streptomyces bluensis)、鲍比 氏链霉菌(Streptomyces bobili)、波楚链霉菌(Streptomyces bottropensis)、 巴西链霉菌(Streptomyces brasiliensis)、Streptomyces brevisprorus、棕褐灰链 霉菌(Streptomyces brunneogriseus)、丰后链霉菌(Streptomyces bungoensis)、 可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)、可可链霉菌阿苏亚种(Streptomyces cacaoi subsp.asoensis)、可可链霉菌可可亚种(Streptomyces cacaoisubsp.cacaoi)、 天青链霉菌(Streptomyces caelestis)、Streptomyces caelicus、青蓝链霉菌 (Streptomyces caeruleus)、青灰链霉菌(Streptomyces caesius)、加利福尼亚链霉菌(Streptomyces californicus)、秃裸链霉菌(Streptomyces calvus)、加 拿大链霉菌(Streptomyces canadiensis)、雀黄链霉菌(Streptomyces canarius)、 纯白链霉菌(Streptomyces candidus)、灰白链霉菌(Streptomyces canescens)、 日惹温泉链霉菌(Streptomyces cangkringensis)、生暗灰链霉菌(Streptomyces caniferus)、暗灰链霉菌(Streptomyces canus)、微管螺旋链霉菌(Streptomyces capillispiralis)、上升岛链霉菌(Streptomyces capoamus)、卡普链霉菌 (Streptomyces capuensis)、肉色链霉菌(Streptomyces carnosus)、鲤链霉菌 (Streptomyces carpaticus)、松果链霉素(Streptomyces carpinensis)、栗色球 孢链霉菌(Streptomyces castaneoglobisporus)、栗色链霉菌(Streptomyces castaneus)、卡斯泰链霉菌(Streptomyces castelarensis)、小串链霉菌 (Streptomyces catenulae)、卡特利链霉菌(Streptomyces cattleya)、卡伍尔 氏链霉菌(Streptomyces cavourensis)、卡伍尔氏链霉菌卡伍尔氏亚种(Streptomycescavourensis subsp.cavourensis)、Streptomyces cebimarensis、制 胞链霉菌(Streptomyces cellostaticus)、纤维黄链霉菌(Streptomyces celluloflavus)、纤维素链霉菌(Streptomyces cellulosae)、河沙子河链霉菌 (Streptomyces champavatii)、教酒色链霉菌(Streptomyces chartreusis)、查 塔努加链霉菌(Streptomyceschattanoogensis)、天安链霉菌(Streptomyces cheonanensis)、Streptomyceschiangmaiensis、千叶链霉菌(Streptomyces chibaensis)、产绿色链霉菌(Streptomyceschlorochromogenes)、冠霉素链霉 菌(Streptomyces chrestomyceticus)、冠霉素链霉菌红色亚种(Streptomyces chrestomyceticus subsp.rubescens)、褐色链霉菌(Streptomyces chromofuscus)、 产色链霉菌(Streptomyces chromogenus)、浅金链霉菌(Streptomyces chryseus)、 金羊毛链霉菌(Streptomyces chrysomallus)、金羊毛链霉菌烟熏亚种 (Streptomyces chrysomallus subsp.fumigatus)、化海链霉菌(Streptomyceschungwhensis)、烬灰直丝链霉菌(Streptomyces cinereorectus)、烬灰红链霉 菌(Streptomyces cinereoruber)、烬灰红链霉菌烬灰红亚种(Streptomyces cinereorubersubsp.cinereoruber)、烬灰红链霉菌果糖发酵亚种(Streptomyces cinereorubersubsp.fructofermentans)、烬灰刺孢链霉菌(Streptomyces cinereospinus)、变灰链霉菌(Streptomyces cinereus)、产灰色链霉菌 (Streptomyces cinerochromogenes)、朱红链霉菌(Streptomyces cinnabarinus)、 肉桂栗色链霉菌(Streptomycescinnamocastaneus)、肉桂色链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)、肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)、肉桂链霉菌白孢 亚种(Streptomyces cinnamoneussubsp.albosporus)、肉桂链霉菌防霉型亚种 (Streptomyces cinnamoneus subsp.formaazacoluta)、肉桂链霉菌犬亚种 (Streptomyces cinnamoneus subsp.lanosus)、肉桂链霉菌稀硫亚种 (Streptomyces cinnamoneus subsp.sparsus)、辐旋链霉菌(Streptomycescirculatus)、卷曲链霉菌(Streptomyces cirratus)、高加索链霉菌(Streptomycesciscaucasicus)、柠檬色荧光链霉菌(Streptomyces citreofluorescens)、柠檬链 霉菌(Streptomyces citreus)、桔色链霉菌(Streptomyces citricolor)、钉斑链 霉菌(Streptomyces clavifer)、带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、 Streptomycescoacervatus、Streptomyces cocklensis、浅天青链霉菌(Streptomyces coelescens)、拟天蓝链霉菌(Streptomyces coeliatus)、天蓝黄链霉菌 (Streptomyces coelicoflavus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、天 蓝橙链霉菌(Streptomycescoeruleoaurantiacus)、天蓝褐链霉菌(Streptomyces coeruleofuscus)、天蓝李紫链霉菌(Streptomyces coeruleoprunus)、天蓝微红 链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)、变天蓝链霉菌(Streptomyces coerulescens)、山丘链霉菌(Streptomyces collinus)、山丘链霉菌紫菀亚种 (Streptomyces collinus subsp.albescens)、哥伦比亚链霉菌(Streptomyces colombiensis)、珊瑚链霉菌(Streptomyces coralus)、黄麻链霉菌(Streptomyces corchorusii)、生皮链霉菌(Streptomyces coriofaciens)、哥斯达黎加链霉菌 (Streptomyces costaricanus)、火山口链霉菌(Streptomyces craterifer)、乳脂白链霉菌(Streptomyces cremeus)、番红链霉菌(Streptomyces croceus)、晶 体链霉菌(Streptomyces crystallinus)、科腊链霉菌(Streptomyces curacoi)、 尖孢链霉菌(Streptomyces cuspidosporus)、蓝微褐链霉菌(Streptomyces cyaneofuscatus)、暗蓝链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)、深蓝链霉菌 (Streptomyces cyaneus)、蓝白链霉菌(Streptomyces cyanoalbus)、深蓝色链 霉菌(Streptomyces cyanocolor)、产蓝链霉菌(Streptomyces cyanogenus)、 蓝灰链霉菌(Streptomyces cyanogriseus)、柱形孢链霉菌(Streptomyces cylindosporus)、达格斯坦链霉菌(Streptomyces daghestanicus)、达窝链霉菌 (Streptomyces davawensis)、德夸菌素链霉菌(Streptomyces decoyicus)、德 曼链霉菌(Streptomyces demainii)、淀粉酶链霉菌(Streptomyces diastaticus)、 淀粉酶链霉菌石板色亚种(Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacus)、淀粉酶 链霉菌淀粉酶亚种(Streptomyces diastaticus subsp.diastaticus)、淀粉酶产色 链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)、淀粉酶产色链霉菌藤黄亚种 (Streptomycesdiastatochromogenes subsp.luteus)、偏端链霉菌(Streptomyces distallicus)、雅加达链霉菌(Streptomyces djakartensis)、德氏链霉菌 (Streptomyces drozdowiczii)、达勒姆链霉菌(Streptomyces durhamensis)、 杜米托尔链霉菌(Streptomycesdurmitorensis)、Streptomyces eburosporeus、 多刺链霉菌(Streptomyces echinatus)、棘孢红链霉菌(Streptomyces echinoruber)、 埃德尔链霉菌(Streptomycesederensis)、Streptomyces elgreteus、Streptomyces elizabethii、峨眉链霉菌(Streptomycesemeiensis)、内霉素链霉菌(Streptomyces endus)、淡紫褐链霉菌(Streptomycesenissocaesilis)、埃里当链霉菌 (Streptomyces eridani)、突发链霉菌(Streptomyceserumpens)、暗红产色链 霉菌(Streptomyces erythrochromogenes)、红色链霉菌(Streptomyces erythrogriseus)、针棘链霉菌(Streptomyces espinosus)、优洛菌素链霉菌 (Streptomyces eurocidicus)、欧洲疮痂链霉菌(Streptomyces europaeiscabiei)、泛温链霉菌(Streptomyces eurythermus)、脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliatus)、 成束链霉菌(Streptomyces fasiculatus)、苦链霉菌(Streptomyces felleus)、 铁钻土链霉菌(Streptomyces ferralitis)、热诚链霉菌近孢菌素亚种(Streptomyces fervenssubsp.melrosporus)、细绳链霉菌(Streptomyces ficellus)、丝状链霉 菌(Streptomycesfilamentosus)、菲律宾链霉菌(Streptomyces filipinensis)、 镶边链霉菌(Streptomyces fimbriatus)、粪生链霉菌(Streptomyces fimicarius)、 芬氏链霉菌(Streptomyces finlayi)、浅黄链霉菌(Streptomyces flaveolus)、 华丽黄链霉菌(Streptomyces flaveus)、黄棕色链霉菌(Streptomyces flavidofuscus)、微黄绿链霉菌(Streptomyces flavidovirens)、微黄绿链霉菌 褐色亚种(Streptomyces flavidovirenssubsp.fuscus)、微菌核链霉菌 (Streptomyces flaviscleroticus)、黄产色链霉菌(Streptomyces flavochromogenes)、黄抗霉素链霉菌(Streptomyces flavofungini)、黄棕色链 霉菌(Streptomyces flavofuscus)、黄灰链霉菌(Streptomyces flavogriseus)、黄大孢链霉菌(Streptomyces flavomacrosporus)、黄直丝链霉菌(Streptomycesflavorectus)、黄发链霉菌(Streptomyces flavotricini)、黄发链霉菌假产色亚 种(Streptomyces flavotricini subsp.pseudochromogenes)、黄变异链霉菌(Streptomyces flavovariabilis)、黄微绿链霉菌(Streptomyces flavovirens)、 黄绿链霉菌(Streptomyces flavoviridis)、黄色链霉菌(Streptomyces flavus)、 柔毛链霉菌(Streptomyces flocculus)、佛罗里达链霉菌(Streptomyces floridae)、 荧光链霉菌(Streptomyces fluorescens)、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、 弗氏链霉菌葡萄色亚种(Streptomyces fradiae subsp.acinicolor)、弗氏链霉菌 意大利亚种(Streptomyces fradiae subsp.italicus)、脆弱链霉菌(Streptomyces fragilis)、断裂链霉菌(Streptomyces fragmentans)、断裂链霉菌水生亚种(Streptomyces fragmentanssubsp.aquatica)、极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)、暗黄硬木链霉菌(Streptomyces fulvorobeus)、暗黄紫链霉菌 (Streptomyces fulvoviolaceus)、暗黄绿链霉菌(Streptomyces fulvoviridis)、 烟熏链霉菌(Streptomyces fumanus)、烟色小菌核链霉菌(Streptomyces fumigatiscleroticus)、杀真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus)、Streptomyces furlongus、Streptomyces furlongus subsp.furlongus、褐暗黑链霉菌(Streptomyces fuscoatrus)、加蓬链霉菌(Streptomyces gabonae)、浅绿色链霉菌(Streptomyces galbus)、加利利链霉菌(Streptomyces galilaeus)、鸡链霉菌(Streptomyces gallinarius)、灭癌素链霉菌(Streptomyces gancidicus)、甘托克链霉菌(Streptomyces gangtokensis)、冈癌霉素链霉菌(Streptomyces gannmycicus)、 加登链霉菌(Streptomyces garden)、加德那氏链霉菌(Streptomyces gardneri)、 吉丹链霉菌(Streptomyces gedanensis)、胶样链霉菌(Streptomyces gelaticus)、 吉尔达南霉素链霉菌(Streptomyces geldanamycininus)、喷泉链霉菌 (Streptomyces geysiriensis)、加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)、吉布 森氏链霉菌(Streptomyces gibsonii)、Streptomyces ginsengisoli、淡青链霉菌 (Streptomyces glaucescens)、浅绿灰链霉菌(Streptomyces glauciniger)、青 孢链霉菌(Streptomyces glaucosporus)、淡灰链霉菌(Streptomyces glaucus)、 球形链霉菌(Streptomyces globifer)、球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)、 球孢链霉菌高加索亚种(Streptomyces globisporussubsp.caucasicus)、球孢链 霉菌球孢亚种(Streptomyces globisporussubsp.globisporus)、浑圆链霉菌 (Streptomyces globosus)、球团链霉菌(Streptomycesglomeratus)、球团橙 色链霉菌(Streptomyces glomeroaurantiacus)、球团产色链霉菌(Streptomyces glomerochromogenes)、戈壁发链霉菌(Streptomyces gobitricini)、高氏链霉 菌(Streptomyces goshikiensis)、古热罗氏链霉菌(Streptomyces gougerotii)、禾粟链霉菌(Streptomyces graminearus)、Streptomyces gramineus、禾生链霉 菌(Streptomyces graminofaciens)、灰黑链霉菌(Streptomyces griseiniger)、 灰菌素链霉菌(Streptomyces griseinus)、灰橙链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacus)、灰棕褐链霉菌(Streptomyces griseobrunneus)、灰肉链霉 菌(Streptomycesgriseocarneus)、灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、灰产色链霉菌吹田亚种(Streptomyces griseochromogenes subsp.suitaensis)、生灰链霉菌(Streptomycesgriseofaciens)、灰黄链霉菌 (Streptomyces griseoflavus)、Streptomycesgriseoflavus subsp.pyrindicus、灰 褐链霉菌(Streptomyces griseofuscus)、灰肉色链霉菌(Streptomyces griseoincarnatus)、浅灰白链霉菌(Streptomyces griseoloalbus)、浅灰暗链霉 菌(Streptomyces griseolosuffuscus)、浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus)、 灰藤黄链霉菌(Streptomyces griseoluteus)、灰色霉素链霉菌(Streptomyces griseomycini)、灰平链霉菌(Streptomyces griseoplanus)、灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens)、灰红链霉菌(Streptomyces griseoruber)、灰锈 赤链霉菌(Streptomyces griseorubiginosus)、灰旋链霉菌(Streptomyces griseospiralis)、灰孢链霉菌(Streptomyces griseosporeus)、灰草黄链霉菌 (Streptomycesgriseostramineus)、灰轮丝链霉菌(Streptomyces griseoverticillatus)、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、灰色链霉菌 (Streptomyces griseus)、灰色链霉菌棕褐亚种(Streptomyces griseus subsp. bruneus)、灰色链霉菌惰性亚种(Streptomycesgriseussubsp.desideus)、灰色 链霉菌埃里兹亚种(Streptomyces griseussubsp.erizensis)、灰色链霉菌甲酸亚 种(Streptomyces griseus subsp.formicus)、灰色链霉菌灰色亚种(Streptomyces griseus subsp.griseus)、灰色链霉菌绛红亚种(Streptomyces griseus subsp. purpureus)、灰色链霉菌紫红色亚种(Streptomycesgriseus subsp.rhodochrous)、 灰色链霉菌溶解亚种(Streptomyces griseussubsp.solvifaciens)、关杜河链霉 菌(Streptomyces guanduensis)、吉尔伯加链霉菌(Streptomyces gulbargensis)、 棉根链霉菌(Streptomyces gypseus)、海南链霉菌(Streptomyces hainanensis)、 蜂海绵链霉菌(Streptomyces haliclonae)、Streptomyces halotolerans、郝氏链 霉菌(Streptomyces halstedii)、夏威夷链霉菌(Streptomyces hawaiiensis)、 Streptomyces hazeliensis、河北链霉菌(Streptomyceshebeiensis)、黑姆氏链霉 菌(Streptomyces heimi)、日光霉素链霉菌(Streptomycesheliomycini)、瑞 士链霉菌(Streptomyces helvaticus)、黑内链霉菌(Streptomyceshenetus)、 草绿色链霉菌(Streptomyces herbaricolor)、异变形链霉菌(Streptomycesheteromorphus)、Streptomyces himgriensis、广岛链霉菌(Streptomyceshiroshimensis)、蓬刺链霉菌(Streptomyces hirsutus)、何尔塘链霉菌 (Streptomyceshorton)、湿链霉菌(Streptomyces humidus)、湿链霉菌抗瘤 亚种(Streptomyces humidussubsp.antitumoris)、腐殖酸链霉菌(Streptomyces humifer)、腐殖质链霉菌(Streptomyces humiferus)、Streptomyces hundungensis、 无色透明链霉菌(Streptomyces hyalinus)、海德拉巴链霉菌(Streptomyces hyderabadensis)、产水链霉菌(Streptomyces hydrogenans)、吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)、吸水链霉菌阿博霉素亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.aabomyceticus)、吸水链霉菌狭霉素亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.angustmyceticus)、吸水链霉菌阿沙霉素亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.azalomyceticus)、吸水链霉菌产晶亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.crystallogenes)、吸水链霉菌德夸菌素亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.decoyicus)、吸水链霉菌二重霉素亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.duamyceticus)、吸水链霉菌神农霉素亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.geldanus)、吸水链霉菌泥土亚种(Streptomyceshygroscopicus subsp.glebosus)、吸水链霉菌透明霉素亚种(Streptomyceshygroscopicus subsp.hialomyceticus)、吸水链霉菌吸水亚种(Streptomyceshygroscopicus subsp.hygroscopicus)、Streptomyces hygroscopicus subsp.hygroscopius、吸水链霉菌柠檬亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp. limoneus)、吸水链霉菌奥萨霉素亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp. ossamyceticus)、刺孢吸水链霉菌(Streptomyces hygrospinosus)、绿色素链 霉菌(Streptomyces iakyrus)、不均匀链霉菌(Streptomyces inaequalis)、印 度链霉菌(Streptomyces indiaensis)、印度链霉菌(Streptomyces indicus)、 靛蓝色链霉菌(Streptomyces indigocolor)、生靛链霉菌(Streptomyces indigoferus)、印尼链霉菌(Streptomyces indonesiensis)、标记链霉菌 (Streptomyces insignis)、中间型链霉菌(Streptomyces intermedius)、不寻 常链霉菌(Streptomyces inusitatus)、甘薯链霉菌(Streptomyces ipomoeae)、 Streptomycesiranensis、石垣链霉菌(Streptomyces ishigakiensis)、牙买加链霉 菌(Streptomycesjamaicensis)、紫花链霉菌(Streptomyces janthinus)、爪哇 链霉菌(Streptomycesjavensis)、戒台寺链霉菌(Streptomyces jietaisiensis)、 如瑞链霉菌(Streptomyces jujuy)、北蹉峨链霉菌(Streptomyces jumonjinensis)、 香川链霉菌(Streptomyces kagawaensis)、Streptomyces kagoshimanus、卡那 霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)、蟹原链霉菌(Streptomyces kaniharaensis)、卡纳塔链霉菌(Streptomyces karnatakensis)、春日井链霉菌 (Streptomyces kasugaensis)、Streptomyces kasugaspinus、卡特拉链霉菌 (Streptomyces katrae)、肯塔基链霉菌(Streptomyces kentuckensis)、可汗达 尔链霉菌(Streptomyces khandalensis)、北里链霉菌(Streptomyces kitasatoensis)、 神户链霉菌(Streptomyces kobenensis)、高阳链霉菌(Streptomyces koyangensis)、 克兰斯基链霉菌(Streptomyces krainskii)、昆明链霉菌(Streptomyces kunmingensis)、库氏链霉菌(Streptomyces kurssanovii)、科威特链霉菌 (Streptomyces kuwaitiensis)、坏唇链霉菌(Streptomyces labedae)、莱西氏 链霉菌(Streptomyces laceyi)、Streptomyces laculatusporus、亮紫链霉菌 (Streptomyceslaeteviolaceus)、羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)、 Streptomyces lannensis、拉沙里链霉菌(Streptomyces lasaliensis)、砖红链霉 菌(Streptomyces lateritius)、劳氏链霉菌(Streptomyces laurentii)、浅紫灰 叶链霉菌(Streptomyces lavendofoliae)、浅紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、浅紫灰链霉菌褐色亚种(Streptomyceslavendulae subsp.fuscus)、 浅紫灰链霉菌蚕脓亚种(Streptomyces lavendulaesubsp.grasserius)、浅紫灰链 霉菌浅紫灰亚种(Streptomyces lavendulaesubsp.lavendulae)、淡紫灰直丝链 霉菌(Streptomyces lavendularectus)、薰衣草灰色链霉菌(Streptomyces lavenduligriseus)、薰衣草色链霉菌(Streptomyceslavendulocolor)、灰青链 霉菌(Streptomyces lazureus)、光滑链霉菌(Streptomyceslevis)、制酵母链 霉菌(Streptomyces levoris)、黎巴嫩链霉菌(Streptomyces libani)、黎巴嫩 链霉菌黎巴嫩亚种(Streptomyces libani subsp.libani)、黎巴嫩链霉菌红黄亚种(Streptomyces libani subsp.rufus)烯霉素链霉菌(Streptomyces lienomycini)、 列斯克链霉菌(Streptomyces lieskei)、丁香链霉菌(Streptomyces lilaceus)、 丁香暗黄链霉菌(Streptomyces lilacinofulvus)、丁香链霉菌(Streptomyces lilacinus)、淤泥链霉菌(Streptomyces limosus)、林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)、利波曼链霉菌(Streptomyces lipmanii)、丽三得利链霉菌(Streptomyces lisandri)、石蕊杀菌素链霉菌(Streptomyces litmocidini)、浅 青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、青紫棒状链霉菌(Streptomyces lividoclavatus)、青紫链霉菌(Streptomyces lividus)、劳意德链霉菌(Streptomyces loidensis)、洛蒙德链霉菌(Streptomyces lomondensis)、长孢黄色链霉菌 (Streptomyces longisporoflavus)、长孢红色链霉菌(Streptomyceslongispororuber)、长孢链霉菌(Streptomyces longisporus)、极长链霉菌(Streptomyces longissimus)、朗伍德链霉菌(Streptomyces longwoodensis)、 鲁萨链霉菌(Streptomyces lucensis)、Streptomyces lunalinharensis、丽娜氏链 霉菌(Streptomyces lunalinharesii)、苍黄疮痂链霉菌(Streptomyces luridiscabiei)、 苍黄链霉菌(Streptomyces luridus)、葡萄牙链霉菌(Streptomyces lusitanus)、 葡萄牙链霉菌四环亚种(Streptomyces lusitanus var.tetracyclini)、黄网链霉菌(Streptomyces luteireticuli)、藤黄色链霉菌(Streptomyces luteocolor)、藤黄 灰链霉菌(Streptomyces luteogriseus)、浅藤黄链霉菌(Streptomyces luteolutescens)、藤黄孢链霉菌(Streptomyces luteosporeus)、藤黄轮丝链霉 菌(Streptomycesluteoverticillatus)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、大 分子霉素链霉菌(Streptomyces macromomyceticus)、大孢子链霉菌 (Streptomyces macrosporeus)、大孢链霉菌(Streptomyces macrosporus)、 Streptomyces maizeus、孔雀石绿链霉菌(Streptomyces malachiticus)、 Streptomyces malachiticus subsp.griseospinosus、孔雀石褐链霉菌(Streptomyces malachitofuscus)、孔雀石直丝链霉菌(Streptomycesmalachitorectus)、孔雀 石刺链霉菌(Streptomyces malachitospinus)、马来亚链霉菌(Streptomyces malayensis)、马来西亚链霉菌(Streptomyces malaysiensis)、Streptomyces manipurensis、海链霉菌(Streptomyces marinus)、海边链霉菌(Streptomyces maritimus)、摩洛哥链霉菌(Streptomyces marokkonensis)、马术链霉菌(Streptomyces mashuensis)、堆孢链霉菌(Streptomyces massasporeus)、马 特链霉菌(Streptomyces matensis)、苯胺紫链霉菌(Streptomyces mauvecolor)、 美登木链霉菌(Streptomyces mayteni)、中杀菌素链霉菌(Streptomyces mediocidicus)、米兰链霉菌(Streptomyces mediolani)、巨孢链霉菌(Streptomyces megasporus)、产黑链霉菌(Streptomyces melanogenes)、生黑孢链霉菌(Streptomyces melanosporofaciens)、Streptomyces mentougouensis、墨西哥链 霉菌(Streptomyces mexicanus)、密执安链霉菌(Streptomyces michiganensis)、 密执安链霉菌溶淀粉亚种(Streptomycesmichiganensis subsp.amylolyticus)、 细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)、小孢链霉菌(Streptomyces microsporus)、 三原链霉菌(Streptomyces miharaensis)、美浓链霉菌(Streptomyces minoensis)、 微菌核链霉菌(Streptomyces minutiscleroticus)、奇异链霉菌(Streptomyces mirabilis)、三崎链霉菌(Streptomyces misakiensis)、三崎链霉菌(Streptomyces misawanensis)、米修链霉菌(Streptomyces misionensis)、茂原链霉菌 (Streptomyces mobaraensis)、温和链霉菌(Streptomyces moderatus)、单霉 素链霉菌(Streptomyces monomycini)、莫氏链霉菌(Streptomyces mordarskii)、 师岗链霉菌(Streptomyces morookaense)、师岗链霉菌(Streptomyces morookaensis)、细黄链霉菌(Streptomyces mucoflavus)、多旋链霉菌 (Streptomyces multispiralis)、鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)、易变链 霉菌(Streptomycesmutabilis)、突变霉素链霉菌(Streptomyces mutomycini)、 生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)、产粘液链霉菌(Streptomyces myxogenes)、卡西氏链霉菌(Streptomyces naganishii)、南宁链霉菌(Streptomyces nanningensis)、南海链霉菌(Streptomyces nanshensis)、奈良 链霉菌(Streptomyces naraensis)、那波链霉菌(Streptomyces narbonensis)、 那士维尔链霉菌(Streptomyces nashvillensis)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、Streptomyces neburosus、Streptomyces neocaliberis、纺锤雷素链 霉菌(Streptomycesnetropsis)、寝屋川链霉菌(Streptomyces neyagawaensis)、 微黑链霉菌(Streptomycesnigellus)、黑色链霉菌(Streptomyces niger)、变 黑链霉菌(Streptomycesnigrescens)、生黑链霉菌(Streptomyces nigrifaciens)、 黑浅灰链霉菌(Streptomycesnigrogriseolus)、黑微紫链霉菌(Streptomyces nigroviolens)、硝孢链霉菌(Streptomyces nitrosporeus)、雪白红链霉菌 (Streptomyces niveoruber)、雪白链霉菌(Streptomyces niveus)、高贵链霉 菌(Streptomyces nobilis)、登户链霉菌(Streptomyces noboritoensis)、结节 链霉菌(Streptomyces nodosus)、结节链霉菌飞鸟亚种(Streptomyces nodosus subsp.asukaensis)、黑胡桃链霉菌(Streptomycesnogalater)、野尻链霉菌(Streptomyces nojiriensis)、诺氏链霉菌(Streptomycesnoursei)、新泽西链 霉菌(Streptomyces novaecaesareae)、新轮生链霉菌(Streptomycesnovoverticillus)、赭黄菌核链霉菌(Streptomyces ochraceiscleroticus)、赭孢 链霉菌(Streptomyces ochrosporus)、土味链霉菌(Streptomyces odorifer)、 相贺链霉菌(Streptomyces ogaensis)、裂生孢链霉菌(Streptomyces oidiosporus)、 橄榄色硬膜链霉菌Streptomyces olivaceiscleroticus)、橄榄灰绿链霉菌 (Streptomycesolivaceoviridis)、橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)、橄榄 产生链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)、橄榄产色链霉菌胞病毒亚种 (Streptomycesolivochromogenes subsp.cytovirinus)、橄榄灰链霉菌 (Streptomyces olivogriseus)、橄榄轮丝链霉菌(Streptomyces olivoverticillatus)、 橄榄绿链霉菌(Streptomycesolivoviridis)、大宫链霉菌(Streptomyces omiyaensis)、奥里诺科链霉菌(Streptomycesorinoci)、装饰链霉菌(Streptomyces ornatus)、Streptomyces osmaniensis、蛎灰链霉菌(Streptomyces ostreogriseus)、 尾鹫链霉菌(Streptomyces owasiensis)、密旋链霉菌(Streptomyces pactum)、 稠李链霉菌(Streptomyces padanus)、苍白色链霉菌(Streptomyces pallidus)、 Streptomyces panacagri、Streptomyces panaciterrae、帕奈链霉菌(Streptomyces panayensis)、意外链霉菌(Streptomyces paradoxus)、巴拉圭链霉菌 (Streptomyces paraguayensis)、微小链霉菌(Streptomyces parvulus)、小链 霉菌(Streptomyces parvus)、寡淀粉酶链霉菌(Streptomyces paucidiastaticus)、 寡孢链霉菌(Streptomyces paucisporeus)、寡产孢链霉菌(Streptomyces paucisporogenes)、保罗斯链霉菌(Streptomyces paulus)、秘鲁链霉菌 (Streptomyces peruviensis)、波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)、波赛链 霉菌青灰亚种(Streptomyces peucetiussubsp.caesius)、波赛链霉菌肉质亚种 (Streptomyces peucetius subsp.carneus)、暗产色链霉菌(Streptomyces phaeochromogenes)、生棕色链霉菌(Streptomycesphaeofaciens)、产褐黄色 链霉菌(Streptomyces phaeoluteichromatogenes)、褐黄色链霉菌(Streptomyces phaeoluteigriseus)、暗绛红链霉菌(Streptomycesphaeopurpureus)、暗色轮丝 链霉菌高规亚种(Streptomyces phaeoverticillatussubsp.takatsukiensis)、暗绿 链霉菌(Streptomyces phaeoviridis)、芦荟链霉菌(Streptomyces pharetrae)、Streptomyces phemorphus、植生链霉菌(Streptomycesphytohabitans)、毛链霉 菌(Streptomyces pilosus)、毛紫褐链霉菌(Streptomycespiloviolofuscus)、 产皮欧霉素链霉菌(Streptomyces piomogenus)、扁平链霉菌(Streptomyces platensis)、扁平链霉菌克拉尔亚种(Streptomyces platensissubsp.clarensis)、 扁平链霉菌锦葵素亚种(Streptomyces platensissubsp.malvinus)、Streptomyces platensis subsp.robigocidicus、褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)、铅链霉菌 (Streptomyces plumbeus)、抗铅链霉菌(Streptomyces plumbiresistens)、浅 多色链霉菌(Streptomyces pluricolorescens)、产多抗链霉菌(Streptomyces polyantibioticus)、多产色链霉菌(Streptomycespolychromogenes)、多产色 链霉菌沙色亚种(Streptomyces polychromogenessubsp.arenicolus)、浦那链霉 菌(Streptomyces poonensis)、早期链霉菌(Streptomycespraecox)、葱绿毛 链霉菌(Streptomyces prasinopilosus)、葱绿孢链霉菌(Streptomycesprasinosporus)、葱绿链霉菌(Streptomyces prasinus)、始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)、原绛红链霉菌(Streptomyces propurpuratus)、李色链霉菌(Streptomyces prunicolor)、沙链霉菌链霉菌(Streptomyces psammoticus)、 假刺孢链霉菌(Streptomyces pseudoechinosporeus)、假浅灰链霉菌 (Streptomycespseudogriseolus)、假浅灰链霉菌葡糖发酵亚种(Streptomyces pseudogriseolussubsp.glucofermentans)、假委内瑞拉链霉菌(Streptomyces pseudovenezuelae)、美好链霉菌(Streptomyces pulcher)、粉末链霉菌 (Streptomyces pulveraceus)、榴红链霉菌(Streptomyces puniceus)、 Streptomyces puniceus subsp.doliceus、紫色疮痂链霉菌(Streptomyces puniciscabiei)、绛红产色链霉菌(Streptomyces purpeochromogenes)、绛红褐 链霉菌(Streptomyces purpeofuscus)、浅绛红链霉菌(Streptomycespurpurascens)、 绛红褐链霉菌(Streptomyces purpureofuscus)、绛红褐链霉菌不凝亚种(Streptomyces purpureofuscus subsp.acoagulans)、绛红链霉菌(Streptomycespurpureus)、成紫菌核链霉菌(Streptomyces purpurogeneiscleroticus)、吡啶 霉素链霉菌(Streptomyces pyridomyceticus)、穗产色链霉菌(Streptomycesracemochromogenes)、穗产色链霉菌(Streptomyces racemosus)、抗射线链 霉菌(Streptomyces radiopugnans)、棉子糖链霉菌(Streptomyces raffinosus)、 枝链链霉菌(Streptomyces rameus)、分支毛霉链霉菌(Streptomyces ramosissimus)、小枝链霉菌(Streptomyces ramulosus)、仰光链霉菌 (Streptomyces rangoon)、仰光链霉菌(Streptomyces rangoonensis)、雷帕霉 素链霉菌(Streptomyces rapamycincus)、累西菲链霉菌(Streptomyces recifensis)、 直丝紫链霉菌(Streptomyces rectiviolaceus)、回头链霉菌耐热亚种 (Streptomyces refuineus subsp.thermotolerans)、王家链霉菌(Streptomyces regalis)、雷格链霉菌(Streptomyces regensis)、抗霉素链霉菌(Streptomyces resistomycificus)、网状链霉菌原霉素亚种(Streptomyces reticulisubsp. protomycicus)、网状疮痂链霉菌(Streptomyces reticuliscabiei)、根际链霉菌(Streptomyces rhizosphaericus)、核糖苷链霉菌(Streptomyces ribosidificus)、 生龟裂链霉菌(Streptomyces rimofaciens)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、 龟裂链霉菌巴龙霉素亚种(Streptomyces rimosus subsp.paromomycinus)、龟 裂链霉菌龟裂亚种(Streptomyces rimosus subsp.rimosus)、利尻链霉菌 (Streptomyces rishiriensis)、略红褐链霉菌(Streptomyces robefuscus)、娄彻 链霉菌(Streptomyces rochei)、玫瑰花链霉菌(Streptomyces rosa)、玫瑰花 链霉菌能登亚种(Streptomyces rosasubsp.notoensis)、玫瑰菌核链霉菌 (Streptomyces roseiscleroticus)、红白链霉菌(Streptomyces roseoalbus)、玫 瑰橙链霉菌(Streptomyces roseoaurantius)、玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)、玫瑰产色链霉菌(Streptomycesroseochromogenus)、玫 瑰产色链霉菌白环菌素亚种(Streptomyces roseochromogenussubsp. albocyclini)、玫瑰烬灰链霉菌(Streptomyces roseocinereus)、玫瑰淀粉酶链霉菌(Streptomyces roseodiastaticus)、玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)、玫瑰暗黄链霉菌(Streptomyces roseofulvus)、玫瑰灰链霉菌(Streptomycesroseogriseus)、玫瑰淡紫链霉菌(Streptomyces roseolilacinus)、浅玫瑰链霉 菌(Streptomyces roseolus)、玫瑰藤黄链霉菌(Streptomyces roseoluteus)、Streptomyces roseoplatus、玫瑰变红链霉菌(Streptomyces roseorubens)、玫瑰 孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)、玫瑰轮丝链霉菌(Streptomyces roseoverticillatus)、玫瑰紫链霉菌(Streptomyces roseoviolaceus)、玫瑰浅紫 链霉菌(Streptomycesroseoviolascens)、玫瑰绿链霉菌(Streptomyces roseoviridis)、玫瑰色链霉菌(Streptomyces roseus)、红色链霉菌(Streptomyces ruber)、红玉色链霉菌(Streptomyces rubicolor)、暗红链霉菌(Streptomyces rubidus)、锈赤蜡黄链霉菌(Streptomyces rubiginosohelvolus)、稍黄链霉菌 (Streptomyces rubiginosus)、红网链霉菌(Streptomyces rubrireticuli)、 Streptomyces rubrocyanodiastaticussubsp.piger、红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)、红淡紫灰链霉菌(Streptomycesrubrolavendulae)、Streptomyces rubroverrucosus、Streptomyces rubrus、红黄产色链霉菌(Streptomyces rufochromogenes)、鲁地链霉菌(Streptomyces rutgersensis)、黑麦链霉菌 (Streptomyces ryensis)、左八郎链霉菌(Streptomyces sahachiroi)、坂井链 霉菌(Streptomyces sakaiensis)、盐场链霉菌(Streptomyces salinarum)、桑 氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)、桑格利娜链霉菌(Streptomyces sanglieri)、 山南链霉菌(Streptomyces sannanensis)、桑格利娜氏链霉菌(Streptomyces sannurensis)、三亚链霉菌(Streptomyces sanyensis)、腐生链霉菌(Streptomyces saprophyticus)、萨腊赛链霉菌(Streptomyces saraceticus)、佐山链霉菌 (Streptomyces sayamaensis)、疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)、皱孢链 霉菌(Streptomyces scabrisporus)、菌核粒链霉菌(Streptomyces sclerogranulatus)、 菌核链霉菌(Streptomyces sclerotialus)、扫状链霉菌(Streptomyces scopiformis)、 景天链霉菌(Streptomyces sedi)、濑野链霉菌(Streptomyces senoensis)、首 尔链霉菌(Streptomyces seoulensis)、栅栏链霉菌(Streptomyces septatus)、 (Streptomyces serianimatus)、横隔链霉菌(Streptomycessetae)、赖野链霉 菌(Streptomyces setonensis)、西唐氏链霉菌(Streptomycessetonii)、陕西 链霉菌(Streptomyces shaanxiensis)、盐田链霉菌(Streptomycesshiodaensis)、 焦土链霉菌(Streptomyces showdoensis)、仙台链霉菌(Streptomycessindenensis)、 盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)、嗜钠链霉菌(Streptomycessodiiphilus)、 索马里链霉菌(Streptomyces somaliensis)、肉穗链霉菌(Streptomycesspadicis)、 稀疏链霉菌(Streptomyces sparsogenes)、稀疏链霉菌(Streptomycessparsus)、 特别链霉菌(Streptomyces specialis)、壮观链霉菌(Streptomycesspectabilis)、 好望角链霉菌(Streptomyces speibonae)、类球形链霉菌(Streptomycesspheroides)、刺产色链霉菌Streptomyces spinichromogenes)、Streptomycesspinicoumarensis、刺疣链霉菌(Streptomyces spinoverrucosus)、螺旋链霉菌(Streptomyces spiralis)、螺旋轮丝链霉菌(Streptomyces spiroverticillatus)、 海绵链霉菌(Streptomyces spongiae)、孢暗灰链霉菌(Streptomyces sporocinereus)、孢裂链霉菌(Streptomyces sporoclivatus)、孢淡灰链霉菌 (Streptomyces spororaveus)、疣孢链霉菌(Streptomyces sporoverrucosus)、 斯特菲斯堡链霉菌(Streptomycessteffisburgensis)、斯特菲斯堡链霉菌斯特菲 斯堡亚种(Streptomycessteffisburgensis subsp.steffisburgensis)、星疮痂链霉 菌(Streptomycesstelliscabiei)、草色链霉菌(Streptomyces stramineus)、亚 红链霉菌(Streptomycessubrutilus)、苏丹链霉菌(Streptomyces sudanensis)、 生磺酸链霉菌(Streptomycessulfonofaciens)、硫磺色链霉菌(Streptomyces sulphureus)、斯维链霉菌(Streptomycessviceus)、成束链霉菌(Streptomyces synnematoformans)、田无链霉菌(Streptomycestanashiensis)、田无链霉菌 抑脑炎霉素变亚种(Streptomyces tanashiensissubsp.cephalomyceticus)、馆山 链霉菌(Streptomyces tateyamensis)、托鲁斯山链霉菌(Streptomyces tauricus)、 唐德链霉菌(Streptomyces tendae)、黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)、 天神海链霉菌(Streptomyces tenjimariensis)、白蚁链霉菌(Streptomyces termitum)、砖红色链霉菌(Streptomyces testaceus)、破伤风链霉菌(Streptomyces tetanusemus)、Streptomyces thermoalcalitolerans、热黑绿链霉菌(Streptomyces thermoatroviridis)、好热嗜一氧化碳链霉菌(Streptomycesthermocarboxydovorans)、嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)、热栗色链霉菌(Streptomyces thermocastaneus)、热淡天 蓝链霉菌(Streptomycesthermocoerulescens)、嗜热喜粪链霉菌(Streptomyces thermocoprophilus)、热蓝斑链霉菌(Streptomyces thermocyaneomaculatus)、 热蓝紫链霉菌(Streptomycesthermocyaneoviolaceus)、热淀粉酶链霉菌 (Streptomyces thermodiastaticus)、热黄链霉菌(Streptomyces thermoflavus)、 热灰紫链霉菌(Streptomycesthermogriseoviolaceus)、热灰链霉菌(Streptomyces thermogriseus)、热吸水链霉菌锈赤亚种(Streptomyces thermohygroscopicus subsp.rubiginosus)、热丁香链霉菌(Streptomyces thermolilacinus)、热线链 霉菌(Streptomyces thermolineatus)、热藤黄链霉菌(Streptomyces thermoluteus)、 热藤黄链霉菌褐色亚种(Streptomycesthermoluteus subsp.fuscus)、热反硝化 链霉菌(Streptomyces thermonitrificans)、热橄榄链霉菌褐色亚种(Streptomyces thermoolivaceus subsp.fuscus)、热橄榄链霉菌热橄榄亚种(Streptomyces thermoolivaceus subsp.thermoolivaceus)、嗜热链霉菌(Streptomyces thermophilus)、嗜热刺孢链霉菌(Streptomyces thermospinosisporus)、耐热 链霉菌(Streptomyces thermotolerans)、热紫链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)、热紫链霉菌不渗透亚种(Streptomyces thermoviolaceus subsp.apingens)、热紫链霉菌热紫亚种(Streptomyces thermoviolaceus subsp.thermoviolaceus)、热普通链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)、小镇链霉 菌(Streptomyces thinghirensis)、硫藤黄链霉菌(Streptomyces thioluteus)、 苏氨霉素链霉菌(Streptomyces threomyceticus)、圆突起链霉菌(Streptomyces torulosus)、登佐链霉菌(Streptomyces tosaensis)、产毒链霉菌(Streptomyces toxifertilis)、毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)、丰加链霉菌(Streptomyces toyocaensis)、三角链霉菌(Streptomyces triangulatus)、三色链霉菌(Streptomyces tricolor)、三底胺链霉菌(Streptomyces triculaminicus)、Streptomyces triostinicus、 三抗逆链霉菌(Streptomyces tritolerans)、津岛链霉菌(Streptomyces tsukiyonensis)、津岛链霉菌(Streptomyces tsusimaensis)、杀结节链霉菌 (Streptomyces tubercidicus)、紫蓝链霉菌(Streptomyces tuirus)、解瘤链霉 菌(Streptomyces tumemacerans)、杜莫氏链霉菌(Streptomyces tumuli)、肿 痂链霉菌(Streptomyces turgidiscabies)、赭褐链霉菌(Streptomyces umbrinus)、 阴荫链霉菌(Streptomyces umbrosus)、变异链霉菌(Streptomyces variabilis)、 多变链霉菌(Streptomyces variegatus)、变化链霉菌(Streptomyces varius)、 华沙链霉菌(Streptomyces varsoviensis)、广阔链霉菌(Streptomyces vastus)、 维洛链霉菌(Streptomyces vellosus)、旺达链霉菌(Streptomyces vendargensis)、 委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)、春季链霉菌(Streptomyces verne)、 变皮链霉菌(Streptomyces versipellis)、轮丝链霉菌(Streptomyces verticillatus)、 轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)、越南链霉菌(Streptomyces vietnamensis)、 酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)、酒红土褐链霉菌(Streptomyces vinaceusdrappus)、紫产色链霉菌(Streptomycesviolaceochromogenes)、紫阔 链霉菌(Streptomyces violaceolatus)、紫色直丝链霉菌(Streptomyces violaceorectus)、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、深红紫链霉菌 (Streptomyces violaceorubidus)、紫色链霉菌(Streptomyces violaceus)、紫 黑链霉菌(Streptomyces violaceusniger)、略紫链霉菌(Streptomyces violarus)、 浅紫链霉菌(Streptomyces violascens)、呈紫色链霉菌(Streptomyces violens)、 紫变红红链霉菌(Streptomyces violorubens)、变绿链霉菌(Streptomyces virens)、 弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)、弗吉尼亚链霉菌生脂亚种 (Streptomyces virginiaesubsp.lipoxae)、浅绿链霉菌(Streptomyces viridans)、 生绿链霉菌(Streptomycesviridifaciens)、绿黄链霉菌(Streptomyces viridiflavus)、 绿色链霉菌(Streptomycesviridis)、绿紫链霉菌(Streptomyces viridiviolaceus)、 绿棕褐链霉菌(Streptomycesviridobrunneus)、绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、绿产色链霉菌驹场亚种(Streptomyces viridochromogenessubsp.komabensis)、绿产色链霉菌硫霉素亚种(Streptomyces viridochromogenes subsp.sulfomycini)、绿淀粉酶链霉菌(Streptomyces viridodiastaticus)、产绿链霉菌(Streptomyces viridogenes)、绿孢链霉菌 (Streptomyces viridosporus)、Streptomyces viridoverrucosus、嗜维生素链霉菌(Streptomyces vitaminophilus)、普通链霉菌(Streptomyces vulgaris)、威德 摩尔链霉菌(Streptomyces wedmorensis)、Streptomyces wellingtoniae、韦腊链 霉菌(Streptomyces werraensis)、威氏链霉菌(Streptomyces willmorei)、紫 藤链霉菌(Streptomyces wistariopsis)、羊毛链霉菌(Streptomyces woolensis)、 黄色产色链霉菌(Streptomyces xanthochromogenes)、杀黄胞菌素链霉菌 (Streptomycesxanthocidicus)、黄溶链霉菌(Streptomyces xantholiticus)、黄 暗色链霉菌(Streptomyces xanthophaeus)、厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)、星海链霉菌(Streptomyces xinghaiensis)、食木聚糖链霉菌 (Streptomyces xylophagus)、阳陵链霉菌(Streptomyces yanglinensis)、阎氏 链霉菌(Streptomyces yanii)、耶特链霉菌(Streptomyces yatensis)、埃里温 链霉菌(Streptomyces yeochonensis)、亚尔瓦链霉菌(Streptomyces yerevanensis)、 日惹链霉菌(Streptomyces yogyakartensis)、横须贺链霉菌(Streptomyces yokosukanensis)、Streptomyces youssoufiensis、云南链霉菌(Streptomyces yunnanensis)、沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)、泽耳链霉菌 (Streptomyces zelensis)、抗锌链霉菌(Streptomyces zinciresistens)等。
〔地芽孢杆菌属〕
作为分类在地芽孢杆菌属(Geobacillus)的微生物，可以列举例如 Geobacilluscaldoproteolyticus、热解木糖地芽孢杆菌(Geobacillus caldoxylosilyticus)、脆弱地芽孢杆菌(Geobacillus debilis)、Geobacillus galactosidasius、加尔加泉地芽孢杆菌(Geobacillus gargensis)、侏罗纪地芽孢 杆菌(Geobacillus jurassicus)、好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)、 立陶宛地芽孢杆菌(Geobacillus lituanicus)、苍白地芽孢杆菌(Geobacillus pallidus)、嗜热嗜脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、Geobacillus stromboliensis、地表地芽孢杆菌(Geobacillussubterraneus)、喜温地芽孢杆菌 (Geobacillus tepidamans)、热小链地芽孢杆菌(Geobacillus thermocatenulatus)、 热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)、Geobacillus thermodenitrificans subsp.calidus、热葡糖苷地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、噬热地芽孢杆菌(Geobacillusthermoleovorans)、就地 堆肥地芽孢杆菌(Geobacillus toebii)、乌津油田地芽孢杆菌(Geobacillus uzensis)、火神地芽孢杆菌(Geobacillus vulcani)、Geobacillus zalihae等。
〔红球菌属〕
作为分类在红球菌属(Rhodococcus)的微生物，可以列举例如玫瑰色红 球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、 马红球菌(Rhodococcus equi)、椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)、珊瑚红 球菌(Rhodococcuscorallinus)、深红红球菌(Rhodococcus rubropertinctus)、 嗜粪红球菌(Rhodococcuscoprophilus)、圆红球菌(Rhodococcus globerulus)、 氯酚红球菌(Rhodococcuschlorophenolicus)、藤黄红球菌(Rhodococcus luteus)、 爱知红球菌(Rhodococcusaichiensis)、楚布红球菌(Rhodococcus chubuensis)、 海水红球菌(Rhodococcusmaris)、成束红球菌(Rhodococcus fascines)等。
〔原核生物的优选其他种〕
此外，作为分类在磁螺菌属(Magnetospirillum)的微生物，特别优选趋 磁磁螺菌(Magnetospirillum magneticum)；作为分类在红螺菌属(Rhodospirillum)的微生物，特别优选深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、 世纪红螺菌(Rhodospirillum centenum)及度光红螺菌(Rhodospirillum photometricum)；作为分类在固氮螺菌属(Azospirillum)的微生物，特别优 选具脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)及巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)；作为分类在替斯崔纳菌属(Tistrella)的微生物，特别优选运动 替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)；作为分类在嗜酸菌属(Acidiphilium)的微生 物，特别优选隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)及多嗜嗜酸菌(Acidiphiliummultivorum)；作为分类在红细菌属(Rhodobacter)的微生物，特别优选类球 红细菌(Rhodobacter sphaeroides)及荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)； 作为分类在鲁杰氏菌属(Ruegeria)的微生物，特别优选帕氏鲁杰氏菌(Ruegeria pomeroyi)；作为分类在玫瑰杆菌属(Roseobacter)的微生物，特别优选反硝 化玫瑰杆菌(Roseobacterdenitrificans)及海滨玫瑰杆菌(Roseobacter litoralis)； 作为分类在沟鞭藻玫瑰杆菌(DinoRoseobacter)的微生物，特别优选恒雄芝氏 沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)；作为分类在暗棕色杆菌属 (Phaeobacter)的微生物，特别优选加利西亚暗棕色杆菌(Phaeobacter gallaeciensis)；作为分类在十八杆菌属(Octadecabacter)的微生物，特别优 选南极十八杆菌(Octadecabacter antarcticus)及北极十八杆菌(Octadecabacterarcticus)；作为分类在生丝单胞菌属(Hyphomonas)的微生物，特别优选海 王生丝单胞菌(Hyphomonas neptunium)；作为分类在海茎状菌属(Maricaulis) 的微生物，特别优选海海茎状菌(Maricaulis maris)；作为分类在海氏菌属 (Hirschia)的微生物，特别优选波罗的海海氏菌(Hirschia baltica)；作为分 类在新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)的微生物，特别优选溶芳烃鞘氨醇菌 (Novosphingobium aromaticivorans)；作为分类在鞘氨醇盒菌属 (Sphingopyxis)的微生物，特别优选阿拉斯加鞘氨醇盒菌(Sphingopyxisalaskensis)；作为分类在鞘氨醇菌属(Sphingobium)的微生物，特别优选日 本鞘氨醇菌(Sphingobium japonicum)及氯酚鞘氨醇杆菌(Sphingobium chlorophenolicum)；作为分类在红色杆菌属(Erythrobacter)的微生物，特别 优选海滨红色杆菌(Erythrobacterlitoralis)；作为分类在柄杆菌属(Caulobacter) 的微生物，特别优选新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)及惰性柄杆菌(Caulobacter segnis)；作为分类在苯基杆菌属(Phenylobacterium)的微生物， 特别优选Phenylobacterium zucineum；作为分类在不黏柄菌属(Asticcacaulis) 的微生物，特别优选离中不黏柄菌(Asticcacaulisexcentricus)；作为分类在 中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的微生物，特别优选草木栖中华根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)及弗氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)；作为分类在固氮根瘤菌属(Azorhizobium) 的微生物，特别优选茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)；作为分类 在布鲁氏菌属(Brucella)的微生物，特别优选马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、 羊布鲁氏菌(Brucella ovis)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、田鼠布鲁氏菌 (Brucella microti)、有鳍动物布鲁氏菌(Brucella pinnipedialis)及鳍脚动物 布鲁氏菌(Brucella ceti)；作为分类在橙单胞菌属(Aurantimonas)的微生物， 特别优选锰氧化橙单胞菌(Aurantimonas manganoxydans)；作为分类在慢生 根瘤菌属(Bradyrhizobium)的微生物，特别优选日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)；作为分类在农单胞菌属(Agromonas)的微生 物，特别优选寡养农单胞菌(Agromonas oligotrophica)；作为分类在红假单 胞菌属(Rhodopseudomonas)的微生物，特别优选沼泽红假单胞菌 (Rhodopseudomonaspalustris)；作为分类在硝化杆菌属(Nitrobacter)的微 生物，特别优选维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)及汉堡硝化杆菌 (Nitrobacter hamburgensis)；作为分类在甲基杆菌属(Methylobacterium)的 微生物，特别优选扭托甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、耐辐射甲基 杆菌(Methylobacterium radiotolerans)及结瘤甲基杆菌(Methylobacterium nodulans)；作为分类在红微菌属(Rhodomicrobium)的微生物，特别优选万 尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii)；作为分类在外海芽孢杆菌属(Pelagibacterium)的微生物，特别优选海洋耐盐芽孢杆菌(Pelagibacteriumhalotolerans)；作为分类在细小棒状菌属(Parvibaculum)的微生物，特别优 选食淋洗物细小棒状菌(Parvibaculum lavamentivorans)；作为分类在短小盒 菌属(Parvularcula)的微生物，特别优选百慕大短小盒菌(Parvularcula bermudensis)；作为分类在伯克氏菌属(Burkholderia)的微生物，特别优选 鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)、泰国伯克氏菌(Burkholderia thailandensis)、越南伯克氏菌 (Burkholderia vietnamiensis)、新洋葱伯克氏菌(Burkholderiacenocepacia)、 双向伯克氏菌(Burkholderia ambifaria)、多噬伯克氏菌(Burkholderiamultivorans)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、食异生素伯克氏菌(Burkholderia xenovorans)、瘤块伯克氏菌(Burkholderia phymatum)、强壮植 物伯克氏菌(Burkholderia phytofirmans)、荚壳伯克氏菌(Burkholderia glumae)、 产素伯克氏菌(Burkholderia rhizoxinica)、唐菖蒲伯克氏菌(Burkholderia gladioli)、解卤酚伯克氏菌(Burkholderia phenoliruptrix)及俄克拉荷马伯克 氏菌(Burkholderiaoklahomensis)；作为分类在青枯菌属(Ralstonia)的微生 物，特别优选茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum)、皮氏青枯菌(Ralstonia pickettii)及富养青枯菌(Ralstonia eutropha)；作为分类在贪铜菌属 (Cupriavidus)的微生物，特别优选耐重金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)、台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)及杀虫贪铜菌 (Cupriavidus necator)；作为分类在多核杆菌属(Polynucleobacter)的微生物，特别优选必需多核杆菌(Polynucleobacter necessarius)；作为分类在鲍特氏菌 属(Bordetella)的微生物，特别优选百日咳鲍特氏菌(Bordetella pertussis)、 副百日咳鲍特氏菌(Bordetella parapertussis)、彼氏鲍特氏菌(Bordetella petrii) 及鸟鲍特氏菌(Bordetella avium)；作为分类在泰勒氏菌属(Taylorella)的微 生物，特别优选马生殖器泰勒氏菌(Taylorella equigenitalis)；作为分类在嗜 脂环物菌属(Alicycliphilus)的微生物，特别优选脱氮嗜脂环物菌(Alicycliphilus denitrificans)；作为分类在戴尔福特菌属(Delftia)的微生物，特别优选食酸 戴尔福特菌(Delftia acidovorans)；作为分类在沙壤土杆菌属(Ramlibacter) 的微生物，特别优选泰塔温沙壤土杆菌(Ramlibactertataouinensis)；作为分 类在红育菌属(Rhodoferax)的微生物，特别优选还原铁红育菌(Rhodoferax ferrireducens)；作为分类在贪噬菌属(Variovorax)的微生物，特别优选争论 贪噬菌(Variovorax paradoxus)；作为分类在极单胞菌属(Polaromonas)的 微生物，特别优选食萘极单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)；作为分类 在食酸菌属(Acidovorax)的微生物，特别优选西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)、Acidovoraxebreus及燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)；作为分类在蚯蚓肾杆 菌属(Verminephrobacter)的微生物，特别优选蚯蚓蚯蚓肾杆菌 (Verminephrobactereiseniae)；作为分类在赫山单胞菌属(Herminiimonas) 的微生物，特别优选砷氧化赫山单胞菌(Herminiimonas arsenicoxydans)；作 为分类在草螺菌属(Herbaspirillum)的微生物，特别优选织片草螺菌 (Herbaspirillum seropedicae)；作为分类在山冈单胞菌属(Collimonas)的微 生物，特别优选食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans)；作为分类在色 杆菌属(Chromobacterium)的微生物，特别优选紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)；作为分类在鸥杆菌属(Laribacter)的微生物，特别优选香港鸥 杆菌(Laribacter hongkongensis)；作为分类在假高炳根氏菌属 (Pseudogulbenkiania)的微生物，特别优选氧化亚铁假高炳根氏菌 (Pseudogulbenkiania ferrooxidans)；作为分类在亚硝化单胞菌属 (Nirosomonas)的微生物，特别优选欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)；作为分类在亚硝化螺菌属(Nitrosospira)的微生物，特别优选多 形亚硝化螺菌(Nitrosospira multiformis)；作为分类在固氮弧菌属 (Aromatoleum)的微生物，特别优选(Aromatoleum aromaticum)；作为分 类在脱氯单胞菌属(Dechloromonas)的微生物，特别优选Dechloromonas aromatica；作为分类在固氮螺形菌(脱氯弯杆菌)属(Azospira(Dechlorosoma)) 的微生物，特别优选水稻固氮螺形菌(猪脱氯弯杆菌)(Azospira oryzae(Dechlorosoma suillum))；作为分类在莱茵海默氏菌属(Rheinheimera) 的微生物，特别优选南海莱茵海默氏菌(Rheinheimera nanhaiensis)；作为分 类在亚硝化球菌属(Nitrosococcus)的微生物，特别优选海洋亚硝化球菌 (Nitrosococcus oceani)；作为分类在需盐红螺菌属(Halorhodospira)的微生 物，特别优选嗜盐需盐红螺菌(Halorhodospira halophila)；作为分类在黄单 胞菌属(Xanthomonas)的微生物，特别优选野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonasaxonopodis)、水稻黄单胞菌 (Xanthomonas oryzae)、白纹黄单胞菌(Xanthomonasalbilineans)及柑橘黄 单胞菌(Xanthomonas citri)；作为分类在寡养单胞菌属(Stenotrophomonas) 的微生物，特别优选嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)；作 为分类在假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)的微生物，特别优选水原假黄 色单胞菌(Pseudoxanthomonas suwonensis)及枣褐色假黄色单胞菌(Pseudoxanthomonas spadix)；作为分类在弗郎西斯氏菌属(Francisella)的 微生物，特别优选土拉热弗郎西斯氏菌(Francisella tularensis)及新凶手弗郎 西斯氏菌(Francisella novicida)；作为分类在解环菌属(Cycloclasticus)的微 生物，特别优选Cycloclasticus zancles；作为分类在河氏菌属(Hahella)的微 生物，特别优选济州岛河氏菌(Hahella chejuensis)；作为分类在盐单胞菌属 (Halomonas)的微生物，特别优选伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)；作 为分类在食烷菌属(Alcanivorax)的微生物，特别优选泊库岛食烷菌 (Alcanivorax borkumensis)及柴油食烷菌(Alcanivoraxdieselolei)；作为分 类在康氏菌属(Kangiella)的微生物，特别优选韩国康氏菌(Kangiella koreensis)；作为分类在固氮菌属(Azotobacter)的微生物，特别优选瓦恩兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)；作为分类在嗜冷杆菌属(Psychrobacter) 的微生物，特别优选北极嗜冷杆菌(Psychrobacter arcticus)及盐晶嗜冷杆菌 (Psychrobactercryohalolentis)；作为分类在别样谢瓦氏菌属(Alishewanella) 的微生物，特别优选发酵海鲜异希瓦氏菌(Alishewanella jeotgali)；作为分类 在交替单胞菌属(Alteromonas)的微生物，特别优选麦氏交替单胞菌 (Alteromonas macleodii)；作为分类在冰居菌属(Glaciecola)的微生物，特 别优选脱氮冰居菌(Glaciecola nitratireducens)、嗜冷冰居菌(Glaciecola psychrophila)及浅粉红色冰居菌(Glaciecola punicea)；作为分类在海杆状菌 属(Marinobacter)的微生物，特别优选水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)、除烃海杆状菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)、粘着海杆状菌 (Marinobacteradhaerens)、栖藻海杆状菌(Marinobacter algicola)及锰氧化 海杆状菌(Marinobactermanganoxydans)；作为分类在海杆菌属 (Marinobacterium)的微生物，特别优选斯氏海杆菌(Marinobacterium stanieri)； 作为分类在噬糖菌属(Saccharophagus)的微生物，特别优选降解糖噬糖菌 (Saccharophagus degradans)；作为分类在铁还原单胞菌属(Ferrimonas)的 微生物，特别优选Ferrimonas balearica；作为分类在源海菌属(Idiomarina)的 微生物，特别优选罗伊赫源海菌(Idiomarina loihiensis)及波罗的海源海菌(Idiomarina baltica)；作为分类在科维尔氏菌属(Colwellia)的微生物，特 别优选冷红科维尔氏菌(Colwellia psychrerythraea)；作为分类在假交替单胞 菌属(Pseudoalteromonas)的微生物，特别优选游海假交替单胞菌 (Pseudoalteromonashaloplanktis)、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)及长衫假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tunicata)；作为分类在弧 菌属(Vibrio)的微生物，特别优选副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、 创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、弗氏弧菌(Vibrio furnissii)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、锡那罗州弧菌(Vibrio sinaloensis)、 轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)、东方弧菌(Vibrioorientalis)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、解珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、Vibrio caribbenthicus、巴西弧 菌(Vibrio brasiliensis)及解藻酸弧菌(Vibrioalginolyticus)；作为分类在发 光杆菌属(Photobacterium)的微生物，特别优选深层发光杆菌(Photobacterium profundum)；作为分类在气单胞菌属(Aeromonas)的微生物，特别优选嗜水 气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida) 及维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)；作为分类在盐水球形菌属(Salinisphaera) 的微生物，特别优选深层盐水球形菌(Salinisphaera shabanensis)；作为分类 在军团菌属(Legionella)的微生物，特别优选嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)及长滩军团菌(Legionella longbeachae)；作为分类在考克斯氏 体属(Coxiella)的微生物，特别优选伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)； 作为分类在脱硫球菌属(Desulfococcus)的微生物，特别优选食油脱硫球菌 (Desulfococcus oleovorans)；作为分类在脱硫杆菌属(Desulfobacterium)的 微生物，特别优选自养脱硫杆菌(Desulfobacteriumautotrophicum)；作为分 类在脱硫酸盐杆菌属(Desulfatibacillum)的微生物，特别优选食烃烯脱硫酸 盐杆菌(Desulfatibacillum alkenivorans)；作为分类在脱硫盒菌属(Desulfobulbus)的微生物，特别优选丙酸脱硫盒菌(Desulfobulbus propionicus)；作为分类在脱硫盒菌属(Desulfarculus)的微生物，特别优选 巴氏脱硫盒菌(Desulfarculusbaarsii)；作为分类在地杆菌属(Geobacter)的 微生物，特别优选金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)、还原铀地杆 菌(Geobacter uraniireducens)及伯米吉地杆菌(Geobacter bemidjiensis)；作 为分类在互营杆菌属(Syntrophobacter)的微生物，特别优选氧化延胡奈酸互 营杆菌(Syntrophobacter fumaroxidans)；作为分类在共养菌属(Syntrophus) 的微生物，特别优选食酸共养菌(Syntrophus aciditrophicus)；作为分类在脱 硫念珠菌属(Desulfomonile)的微生物，特别优选蒂氏脱硫念珠菌(Desulfomonile tiedjei)；作为分类在蛭弧菌属(Bdellovibrio)的微生物，特 别优选食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)及Bdellovibrio exovorus；作为 分类在噬菌属(Bacteriovorax)的微生物，特别优选海洋噬菌(Bacteriovorax marinus)；作为分类在标桩菌属(Stigmatella)的微生物，特别优选橙色标桩 菌(Stigmatella aurantiaca)；作为分类在黏球菌属(Myxococcus)的微生物， 特别优选橙黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)及微红黄色黏球菌(Myxococcus fulvus)；作为分类在厌氧黏杆细菌属(Anaeromyxobacter)的微生物，特别 优选脱卤厌氧黏杆细菌(Anaeromyxobacterdehalogenans)；作为分类在堆囊 菌属(Sorangium)的微生物，特别优选纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)； 作为分类在海无柄孢囊黏细菌属(Haliangium)的微生物，特别优选苍黄海无 柄孢囊黏细菌(Haliangium ochraceum)；作为分类在酸杆菌属(Acidobacterium) 的微生物，特别优选荚膜酸杆菌(Acidobacterium capsulatum)；作为分类在 短链小球菌属(Granulicella)的微生物，特别优选Granulicella tundricola；作为分类在水沉积物杆菌属(Ilumatobacter)的微生物，特别优选Ilumatobactercoccineum；作为分类在链孢囊菌属(Streptosporangium)的微生物，特别优选 玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)；作为分类在拟诺卡氏菌属 (Nocardiopsis)的微生物，特别优选达氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)；作为分类在喜热裂孢菌属(Thermobifida)的微生物，特别优 选褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)；作为分类在高温单孢菌属 (Thermomonospora)的微生物，特别优选弯曲高温单胞菌(Thermomonosporacurvata)；作为分类在假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的微生物，特别优选 食二氯杂环己烷假诺卡氏菌(Pseudonocardia dioxanivorans)；作为分类在拟 无枝酸菌属(Amycolatopsis)的微生物，特别优选地中海拟无枝酸菌 (Amycolatopsismediterranei)；作为分类在糖单孢菌属(Saccharomonospora) 的微生物，特别优选绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)及新疆糖单孢 菌(Saccharomonosporaxinjiangensis)；作为分类在糖多孢菌属 (Saccharopolyspora)的微生物，特别优选红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)及刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)；作为分类在嗜热双孢 菌属(Thermobispora)的微生物，特别优选双孢嗜热双孢菌(Thermobispora bispora)；作为分类在束丝放线菌属(Actinosynnema)的微生物，特别优选 奇迹束丝放线菌(Actinosynnema mirum)；作为分类在小单孢菌属 (Micromonospora)的微生物，特别优选橙色小单孢菌(Micromonospora aurantiaca)；作为分类在盐水孢菌属(Salinispora)的微生物，特别优选热带 盐水孢菌(Salinispora tropica)及栖沙盐水孢菌(Salinispora arenicola)；作为 分类在疣孢菌属(Verrucosispora)的微生物，特别优选海洋疣孢菌 (Verrucosispora maris)；作为分类在韩国生工菌属(Kribbella)的微生物， 特别优选苍黄韩国生工菌(Kribbella flavida)；作为分类在棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，特别优选约-卡二氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)、解脲棒杆菌(Corynebacterium urealyticum)、解谷氨酸棒杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)、解氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes) 及克氏棒杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii)；作为分类在诺卡氏菌属 (Nocardia)的微生物，特别优选皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、巴西诺 卡氏菌(Nocardia brasiliensis)及圣乔治教堂诺卡氏菌(Nocardia cyriacigeorgica)；作为分类在戈登氏菌属(Gordonia)的微生物，特别优选支气 管戈登氏菌(Gordonia bronchialis)、Gordonia neofelifaecis及土地戈登氏菌 (Gordonia terrae)；作为分类在迪茨氏菌属(Dietzia)的微生物，特别优选肉桂 色迪茨氏菌(Dietzia cinnamea)；作为分类在分支杆菌属(Mycobacterium) 的微生物，特别优选结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支杆 菌(Mycobacteriumbovis)、麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)、鸟分支 杆菌(Mycobacterium avium)、耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)、 溃疡分支杆菌(Mycobacterium ulcerans)、范巴伦氏分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)、浅黄分支杆菌(Mycobacterium gilvum)、脓肿分支杆菌 (Mycobacterium abscessus)、海分支杆菌(Mycobacterium marinum)、马赛分支杆菌(Mycobacterium massiliense)、草分支杆菌(Mycobacterium phlei)、 抗热分支杆菌(Mycobacterium thermoresistibile)、托斯卡纳分支杆菌 (Mycobacteriumtusciae)、蟾分支杆菌(Mycobacterium xenopi)及罗得西亚 分支杆菌(Mycobacteriumrhodesiae)；作为分类在分枝菌酸球菌属 (Amycolicicoccus)的微生物，特别优选微黄分枝菌酸球菌(Amycolicicoccus subflavus)；作为分类在束村氏菌属(Tsukamurella)的微生物，特别优选稍 变束村氏菌(Tsukamurella paurometabola)；作为分类在慢反应脂肪酸菌属 (Segniliparus)的微生物，特别优选光滑慢反应脂肪酸菌(Segniliparusrotundus)、；作为分类在小杆菌属(Microbacterium)的微生物，特别优选砖 红色小杆菌(Microbacterium testaceum)；作为分类在微球菌属(Micrococcus) 的微生物，特别优选藤黄微球菌(Micrococcus luteus)；作为分类在节杆菌属 (Arthrobacter)的微生物，特别优选研究团队节杆菌(Arthrobacter arilaitensis)、 氯酚节杆菌(Arthrobacterchlorophenolicus)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)及食菲节杆菌(Arthrobacter phenanthrenivorans)；作为分类在肾 杆菌属(Renibacterium)的微生物，特别优选鲑亚科肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)；作为分类在考克氏菌属(Kocuria)的微生物，特别优选嗜根 考克氏菌(Kocuria rhizophila)；作为分类在皮肤球菌属(Kytococcus)的微 生物，特别优选丛皮肤球菌(Kytococcus sedentarius)；作为分类在纤维单胞 菌属(Cellulomonas)的微生物，特别优选粪纤维单胞菌(Cellulomonasfimi)； 作为分类在间孢囊菌属(Intrasporangium)的微生物，特别优选秃裸间孢囊菌(Intrasporangium calvum)；作为分类在丝氨酸球菌属(Serinicoccus)的微生 物，特别优选丝氨酸球菌(Serinicoccus profundi)；作为分类在弗兰克氏菌属 (Frankia)的微生物，特别优选桤木弗兰克氏菌(Frankia alni)；作为分类在 热酸菌属(Acidothermus)的微生物，特别优选解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)；作为分类在中村氏菌属(Nakamurella)的微生物，特别优选 多裂中村氏菌(Nakamurella multipartita)；作为分类在地嗜皮菌属 (Geodermatophilus)的微生物，特别优选昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilus obscurus)；作为分类在斯塔克布朗氏菌属(Stackebrandtia)的微生物，特别 优选拿骚斯塔克布朗氏菌(Stackebrandtia nassauensis)；作为分类在细小链孢菌属(Catenulispora)的微生物，特别优选嗜酸细小链孢菌(Catenulispora acidiphila)；作为分类在红色杆形菌属(Rubrobacter)的微生物，特别优选喜 木聚糖(Rubrobacterxylanophilus)；作为分类在束缚菌属(Conexibacter)的微 生物，特别优选伍氏束缚菌(Conexibacter woesei)；作为分类在大洋芽孢杆 菌属(Oceanobacillus)的微生物，特别优选伊平屋桥大洋芽孢杆菌 (Oceanobacillus iheyensis)；作为分类在赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus) 的微生物，特别优选球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)；作为 分类在喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)的微生物，特别优选嗜盐喜盐芽孢杆菌 (Halobacillus halophilus)；作为分类在脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus) 的微生物，特别优选酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)； 作为分类在属(Kyrpidia)的微生物，特别优选(Kyrpidia tusci)；作为分类 在短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的微生物，特别优选桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)；作为分类在乳杆菌属(Lactobacillus)的微生物， 特别优选布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)；作为分类在梭菌属(Clostridium) 的微生物，特别优选丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、产气荚膜 梭菌(Clostridiumperfringens)、科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、噬细胞梭 菌(Clostridiumcellulovorans)、艰难梭菌(Clostridium difficile)及斯氏梭菌 (Clostridiumsticklandii)；作为分类在嗜碱菌属(Alkaliphilus)的微生物， 特别优选金属还原嗜碱菌(Alkaliphilus metalliredigens)及奥氏嗜碱菌 (Alkaliphilus oremlandii)；作为分类在共养单胞菌属(Syntrophomonas)的 微生物，特别优选沃氏共养单胞菌(Syntrophomonaswolfei)；作为分类在互 养栖热菌属(Syntrophothermus)的微生物，特别优选脂肪酸特异互养栖热菌 (Syntrophothermus lipocalidus)；作为分类在真杆菌属(Eubacterium)的微生物，特别优选直肠真杆菌(Eubacterium rectale)及黏液真杆菌(Eubacteriumlimosum)；作为分类在脱亚硫酸杆菌属(Desulfitobacterium)的微生物，特 别优选哥本哈根脱亚硫酸杆菌(Desulfitobacterium hafniense)；作为分类在脱 硫肠状菌属(Desulfotomaculum)的微生物，特别优选还原脱硫肠状菌 (Desulfotomaculumreducens)；作为分类在暗色厌氧香肠状菌属 (Pelotomaculum)的微生物，特别优选丙酸盐暗色厌氧香肠状菌 (Pelotomaculum thermopropionicum)；作为分类在丁酸弧菌属(Butyrivibrio) 的微生物，特别优选解解朊丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)；作为分 类在罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)的微生物，特别优选人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)；作为分类在颤螺旋菌属(Oscillibacter)的微生物，特 别优选产戊酸颤螺旋菌(Oscillibacter valericigenes)；作为分类在热厌氧杆状 菌属(Thermoanaerobacter)的微生物，特别优选腾冲嗜热厌氧杆菌 (Thermoanaerobactertengcongensis)；作为分类在一氧化碳嗜热菌属 (Carboxydothermus)的微生物，特别优选生氢一氧化碳嗜热菌 (Carboxydothermus hydrogenoformans)；作为分类在需碱厌氧菌属(Natranaerobius)的微生物，特别优选嗜热需碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)；作为分类在束缚杆菌属(Haliscomenobacter)的微生物，特别 优选水束缚杆菌(Haliscomenobacter hydrossis)；作为分类在卟啉单胞菌属 (Porphyromonas)的微生物，特别优选牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)及不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonas asaccharolytica)；作为分类 在臭气杆菌属(Odoribacter)的微生物，特别优选内脏臭气杆菌(Odoribacter splanchnicus)；作为分类在螺状菌属(Spirosoma)的微生物，特别优选舌螺 状菌(Spirosoma linguale)；作为分类在古字状菌属(Runella)的微生物，特 别优选飘软古字状菌(Runella slithyformis)；作为分类在奇异球菌属(Deinococcus)的微生物，特别优选耐放射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)、热泉奇异球菌(Deinococcus geothermalis)、沙漠奇异球菌 (Deinococcus deserti)、马里科帕部落奇异球菌(Deinococcus maricopensis)、 解蛋白奇异球菌(Deinococcusproteolyticus)及戈壁奇异球菌(Deinococcus gobiensis)；作为分类在栖热菌属(Thermus)的微生物，特别优选嗜热栖热 菌(Thermus thermophilus)、Thermusagnaticus、黄栖热菌(Thermus flavus)、 编码栖热菌(Thermus caldophilus)、红色栖热菌(Thermus ruder)及水管致黑栖热 菌(Thermus scotoductus)；作为分类在稍栖热菌属(Meiothermus)的微生物， 特别优选红色稍栖热菌(Meiothermus ruber)及席氏稍栖热菌(Meiothermus silvanus)；作为分类在大洋栖热菌属(Oceanithermus)的微生物，特别优选深层大洋栖热菌(Oceanithermus profundus)；作为分类在海栖热菌属 (Marinithermus)的微生物，特别优选热液口海栖热菌(Marinithermus hydrothermalis)；作为分类在出芽单胞菌属(Gemmatimonas)的微生物，特 别优选橙色出芽单胞菌(Gemmatimonasaurantiaca)；作为分类在梭杆菌属 (Fusobacterium)的微生物，特别优选具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)； 作为分类在泥杆菌属(Ilyobacter)的微生物，特别优选多养型泥杆菌(Ilyobacter polytropus)；作为分类在玫瑰弯菌属(Roseiflexus)的微生物，特别优选卡氏玫 瑰弯菌(Roseiflexus castenholzii)；作为分类在滑柱菌属(Herpetosiphon)的 微生物，特别优选橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus)；作为分类在热微 菌属(Thermomicrobium)的微生物，特别优选玫瑰色热微菌(Thermomicrobiumroseum)；作为分类在热袍菌属(Thermotoga)的微生物，特别优选莱廷格热 袍菌(Thermotoga lettingae)；作为分类在栖热腔菌属(Thermosipho)的微生 物，特别优选美拉尼西亚栖热腔菌(Thermosipho melanesiensis)及非洲栖热 腔菌(Thermosiphoafricanus)；作为分类在高温杆菌属(Fervidobacterium) 的微生物，特别优选多节高温杆菌(Fervidobacterium nodosum)；作为分类在 脱铁杆菌属(Deferribacter)的微生物，特别优选还原硫栖脱铁杆菌 (Deferribacter desulfuricans)；作为分类在热土弧菌属(Calditerrivibrio)的 微生物，特别优选硝酸盐还原热土弧菌(Calditerrivibrionitroreducens)；作为 分类在弯枝菌属(Flexistipes)的微生物，特别优选红海弯枝菌(Flexistipes sinusarabici)；作为分类在生金球菌属(Metallosphaera)的微生物，特别优选 勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)；作为分类在气火菌属(Aeropyrum) 的微生物，特别优选敏捷气火菌(Aeropyrum pernix)；作为分类在热棒菌属 (Pyrobaculum)的微生物，特别优选需氧热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、 岛屿热棒菌(Pyrobaculumislandicum)、热泉热棒菌(Pyrobaculum calidifontis) 及Pyrobaculum neutrophilum；作为分类在高温分枝菌属(Caldivirga)的微生 物，特别优选马基灵山高温分枝菌(Caldivirga maquilingensis)；作为分类在 火山热泉杆菌属(Vulcanisaeta)的微生物，特别优选散布火山热泉杆菌 (Vulcanisaeta distributa)；作为分类在酸叶菌属(Acidilobus)的微生物，特 别优选噬糖酸叶菌(Acidilobus saccharovorans)；作为分类在盐盒菌属 (Haloarcula)的微生物，特别优选死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)；作为分类在盐方形菌属(Haloquadratum)的微生物，特别优选瓦氏盐方形菌(Haloquadratumwalsbyi)；作为分类在嗜盐碱单孢菌属(Natronomonas)的 微生物，特别优选法老嗜盐碱单孢菌(Natronomonas pharaonis)；作为分类在 盐红菌属(Halorubrum)的微生物，特别优选湖渊盐红菌(Halorubrum lacusprofundi)；作为分类在盐土生古菌属(Haloterrigena)的微生物，特别优 选土库曼盐土生古菌(Haloterrigena turkmenica)；作为分类在无色需碱菌属 (Natrialba)的微生物，特别优选马加蒂湖无色需碱菌(Natrialba magadii)； 作为分类在盐碱球菌属(Halalkalicoccus)的微生物，特别优选咸海鲜盐碱球 菌(Halalkalicoccus jeotgali)；作为分类在盐几何形菌属(Halogeometricum) 的微生物，特别优选波多黎各盐几何形菌(Halogeometricum borinquense)； 作为分类在热原体属(Thermoplasma)的微生物，特别优选嗜酸热原体 (Thermoplasma acidophilum)及火山热原体(Thermoplasma volcanium)；作 为分类在嗜酸古菌属(Picrophilus)的微生物，特别优选干热嗜酸古菌 (Picrophilus torridus)；作为分类在亚铁原体属(Ferroplasma)的微生物，特 别优选Ferroplasma acidarmanus；作为分类在古生球菌属(Archaeoglobus)的微生物，特别优选闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)及混毒古生球菌(Archaeoglobus veneficus)；作为分类在铁古球菌属(Ferroglobus)的微生物， 特别优选和平铁古球菌(Ferroglobus placidus)；作为分类在多形体属 (Polymorphum)的微生物，特别优选Polymorphum gilvum；作为分类在云母 弧菌属(Micavibrio)的微生物，特别优选铜绿云母弧菌(Micavibrio aeruginosavorus)；作为分类在多贺氏菌属(Simiduia)的微生物，特别优选 食藻多贺氏菌属(Simiduia agarivorans)；作为分类在纤发菌属(Leptothrix) 的微生物，特别优选霍氏纤发菌(Leptothrix cholodnii)；作为分类在硫单胞 菌属(Thiomonas)的微生物，特别优选中间硫单胞菌(Thiomonas intermedia)； 作为分类在红长命菌属(Rubrivivax)的微生物，特别优选胶状红长命菌 (Rubrivivaxgelatinosus)；作为分类在甲基养菌属(Methylibium)的微生物， 特别优选喜石甲基养菌(Methylibium petroleiphilum)；作为分类在厌氧球菌 属(Anaerococcus)的微生物，特别优选普氏厌氧球菌(Anaerococcus prevotii)。
[真核生物的优选目]
属于真核生物的微生物，可以列举属于散囊菌目(Eurotiales)、酵母目(Saccharomycetales)、煤炱目(Capnodiales)、格孢腔菌目(Pleosporales)、 黑粉菌目(Ustilaginales)、银耳目(Tremellales)、目(Cystofilobasidiales)、 柔膜菌目(Helotiales)、盘菌目(Pezizales)、多孔菌目(Polyporales)、伞 菌目(Agaricales)、柄锈菌目(Pucciniales)、巨座壳目(Magnaporthales)、 粪壳菌目(Sordariales)、小囊菌目(Microascales)、肉座菌目(Hypocreales)、 锁掷酵母目(Sporidiobolales)、外担菌目(Exobasidiales)、马拉色菌目 (Malasseziales)、爪甲团囊菌目(Onygenales)、虫囊菌目(Laboulbeniales) 及毛霉菌目(Mucorales)的微生物。
此外，实验上确认能够生成甲基丙烯酸衍生物的特别优选微生物为属于散 囊菌目(Eurotiales)及酵母目(Saccharomycetales)的微生物。
[真核生物的优选科及属]
作为分类在煤炱目(Capnodiales)的微生物可以例举球腔菌属(Mycosphaerella)、接瓶霉属(Zygophiala)、Zymoseptoria属、枝孢属 (Cladosporium)及煤炱菌属(Capnodium)；作为分类在格孢腔菌目 (Pleosporales)的微生物，可以列举光黑壳属(Preussia)、短枝霉属 (Brachycladium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、格孢腔菌属(Pleospora)、 格孢腔菌属(Pleospora)、小球腔霉属(Leptosphaeria)、小光壳属(Leptosphaerulina)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria)及核腔菌属(Pyrenophora)； 作为分类在黑粉菌目(Ustilaginales)的微生物，可以列举圆核腔菌属 (Pseudozyma)、球黑粉霉属(Tolyposporium)及黑粉菌属(Ustilago)；作 为分类在银耳目(Tremellales)的微生物，可以列举布勒担孢酵母属 (Bulleromyces)、线黑粉菌(隐球菌)属(Filobasidiella(Cryptococcus))、 布勒掷孢酵母属(Bullera)、Fellomyces属、考克娃酵母属(Kockovaella)及 丝孢酵母属(Trichosporon)；作为分类在Cystofilobasidiales目微生物可以列 举木拉克酵母属(Mrakia)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)及Udeniomyces属；作为分类在柔膜菌目(Helotiales)的微生物，可以列举葡萄孢盘菌属 (Botryotinia)、念珠菌属(Monilia)、链核盘菌属(Monilinia)及核盘菌属 (Sclerotinia)；作为分类在盘菌目(Pezizales)的微生物，可以列举盘菌属(Peziza)、羊肚菌属(Morchella)、马鞍菌属(Helvella)、瓶束霉属(Ascodesmis)、 属(Ascobolus)及块菌属(Tuber)；作为分类在多孔菌目(Polyporales)的 微生物，可以列举类齿菌属(Mycoleptodonoides)、Mycoaciella属、帕氏孔 菌属(Parmastomyces)及泊氏孔菌属(Postia)；作为分类在伞菌目(Agaricales)的微生物，可以列举Arthromyces属、Mycenoporella属、蜡蘑属(Laccaria)、 属(Moniliophthora)、鬼伞属(Coprinopsis)及裂褶菌属(Schizophyllum)； 作为分类在柄锈菌目(Pucciniales)的微生物，可以列举柄锈菌属(Puccinia)、 栅锈菌属(Melampsora)、柱锈菌属(Cronartium)、瘿果盘菌属(Cyttaria)、 鞘锈菌属(Coleosporium)、囊孢锈菌属(Blastospora)及伞锈菌属(Ravenelia)； 作为分类在长喙壳菌目(Magnaporthales)的微生物，可以列举巨座壳属 (Magnaporthe)；作为分类在粪壳菌目(Sordariales)的微生物，可以列举柄 孢壳菌属(Podospora)、链孢霉属(Neurospora)、粪壳菌属(Sordaria)、 毛壳菌属(Chaetomium)、梭孢壳属(Thielavia)、毁丝霉属(Myceliophthora) 及Monotosporella属；作为分类在小囊菌目(Microascales)的微生物，可以列 举小囊菌属(Microascus)、Nodulosphaeria属、Okeanomyces属及长喙壳属 (Ceratocystis)；作为分类在肉座菌目(Hypocreales)的微生物，可以列举镰 孢菌属(Fusarium)、丛赤壳属(Nectria)、肉座菌属(Hypocrea)、菌寄生 属(Hypomyces)、木霉菌属(Trichoderma)、虫草菌属(Cordyceps)、麦 角菌属(Claviceps)及枝顶孢属(Acremonium)；作为分类在锁掷酵母目 (Sporidiobolales)的微生物，可以列举红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红 酵母属(Rhodotorula)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)属及掷孢酵母属 (Sporobolomyces)；作为分类在外担菌目(Exobasidiales)的微生物，可以 列举果黑粉菌属(Graphiola)、外担菌属(Exobasidium)及腐霉属 (Dicellomyces)；作为分类在马拉色菌目(Malasseziales)的微生物，可以列 举马拉色菌属(Malassezia)；作为分类在爪甲团囊菌目(Onygenales)的微生物，可以列举裸子囊菌(Gymnoascus)属、单囊霉属(Eremascus)、节皮 菌属(Arthroderma)、球孢子菌属(Coccidioides)、副球孢子菌属 (Paracoccidioides)、Uncinocarpus属、毛癣菌属(Trichophyton)及阿耶罗菌 属(Ajellomyces)；作为分类在虫囊菌目(Laboulbeniales)的微生物，可以 列举刺菌属(Rhachomyces)、虫生菌属(Rickia)、点菌属(Stigmatomyces) 及角霉属(Ceratomyces)；作为分类在毛霉菌目(Mucorales)的微生物，可以列 举犁头霉属(Absidia)、毛霉属(Mucor)、根毛霉属(Rhizomucor)及根霉 属(Rhizopus)的微生物。
作为分类在散囊菌目(Eurotiales)的微生物，可以列举新石座菌属(Neopetromyces)、曲霉属(Aspergillus)、新萨托菌属(Neosartorya)、丝 衣霉属(Byssochlamys)、裸胞壳属(Emericella)、正青霉属(Eupenicillium)、 散囊菌属(Eurotium)、半内果菌属(Hemicarpenteles)、青霉属(Penicillium)、 篮状菌属(Talaromyces)及红曲菌属(Monascus)。
作为分类在酵母目(Saccharomycetales)的微生物，可以列举节囊酵母属(Arthroascus)、季氏酵母属(Guilliermondella)、棒孢酵母属(Clavispora)、 梅奇酵母属(Metschnikowia)、油脂酵母属(Lipomyces)、内孢霉属属 (Endomyces)、浆毒属(Ascoidea)、Cephaloascus属、拟威克酵母属 (Wickerhamiella)、囊酵母属(Zygoascus)、Trichomonascus属、芽孢酵母 属(Aciculoconidium)、针芽孢酵母属(Ambrosiozyma)、Blastobotrys属、 Botryozyma属、酒香酵母属(Brettanomyces)、Myxozyma属、Ogataea属、Komagataella属、三角酵母属(Trigonopsis)、裂芽酵母属(Schizoblastosporion) 及合轴酵母属(Sympodiomyces)。此外，属于酵母目(Saccharomycetales) 的微生物中，优选的微生物，可以列举作为分类在类酵母科 (Saccharomycodaceae)、Pichiaceae、双足囊菌科(Dipodascaceae)及丝分孢 子酵母目的微生物。属于该科的微生物，可以列举有孢汉逊酵母 (Hanseniaspora)属、克勒克酵母属(Kloeckera)、类酵母属(Saccharomycodes)、 拿逊酵母属(Nadsonia)、阿舒囊霉属(Ashbya)、固囊酵母属(Citeromyces)、 德克酵母属(Dekkera)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、酵母属(Saccharomyces)、 Saturnispora属、Tetrapisispora属、有孢圆酵母属(Torulaspora)、接合酵母属 (Zygosaccharomyces)、接合囊孢菌属(Zygotorulaspora)、假囊酵母属 (Eremothecium)、Lachancea属、范氏酵母属(Vanderwaltozyma)、 Naumovozyma属、酿酒酵母属(Kazachstania)、假囊酵母属(Eremothecium)、 拟威尔酵母属(Williopsis)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、 双足囊菌属(Dipodascus)、Arxula属、半乳糖霉菌属(Galactomyces)、地 丝菌属(Geotrichum)、Babjevia属、德巴利酵母属(Debaryomyces)、许旺 酵母属(Schwanniomyces)、Priceomyces属、Yamadazyma属、木糖发酵酵母 属(Scheffersomyces)、Meyerozyma属、路德酵母属(Lodderomyces)、原 孢酵母属(Sporopachydermia)及假丝酵母属(Candida)。
属于真核生物的其他属可以列举葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)、 Helicomyces属、短梗霉属(Aureobasidium)、壳月孢属(Selenophoma)、黑 斑黑粉菌属(Melanotaenium)、Otospora属、球囊霉属(Glomus)、异水霉 属(Allomyces)、根前毛菌属(Rhizidiomyces)、丝壶菌属(Hyphochytrium)、 裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、线黑粉酵母属(Filobasidium)、散斑壳 属(Lophodermium)、座囊菌属(Dothidea)、粉孢霉属(Oidium)、芽枝霉 属(Amorphotheca)、柱顶孢属(Scytalidium)、外囊菌属(Taphrina)、Strangospora 属、壶菌属(Chytridium)、肺炎菌属(Pneumocystis)、小菌核属(Sclerotium)、 粒毛盘菌属(Neolecta)、隔担菌属(Septobasidium)、炭角菌属(Xylaria)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、拟茎点霉属(Phomopsis)、Sydowiella属、Coniochaetidium属、分支孢菌属(Sporothrix)、Moleospora属、轮枝菌属(Verticillium)、小囊菌属(Microascales)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、微 座孢属(Microstroma)属及破囊壶菌属(Thraustochytrium)。
其中，优选的微生物为被指出具有支链氨基酸代谢途径中的酶且作为分类 在属(Zymoseptoria)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria)、圆核腔菌属(Pseudozyma)、 黑粉菌属(Ustilago)、阿舒囊霉属(Ashbya)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、 酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、德巴利酵母属 (Debaryomyces)、属(Scheffersomyces)、属(Meyerozyma)、路德酵母属 (Lodderomyces)、假丝酵母属(Candida)、线黑粉菌(隐球菌)属(Filobasidiella (Cryptococcus))、葡萄孢盘菌属(Botryotinia)、核盘菌属(Sclerotinia)、 块菌属(Tuber)、属(Postia)、蜡蘑属(Laccaria)、属(Moniliophthora)、 鬼伞属(Coprinopsis)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柄锈菌属(Puccinia)、 属(Magnaporthe)、柄孢壳菌属(Podospora)、链孢霉属(Neurospora)、粪壳菌属(Sordaria)、梭孢壳属(Thielavia)、毁丝霉属(Myceliophthora)、 镰孢菌属(Fusarium)、丛赤壳属(Nectria)、马拉色菌属(Malassezia)、 曲霉属(Aspergillus)、新萨托菌属(Neosartorya)、节皮菌属(Arthroderma)、 球孢子菌属(Coccidioides)、副球孢子菌属(Coccidioides)、属(Uncinocarpus)、 毛癣菌属(Trichophyton)及属(Ajellomyces)的微生物。
外，实验上确认能够生成甲基丙烯酸衍生物的特别优选微生物为作为分 类在酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)及曲霉属(Aspergillus) 的微生物。
[真核生物的优选种]
〔酵母属〕
类于酵母(Saccharomyces)属的微生物，可以列举例如巴奈特酵母(Saccharomyces barnettii)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、贝酵母葡萄 汁变种(Saccharomyces bayanus var.uvarum)、布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)、博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi)、里约酵母(Saccharomyces cariocanus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、芽殖酵母(Saccharomyces castellii)、葡萄酒酵母(Saccharomyces dairenensis)、淀粉酶酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)、湖北克鲁维酵母(Saccharomyces humaticus)、克鲁弗酵母 (Saccharomyces kluyveri)、库德里阿兹威酵母(Saccharomyces kudriavzevii)、 Saccharomyces kunashirensis、摩纳酵母(Saccharomyces martiniae)、粟酒裂 殖酵母(Saccharomyces mikatae)、Saccharomycesnaganishii、Saccharomyces novalvarietatis、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴斯德酵母 (Saccharomyces pastorianus)、Saccharomyces rosinii、鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)、星状酵母(Saccharomyces stellatus)、斯维兹酵母(Saccharomyces servazzii)、Saccharomyces spencerorum、特地酵母(Saccharomycestransvaalensis)、图列茨酵母(Saccharomyces turicensis)、Saccharomycesyakushimaensis var.yakushimaensis、单孢酵母(Saccharomyces unisporus)、葡 萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)等。
〔假丝酵母属〕
作为分类在假丝酵母(Candida)属的微生物，可以列举例如子囊菌类假 丝酵母(Candida aaseri)、非洲假丝酵母(Candida africana)、Candida aglyptinia、 Candidaagrestis、Candida akabanensis、Candida alai、白假丝酵母(Candida albicans)、子囊菌假丝酵母(Candida alishanica)、Candida allociferrii、Candida amapae、Candidaambrosiae、Candida amphixiae、Candida anatomiae、Candida ancudensis、Candidaandamanensis、Candida anglica、Candida anneliseae、Candida antillancae、Candidaanutae、蜜生假丝酵母(Candida apicola)、Candida apis、 Candida apis var.apis、Candida aquaetextoris、阿糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、Candidaarcana、Candida ascalaphidarum、亚洲假丝酵母 (Candida asiatica)、Candida atbi、Candida atakaporum、Candida athensensis、 大西洋假丝酵母(Candida atlantica)、Candida atmosphaerica、Candida auringiensis、Candida auris、Candida aurita、Candida austromarina、阿斯米假丝 酵母(Candida azyma)、Candidabarrocoloradensis、Candida batistae、必蔡假 丝酵母(Candida beechii)、Candidabertae、伯塞特假丝酵母(Candida berthetii)、 Candida bituminiphila、布莱克威尔假丝酵母(Candida blackwellae)、布朗克 假丝酵母(Candida blankii)、蟑虫郎假丝酵母(Candida blattae)、蜚蠊目假 丝酵母(Candida blattariae)、Candida bohiensis、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Candida bokatorum、菌生假丝酵母(Candidaboleticola)、Candida bolitotheri、博伊丁假丝酵母(Candida bombi)、槐糖脂菌假丝酵母(Candida bombicola)、伯氏假丝酵母(Candida bondarzewiae)、乳牛假丝酵母(Candidabovina)、Candida bribrorum、布伦氏假丝酵母(Candida brumptii)、Candidabuenavistaensis、Candida buinensis、Candida bullrunensis、奶酪假丝酵母(Candidabutyri)、可可假丝酵母(Candida cacaoi)、Candida canberraensis、卡塔尔假 丝酵母(Candida cantarellii)、腐木生假丝酵母(Candida cariosilignicola)、 赞斯托假丝酵母(Candida carpophila)、Candida caryicola、酪蛋白假丝酵母 (Candidacaseinolytica)、Candida castellii、Candida castrensis、链状假丝酵母 (Candidacatenulata)、解纤维假丝酵母(Candida cellulolytica)、(Candida cerambycidarum)、Candida chauliodes、Candida chickasaworum、智利假丝酵 母(Candida chilensis)、Candida chiropterorum、Candida choctaworum、Candida chrysomelidarum、苹果假丝酵母(Candida cidri)、西弗假丝酵母(Candida ciferrii)、Candida cleridarum、Candidacoipomensis、丘陵假丝酵母(Candida colliculosa)、Candida conglobata、Candidacorydali、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、Candida dajiaensis、Candidadanieliae、Candida davenportii、Candida davisiana、畸形假丝酵母(Candidadeformans)、Candida dendrica、Candida dendronema、Candida derodonti、Candidadeserticola、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensiae)、地格伯恩斯假丝酵母(Candidadigboiensis)、歧异假丝酵母 (Candida diversa)、Candida dosseyi、Candida drimydis、果蝇假丝酵母(Candida drosophilae)、杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)、Candidaeasanensis、谷 食假丝酵母(Candida edax)、Candida elateridarum、雅致假丝酵母(Candida elegans)、Candida emberorum、Candida endomychidarum、嗜虫假丝酵母(Candida entomophila)、Candida eppingiae、爱沙木属假丝酵母(Candida eremophlia)、Candida ergatensis、欧诺比假丝酵母(Candida ernobii)、埃切假丝酵母(Candidaetchellsii)、乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)、无名假丝酵母(Candida famata)、 无名假丝酵母原变种(Candida famata var.famata)、芬尼克假丝酵母(Candida fennica)、发酵假丝酵母(Candida fermentati)、Candida fermenticarens、弗 氏假丝酵母(Candidafloricola)、费氏假丝酵母(Candida fluviatilis)、子囊 菌假丝酵母(Candida fragi)、Candida fragicola、弗里思假丝酵母(Candida freyschussii)、弗氏假丝酵母(Candidafriedrichii)、Candida frijolensensis、 Candida fructus、Candida fukazawae、Candida fukuyamanensis、Candida fungicola、 Candida fusiformata、半乳假丝酵母(Candida galacta)、Candida galis、Candida gatunensis、Candida geochares、德国假丝酵母(Candida germanica)、加纳假 丝酵母(Candida ghanaensis)、Candidagigantensis、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、团假丝酵母(Candida glaebosa)、球形假丝酵母(Candida globosa)、 Candida glucosophila、Candida golubevii、Candidagorgasii、非产菌孢性子囊假 丝酵母(Candida gosingica)、后藤假丝酵母(Candidagotoi)、Candida gropengiesseri、Candida guaymorum、季也蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)、 黑马朗假丝酵母(Candida haemulonii)、Candida halonitratophila、嗜盐假丝酵 母(Candida halophila)、Candida hasegawae、希腊假丝酵母(Candidahellenica)、 霍氏假丝酵母(Candida holmii)、虫群假丝酵母(Candida homilentoma)、大麦假丝酵母(Candida hordei)、Candida hsintzibuensis、小假丝酵母(Candidahumilis)、匈牙利假丝酵母(Candida hungarica)、Candida hungchunana、异 常瑞斯特氏假丝酵母(Candida incommunis)、平常假丝酵母(Candida inconspicua)、大假丝酵母(Candida ingens)、虫生假丝酵母(Candida insectalens)、 昆虫假丝酵母(Candidainsectamans)、虫生假丝酵母(Candida insectorum)、 Candida insectosa、间型假丝酵母(Candida intermedia)、间型假丝酵母原变种 (Candida intermedia var.intermedia)、蕹菜假丝酵母(Candida ipomoeae)、 Candida ishiwadae、日本假丝酵母(Candidajaponica)、Candida jaroonii、Candida jeffriesii、Candida jianshihensis、鹫峰假丝酵母(Candida jiufengensis)、Candida kanchanaburiensis、高雄假丝酵母(Candidakaohsiungensis)、Candida karawaiewii、 Candida kashinagacola、Candida kazuoi、乳酒假丝酵母(Candida kefyr)、Candida khaoyaiensis、Candida khmerensis、甲府假丝酵母(Candida kofuensis)、Candida krabiensis、克瑞斯假丝酵母(Candida krissii)、克鲁伊假丝酵母(Candida kruisii)、 克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、克柔假丝酵母(Candida krusoides)、Candida kunorum、Candida kunwiensis、Candida labiduridarum、Candida lactis-condensi、 Candida laemsonensis、郎必可假丝酵母(Candidalambica)、Candida lassenensis、 麦芽糖假丝酵母(Candida laureliae)、Candidaleandrae、Candida lessepsii、 Candida levantina、Candida lidongshanica、木生假丝酵母(Candida lignicola)、 Candida lignohabitans、Candida lignophila、Candidalignosa、解脂假丝酵母 (Candida lipolytica)、Candida litsaeae、Candidallanquihuensis、罗德假丝酵 母(Candida lodderae)、卢迪亚纳假丝酵母(Candidalundiana)、葡萄牙假丝 酵母(Candida lusitaniae)、Candida lycoperdinae、Candidalyxosophila、Candida maesa、木兰假丝酵母(Candida magnoliae)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、 产甘露醇假丝酵母(Candida mannitofaciens)、海洋假丝酵母(Candida maris)、 滨海假丝酵母(Candida maritima)、Candida maxii、口津假丝酵母(Candida melibiosica)、梅林假丝酵母(Candida melinii)、膜醭假丝酵母(Candidamembranifaciens)、肠系膜假丝酵母(Candida mesenterica)、热带假丝酵母 (Candidametapsilosis)、Candida methanolovescens、Candida methanosorbosa、 甲醇同化假丝酵母(Candida methylica)、Candida michaelii、梅林假丝酵母 (Candida milleri)、莫格假丝酵母(Candida mogii)、Candida mokoenaii、 Candida molischiana、Candida montana、Candida morakotiae、Candida mucifera、 Candida multigemmis、芭蕉假丝酵母(Candidamusae)、Candida mycetangii、 Candida naeodendra、Candida nakhonratchasimensis、Candida nanaspora、纳塔 尔假丝酵母(Candida natalensis)、Candida neerlandica、奈莫假丝酵母(Candida nemodendra)、浮游假丝酵母(Candida neustonensis)、嗜硝假丝酵母(Candida nitrativorans)、嗜硝假丝酵母(Candida nitratophila)、Candidanodaensis、Candida nonsorbophila、挪威假丝酵母(Candida norvegensis)、诺维吉假丝酵母(Candida norvegica)、Candida novakii、钝状假丝酵母原变种(Candida obtusavar.obtusa)、 Candida odintsovae、橄榄假丝酵母(Candida oleophila)、橄榄假丝酵母(Candida olivae)、安大略假丝酵母(Candida ontarioensis)、Candida ooitensis、Candida orba、俄勒同假丝酵母(Candida oregonensis)、Candida orthopsilosis、Candida ortonii、卵状假丝酵母(Candida ovalis)、金龟子假丝酵母(Candidaoxycentoniae)、 Candida pallodes、抗草甘膦菌株假丝酵母(Candida palmioleophila)、Candida palmyrensis、帕鲁迪格拿假丝酵母(Candida paludigena)、巴拿马假丝酵母(Candida panamensis)、Candida panamericana、拟多形假丝酵母(Candidaparapolymorpha)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、近平滑假丝酵母 原变种(Candida parapsilosis var.parapsilosis)、近皱褶假丝酵母(Candida pararugosa)、Candida pattaniensis、清酒假丝酵母(Candida peltata)、Candida peoriaensis、Candida petrohuensis、滑假丝酵母(Candida phangngensis)、Candida picachoensis、Candida piceae、Candida pignaliae、Candida pimensis、Candida pini、 皮托假丝酵母(Candida pintolopesii)、皮托假丝酵母原变种(Candida pintolopesiivar.pintolopesii)、皮托假丝酵母史洛邦变种(Candida pintolopesii var.sloofiae)、Candida pinus、Candida plutei、多形假丝酵母(Candida polymorpha)、Candidapomiphila、Candida ponderosae、杨盘假丝酵母(Candida populi)、鲍氏假丝 酵母(Candida powellii)、Candida prachuapensis、洋丁香叶斑病假丝酵母 (Candidaprunicola)、Candida pseudoflosculorum、假球腺蔓假丝酵母(Candidapseudoglaebosa)、Candida pseudohaemulonii、拟间型假丝酵母(Candidapseudointermedia)、拟鹫峰假丝酵母(Candida pseudojiufengensis)、拟郎比 可假丝酵母(Candida pseudolambica)、Candida pseudovanderkliftii、嗜冷假丝 酵母(Candidapsychrophila)、铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)、螟蛾 假丝酵母(Candidapyralidae)、桔假丝酵母(Candida quercitrusa)、Candida quercuum、Candidarailenensis、Candida ralunensis、Candida ranongensis、Candida ratchasimensis、Candida restingae、Candida reversa、鹬虻假丝酵母(Candida rhagii)、Candidarobnettiae、皱褶菌膜假丝酵母(Candida rugopelliculosa)、 皱褶假丝酵母(Candidarugosa)、皱褶假丝酵母原变种(Candida rugosa var. rugosa)、Candida sagamina、齐藤假丝酵母(Candida saitoana)、清酒假丝酵 母(Candida sake)、萨地假丝酵母(Candidasalmanticensis)、Candida sanitii、 Candida santamariae、Candida santamariaevar.membranifaciens、Candida santamariae var.santamariae、Candidasantjacobensis、Candida sanyiensis、Candida saraburiensis、Candida savonica、沙塔夫假丝酵母(Candida schatavii)、Candida sekii、Candida sequanensis、Candidasergipensis、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、Candida shehatae var.insectosa、Candida shehatae var.lignosa、休哈 塔假丝酵母原变种(Candida shehataevar.shehatae)、Candida siamensis、思尔 娃假丝酵母(Candida silvae)、Candidasilvanorum、Candida silvatica、Candida silvicultrix、Candida sinolaborantium、Candida sithepensis、斯鲁菲假丝酵母 (Candida slooffiae)、Candida smagusa、Candida smithsonii、Candida sojae、 马铃薯假丝酵母(Candida solani)、Candidasolicola、Candida sonckii、Candida songkhlaensis、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candidasonorensis)、Candida sophiaereginae、Candida sorbophila、Candida sorbosa、Candidasorbosivorans、 山梨木糖假丝酵母(Candida sorboxylosa)、斯潘多维假丝酵母(Candidaspandovensis)、园球形假丝酵母(Candida sphaerica)、Candida stauntonica、 星形假丝酵母(Candida stellata)、Candida stellimalicola、Candida stri、Candidasucciphila、瑞典假丝酵母(Candida suecica)、素贴山假丝酵母(Candida suthepensis)、Candida suwanaritii、铃木假丝酵母(Candida suzukii)、高松假 丝酵母(Candidatakamatsuzukensis)、高田假丝酵母(Candida takata)、Candida taliae、Candidatammaniensis、Candida tannotolerans、Candida tanticharoeniae、Candidatanzawaensis、Candida taoyuanica、Candida tartarivorans、Candida temnochilae、纤细假丝酵母(Candida tenuis)、Candida tepae、Candida terebra、 Candida terraborum、Candida tetrigidarum、Candida thailandica、Candida thaimueangensis、Candidatheae、Candida thermophila、Candida tilneyi、Candida tolerans、Candida torresii、Candida tritomae、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、 热带假丝酵母原变种(Candidatropicalis var.tropicalis)、Candida trypodendroni、 Candida tsuchiyae、筑波假丝酵母(Candida tsukubaensis)、Candida tumulicola、 螨假丝酵母(Candida ulmi)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、越橘假丝酵母 (Candida vaccinii)、,瓦尔维亚假丝酵母(Candida valdiviana)、粗壮假丝酵 母(Candida valida)、Candida vanderwaltii、变异假丝酵母(Candida variabilis)、 Candida vartiovaarae、Candida veronae、易变假丝酵母(Candida versatilis)、 Candida vinaria、葡萄酒假丝酵母(Candida vini)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、Candida wancherniae、Candida wickerhamii、Candidawounanorum、 Candida wyomingensis、Candida xestobii、Candida xyloterini、Candidayuanshanicus、Candida yuchorum、Candida zemplinina、诞沫假丝酵母(Candidazeylanoides)、诞沫假丝酵母原变种(Candida zeylanoides var.zeylanoides)等。
〔曲霉属〕
作为分类在曲霉(Aspergillus)属的微生物，可以列举例如Aspergillusacanthosporus、Aspergillus acolumnaris、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、Aspergillus aeneus、Aspergillus affinis、阿拉曲霉(Aspergillus allahabadii)、 洋葱曲霉(Aspergillus alliaceus)、Aspergillus alutaceus、Aspergillus ambiguus、 阿姆斯特丹曲霉(Aspergillus amstelodami)、食淀粉曲霉(Aspergillus amylovorus)、Aspergillus anomalus、花束曲霉(Aspergillus anthodesmis)、 Aspergillus apica、Aspergillus appendiculatus、Aspergillus arenarius、糙孢曲霉 (Aspergillusasperescens)、无壳曲霉(Aspergillus athecius)、Aspergillus aurantiobrunneus、鲜橙曲霉(Aspergillus auratus)、鲜橙曲霉酸涩变种 (Aspergillus aureus var.acidus)、Aspergillus aureus var.minor、Aspergillus aureofulgens、具黄曲霉(Aspergillusaureolatus)、Aspergillus aureolus、金头 曲霉(Aspergillus auricomus)、燕麦曲霉(Aspergillus avenaceus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、Aspergillus awamorivar.fumeus、泡盛曲霉褐色变种 (Aspergillus awamori var.fuscus)、Aspergillusawamori var.minimus、 Aspergillus awamori var.piceus、甘薯曲霉(Aspergillusbatatas)、双色曲霉 (Aspergillus bicolor)、两型壳曲霉(Aspergillus biplanus)、双孢曲霉(Aspergillus bisporus)、蚕沙曲霉(Aspergillus bombycis)、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、 短柄曲霉(Aspergillus brevipes)、Aspergillusbridgeri、Aspergillus brunneo-uniseriatus、Aspergillus brunneo-uniseriatusvar.nanus、Aspergillus caelatus、浅蓝灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、丛簇曲霉(Aspergillus caespitosus)、 Aspergillus campestris、亮白曲霉(Aspergilluscandidus)、炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、Aspergillus carnoyi、放线曲 霉(Aspergillus cellulosae)、鹿皮色曲霉(Aspergilluscervinus)、谢瓦氏曲霉 (Aspergillus chevalieri)、谢瓦氏曲霉间型变种(Aspergilluschevalieri var. intermedius)、Aspergillus chrysellus、肉桂色曲霉(Aspergilluscinnamomeus)、 Aspergillus citrisporus、棒黄曲霉(Aspergillus clavatoflavus)、Aspergillus clavatonanica、矮棒曲霉(Aspergillus clavatonanicus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、Aspergillus cleistominutus、圆锥曲霉(Aspergillusconicus)、锥接 曲霉(Aspergillus conjunctus)、Aspergillus coremiiformis、皱折曲霉(Aspergillus corrugatus)、Aspergillus crassihyphae、淡黄曲霉(Aspergilluscremeus)、冠 突曲霉(Aspergillus cristatus)、结痂曲霉(Aspergillus crustosus)、黄晶曲霉 (Aspergillus crystallinus)、弯头曲霉(Aspergillus deflectus)、Aspergillusdimorphicus、Aspergillus diversus、Aspergillus dorothicus、Aspergillusduricaulis、 Aspergillus eburneocremeus、Aspergillus echinulatus、埃及曲霉(Aspergillus egyptiacus)、雅致曲霉(Aspergillus elegans)、Aspergillusellipticus、细长曲 霉(Aspergillus elongatus)、Aspergillus fennelliae、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、费舍尔曲霉(Aspergillus fischeri)、费舍尔曲霉巴西变种(Aspergillus fischeri var.brasiliensis)、Aspergillus fischeri var.glaber、Aspergillus fischeri var. spinosus、佛莱氏曲霉(Aspergillus flaschentraegeri)、黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)、黄叉曲霉(Aspergillus flavofurcatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、 黄曲霉柱头变种(Aspergillus flavus var.columnaris)、黄曲霉原变种(Aspergillus flavus var.flavus)、黄曲霉酱油变种(Aspergillus flavusvar.sojae)、Aspergillus flocculosus、Aspergillus floriformis、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、臭曲霉酸 涩变种(Aspergillus foetidus var.acidus)、臭曲霉苍白变种(Aspergillus foetidus var.pallidus)、Aspergillus foveolatus、弗雷曲霉(Aspergillus fresenii)、Aspergillus fruticulosus、Aspergillus fumaricus、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、Aspergillus fumigatus var.acolumnaris、烟曲霉椭孢变种(Aspergillus fumigatus var. ellipticus)、烟曲霉原变种(Aspergillus fumigatusvar.fumigatus)、Aspergillus fumigatus var.helvolus、绳状青霉(Aspergillusfuniculosus)、巨大曲霉 (Aspergillus giganteus)、Aspergillus glaber、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、 Aspergillus gorakhpurensis、细曲霉(Aspergillusgracilis)、Aspergillus granulatus、 粒落曲霉(Aspergillus granulosus)、Aspergillus gymnosardae、Aspergillus halophilicus、Aspergillus helicothrix、Aspergillus hennebergii、Aspergillus heterocaryoticus、异形曲霉(Aspergillusheteromorphus)、Aspergillus heterothallicus、Aspergillus iizukae、Aspergillusimplicatus、Aspergillus insuetus、 Aspergillus insulicola、乾氏曲霉(Aspergillusinuii)、解乌头酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、Aspergillus ivoriensis、两形头曲霉(Aspergillus janus)、Aspergillus janus var.brevis、两形头曲霉原变种(Aspergillusjanus var.janus)、日本曲霉 (Aspergillus japonicus)、日本曲霉褐斑变种(Aspergillus japonicus var. atrofuscus)、日本曲霉绿黄变种(Aspergillusjaponicus var.viridiflavus)、 Aspergillus kambarensis、神奈川曲霉(Aspergilluskanagawaensis)、河内曲霉 (Aspergillus kawachii)、Aspergillus lanosus、Aspergillus lentulus、兔粪曲霉 (Aspergillus leporis)、Aspergillus leucocarpus、长囊曲霉(Aspergillus longivesica)、琉球曲霉(Aspergillus luchuensis)、Aspergillus lucknowensis、 藤黄黑曲霉(Aspergillus luteo-niger)、玛琳曲霉(Aspergillus malignus)、 Aspergillus malodoratus、芒让曲霉(Aspergillusmanginii)、Aspergillus medius、 蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、Aspergillusmicrocephalus、Aspergillus microviridicitrinus、Aspergillus microcysticus、微小曲霉(Aspergillus minimus)、 Aspergillus miyokoensis、Aspergillus montevidensis、多色曲霉(Aspergillus multicolor)、木芙蓉曲霉(Aspergillus mutabilis)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、Aspergillus nidulans var.acristatus、Aspergillusnidulans var.dentatus、Aspergillus nidulans var.echinulatus、Aspergillusnidulans var.latus、构巢曲霉玫瑰变种 (Aspergillus nidulans var.roseus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉肉桂 色偶然变种(Aspergillus niger mut.cinnamomeus)、黑曲霉间型变种(Aspergillus niger var.intermedius)、黑曲霉大孢变种(Aspergillusniger var.macrosporus)、 Aspergillus niger var.nanus、黑曲霉原变种(Aspergillusniger var.niger)、 Aspergillus niger var.niger f.hennebergii、黑曲霉海枣变种(Aspergillus niger var. phoenicis)、Aspergillus niger mut.schiemanni、Aspergillus niveoglaucus、雪白 曲霉(Aspergillus niveus)、雪白曲霉印度变种(Aspergillus niveus ver.indica)、 集峰曲霉(Aspergillus nomius)、Aspergillusnutans、Aspergillus ochraceoroseus、 赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、Aspergillusornatus、米曲霉(Aspergillus oryzae)、 米曲霉棕褐变种(Aspergillus oryzaevar.brunneus)、米曲霉平展变种 (Aspergillus oryzae var.effusus)、Aspergillusoryzae var.magnasporus、米曲 霉原变种(Aspergillus oryzae var.oryzae)、米曲霉黄孢变种(Aspergillus oryzae var.sporoflavus)、米曲霉变异变种(Aspergillus oryzaevar.variabilis)、米曲 霉绿变种(Aspergillus oryzae var.viridis)、孔曲霉(Aspergillus ostianus)、 Aspergillus pallidus、巴拿马曲霉(Aspergilluspanamensis)、争论曲霉 (Aspergillus paradoxus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、寄生曲霉球状 变种(Aspergillus parasiticus var.globosus)、Aspergillus parvathecius、Aspergillus parvulus、Aspergillus penicillioformis、帚状曲霉(Aspergillus penicillioides)、 Aspergillus persii、佩特曲霉(Aspergilluspetrakii)、Aspergillus peyronelii、 Aspergillus phialiseptus、海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)、多育曲霉(Aspergillus proliferans)、疣梗曲霉(Aspergillus protuberus)、假弯头曲霉(Aspergillus pseudodeflectus)、假灰绿曲霉(Aspergillus pseudoglaucus)、假溜曲霉 (Aspergillus pseudotamarii)、粘状曲霉(Aspergillus pulverulentus)、Aspergillus pulvinus、红紫曲霉(Aspergilluspuniceus)、Aspergillus quadricinctus、Aspergillus quadrilineatus、Aspergillusquercinus、Aspergillus quercinus var.petrakii、 Aspergillus raperi、Aspergillusrecurvatus、Aspergillus repens、局限曲霉 (Aspergillus restrictus)、Aspergillusrhizopodus、Aspergillus robustus、赤曲霉(Aspergillus ruber)、Aspergillusrugulosus、Aspergillus saitoi var.kagoshimaensis、 Aspergillus salviicola、菌核曲霉(Aspergillus sclerotiorum)、埋藏曲霉 (Aspergillus sepultus)、森林曲霉(Aspergillus silvaticus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、稀疏曲霉(Aspergillussparsus)、Aspergillus spathulatus、壮观曲霉 (Aspergillus spectabilis)、Aspergillus spelunceus、Aspergillus speluneus、 Aspergillus spinulosus、星状曲霉(Aspergillus stellatus)、Aspergillus stellatus var. astellatus、Aspergillusstramenius、Aspergillus striatus、Aspergillus stromatoides、 近绿曲霉(Aspergillus subolivaceus)、Aspergillus subsessilis、硫色曲霉 (Aspergillussulphureus)、硫色曲霉微小变种(Aspergillus sulphureus var. minimus)、Aspergillussunderbanii、聚多曲霉(Aspergillus sydowii)、溜曲霉 (Aspergillus tamarii)、Aspergillus tardus、土曲霉(Aspergillus terreus)、 Aspergillus terreusvar.africanus、土曲霉金色变种(Aspergillus terreus var. aureus)、Aspergillusterreus var.baedijnii、Aspergillus terreus var.globosus、 土曲霉原变种(Aspergillus terreus var.terreus)、栖土曲霉(Aspergillus terricola)、 栖土曲霉美国变种(Aspergillus terricola var.americana)、栖土曲霉印度变种 (Aspergillusterricola var.indicus)、Aspergillus testaceocolorans、Aspergillusthermomutatus、Aspergillus thomii、Aspergillus togoensis、高渗曲霉(Aspergillustonophilus)、毒曲霉(Aspergillus toxicarius)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、Aspergillus umbrosus、爪甲曲霉(Aspergillus unguis)、Aspergillus unilateralis、Aspergillus usamii mut.shirousamii、Aspergillus usamii var.shiro-usamii、焦曲霉(Aspergillus ustus)、葡萄汁曲霉(Aspergillus uvarum)、Aspergillus vadensis、 变异曲霉(Aspergillus varians)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、紫罗兰 褐曲霉(Aspergillus violaceofuscus)、Aspergillus violaceus、绿垂曲霉(Aspergillusviridinutans)、葡萄曲霉(Aspergillus vitis)、Aspergillus vitisvar.montevidensis、 温特曲霉(Aspergillus wentii)、Aspergillus wentiivar.minimus、肇庆曲霉 (Aspergillus zhaoqingensis)、环带曲霉(Aspergilluszonatus)等。
〔真核生物的优选其他种〕
此外，作为分类在属(Zymoseptoria)的微生物，可以列举Zymoseptoria tritici；作为分类在暗球腔菌属(Phaeosphaeria)的微生物，可以列举小麦颖枯 病菌(Phaeosphaeria nodorum)；作为分类在圆核腔菌属(Pseudozyma)的微 生物，可以列举肝圆核腔菌(Pyrenophora teres)；作为分类在黑粉菌属 (Ustilago)的微生物，可以列举小黑粉菌(Ustilago maydis)；作为分类在 阿舒囊霉属(Ashbya)的微生物，可以列举核黄菌(Ashbya gossypii) (Eremothecium gossypii)；作为分类在克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的微生 物，可以列举乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)；作为分类在耶氏酵母 属(Yarrowia)的微生物，可以列举解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；作 为分类在德巴利酵母属(Debaryomyces)的微生物，可以列举汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；作为分类在Scheffersomyces属的微生物，可以列 举Scheffersomyces stipitis；作为分类在Meyerozyma属的微生物，可以列举季 也蒙酵母(Meyerozyma guilliermondii)；作为分类在路德酵母属 (Lodderomyces)的微生物，可以列举长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)；作为分类在线黑粉菌(隐球菌)属(Filobasidiella(Cryptococcus)) 的微生物，可以列举新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、格特隐球菌及 Cryptococcus amylolentus；作为分类在葡萄孢盘菌属(Botryotinia)的微生物， 可以列举富氏葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)；作为分类在核盘菌属 (Sclerotinia)的微生物，可以列举油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)； 作为分类在块菌属(Tuber)的微生物，可以列举黑孢块菌(Tubermelanosporum)；作为分类在属(Postia)的微生物，可以列举绵腐卧孔菌(Postiaplacenta)；作为分类在蜡蘑属(Laccaria)的微生物，可以列举双色蜡蘑(Laccariabicolor)；作为分类在Moniliophthora属的微生物，可以列举Moniliophthoraperniciosa；作为分类在鬼伞属(Coprinopsis)的微生物，可以列举灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)；作为分类在裂褶菌属(Schizophyllum)的微生物，可 以列举裂褶菌(Schizophyllum commune)；作为分类在柄锈菌属(Puccinia) 的微生物，可以列举禾柄锈菌(Puccinia graminis)；作为分类在属(Magnaporthe) 的微生物，可以列举稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)；作为分类在柄孢壳菌 属(Podospora)的微生物，可以列举柄孢霉；作为分类在链孢霉属(Neurospora) 的微生物，可以列举粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；作为分类在粪壳菌属 (Sordaria)的微生物，可以列举Sordaria macrospora；作为分类在梭孢壳属(Thielavia)的微生物，可以列举土生梭孢霉(Thielavia terrestris)；作为分 类在毁丝霉属(Myceliophthora)的微生物，可以列举嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)；作为分类在镰孢菌属(Fusarium)的微生物， 可以列举禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)；作为分类在丛赤壳属(Nectria) 的微生物，可以列举鞭毛藻丛赤壳菌；作为分类在马拉色菌属(Malassezia) 的微生物，可以列举球形马拉色菌(Malassezia globosa)；作为分类在新萨托 菌属(Neosartorya)的微生物，可以列举费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)； 作为分类在节皮菌属(Arthroderma)的微生物，可以列举Arthroderma benhamiae；作为分类在球孢子菌属(Coccidioides)的微生物，可以列举粗球 孢子菌(Coccidioides immitis)及非加利福尼亚粗球孢子菌(Coccidioidesposadasii)；作为分类在副球孢子菌属(Coccidioides)的微生物，可以列举巴 西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)；作为分类在属(Uncinocarpus) 的微生物，可以列举Uncinocarpus reesii；作为分类在毛癣菌属(Trichophyton) 的微生物，可以列举疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)；作为分类在属 (Ajellomyces)的微生物，可以列举荚膜(Ajellomyces capsulatus)；作为分 类在肉座菌属(Hypocrea)的微生物，可以列举红棕肉座菌(Hypocrea rufa)； 作为分类在枝顶孢属(Acremonium)的微生物，可以列举产黄顶头孢霉 (Acremonium chrysogenum)；作为分类在青霉属(Penicillium)的微生物， 可以列举卡门柏青霉(Penicillium camembertii)；作为分类在属(Ogataea) 的微生物，可以列举Ogataea minuta；作为分类在属(Komagataella)的微生物， 可以列举Komagataellapastoris；作为分类在三角酵母属(Trigonopsis)的微生 物，可以列举变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)；作为分类在裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)的微生物，可以列举粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)；作为分类在柱顶孢属(Scytalidium)的微生物， 可以列举Scytalidium thermophirum。
上述原核及真核微生物中，实验上确认能够生成甲基丙烯酸衍生物的特别 优选属如下所示。假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘 氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、丛毛单胞菌(Comamonas)、短波单胞菌属 (Brevundimonas)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、土地杆菌属(Pedobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、 无色小杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、希瓦氏菌属 (Shewanella)、利斯顿氏菌属(Listonella)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、 中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、副球菌属 (Paracoccus)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、 地芽孢杆菌属(Geobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、酵母属 (Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)以及曲霉属(Aspergillus)的微 生物。
其中，更优选鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、丛毛单胞菌(Comamonas)、 短波单胞菌属(Brevundimonas)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、苍白杆 菌属(Ochrobactrum)、土地杆菌属(Pedobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、 无色小杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、希瓦氏菌属 (Shewanella)、利斯顿氏菌属(Listonella)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、 中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、副球菌属(Paracoccus)、黄色杆菌属 (Xanthobacter)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、红球菌属(Rhodococcus) 以及假丝酵母属(Candida)的微生物。
[优选菌株]
作为本发明所涉及甲基丙烯酸制造方法中使用的具有甲基丙烯酸生成能 力的微生物的特别优选例，可以列举如下具有较高甲基丙烯酸生成能力的菌株 (参考后述实施例)。
(i)属于假单胞菌属(Pseudomonas)的B25-2菌株((邮政编码292-0818、 日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)、保藏号：NITE BP-1451)、D22-1 菌株(保藏号：NITE BP-1452)、D43-1菌株(保藏号：NITE BP-1453)、 D25菌株(保藏号：NITE BP-1454)、D26菌株(保藏号：NITE BP-1455)、 D29菌株(保藏号：NITE BP-1456)、D41-2菌株(保藏号：NITE BP-1457) 或者恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NBRC12996。
(ii)属于芽孢杆菌属(Bacillus)的G1菌株(保藏号：NITE BP-1458)、 G2(保藏号：NITE BP-1459)菌株、R1菌株(保藏号：NITE BP-1460)、枯 草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NBRC12210、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius) ATCC14574、巨兽芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NBRC15308或者简单芽孢 杆菌(Bacillus simplex)ATCC49097。
(iii)属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)的B13菌株(保藏号：NITE BP-1461)。
(iv)属于丛毛单胞菌(Comamonas)的土生丛毛单胞菌(Comamonas terrigena)NBRC13299。
(v)属于短波单胞菌属(Brevundimonas)的缺陷短波单胞菌 (Brevundimonasdiminuta)ATCC11568、泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)ATCC11426或者近弧状短波单胞菌(Brevundimonas subvibrioides) NBRC16000。
(vi)属于鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)的少动鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonaspaucimobilis)NBRC 13935。
(vii)属于苍白杆菌属(Ochrobactrum)的苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)NBRC12951、中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)NBRC15820、中间 苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)NBRC13694、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)ATCC49237、贵格纳苍白杆菌(Ochrobactrum grignonense)NBRC 102586或者羽扇豆苍白杆菌(Ochrobactrum lupini)NBRC 102587。
(viii)属于土地杆菌属(Pedobacter)的肝素土地杆菌(Pedobacter heparinus)Pedobacter heparinus NBRC12017。
(ix)属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)NBRC13157。
(x)属于无色小杆菌属(Achromobacter)的脱氮无色小杆菌 (Achromobacterdenitrificans)NBRC12669。
(xi)属于不动杆菌属(Acinetobacter)的溶血不动杆菌(Acinetobacterhaemolyticus)ATCC17906或者琼氏不动杆菌ATCC17908。
(xii)属于希瓦氏菌属(Shewanella)的Shewanella fodinae NBRC105216。
(xiii)属于利斯顿氏菌属(Listonella)的鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)ATCC19264。
(xiv)属于土壤杆菌属(Agrobacterium)的藤黄土壤杆菌(Agrobacteriumluteum)NBRC15768。
(xv)属于中间根瘤菌属(Mesorhizobium)的百脉根中间根瘤菌 (Mesorhizobiumloti)ATCC700743。
(xvi)属于根瘤菌属(Rhizobium)的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)ATCC10004。
(xvii)属于副球菌属(Paracoccus)的嗜胺副球菌(Paracoccus aminophilus)NBRC16710。
(xviii)属于黄色杆菌属(Xanthobacter)的自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)ATCC35674。
(xix)属于链霉菌属(Streptomyces)的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)NBRC13350。
(xx)属于地芽孢杆菌属(Geobacillus)的嗜热嗜脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillusstearothermophilus)NBRC12983。
(xxi)可以列举红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)。更优选菌株可 以列举红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)PR-4菌株、红串红球菌 (Rhodococcuserythropolis)KA2-5-1菌株、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8菌株、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)D-1菌株、 红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)H-2菌株、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)N1-36菌株、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)I-19菌株、 红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)ECRD-1菌株、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)B1菌株、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)SY-1菌株、红 串红球菌(Rhodococcus erythropolis)UM3菌株、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)UM9菌株或者红球菌(Rhodococcus sp.)T09菌株等，特别优选 菌株可以列举红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)PR-4菌株。
(xxii)属于酵母(Saccharomyces)属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC1136、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC2347 或者奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)NBRC10609。
(xxiii)属于假丝酵母(Candida)属的产阮假丝酵母Candida utilis NBRC1086或者近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ATCC22019。
(xxiv)属于曲霉(Aspergillus)属的黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC6275、 黄曲霉(Aspergillus flavus)NBRC8558或者米曲霉(Aspergillus oryzae) NBRC4255。
[通过筛选等选择微生物的方法]
具有甲基丙烯酸生成能力的微生物可以由土壤、河水、湖沼水、海水、污 泥、动物、植物、昆虫等以氨基酸或脂肪酸的同化性为指标利用平板分离法、 富集培养法等筛选而发现。
具体而言，可以通过评价缬氨酸及异丁酸的同化性、和/或甲基丙烯酸生 成能力从而选择适合于本发明的微生物。缬氨酸或异丁酸的同化性例如可以通 过确认在以0.1～1％的缬氨酸或异丁酸为碳源的合成培养基中的生育从而进 行评价。甲基丙烯酸生成能力例如可以通过分析在同一培养液中的甲基丙烯酸 的生成从而进行评价。或者，可以通过使同一培养中获得的菌体与包含0.1～ 1％的缬氨酸或异丁酸的溶液接触，分析同一反应液中的甲基丙烯酸的生成， 从而进行评价。反应只要在30℃振荡5～120小时即可。理想的是，优选通过 上述评价具有生成0.04ppm以上甲基丙烯酸衍生物的能力的微生物。
或者，也可以通过微生物的菌学性质(培养性质、形态学性质、生理学性 质、化学分类学性质及遗传学性质)来选择适合于本发明的微生物。例如，可 以由微生物的rRNA基因的同源性选择本发明的微生物。具体而言，可以从具 有如下rRNA基因的微生物中选择，所述rRNA基因包含相对于序列号1～49 中所述的碱基序列中的任一者显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以 上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱 基序列。
进而，适合于本发明的微生物可以从属于上述分类学上的目、科或属的微 生物中选择，并组合rRNA基因信息从而高效筛选。
另外，rRNA基因的解析及鉴定方法可以参照例如“基因解析法16SrRNA 基因的碱基序列决定法(基因解析法16SrRNA基因的碱基序列确定法)(日 本放线菌学会编，放线菌的分类和鉴定，pp88-117 2001)”、“Bulletin of Japanese Society of MicrobialEcology Vol.10、31-42、1995”及“第16改正日本药局方； 通过基因解析的微生物的迅速鉴定法(日本药典第16版；通过基因解析迅速 鉴定微生物的方法)”等。优选将这些菌学性质与缬氨酸或异丁酸的同化性及 甲基丙烯酸生成能力的指标组合，来选择适合于本发明的微生物。通过这样进 行，还能够从现有的典型培养物中选择。
[衍生株]
作为微生物，还可以使用由具有甲基丙烯酸生成能力的微生物(例如上述 (i)～(xxiv)的菌株)通过天然或化学处理或物理处理衍生的、依然保持以 可再生原料和/或生物质作为碳源和/或能源生成甲基丙烯酸的能力的衍生株。 衍生株包括以下所示的“变异株”、“基因改变株”。
[变异株]
变异株可以通过对具有甲基丙烯酸生成能力的微生物进行化学处理或物 理处理(例如γ射线照射等)诱发基因变异而获得。
[基因改变株]
基因改变株为按照下述方式使具有甲基丙烯酸生成能力的微生物的活性 增强、或使活性缺失或降低而得的菌株。
活性增强是指：在由菌体外向微生物内导入的基因的作用下，该微生物中 的酶基因(不论来源如何)的表达量增大，除了将编码酶的基因由微生物的菌 体外导入菌体内以外，还包括：使微生物的基因组上保有的酶基因的启动子活 性增强、或通过置换为其它启动子从而使酶基因强表达的方式，或者使该酶基 因的阻遏活性下降或失活从而使该酶的活性增强的方式。另外，基因导入、基 因组上的基因的置换等可以通过常规方法进行。
基因改变株可以是进行了使阻碍甲基丙烯酸合成反应的酶的活性缺失或 降低的基因改变而获得的改变株。活性的“缺失”或“降低”是指该微生物中的该 酶基因的表达完全消失或者减少，除了该酶基因发生置换、缺失或插入以外， 还包括：使微生物的基因组上保有的酶基因的启动子活性降低、或通过置换为 其它启动子从而抑制酶基因的表达的方式，或者使该酶基因的阻遏活性增强或 活化从而使该酶的活性降低的方式。另外，这些基因改变可以通过常规方法进 行。
作为优选的改变株，可以列举具有以下所示的(a)或(b)中的至少一种 特征的改变株。
(a)通过导入BCKAD基因和/或ACD基因，甲基丙烯酸生成活性增强。
(b)通过使烯酰辅酶A水合酶基因、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因和 /或3-羟基异丁酸脱氢酶基因缺失或失活，甲基丙烯酸生成活性增强。缺失或 失活通过对全部基因或碱基序列的一部分进行置换、缺失或插入而进行。
[基因重组株]
进而，作为微生物，还可以使用通过在不具有甲基丙烯酸生成能力的微生 物中导入由具有甲基丙烯酸生成能力的微生物鉴定出的甲基丙烯酸合成相关 酶，从而从新赋予了以可再生原料和/或生物质作为碳源和/或能源生成甲基丙 烯酸的能力的菌株。在制作基因重组株时，可以通过与上述基因改变株的制作 同样的方法来进行。
[近缘株]
进而，作为微生物，还可以使用为具有甲基丙烯酸生成能力的微生物(例 如上述(i)～(xxiv)的菌株)的近缘种、且同样保持以可再生原料和/或生 物质作为碳源和/或能源生成甲基丙烯酸的能力的菌株。近缘种例如可以通过 以核酸的碱基序列信息为基础通过进行分子系统解析而获得。具体而言，近缘 种可以通过核糖体RNA基因(rRNA基因；以下rDNA)的碱基序列的同源性 解析而获得。
作为优选的近缘种可以列举如下。
可以列举出：(1)属于假单胞菌(Pseudomonas)属、且具有如下16S rDNA 的微生物，所述16S rDNA包含相对于上述(i)的菌株的16S rDNA的部分碱 基序列(序列号1～8)中的任一者显示81％以上、优选88％以上、更优选95％ 以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的 碱基序列。
(2)属于芽孢杆菌(Bacillus)属，且具有如下16S rDNA的微生物，所 述16S rDNA包含相对于上述(ii)的菌株的16S rDNA的部分碱基序列(序 列号9～15)中的任一者显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以上、 更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱基序 列。
(3)属于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)属，且具有如下16S rDNA的 微生物，所述16S rDNA包含相对于上述(iii)的菌株的16S rDNA的部分碱 基序列(序列号16)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更 优选95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的 同源性的碱基序列。
(4)属于丛毛单胞菌(Comamonas)属，且具有如下16S rDNA的微生 物，所述16SrDNA包含相对于上述(iv)的菌株的16S rDNA的部分碱基序 列(序列号17)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选 95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源 性的碱基序列。
(5)属于短波单胞菌(Brevundimonas)属，且具有如下16S rDNA的微 生物，所述16S rDNA包含相对于上述(v)的菌株的16S rDNA的部分碱基 序列(序列号18～20)中的任一者显示81％以上、优选88％以上、更优选95％ 以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的 碱基序列。
(6)属于鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)属，且具有如下16S rDNA的 微生物，所述16S rDNA包含相对于上述(vi)的菌株的16S rDNA的部分碱 基序列(序列号21)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更 优选95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的 同源性的碱基序列。
(7)属于苍白杆菌(Ochrobactrum)属，且具有如下16S rDNA的微生物， 所述16SrDNA包含相对于上述(vii)的菌株的16S rDNA的部分碱基序列(序 列号22～26)中的任一者显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以上、 更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱基序 列。
(8)属于土地杆菌(Pedobacter)属，且具有如下16S rDNA的微生物， 所述16SrDNA包含相对于上述(viii)的菌株的16S rDNA的部分碱基序列(序 列号27)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以 上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱 基序列。
(9)属于类芽孢杆菌(Paenibacillus)属，且具有如下16S rDNA的微生 物，所述16S rDNA包含相对于上述(ix)的菌株的16S rDNA的部分碱基序 列(序列号28)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选 95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源 性的碱基序列。
(10)属于无色小杆菌(Achromobacter)属，且具有如下16S rDNA的微 生物，所述16S rDNA包含相对于上述(x)的菌株的16S rDNA的部分碱基 序列(序列号29)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优 选95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同 源性的碱基序列。
(11)属于不动杆菌(Acinetobacter)属，且具有如下16S rDNA的微生 物，所述16SrDNA包含相对于上述(xi)的菌株的16S rDNA的部分碱基序 列(序列号30～31)中的任一者显示81％以上、优选88％以上、更优选95％ 以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的 碱基序列。
(12)属于希瓦氏菌(Shewanella)属，且具有如下16S rDNA的微生物， 所述16SrDNA包含相对于上述(xii)的菌株的16S rDNA的部分碱基序列(序 列号32)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以 上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱 基序列。
(13)属于利斯顿氏菌(Listonella)属，且具有如下16S rDNA的微生物， 所述16SrDNA包含相对于上述(xiii)的菌株的16S rDNA的部分碱基序列(序 列号33)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以 上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱 基序列。
(14)属于土壤杆菌(Agrobacterium)属，且具有如下16S rDNA的微生 物，所述16SrDNA包含相对于上述(xiv)的菌株的16S rDNA的部分碱基序 列(序列号34)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选 95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源 性的碱基序列。
(15)属于中间根瘤菌(Mesorhizobium)属，且具有如下16S rDNA的 微生物，所述16S rDNA包含相对于上述(xv)的菌株的16S rDNA的部分碱 基序列(序列号35)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更 优选95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的 同源性的碱基序列。
(16)属于根瘤菌(Rhizobium)属，且具有如下16S rDNA的微生物， 所述16S rDNA包含相对于上述(xvi)的菌株的16S rDNA的部分碱基序列(序 列号36)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以 上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱 基序列。
(17)属于副球菌(Paracoccus)属，且具有如下16S rDNA的微生物， 所述16S rDNA包含相对于上述(xvii)的菌株的16S rDNA的部分碱基序列 (序列号37)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选95％ 以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的 碱基序列。
(18)属于黄色杆菌(Xanthobacter)属，且具有如下16S rDNA的微生 物，所述16SrDNA包含相对于上述(xviii)的菌株的16S rDNA的部分碱基 序列(序列号38)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优 选95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同 源性的碱基序列。
(19)属于链霉菌(Streptomyces)属，且具有如下16S rDNA的微生物， 所述16SrDNA包含相对于上述(xix)的菌株的16S rDNA的部分碱基序列(序 列号39)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以 上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱 基序列。
(20)属于地芽孢杆菌(Geobacillus)属，且具有如下16S rDNA的微生 物，所述16SrDNA包含相对于上述(xx)的菌株的16S rDNA的部分碱基序 列(序列号40)所示的部分碱基序列显示81％以上、优选88％以上、更优选 95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源 性的碱基序列。
(21)可以列举出：具有如下16S rDNA的微生物，所述16S rDNA包含 相对于红串红球菌PR-4株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号41)显示81％ 以上、优选88％以上、更优选95％以上、更优选97％以上、更优选98％以上、 进而优选99.5％以上的同源性的碱基序列。
(22)属于酵母(Saccharomyces)属，且具有如下LSUrDNA的微生物， 所述LSUrDNA包含相对于上述(xxii)的菌株的LSUrDNA的部分碱基序列 (序列号42～44)中的任一者显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以 上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱 基序列。
(23)属于假丝酵母(Candida)属，且具有如下LSUrDNA的微生物， 所述LSUrDNA包含相对于上述(xxiii)的菌株的LSUrDNA的部分碱基序列 (序列号45～46)中的任一者显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以 上、更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱 基序列。
(24)属于曲霉(Aspergillus)属，且具有如下LSUrDNA的微生物，所 述LSUrDNA包含相对于上述(xxiv)的菌株的LSUrDNA的部分碱基序列(序 列号47～49)中的任一者显示81％以上、优选88％以上、更优选95％以上、 更优选97％以上、更优选98％以上、进而优选99.5％以上的同源性的碱基序 列。
此外，近缘种还可以从已有的典型培养物中基于将菌学性质适当组合而成 的信息来进行选择。
这里，关于“同源性”，在为碱基序列的情况下，按照欲比较的2个碱基序 列的碱基尽量多地达到一致的方式将两碱基序列排列，将一致的碱基数除以全 部碱基数而得的值以百分率表示。进行上述排列时，根据需要，在进行比较的 2个序列的一者或两者中适当插入间隔序列(gap)。这样的序列的排列化可以使 用例如BLAST、FASTA、CLUSTALW等公知的程序来进行。在插入间隔序 列时，上述全部碱基数为将1个间隔序列作为1个碱基计数时的碱基数。这样 计数获得的全部碱基数在进行比较的2个序列间不同的情况下，同源性(％) 通过将一致的碱基数除以长序列的全部碱基数而算出。氨基酸序列的同源性也 同样。
进而，本发明的甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯的制造方法中，还可以通 过如下工序制造甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯，所述工序为：使用在具有甲 基丙烯酸生成能力的微生物中导入了AAT基因和/或ACD基因的重组微生物， 与可再生原料和/或生物质接触。
[在具有甲基丙烯酸生成能力的微生物导入了AAT基因的重组微生物的 制作]
〔AAT〕
AAT为具有催化将酰基-辅酶A的酰基转移给醇或酚类而合成酯的催化作 用的酶。据称，AAT参与各种水果中的酯的生成。已知AAT存在于姜目(香 蕉)、蔷薇目(草莓、苹果、梨、桃)、葫芦目(甜瓜)、杜鹃花目(猕猴桃)、 唇形目(橄榄)、茄目(番茄)、无患子目(柠檬、芒果)等植物中。
本发明中使用的AAT，只要是具有以甲基丙烯酰辅酶A和醇或酚类为原 料制造甲基丙烯酸酯的能力的来源于生物体的催化剂则没有特别限定，无论其 种类及起源如何。作为酶源优选来源于植物，其中优选分类在被子植物的植物。
适用于本发明的AAT，可以通过以下方法由上述植物中选择。根据需要 将组织的合适部位切断从而获取。在该切断部位添加包含甲基丙烯酰辅酶A 和醇或酚类的溶液，进行振荡，使其反应一定时间。通过GC(气相色谱法) 确认其反应液中有无甲基丙烯酸酯，从而可以确认合成活性。具体而言，例如 将果肉或果皮切断，对其添加含有1～10mM的甲基丙烯酰辅酶A、0.35M KCl 以及5～50倍摩尔量的正丁醇的溶液，在30℃振荡1～10小时。反应结束后， 通过GC确认有无甲基丙烯酸酯，从而可以选择能够用于本发明的AAT。
醇或酚类为以下的式“R-OH”表示的化合物。醇或酚类的结构由于与甲基 丙烯酸酯是对应的，因此其结构与上述式1的R的定义相同，表示直链或支 链的碳原子数1～20的烃基。烃基可以是饱和或不饱和的非环状烃基，也可以 是饱和或不饱和的环状烃基。优选为直链或支链的碳原子数1～10的无取代的 醇、芳烷基醇或酚类，特别优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异 丁基、仲丁基、叔丁基、正戊醇、异戊醇、叔戊醇、正己醇、异己醇、2-己醇、 二甲基丁醇、乙基丁醇、庚醇、辛醇、2-乙基己醇的碳原子数1～8的烷基醇、 苯甲醇或苯酚。
作为适用于本发明的AAT的酶源，例如是属于选自由以下的目所组成的 组中的任一目的植物：姜目(Zingiberales)、蔷薇目(Rosales)、杜鹃花目 (Ericales)、葫芦目(Cucurbitales)、十字花目(Brassicales)、樟目(Laurales)、 禾本目(Poales)、棕榈目(Arecales)、天门冬目(Asparagales)、虎耳草目 (Saxifragales)、石竹目(Caryophyllales)、葡萄目(Vitales)、金虎尾目 (Malpighiales)、酢浆草目(Oxalidales)、豆目(Fabales)、无患子目(Sapindales)、 锦葵目(Malvales)、桃金娘目(Myrtales)、毛茛目(Ranunculales)、茄目 (Solanales)、唇形目(Lamiales)、龙胆目(Gentianales)以及菊目(Asterales)。 其中，优选属于选自姜目(Zingiberales)、蔷薇目(Rosales)、杜鹃花目(Ericales)、 葫芦目(Cucurbitales)、十字花目(Brassicales)以及樟目(Laurales)所组成 的组中的任一目的植物。
作为属于姜目的植物，优选芭蕉科(Musaceae)以及姜科(Zingiberaceae) 的植物；作为属于蔷薇目的植物，优选蔷薇科(Rosaceae)以及桑科(Moraceae) 的植物；作为属于杜鹃花目的植物，优选杜鹃花科(Ericaceae)、猕猴桃科 (Actinidiaceae)、柿树科(Ebenaceae)以及山茶科(Theaceae)的植物；作为 属于葫芦目的植物，优选葫芦科(Cucurbitaceae)的植物；作为属于十字花目 的植物，优选番木瓜科(Caricaceae)以及十字花科(Brassicaceae)的植物； 作为属于樟目的植物，优选樟科(Lauraceae)的植物；作为属于禾本目的植物， 优选凤梨科(Bromeliaceae)以及禾本科(Poaceae)的植物；作为属于棕榈目 的植物，优选槟榔科(Arecaceae)的植物；作为属于天门冬目的植物，优选 兰科(Orchidaceae)以及鸢尾科(Iridaceae)的植物；作为属于虎耳草目的植 物，优选茶藨子科(Grossulariaceae)的植物；作为属于石竹目的植物，优选 石竹科(Caryophyllaceae)的植物；作为属于葡萄目的植物，优选葡萄科 (Vitaceae)的植物；作为属于金虎尾目的植物，优选金虎尾科(Malpighiaceae)、 西番莲科(Passifloraceae)、大戟科(Euphorbiaceae)以及杨柳科(Salicaceae) 的植物；作为属于酢浆草目的植物，优选酢浆草科(Oxalidaceae)的植物；作 为属于豆目的植物，优选豆科(Fabaceae)的植物；作为属于无患子目的植物， 优选芸香科(Rutaceae)、无患子科(Sapindaceae)以及漆树科(Anacardiaceae) 的植物；作为属于锦葵目的植物，优选锦葵科(Malvaceae)的植物；作为属 于桃金娘目的植物，优选千屈菜科(Lythraceae)、柳叶菜科(Onagraceae)以 及桃金娘科(Myrtaceae)的植物；作为属于毛茛目的植物，优选毛茛科 (Ranunculaceae)以及罂粟科(Papaveraceae)的植物；作为属于茄目的植物， 优选茄科(Solanaceae)的植物；作为属于唇形目的植物，优选木樨科(Oleaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)以及唇形科(Lamiaceae)的植物；作 为属于龙胆目的植物，优选夹竹桃科(Apocynaceae)的植物；作为属于菊目 (Asterales)的植物，优选菊科(Asteraceae)的植物。也可以利用上述植物的 近缘种。在这些之中，进而优选为属于芭蕉科(Musaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、 杜鹃花科(Ericaceae)、猕猴桃科(Actinidiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、 番木瓜科(Caricaceae)以及樟科(Lauraceae)的植物。
具体而言，作为属于芭蕉科的植物，优选芭蕉(Musa)属的植物；作为 属于姜科(Zingiberaceae)的植物，优选姜属(Zingiber)的植物；作为属于蔷 薇科的植物，优选草莓(Fragaria)属、苹果(Malus)属、李(Prunus)属、 梨(Pyrus)属、枇杷(Eriobotrya)属、木瓜(Chaenomeles)属、悬钩子(Rubus) 属以及蔷薇(Rosa)属的植物；作为属于桑科(Moraceae)的植物，优选榕(Ficus) 属的植物；作为属于杜鹃花科的植物，优选越桔(Vaccinium)属的植物；作 为属于猕猴桃科的植物，优选猕猴桃(Actinidia)属的植物；作为属于柿树科 的植物，优选柿树(Diospyros)属的植物；作为属于山茶科的植物，优选山 茶(Camellia)属的植物；作为属于葫芦科的植物，优选黄瓜(Cucumis)属 以及西瓜(Citrullus)属的植物；作为属于番木瓜科的植物，优选番木瓜(Carica) 属以及山地番木瓜(Vasconcellea)属的植物；作为属于十字花科的植物，优 选拟南芥(Arabidopsis)属的植物；作为属于樟科的植物，优选鳄梨(Persea) 属的植物；作为属于凤梨科的植物，优选凤梨属(Ananas)的植物；作为属于 禾本科的植物，优选稻(Oryza)属、小麦(Triticum)属、大麦(Hordeum) 属、玉蜀黍(Zea)属、高粱(Sorghum)属以及短柄草(Brachypodium)属的 植物；作为属于棕榈科的植物，优选椰子(Cocos)属的植物；作为属于兰科 的植物，优选万代兰(Vanda)属的植物；作为属于鸢尾科的植物，优选鸢尾 (Iris)属的植物；作为属于茶藨子科的植物，优选醋栗(Ribes)属的植物； 作为属于石竹科的植物，优选石头花属(Gypsophila)的植物；作为属于葡萄 科的植物，优选葡萄(Vitis)属的植物；作为属于金虎尾科的植物，优选金虎 尾(Malpighia)属的植物；作为属于西番莲科的植物，优选西番莲(Passiflora) 属的植物；作为属于大戟科的植物，优选蓖麻(Ricinus)属的植物；作为属于 杨柳科的植物，优选杨属(Populus)的植物；作为属于酢浆草科的植物，优 选杨桃(Averrhoa)属的植物；作为属于豆科的植物，优选苜蓿(Medicago) 属、羽扇豆(Lupinus)属、大豆(Glycine)属以及蝶豆(Clitoria)属的植物； 作为属于芸香科的植物，优选芸香(Citrus)属以及木橘(Aegle)属的植物； 作为属于无患子科的植物，优选荔枝(Litchi)属的植物；作为属于漆树科的 植物，优选芒果(Mangifera)属的植物；作为属于锦葵科的植物，优选榴莲 (Durio)属以及可可(Theobroma)属的植物；作为属于千屈菜科的植物，优 选石榴(Punica)属的植物；作为属于柳叶菜科的植物，优选克拉花(Clarkia) 属的植物；作为属于桃金娘科的植物，优选番石榴(Psidium)属的植物；作 为属于毛茛科的植物，优选类叶升麻(Actaea)属的植物；作为属于罂粟科的 植物，优选罂粟(Papaver)属的植物；作为属于茄科的植物，优选茄(Solanum)属、辣椒(Capsicum)属、烟草(Nicotiana)属以及矮牵牛(Petunia)属的植 物；作为属于木樨科的植物，优选木犀榄属(Olea)属的植物；作为属于马鞭 草科的植物，优选马鞭草(Glandularia)属的植物；作为属于唇形科的植物， 优选鼠尾草(Salvia)属的植物；作为属于夹竹桃科的植物，优选萝芙木 (Rauvolfia)属以及长春花(Catharanthus)属的植物；作为属于菊科的植物， 优选果香菊(Chamaemelum)属的植物。其中，更优选属于芭蕉属、草莓属、 苹果属、李属、梨属、越桔属、猕猴桃属、黄瓜属、番木瓜属或鳄梨属的植物。 其中，特别优选属于芭蕉属、苹果属、李属、梨属、越桔属、猕猴桃属、黄瓜 属、番木瓜属或鳄梨属的植物。特别优选属于芭蕉属、苹果属、梨属、猕猴桃 属、黄瓜属、番木瓜属或鳄梨属的植物。
进而，具体而言，作为属于芭蕉属的植物，特别优选香蕉(Musa x paradisiaca)、芭蕉(Musa basjoo)、红蕉(Musa coccinea)以及小果野蕉(Musa acuminata)；作为属于姜属的植物，特别优选姜(Zingiber officinale)；作为属 于草莓属的植物，特别优选草莓(Fragaria x ananassa)、弗州草莓(Fragaria virginiana)、智利草莓(Fragariachiloensis)以及野草莓(Fragariavesca)；作 为属于苹果属的植物，特别优选苹果(Maluspumila、Malus domestica、Malus baccata)、垂丝海棠(Malus halliana)、多花海棠(Malusfloribunda)以及海棠 果(Malus prunifolia)；作为属于李属的植物，特别优选梅子(Prunus mume)、 欧洲甜樱桃(Prunus avium)、桃(Prunus persica)、杏(Prunusarmeniaca)、扁 桃(Prunus dulcis)、李(Prunus salicina)以及欧洲李(Prunusdomestica)；作 为属于梨属的植物，特别优选西洋梨(Pyrus communis)、沙梨(Pyruspyrifolia)、 豆梨(Pyrus calleryana)以及野生西洋梨(Pyrus pyraster)；作为属于枇杷属的 植物，特别优选枇杷(Eriobotrya japonica)；作为属于木瓜属的植物，特别优 选木瓜(Chaenomeles sinensis)；作为属于悬钩子属的植物，特别优选覆盆子 (Rubus idaeus)以及黑莓(Rubus fruticosus)；作为属于蔷薇属的植物，特别 优选玫瑰(Rosa rugosa)；作为属于无花果属的植物，特别优选无花果(Ficus carica)；作为属于越桔属的植物，特别优选蓝莓(Vaccinium corymbosum、 Vaccinium angustifolium)、欧洲越橘(Vacciniummyrtillus)、越橘(Vaccinium vitis-idaea)以及红莓苔子(Vaccinium oxycoccos)；作为属于猕猴桃属的植物， 特别优选猕猴桃(Actinidia chinensis、Actinidia deliciosa)、软枣猕猴桃(Actinidia arguta)、山梨猕猴桃(Actinidia rufa)以及葛枣猕猴桃(Actinidia polygama)； 作为属于柿树属的植物，特别优选柿(Diospyros kaki)；作为属于山茶属的植 物，特别优选茶树(Camellia sinensis)；作为属于黄瓜属的植物，特别优选黄 瓜(Cucumis sativus)、甜瓜(Cucumis melo)、西印度瓜(Cucumis anguria) 以及刺角瓜(Cucumis metulifer)；作为属于西瓜属的植物，特别优选西瓜 (Citrullus lanatus)；作为属于番木瓜属的植物，特别优选番木瓜(Carica papaya)；作为属于山地番木瓜属的植物，特别优选山地番木瓜 (Vasconcelleacundinamarcensis)；作为属于拟南芥属的植物，特别优选拟南芥 (Arabidopsis thaliana)以及琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)；作为属于鳄梨属 的植物，特别优选鳄梨(Persea americana)；作为属于凤梨属的植物，特别优选菠萝(Ananas comosus)；作为属于禾本属的植物，特别优选水稻(Oryza sativa)；作为属于小麦属的植物，特别优选小麦(Triticum aestivum)；作为属 于大麦属的植物，特别优选大麦(Hordeum vulgare)；作为属于玉蜀黍属的植 物，特别优选玉蜀黍(Zea mays)；作为属于高粱属的植物，特别优选高粱 (Sorghum bicolor)；作为属于短柄草属的植物，特别优选二穗短柄草 (Brachypodium distachyon)；作为属于椰子属的植物，特别优选椰子(Cocosnucifera)；作为属于万代兰属的植物，特别优选万代兰(Vandahybrid cultivar)； 作为属于鸢尾属的植物，特别优选荷兰鸢尾(Iris x hollandica)；作为属于醋栗 属的植物，特别优选黑加仑(黑醋栗)(Ribes nigrum)；作为属于石头花属的 植物，特别优选圆锥石头花(Gypsophila paniculata、Gypsophila elegans)；作 为属于葡萄属的植物，特别优选葡萄(Vitis vinifera、Vitis labrusca)；作为属 于金虎尾属的植物，特别优选西印度樱桃(Malpighia glabra)；作为属于西番 莲属的植物，特别优选西番莲(Passiflora edulis)；作为属于蓖麻属的植物，特 别优选蓖麻(Ricinus communis)；作为属于杨属属的植物，特别优选欧洲大叶 杨(Populus trichocarpa)；作为属于杨桃属的植物，特别优选杨桃(Averrhoa carambola)；作为属于苜蓿属的植物，特别优选蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)； 作为属于羽扇豆属的植物，特别优选羽扇豆(白羽扇豆)(Lupinusalbus)；作为属于大豆属的植物，特别优选大豆(Glycine max)；作为属于蝶豆属的植物， 特别优选蝶豆(Clitoria ternatea)；作为属于芸香属的植物，特别优选柠檬(Citrus limon)、酢橘(Citrus sudachi)、臭橙(Citrus sphaerocarpa)、葡萄柚(Citrus x paradisi)、日本柚子(Citru sjunos)莱檬(Citrus aurantifolia)、温州蜜柑(Citrus unshiu)以及甜橙(Citrus sinensis)；作为属于木橘属的植物，特别优选木橘 (Aegle marmelos)；作为属于荔枝属的植物，特别优选荔枝(Litchi chinensis)； 作为属于芒果属的植物，特别优选芒果(Mangifera indica)；作为属于榴莲属 的植物，特别优选榴莲(Durio zibethinus)；作为属于可可属的植物，特别优 选可可(Theobroma cacao)；作为属于石榴属的植物，特别优选石榴(Punica granatum)；作为属于克拉花属的植物，特别优选仙女扇(fairy fans)(Clarkia breweri)以及矮送春花(Red ribbons)(Clarkia concinna)；作为属于番石榴属的植物，特别优选番石榴(Psidium guajava)；作为属于类叶升麻属的植物， 特别优选美类叶升麻(Actaea racemosa)；作为属于罂粟属的植物，特别优选 罂粟(Papaversomniferum)、东方罂粟(Papaver orientale)以及大红罂粟(Papaver bracteatum)；作为属于茄属的植物，特别优选番茄(Solanum lycopersicum)； 作为属于辣椒属的植物，特别优选辣椒(Capsicum annuum)以及黄灯笼辣椒 (Capsicum chinense)；作为属于烟草属的植物，特别优选烟草(Nicotiana tabacum、Nicotiana attenuata)；作为属于矮牵牛属的植物，特别优选矮牵牛 (Petunia x hybrida)；作为属于木犀榄属的植物，特别优选油橄榄(Olea europaea)；作为属于马鞭草属的植物，特别优选美女樱(Glandularia x hybrida)；作为属于鼠尾草属的植物，特别优选一串红(Salvia splendens)；作为属于萝 芙木属的植物，特别优选印度萝芙木(Rauvolfia serpentina)；作为属于长春花 属的植物，特别优选长春花(Catharanthus roseus)；作为属于果香菊属的植物， 特别优选罗马甘菊(Chamaemelum nobile)。其中，优选香蕉、草莓、苹果、 梅子、西洋梨、蓝莓、猕猴桃、甜瓜、番木瓜及鳄梨。更优选香蕉、苹果、梅 子、西洋梨、蓝莓、猕猴桃、甜瓜、番木瓜及鳄梨。特别优选香蕉、苹果、西 洋梨、猕猴桃、甜瓜、番木瓜及鳄梨。
本发明中，植物的分类基于APG植物分类体系第3版(Botanical Journal of theLinnean Society，2009，161，105121)。
在选择AAT时，还可以分离上述AAT基因，导入例如常见宿主载体系统， 利用以该载体系统进行转化而得的微生物进行评价选择。例如，已经公开了若 干种AAT基因(例如，参照专利文献7)。也可以基于该信息制作DNA探针， 例如制作PCR中使用的引物，进行PCR，从而分离该基因。此外，还可以通 过常规方法进行AAT基因的全碱基序列合成。关于这些基因信息为已知的 AAT是否具有甲基丙烯酸酯的合成活性，可以通过上述方法同样地进行确认。 另一方面，对于基因信息尚不清楚的AAT，可以将AAT纯化，基于其蛋白质 通过基因工程学方法获得基因信息。
本发明中，作为优选的AAT基因，只要其翻译产物具有制造甲基丙烯酸 酯的能力则没有特别限定，可以从上述AAT酶源中适当选择。特别优选列举 苹果来源AAT基因(序列号77)、草莓来源AAT基因(序列号79)、草莓 来源AAT基因(序列号81)。
另外，本发明中AAT基因还包含编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质为 包含在野生型的氨基酸序列中置换、缺失或附加1或多个氨基酸而成的氨基酸 序列、且具有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性的蛋白质。
这里，用语“数个”是指1～40个、优选1～20个、更优选10个以下。为 了在基因中导入变异，可以通过Kunkel法、Gapped duplex法等公知方法并使 用利用位点特异性突变诱导法的变异导入用试剂盒，例如QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司)、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：宝生物公司)等。或者，也可以人 工合成具有包含变异的序列的整个基因。
本发明中，DNA的碱基序列的确认可以通过利用惯用的方法进行序列确 定来进行。例如，还可以基于桑格法使用适当的DNA测序仪对序列进行确认。
此外，本发明中，AAT基因还包括编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质 为与由野生型的氨基酸序列组成的蛋白质显示90％以上、优选95％以上、更 优选99.5％以上、进而优选99.9％以上的同源性，且具有由甲基丙烯酰辅酶A 和醇生成甲基丙烯酸酯的活性的蛋白质。
进而，本发明中，AAT基因还包括如下基因，所述基因与具有和野生型 的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交，且编码具有由甲基 丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性的蛋白质。
本说明书中，杂交的方法可以参照例如“Molecular Cloning，A LaboratoryManual 2nd ed.”(ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))、“Current Protocolsin Molecular Biology”(John Wiley&Sons(1987-1997))等。
本说明书中，严格条件可以列举例如：将固定有DNA的尼龙膜在包含 6×SSC(1×SSC为在1升水中溶解氯化钠8.76g、柠檬酸钠4.41g而成的溶液)、 1％SDS、100μg/ml鱼精DNA、0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮、 0.1％Ficoll的溶液中于65℃与探针一起保温20小时进行杂交的条件，但并非 仅限于此。本领域技术人员可以在这样的缓冲液的盐浓度、温度等条件的基础 上考虑其它的探针浓度、探针长度、反应时间等各项条件来设定杂交的条件。 作为杂交后的洗涤条件，可以列举例如“2×SSC、0.1％SDS、42℃”、“1×SSC、 0.1％SDS、37℃”，作为更严格的条件，可以列举例如“1×SSC、0.1％SDS、65℃”、 “0.5×SSC、0.1％SDS、50℃”等条件。
进而，本发明中，AAT基因还包含如下基因，所述基因由使用BLAST等 (例如，默认值即初始设定的参数)计算时与野生型的碱基序列显示80％以 上、更优选90％以上、最优选95％以上的同源性的碱基序列组成，且编码具 有由甲基丙烯酰辅酶A和醇生成甲基丙烯酸酯的活性的蛋白质。此外，上述 AAT基因的密码子可以根据转化中使用的微生物的密码子的使用频率进行变 更。
〔导入了AAT基因的重组微生物的制作〕
以本发明的具有甲基丙烯酸生成能力的微生物为宿主导入上述编码AAT 基因的DNA，在该微生物内转录翻译成蛋白质，从而能够制造甲基丙烯酸酯。 进而，还可以同时导入使甲基丙烯酸生成活性增强的酶基因(例如，ACD、 BCKAD等基因)。
对基因导入方法没有特别限定，优选所导入的DNA处于重组到载体中的 形态。即，使AAT基因以能够在上述宿主细胞内表达的形态重组到载体中并 将其导入宿主细胞。这些载体包括能够在宿主微生物中独立复制的载体、能够 重组到微生物基因组中的载体等，只要保持有AAT基因则没有特别限定，可 以使用适合于各微生物的载体。红球菌属细菌、类似菌中，还能够利用通过电 穿孔等导入的DNA具有容易重组到基因组的性质将能够表达的包含AAT基 因的DNA片段插入到基因组中。当在细胞内导入包含AAT基因在内的多个 基因时，可以以各基因能够表达的形态重组到1个或多个表达载体中。
本发明中能够使用的载体包括质粒载体、噬菌体(病毒)载体、粘粒载体 及人工染色体载体等，进而可以包含1个或多个能够选择的标记基因及适当的 表达调节序列。目前已知有多种宿主、载体系统，可以根据需要通过同样的方 法开发宿主、载体系统。
例如，作为用于对属于红球菌属(Rhodococcus)的微生物进行导入的载 体，可以使用pK1、pK2、pK3及pK4、以及pSJ034(参照日本特开平10-337185 号)、pSJ023及pSJ002(参照日本特开平10-24867号)等(不限于这些)公 知的载体。此外，还可以使用将公知的载体变成期望构成的载体。pSJ023作 为转化体Rhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ023(FERM BP-6232)保藏 在产业综合技术研究所专利生物保藏中心。
上述AAT基因向载体的插入可以使用本领域技术人员已知的基因重组技 术进行。例如，可以利用使用限制性酶内切和连接试剂盒的方法、使用拓扑异 构酶的方法、InFusion试剂盒(宝生物)等。插入载体中的基因可以连接、插 入至能够在宿主生物中调节各基因编码的蛋白质的转录翻译的启动子的下游。 此外，插入时，可以根据需要附加适当的接头。此外，可以根据需要连接欲进 行基因导入的宿主微生物能够利用的终止子序列、增强子序列、剪接信号序列、 poly(A)加尾信号序列、SD序列或Kozak序列等核糖体结合序列、选择标 记基因等。作为选择标记基因的例子，除了可以列举氨苄青霉素抗性基因、四 环素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等耐药 性基因以外，还可以列举氨基酸、核酸等营养素的细胞内生物合成相关基因、 或编码荧光素酶等荧光蛋白的基因等。也可以随着插入而对DNA编码的氨基 酸序列的一部分进行置换。
从上述观点出发，本发明的一例中，作为红球菌属用的载体，特别优选使 用对pK4进行变异处理而获得的pLK005。可以构建按照配置在pLK005启动 子的3’下游的方式连接、插入AAT基因，在启动子控制下表达AAT基因的 表达质粒载体。
载体中可以插入单独的AAT基因群、或其它选自增强甲基丙烯酸生成活 性的酶基因群中的任1个基因，也可以插入多个基因。在用于插入到载体中的 基因时，“多个”是指能够插入2～5个、2～4个、优选2～3个基因。此外， 在一个载体中插入多个基因时，这些基因优选形成操纵子。这里，“操纵子” 是指在同一启动子控制下转录的1或更多个基因所构成的核酸排列单位。
上述基因、优选处于载体形态的基因可以利用本领域技术人员已知的方法 导入到宿主微生物中。作为向宿主微生物中导入重组载体的方法，只要是适合 于宿主微生物的方法则没有特别限定，可以列举例如电穿孔法、原生质法、乙 酸锂法、磷酸钙法、脂质体转染法、接合转导法等。
(2)甲基丙烯酸的制造工序
(2-1)通过培养制造甲基丙烯酸
本发明的甲基丙烯酸的制造方法中，可以通过在包含可再生原料和/或生 物质的水性介质中培养上述微生物而在培养物中获得甲基丙烯酸。
[培养基]
微生物培养中使用的包含可再生原料和/或生物质的水性介质(培养基) 为微生物能够增殖的、包含至少一种碳源的包含充分营养素的固体培养基或液 体培养基。一些实施方式中，培养基优选配置成最适合于细胞的生存及增殖的 pH及盐浓度。
可再生原料及生物质只要能够产生甲基丙烯酸则没有特别限定。可再生原 料及生物质可以是植物性材料、动物性材料及生物降解性废弃物等。优选的可 再生原料及生物质为聚蛋白胨、肉浸膏、酵母提取物、玉米浆或大豆等的提取 物。这些提取物可以直接使用或进行部分纯化后使用。可再生原料可以是多糖 类、寡糖类及属于单糖类的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖及阿拉伯糖 以及它们的衍生物。进而，可再生原料及生物质还可以使用由这些糖类衍生或 代谢而产生的脂质、氨基酸类、有机酸类及醇类。作为优选的可再生原料，可 以列举葡萄糖、果糖、木糖等糖类；缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、谷氨 酸等氨基酸类；乙酸、丙酮酸、乳酸、乙酰乙酸、乙酰乳酸、2-氧代异戊酸、 丁酸、异丁酸、丙酸、苹果酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等酸；乙醇、正丙醇、 异丙醇、正丁醇、异丁醇等醇。这些可再生原料可以单独使用1种，也可以将 2种以上组合使用。
培养基中的可再生原料和/或生物质的浓度只要能够产生甲基丙烯酸则没 有特别限定。浓度为例如0.05～20(w/v)％、优选0.1～15(w/v)％、更优 选0.2～10(w/v)％。以0.2(w/v)％以上使用是由于能够提升微生物的甲基 丙烯酸产生能力，设为10(w/v)％以下是由于即使添加更多也确认不到效果 的飞跃性提升。
培养基中可以添加无机氮源或无机金属盐类等。作为无机氮源，使用例如 氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐等。
关于氮源在培养基中的浓度，只要能够产生甲基丙烯酸则没有特别限定。 浓度为例如0.01～10(w/v)％、优选0.05～8(w/v)％、更优选0.1～4(w/v)％。
作为无机金属盐，使用例如磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、 氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
关于无机盐类的培养基中的浓度，只要能够产生甲基丙烯酸则没有特别限 定。浓度为例如0.001～1.6(w/v)％、优选0.005～1.3(w/v)％、更优选0.01～ 1(w/v)％。使用0.01(w/v)％以上，是由于能够提升微生物的甲基丙烯酸 产生能力，设为1(w/v)％以下是由于即使添加更多也确认不到效果的飞跃 性提升。
此外，培养基中可以根据需要添加微量金属、维生素等。此外，可以根据 需要在培养基中追加添加微生物的生育所必须的各种有机物、无机物、表面活 性剂或通常使用的消泡剂等。
[培养条件]
微生物向培养基中的接种可以通过现有公知的方法进行。对培养方法也没 有特别限定，可以使用振荡培养、通气搅拌培养及静置培养等公知方法。
微生物的培养条件只要微生物能够生育、且生成甲基丙烯酸则没有特别限 定。培养可以在好氧条件下进行，也可以在厌氧条件下进行。
pH、温度及培养时间只要是微生物能够生育、且生成甲基丙烯酸的条件 则没有特别限定。pH优选3～10、更优选4～9、进而优选5～8。温度优选10～ 45℃、更优选15～40℃、进而优选20～35℃。培养时间优选10～1000小时、 更优选15～480小时、进而优选20～240小时。
可以按照使甲基丙烯酸的产生量与可再生原料和/或生物质的利用量的比 率达到最大的方式，对各菌株适当选择这些培养条件或将这些培养条件优化。 另外，通过适当调整碳源的量及培养条件还可以调整甲基丙烯酸的产生量。
作为用于积累0.04ppm以上的甲基丙烯酸的优选条件，在pH5.5～7.5的 条件下、使可再生原料和/或生物质的浓度直接或间接地维持在0.1％以上、将 温度调整至20～40℃的范围，在以上条件下反应3小时以上。进而，关于培 养液中的微生物浓度，在培养液的环境不适合于微生物或培养细胞的增殖、致 其死灭的比率不变高的范围内维持在高浓度的状态，这对于获得高效率的生产 性而言是优选的，例如，以干燥重量计维持在2g/L以上即可获得良好的生产 效率、提高生成物的积累浓度。
(2-2)利用静止菌体反应制造甲基丙烯酸
本发明的甲基丙烯酸的制造方法中，除了如上所述的在包含可再生原料和 /或生物质的水性介质中进行伴随有增殖的微生物培养的方法以外，还可以采 用以下方法。无论微生物是否具有增殖能力，均可以通过使预先培养的微生物 与包含可再生原料和/或生物质的水性介质接触，基于实质上不伴随增殖的静 止菌体反应产生甲基丙烯酸。
[反应液]
静止菌体反应中使用的包含可再生原料和/或生物质的水性介质(反应液) 中所包含的可再生原料及其浓度可以与上述通过培养制造甲基丙烯酸时相同。
反应液中可以添加无机金属盐类等。作为无机金属盐，使用例如磷酸一氢 钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳 酸钙等。
无机盐类在反应液中的浓度只要能够产生甲基丙烯酸则没有特别限定。浓 度为例如0.0001～2(w/v)％、优选0.0003～1.3(w/v)％、更优选0.001～1 (w/v)％。
此外，反应液中可以根据需要添加微量金属、维生素等。此外，可以根据 需要在反应液中追加添加反应所必须的各种有机物、无机物、表面活性剂或通 常使用的消泡剂等。
[反应条件]
静止菌体反应中，直接使用预先培养的微生物的培养液或通过过滤或离心 分离等回收的菌体。回收的微生物可以在再悬浮于适当的缓冲液等成为任意的 菌浓度后使用。缓冲液等使用生理盐水、磷酸钾缓冲液、tris-盐酸缓冲液、甘 氨酸-氢氧化钠缓冲液及硼酸-氢氧化钠缓冲液等。
此外，静止菌体反应中，还可以使用回收的微生物的处理物(例如，破碎 物、粗酶或纯化酶等)。进而，还可以将微生物或其处理物通过公知的方法固 定化在适当的载体上，在反应中使用该固定化物。
反应条件只要能够生成甲基丙烯酸则没有特别限定。反应可以在好氧条件 下进行也可以在厌氧条件下进行。对反应方法也没有特别限定，可以使用振荡 反应、通气搅拌反应及静置反应等公知方法。
pH、温度及反应时间只要是能够生成甲基丙烯酸的条件则没有特别限定。 pH优选3～10、更优选4～9、进而优选5～8。温度优选10～45℃、更优选 15～40℃、进而优选20～35℃。培养时间方面，在好氧条件下优选为10～180 小时、更优选15～150小时、进而优选20～120小时。
此外，出于将生成的甲基丙烯酸分离的目的，还可以预先添加有机溶剂以 2相体系进行反应。作为有机溶剂，可以使用例如直链状、支链状或环状的、 饱和或不饱和的脂肪族烃、饱和或不饱和的芳香族烃等中的一种或将2种以上 混合使用。具体而言，可以列举例如烃系溶剂(例如戊烷、己烷、环己烷、苯、 甲苯、二甲苯等)、卤代烃系溶剂(例如二氯甲烷、氯仿等)、醚系溶剂(例 如二乙基醚、二丙基醚、二异丙基醚、二丁基醚、叔丁基甲基醚、二甲氧基乙 烷等)、酯系溶剂(例如甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲 酯)等。通过预先添加这些有机溶剂，有时生成的甲基丙烯酸进入有机相，反 应能够高效进行。
可以按照使甲基丙烯酸的产生量与可再生原料和/或生物质的利用量的比 率达到最大的方式，对各菌株适当选择这些反应条件或将这些反应条件优化。 另外，通过适当调整碳源的量及反应条件还可以调整甲基丙烯酸的产生量。
本发明的甲基丙烯酸的制造方法中，还可以将上述的通过培养制造甲基丙 烯酸和通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸适当组合来进行。通过将2个方法组 合，能够更高效地生产甲基丙烯酸。进而，本发明的甲基丙烯酸的制造方法中， 除了使微生物接触作为培养基或静止菌体反应液制备的包含可再生原料和/或 生物质的水性介质的方法以外，还可以采用使微生物直接接触可再生原料和/ 或生物质的方法。
作为用于积累0.04ppm以上的甲基丙烯酸的优选条件，在pH5.5～7.5的 条件下、使可再生原料和/或生物质的浓度直接或间接地维持在0.1％以上、将 温度调整至20～40℃的范围，在以上条件下反应3小时以上。进而，关于反 应液中的微生物浓度，维持在高浓度的状态对于获得高效率的生产性而言是优 选的，例如，以干燥重量计维持在2g/L以上即可获得良好的生产效率、提高 生成物的积累浓度。
(2-3)甲基丙烯酸的回收
培养基中或反应液中生成的甲基丙烯酸及其生成量可以使用高效液相色 谱及LC-MS等常规方法进行检测、测定。
通过将过滤、离心分离、真空浓缩、离子交换或吸附色谱、溶剂提取、蒸 馏及结晶等公知的操作根据需要适当组合，可以从培养基或反应液中分离、纯 化甲基丙烯酸。
可以由获得的甲基丙烯酸通过酯化反应制造甲基丙烯酸酯。进而，还可以 在具有甲基丙烯酸生成能力的微生物(例如上述(i)～(xxiv)的菌株)中导 入甲基丙烯酸的酯化反应相关酶的基因而制造甲基丙烯酸酯。
(3)甲基丙烯酸酯的制造工序
(3-1)通过培养制造甲基丙烯酸酯
本发明中，甲基丙烯酸酯的制造可以如下进行：通过在包含可再生原料和 /或生物质的水性介质中，培养在具有甲基丙烯酸生成能力的微生物及它们的 衍生株中导入了AAT基因的基因重组微生物，从而在培养菌体或培养物中生 成、积累甲基丙烯酸酯，从该培养菌体或培养物或培养容器气相部回收甲基丙 烯酸酯。
[培养基]
微生物培养中使用的包含可再生原料和/或生物质的水性介质(培养基) 为微生物能够增殖的、包含至少一种碳源的包含充分营养素的固体培养基或液 体培养基。一些实施方式中，培养基优选配置成最适合于细胞的生存及增殖的 pH及盐浓度。
可再生原料及生物质只要能够产生甲基丙烯酸酯则没有特别限定。可再 生原料及生物质可以是植物性材料、动物性材料及生物降解性废弃物等。优选 的可再生原料及生物质为聚蛋白胨、肉浸膏、酵母提取物、玉米浆或大豆等的 提取物。这些提取物可以直接使用或进行部分纯化后使用。可再生原料可以是 多糖类、寡糖类及属于单糖类的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖及阿拉 伯糖以及它们的衍生物。进而，可再生原料及生物质还可以使用由这些糖类衍 生或代谢而产生的脂质、氨基酸类、有机酸类及醇类。作为优选的可再生原料， 可以列举葡萄糖、果糖、木糖等糖类；缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、谷 氨酸等氨基酸类；乙酸、丙酮酸、乳酸、乙酰乙酸、乙酰乳酸、2-氧代异戊酸、 丁酸、异丁酸、丙酸、苹果酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等酸；乙醇、正丙醇、 异丙醇、正丁醇、异丁醇等醇。这些可再生原料可以单独使用1种，也可以将 2种以上组合使用。
培养基中的可再生原料和/或生物质的浓度只要能够产生甲基丙烯酸酯则 没有特别限定。浓度为例如0.05～20(w/v)％、优选0.1～15(w/v)％、更 优选0.2～10(w/v)％。以0.2(w/v)％以上使用是由于能够提升微生物的甲 基丙烯酸酯产生能力，设为10(w/v)％以下是由于即使添加更多也确认不到 效果的飞跃性提升。
培养基可以根据目标甲基丙烯酸酯添加醇或酚类。醇或酚类优选使用上述 的醇或酚类。这些醇或酚类可以单独使用1种，也可以将2种以上组合使用。
醇或酚类在培养基中的浓度只要能够产生甲基丙烯酸酯则没有特别限定。 浓度为例如0.01～20(w/v)％、优选0.05～10(w/v)％、更优选0.1～5(w/v)％。 此外，醇或酚类既可以预先添加到培养基中也可以一边进行培养一边连续或分 2次以上间歇添加。
培养基中可以添加无机氮源或无机金属盐类等。作为无机氮源，使用例如 氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐等。
关于氮源在培养基中的浓度，只要能够产生甲基丙烯酸酯则没有特别限 定。浓度为例如0.01～10(w/v)％、优选0.05～8(w/v)％、更优选0.1～4 (w/v)％。
作为无机金属盐，使用例如磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、 氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
关于无机盐类在培养基中的浓度，只要能够产生甲基丙烯酸酯则没有特别 限定。浓度为例如0.001～1.6(w/v)％、优选0.005～1.3(w/v)％、更优选 0.01～1(w/v)％。使用0.01(w/v)％以上，是由于能够提升微生物的甲基 丙烯酸酯产生能力，设为1(w/v)％以下是由于即使添加更多也确认不到效 果的飞跃性提升。
此外，培养基中可以根据需要添加微量金属、维生素等。此外，可以根据 需要在培养基中追加添加微生物的生育所必须的各种有机物、无机物、表面活 性剂或通常使用的消泡剂等。
[培养条件]
微生物向培养基中的接种可以通过现有公知的方法进行。对培养方法也没 有特别限定，可以使用振荡培养、通气搅拌培养及静置培养等公知方法。
微生物的培养条件只要微生物能够生育、且生成甲基丙烯酸酯则没有特别 限定。培养可以在好氧条件下进行也可以在厌氧条件下进行。
pH、温度及培养时间只要是微生物能够生育、且生成甲基丙烯酸酯的条 件则没有特别限定。pH优选3～10、更优选4～9、进而优选5～8。温度优选 10～45℃、更优选15～40℃、进而优选20～35℃。培养时间优选10～1000 小时、更优选15～480小时、进而优选20～240小时。
可以按照使甲基丙烯酸酯的产生量与可再生原料和/或生物质的利用量的 比率达到最大的方式，对各菌株适当选择这些培养条件或将这些培养条件优 化。另外，通过适当调整碳源的量及培养条件还可以调整甲基丙烯酸酯的产生 量。
作为用于积累0.04ppm以上的甲基丙烯酸酯的优选条件，在pH5.5～7.5 的条件下、使可再生原料和/或生物质的浓度直接或间接地维持在0.1％以上、 且使醇或酚类的浓度直接或间接地维持在0.1％以上、将温度调整至20～40℃ 的范围，在以上条件下反应3小时以上。进而，关于培养液中的微生物浓度， 在培养液的环境不适合于微生物或培养细胞的增殖、致其死灭的比率不变高的 范围内维持在高浓度的状态，这对于获得高效率的生产性而言是优选的，例如， 以干燥重量计维持在2g/L以上即可获得良好的生产效率、提高生成物的积累 浓度。
(3-2)利用静止菌体反应制造甲基丙烯酸酯
本发明的甲基丙烯酸酯的制造方法中，除了如上所述的在包含可再生原料 和/或生物质的水性介质中进行伴随有增殖的微生物培养的方法以外，还可以 采用以下方法。无论微生物是否具有增殖能力，均可以通过使预先培养的微生 物与包含可再生原料和/或生物质的水性介质接触，基于实质上不伴随增殖的 静止菌体反应产生甲基丙烯酸酯。
[反应液]
静止菌体反应中使用的包含可再生原料和/或生物质的水性介质(反应液) 中所包含的可再生原料及其浓度可以与上述通过培养制造甲基丙烯酸酯时相 同。
静止菌体反应中使用的醇或酚类及其浓度与上述通过培养制造甲基丙烯 酸酯时相同。
反应液中可以添加无机金属盐类等。作为无机金属盐，使用例如磷酸一氢 钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳 酸钙等。
无机盐类在反应液中的浓度只要能够产生甲基丙烯酸酯则没有特别限定。 浓度为例如0.0001～2(w/v)％、优选0.0003～1.3(w/v)％、更优选0.001～ 1(w/v)％。
此外，反应液中可以根据需要添加微量金属、维生素等。此外，可以根据 需要在反应液中追加添加反应所必须的各种有机物、无机物、表面活性剂或通 常使用的消泡剂等。
[反应条件]
静止菌体反应中，直接使用预先培养的微生物的培养液或通过过滤或离心 分离等回收的菌体。回收的微生物可以在再悬浮于适当的缓冲液等以任意的菌 浓度使用。缓冲液等使用生理盐水、磷酸钾缓冲液、tris-盐酸缓冲液、甘氨酸 -氢氧化钠缓冲液及硼酸-氢氧化钠缓冲液等。
此外，静止菌体反应中，还可以使用回收的微生物的处理物(例如，破碎 物、粗酶或纯化酶等)。进而，还可以将微生物或其处理物通过公知的方法固 定化在适当的载体上，在反应中使用该固定化物。
反应条件只要能够生成甲基丙烯酸酯则没有特别限定。反应可以在好氧条 件下进行也可以在厌氧条件下进行。对反应方法也没有特别限定，可以使用振 荡反应、通气搅拌反应及静置反应等公知方法。
pH、温度及反应时间只要是能够生成甲基丙烯酸的条件则没有特别限定。 pH优选3～10、更优选4～9、进而优选5～8。温度优选10～45℃、更优选 15～40℃、进而优选20～35℃。反应时间方面，在好氧条件下优选为5～180 小时、更优选10～150小时、进而优选15～120小时。
此外，出于将生成的甲基丙烯酸酯分离的目的，还可以预先添加有机溶剂 以2相体系进行反应。作为有机溶剂，可以使用例如直链状、支链状或环状的、 饱和或不饱和的脂肪族烃、饱和或不饱和的芳香族烃等中的一种或将2种以上 混合后使用。具体而言，可以列举例如烃系溶剂(例如戊烷、己烷、环己烷、 苯、甲苯、二甲苯等)、卤代烃系溶剂(例如二氯甲烷、氯仿等)、醚系溶剂 (例如二乙基醚、二丙基醚、二异丙基醚、二丁基醚、叔丁基甲基醚、二甲氧 基乙烷等)、酯系溶剂(例如甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙 酸甲酯)等。通过预先添加这些有机溶剂，有时生成的甲基丙烯酸酯进入有机 相，反应能够高效进行。
可以按照使甲基丙烯酸酯的产生量与可再生原料和/或生物质的利用量的 比率达到最大的方式，对各菌株适当选择这些反应条件或将这些反应条件优 化。另外，通过适当调整碳源的量及反应条件还可以调整甲基丙烯酸酯的产生 量。
作为用于积累0.04ppm以上的甲基丙烯酸酯的优选条件，在pH5.5～7.5 的条件下、使可再生原料和/或生物质的浓度直接或间接地维持在0.1％以上、 且使醇或酚类的浓度直接或间接地维持在0.1％以上、将温度调整至20～40℃ 的范围，在以上条件下反应3小时以上。进而，关于反应液中的微生物浓度， 维持在高浓度的状态对于获得高效率的生产性而言是优选的，例如，以干燥重 量计维持在2g/L以上即可获得良好的生产效率、提高生成物的积累浓度。
本发明的甲基丙烯酸酯的制造方法中，还可以将上述的通过培养制造甲基 丙烯酸酯和通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸酯适当组合来进行。通过将2 个方法组合，能够更高效地生产甲基丙烯酸酯。进而，本发明的甲基丙烯酸酯 的制造方法中，除了使微生物接触作为培养基或静止菌体反应液制备的包含可 再生原料和/或生物质的水性介质的方法以外，还可以采用使微生物直接接触 可再生原料和/或生物质的方法。
(3-3)甲基丙烯酸酯的回收
培养基中或反应液中生成的甲基丙烯酸酯及其生成量可以使用高效液相 色谱及LC-MS等常规方法进行检测、测定。此外，挥发到培养容器或反应容 器的气相部(顶空部)中的甲基丙烯酸酯及其生成量可以使用气相色谱等常规 方法进行检测、测定。
通过将过滤、离心分离、真空浓缩、离子交换或吸附色谱、溶剂提取、蒸 馏及结晶等公知的操作根据需要适当组合，可以从培养基或反应液中分离、纯 化甲基丙烯酸酯。
2.甲基丙烯酸合成相关酶及其基因
以下详细说明作为本发明的一方面的甲基丙烯酸合成相关酶及其基因。
本发明人等对具有甲基丙烯酸衍生物的生产能力的微生物进行了广泛探 索，发现能够采用微生物生成甲基丙烯酸。根据探索的经过和现有技术推测其 合成途径为缬氨酸分解通路。
从与遗传病的关系考虑，对人和大鼠等的缬氨酸分解通路进行了研究 (Methodsin Enzymology，324：241-258(2000))。但是，关于微生物 的缬氨酸分解通路中的酶的见解少，细节尚不清楚。关于丝状菌中的构巢曲霉， 公开了如下结果：由缺失scdA基因的变异株的解析启示，scdA基因产物参与 异亮氨酸、缬氨酸及短链脂肪酸的代谢，具有作用于多个代谢通路的酰基辅酶 A脱氢酶活性(Fungal Genet.Biol.45：180-189(2008))。该结果为间接评 价，该酶对于实际的甲基丙烯酸生成是否有效尚不清楚。此外，对于微生物来 源的酶仅有细菌之一的放线菌链霉菌属的信息(Microbiology 145：2323-2334 (1999))。上述文献中，使用由天蓝色链霉菌克隆的ACD基因(acdH)、 并由大肠杆菌重组体制备的部分纯化酶确认了由异丁酰辅酶A生成甲基丙烯 酰辅酶A。本发明人等对此也进行了追加试验，虽然在以大肠杆菌为宿主的重 组体中确认到了显著的酶蛋白表达，但ACD活性方面仅确认到极微弱的活性， 判断该酶并不适合于甲基丙烯酸合成。
因此，本发明人等出于有效利用微生物的甲基丙烯酸合成相关酶的目的对 其它微生物的酶基因进行了探索，结果发现了下述这些有用的酶。
从本发明的具有一定甲基丙烯酸生产能力的微生物中选择了假单胞菌属 及红球菌属。
对于假单胞菌属微生物，恶臭假单胞菌、绿脓杆菌的缬氨酸同化能力是已 知的(Bacteriol.Review 40：42-54(1976))。红球菌属微生物的缬氨酸同 化能力虽非已知，但在本发明的过程中发明人等在实验中确认了其具有甲基丙 烯酸生产能力。基于基因组序列已经公开的绿脓杆菌PAO1和红串红球菌PR4具有推测参与甲基丙烯酸合成的ACD这一假设，通过同源检索从这些属 中对候选进行了列表。
之前的文献中记载了：存在相对于人的ACD即ACAD8显示高同源性的 细菌的同源基因(J.Mol.Evol.69：176-193(2009))(但是没有通过实验 确认活性)。此外，关于上述基因组序列已经公开的绿脓杆菌PAO1及红串 红球菌PR4的两种细菌，仅仅知晓存在酰基辅酶A脱氢酶和附注的开放阅读 框(ORF)这一信息。
对于两细菌的基因组序列信息，进行了与人ACAD8的氨基酸序列同源性 的检索，通过PCR法扩增获得了可见同源性的共6种ORF的基因，重组到大 肠杆菌用的表达载体中。使用这些表达载体制作重组体，研究了重组体中的同 源蛋白质的表达和重组体细胞提取液的ACD活性。
[ACD]
其结果是，导入了来自绿脓杆菌PAO1的命名为PA_acdA脱氢酶1的基 因和导入了来自红串红球菌PR4的命名为RE_acd1的基因的重组体可以获得 极高的活性(序列号51及53)。PA_acd1和RE_acd1各自编码的氨基酸序列 (序列号50及52)中相互显示57％的同源性。另一方面，未确认到活性的 PA_acd2、RE_acd2和仅确认到微弱的活性的acdH(链霉菌)与确认到高活性 的PA_acd1和RE_acd1的氨基酸水平的同源性如以下所示。PA_acd2与 PA_acd1及RE_acd1分别显示40％及41％的同源性。RE_acd2与PA_acd1及 RE_acd1分别显示36％的同源性。acdH与PA_acd1及RE_acd1分别显示38％ 及36％的同源性。
即，作为对于甲基丙烯酸合成有用的ACD之一，为(A)由PA_acd1或 RE_acd1编码的氨基酸序列(序列号50或52)组成、和(B)由PA_acd1或 RE_acd1编码的氨基酸序列(序列号50或52)在氨基酸序列水平显示45％以 上的同源性、更优选显示60％的同源性、进而优选显示80％以上的同源性的 氨基酸序列组成、且具有ACD活性的酶。或者，为(C)由在PA_acd1或RE_acd1 编码的氨基酸序列(序列号50或52)中缺失、置换、附加和/或插入1或多个 氨基酸的氨基酸序列组成、且具有ACD活性的酶。
此外，PA_acd1和RE_acd1各自编码的氨基酸序列(序列号50及52)的C末端起的70个氨基酸残基显示69％的同源性。另一方面，未确认到活性的 PA_acd2、RE_acd2和仅确认到微弱的活性的acdH(链霉菌)与确认到高活性 的PA_acd1和RE_acd1的C末端起的70个氨基酸残基的氨基酸水平的同源性 如以下所示。PA_acd2与PA_acd1及RE_acd1分别显示43％及43％的同源性。 RE_acd2与PA_acd1及RE_acd1分别显示38％的同源性。acdH与PA_acd1及RE_acd1分别显示43％及38％的同源性。
本发明中，对甲基丙烯酸的合成有用的ACD的其它方式为(D)由与 PA_acd1或RE_acd1编码的氨基酸序列(序列号50或52)的C末端起的70 个氨基酸残基的氨基酸序列显示60％以上的同源性、更优选显示65％以上的 同源性、进而优选显示80％以上的同源性的氨基酸序列组成、且具有ACD活 性的酶。
作为本发明的甲基丙烯酸的制造方法中特别有用的ACD基因之一为选自 以下基因组成的组中的基因。
(a)编码由序列号50或52所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因、
(b)由序列号51或52所示的碱基序列组成的基因、
(c)编码由与序列号50或52所示的氨基酸序列组成的蛋白质显示45％ 以上的同源性的氨基酸序列组成、且具有ACD活性的蛋白质的基因、及
(d)编码由在序列号50或52所示的氨基酸序列中缺失、置换、附加和/ 或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有ACD活性的蛋白质的基因。
本发明中ACD作为甲基丙烯酸合成酶之一是有用的，且只要来源于本发 明的具有一定甲基丙烯酸生成能力的微生物则没有特别限定。
更优选来源于假单胞菌属及红串红球菌，作为优选的菌株，可以列举红串 红球菌PR-4株、红串红球菌KA2-5-1株、红串红球菌IGTS8株、红串红球菌 D-1株、红串红球菌H-2株、红串红球菌N1-36株、红串红球菌I-19株、红串 红球菌ECRD-1株、红串红球菌B1株、红串红球菌SY-1株、红串红球菌UM3 株、红串红球菌UM9株或红球菌T09株等，特别优选列举红串红球菌PR-4 株。
以上记载了作为参与甲基丙烯酸合成的酶之一的ACD及其基因的获得。
[BCKAD]
下面记载参与甲基丙烯酸合成的BCKAD。BCKAD为能够由2-氧代异戊 酸生成异丁酰辅酶A的酶。可以由本发明的具有一定甲基丙烯酸生产能力的 微生物获得BCKAD及其基因。
来源于恶臭假单胞菌、绿脓杆菌的BCKAD为由4个多肽组成的复合体(序 列号54、56、58及60)、它们的基因(序列号55、57、59及61)形成操纵 子，这是已知的(Methods inEnzymology(2000)324:129-138)。
作为该基因的获得方法，例如可以由绿脓杆菌PAO1的基因组序列设计 用于扩增整个BCKAD操纵子的引物，以基因组DNA为模板通过PCR反应扩 增整个操纵子，重组到大肠杆菌用的表达载体中，从而构建用于表达BCKAD 的载体。使用该载体制作重组体，可以获得BCKAD基因及BCKAD。
本发明中，BCKAD只要作为对于甲基丙烯酸合成有用的酶之一来使用且 来源于本发明的具有一定甲基丙烯酸生成能力的微生物，则对其基因没有特别 限定，可以例示例如选自下述(e)～(h)、(i)～(l)、或(m)～(p) 组成的组中的基因。
(e)编码具有序列号54、56、58及60所示的氨基酸序列的4个多肽的 基因。
(f)由序列号55、57、59及61所示的碱基序列组成的基因。
(g)与编码具有序列号54、56、58及60所示的氨基酸序列的4个多肽 的基因的互补链在严格条件下杂交、且编码具有BCKAD活性的蛋白质的基 因。
(h)由在序列号54、56、58及60所示的氨基酸序列中缺失、置换、附 加和/或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且编码具有BCKAD活性的 蛋白质的基因。
(i)编码具有序列号62、64、66及68所示的氨基酸序列的4个多肽的 基因。
(j)由序列号63、65、67及69所示的碱基序列组成的基因。
(k)与编码具有序列号62、64、66及68所示的氨基酸序列的4个多肽 的基因的互补链在严格条件下杂交、且编码具有BCKAD活性的蛋白质的基 因。
(l)由在序列号62、64、66及68所示的氨基酸序列中缺失、置换、附 加和/或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且编码具有BCKAD活性的 蛋白质的基因。
(m)编码具有序列号70、72及74所示的氨基酸序列的3个多肽的基因。
(n)由序列号71、73及75所示的碱基序列组成的基因。
(o)与编码具有序列号70、72及74所示的氨基酸序列的3个多肽的基 因的互补链在严格条件下杂交、且编码具有BCKAD活性的蛋白质的基因。
(p)由在序列号70、72及74所示的氨基酸序列中缺失、置换、附加和/ 或插入1或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且编码具有BCKAD活性的蛋白质 的基因。
本发明中，编码BCKAD的基因并不限于上述序列，具有与上述序列号所 述的碱基序列具有约50％以上、优选约60％以上、更优选约70％以上、进而 优选约80％以上、特别优选约90％以上、进而特别优选约95％以上、最优选 约98％以上的同源性的碱基序列的基因，只要其编码具有BCKAD活性的蛋 白质则也包含在编码BCKAD的基因中。
本发明中BCKAD可以列举例如具有序列号54、56、58及60所示的氨基 酸、序列号62、64、66及68所示的氨基酸序列或序列号70、72及74所示的 氨基酸序列的BCKAD。
本发明中，BCKAD并不限于具有上述序列的BCKAD，包含上述序列号 所述的氨基酸序列具有约50％以上、优选约60％以上、更优选约70％以上、 进而优选约80％以上、特别优选约90％以上、进而特别优选约95％以上、最 优选约98％以上的同源性的氨基酸序列、且具有BCKAD活性的蛋白质也包 含在本发明中的BCKAD中。
上述同源性的数值是使用作为序列解析软件的GENETYX(GENETYX CORPORATION)运行同源性解析程序而求出的。此时的参数为默认值设定 (初始设定)。
此外，本发明中，BCKAD还包括在序列号54、56、58及60所示的氨基 酸、序列号62、64、66及68所示的氨基酸序列或序列号70、72及74所示的 氨基酸序列中包含缺失、置换、附加和/或插入1个或数个氨基酸的氨基酸序 列、且具有BCKAD活性的蛋白质。
更具体而言，可以列举包含以下氨基酸序列、且具有BCKAD活性的蛋白 质。
可以列举：(i)在序列号54、56、58及60所示的氨基酸、序列号62、 64、66及68所示的氨基酸序列或序列号70、72及74所示的氨基酸序列中缺 失1～20个(例如1～10个、优选1～5个、进而优选1～2个)氨基酸的氨基 酸序列、
(ii)序列号54、56、58及60所示的氨基酸、序列号62、64、66及68 所示的氨基酸序列或序列号70、72及74所示的氨基酸序列的1～20个(例如 1～10个、优选1～5个、进而优选1～2个)氨基酸置换为其它氨基酸的氨基 酸序列、
(iii)在序列号54、56、58及60所示的氨基酸、序列号62、64、66及 68所示的氨基酸序列或序列号70、72及74所示的氨基酸序列中附加1～20 个(例如1～10个、优选1～5个、进而优选1～2个)氨基酸的氨基酸序列、
(iv)在序列号54、56、58及60所示的氨基酸、序列号62、64、66及 68所示的氨基酸序列或序列号70、72及74所示的氨基酸序列中插入1～20 个(例如1～10个、优选1～5个、进而优选1～2个)氨基酸的氨基酸序列、
(v)上述(i)～(iv)组合成的氨基酸序列。
置换氨基酸序列的1个或数个氨基酸时，优选类似氨基酸残基间的保守置 换。例如氨基酸基于其侧链的性质分类为疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、 W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具 有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基侧链的氨基酸(S、 T、Y)、具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸及酰胺侧链的氨 基酸(D、N、E、Q)、具有含碱基侧链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香 族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。已知分类于各组的氨基酸彼此置换时，维 持该多肽活性的可能性高，这样的氨基酸的彼此置换是优选的。可以列举例如 甘氨酸和脯氨酸、甘氨酸和丙氨酸或缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸、谷氨酸和谷 氨酰胺、天冬氨酸和天冬酰胺、半胱氨酸和苏氨酸、苏氨酸和丝氨酸或丙氨酸、赖氨酸和精氨酸间的置换。
此外，与前述氨基酸序列的缺失、置换、附加和/或插入相应地，在序列 号55、57、59及61所示的碱基序列、序列号63、65、67及69所示的碱基序 列或序列号71、73及75所示的碱基序列中发生数个碱基缺失、置换、附加和 /或插入等变异的碱基序列，只要其编码本发明中具有BCKAD活性的蛋白质， 则也包含在编码BCKAD的基因中。另外，缺失、置换、附加和/或插入的碱 基的个数为30个以下、优选15个以下、特别优选6个以下。进而，由与以下 基因互补的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交的DNA，只要其编码具有 BCKAD活性的蛋白质则也包含于编码BCKAD的基因，所述基因为由序列号 55、57、59及61所示的碱基序列组成的基因、由序列号63、65、67及69所 示的碱基序列组成的基因或由序列号71、73及75所示的碱基序列组成的基因。
以上记载了作为参与甲基丙烯酸合成的酶的例子的ACD及BCKAD的酶 蛋白及它们的基因的获得。本发明中，进而也可以同样获得直接或间接参与甲 基丙烯酸合成的其它酶及其基因。
例如，参与甲基丙烯酸合成的酶可以以该活性为指标使用常规方法进行纯 化。此外，可以基于其蛋白质通过基因工程学方法获得基因信息。或者，对本 发明具有一定甲基丙烯酸合成能力的微生物确定其全基因组序列。使用关于编 码目标酶的基因序列的公知信息进行同源检索，由其基因组序列寻找同源性高 的基因序列，通过公知的方法对其基因进行分离或全合成，导入常见宿主载体 系统，通过用该载体系统进行转化的微生物表达候选蛋白并评价目标酶的活 性，从能够进行选择。另外，随着新一代测序仪的普及，本领域技术人员能够 容易地解析微生物的全基因组序列。
进而，本发明的具有一定甲基丙烯酸合成能力的微生物包含由于ACD的 脱氢反应而脱离的电子的受体及其传递系统的相关蛋白以及其基因，这些也包 含在本发明中。
进而，由具有甲基丙烯酸合成能力的微生物获得的参与甲基丙烯酸合成的 酶能够各自单独或多种一起制造甲基丙烯酸衍生物及其中间体。例如，BCKAD 能够由2-氧代异戊酸制造异丁酰辅酶A，ACD能够由异丁酰辅酶A制造甲基 丙烯酰辅酶A。通过将BCKAD及ACD两者的反应组合，可以由2-氧代异戊 酸制造甲基丙烯酰辅酶A。进而，能够通过加入具有水解AAT或甲基丙烯酰 辅酶A活性的酶分别制造甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸。
参与甲基丙烯酸合成的酶可以如上述那样分离基因、利用常见宿主载体制 作重组体(转化体)、对上述重组体进行培养而获得。作为宿主，在为细菌时 可以列举大肠杆菌、红球菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属、链球 菌属、链霉菌属等，在为酵母时可以列举酵母属、假丝酵母属、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属，作为丝状菌时可以列举曲霉属等。在 以获得酶(蛋白质)为目标时，使用大肠杆菌是简便且高效的，故而优选。还 能够在同一宿主中表达多个参与甲基丙烯酸合成的酶。关于由转化体的培养液获得酶，例如可以在回收菌体后通过将菌体破碎，提取，离心分离等方法进行 收集。
这样获得的酶，可以通过在其酶发挥作用的条件下使其与成为原料的化合 物接触从而获得各目标产物。
实施例
以下基于实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。
＜实施例1：甲基丙烯酸生产菌的探索＞
将由日本国内的不同的地点采集的土壤及昆虫作为微生物源，通过富集培 养进行甲基丙烯酸生产菌的探索。缬氨酸的代谢中间体中包含作为甲基丙烯酸 衍生物的甲基丙烯酰辅酶A，因此使用包含L-缬氨酸的培养基，以缬氨酸的 同化性为指标进行筛选。
[由土壤分离]
在灭菌水5mL中加入适量土壤，搅拌，静置后，将适量的上清液添加到 10ml液体培养基中。培养基的组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001341
在30℃震荡培养3～7天。将生育出的菌株接种到同一培养基中，继续进 行数次驯化培养。然后，接种到在同一培养基中加入了1.5％的琼脂的琼脂培 养基中，在30℃培养48小时，使其形成菌落。使用白金环刮取菌落，接种到 琼脂培养基(LB培养基、琼脂1.5％)中，在30℃培养48小时，获得分离株 (B25-2株、D22-1株、D43-1株、D25株、D26株、D29株、D41-2株、R1 株、B13株)。LB培养基的组成为1％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提 取物、0.5％NaCl。
[由昆虫分离]
将采集的淡蓝步甲(Carabus insulicola)在饥饿状态下饲养2天后，将虫 体用95％乙醇及灭菌的生理盐水分别洗涤2次。分离出虫体腹部悬浮在0.3mL 的灭菌水中后，将上清液0.1mL添加至LB液体培养基中，在30℃培养48小 时。将适量的培养上清液添加到10ml液体培养基中。培养基的组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001351
在30℃震荡培养3～7天。将生育出的菌株接种到同一培养基中，继续进 行数次驯化培养。然后，接种到在同一培养基中加入了1.5％的琼脂的琼脂培 养基中，在30℃培养48小时，使其形成菌落。使用白金环刮取菌落接种到琼 脂培养基(LB培养基、琼脂1.5％)中，在30℃培养48小时，获得分离株(G1 株、G2株)。
这些分离株的菌学性质示于下表。表中，“+”表示阳性、“-”表示阴性、“+ w”表示弱反应。
(1)假单胞菌(Pseudomonas sp.)B25-2的菌学性质
[表1-1]
Figure BDA0003311327820001361
[表1-2]
Figure BDA0003311327820001371
按照常规方法确定B25-2株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号1)。
B25-2株的16S rDNA的部分碱基序列相对于假单胞菌属(Pseudomonas) 的16SrDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于栖稻假单胞菌(Pseudomonas orizihabitans)IAM(东京大学分子细胞生物学研究所菌种保藏中心)1568株 (NBRC102199)及日本假单胞菌(Pseudomonas japonica)IAM 15071株 (NBRC103040)显示出最高同源性，为99.2％。(NBRC株可以从独立行政 法人制品评价技术基盘机构微生物中心获得。)
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，B25-2株包 含于假单胞菌属(Pseudomonas)的种形成的簇。此外，B25-2株显示出不同 于假单胞菌属(Pseudomonas)的簇中任一已知种的、独立的分子系统学的位 置。
B25-2株不还原硝酸盐，显示出精氨酸水解酶活性，不水解明胶，同化葡 萄糖、D-甘露糖及葡糖酸钾等，不同化L-阿拉伯糖及D-甘露醇等，在Kings’B 琼脂培养基中产生荧光色素，显示运动性，过氧化氢酶反应及氧化酶反应均显 示阳性，不水解淀粉。这些性状虽然与假单胞菌属(Pseudomonas)的性状不 存在矛盾，但也与任一已知种的性状均不一致。
因此，B25-2株鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。B25-2株于2012年 11月7日在独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)、专利生物保藏中心 (邮编292-0818、日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)中以保藏号NITE BP-1451进行国际保藏。
(2)假单胞菌(Pseudomonas sp.)D22-1的菌学性质
[表2-1]
Figure BDA0003311327820001391
[表2-2]
Figure BDA0003311327820001401
按照常规方法确定D22-1株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号2)。
D22-1株的16S rDNA的部分碱基序列相对于假单胞菌属(Pseudomonas) 的16SrDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于伞菌假单胞菌(Pseudomonas agarici)LMG2112株显示出最高同源性，为98.8％。
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，D22-1株包 含于假单胞菌属(Pseudomonas)的种形成的簇。此外，D22-1株虽然形成与 Pseudomonasabietaniphila同样的簇，但在两者之间确认到了差距。
D22-1株不还原硝酸盐，显示出精氨酸水解酶活性，不显示脲酶活性，不 水解明胶，同化葡萄糖、D-甘露糖及N-乙酰基-D-葡糖胺等，不同化L-阿拉伯 糖及D-甘露醇等，在Kings’B琼脂培养基中不产生荧光色素，显示运动性， 过氧化氢酶反应及氧化酶反应均显示阳性。这些性状虽然与假单胞菌属 (Pseudomonas)的性状一致，但与任一已知种的性状均不一致。
因此，D22-1株鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。D22-1株于2012 年11月7日以保藏号NITE BP-1452进行了国际保藏。
(3)阴城假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)D43-1的菌学性质
[表3-1]
Figure BDA0003311327820001421
[表3-2]
Figure BDA0003311327820001431
按照常规方法确定D43-1株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号3)。
D43-1株的16S rDNA的部分碱基序列相对于假单胞菌属(Pseudomonas) 的16SrDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于阴城假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)Ps33-10株显示出最高同源性，为100％。
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，D43-1株包 含于假单胞菌属(Pseudomonas)的种形成的簇。此外，D43-1株与阴城假单 胞菌(Pseudomonasumsongensis)及Pseudomonas mohnii形成簇，与这2个种 显示相同的分子系统学的位置。
D43-1株还原硝酸盐，显示出精氨酸水解酶活性，不显示脲酶活性，不水 解明胶，同化葡萄糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖等，不同化D-甘露醇及N-乙酰 基-D-葡糖胺等，在Kings’B琼脂培养基中产生荧光色素，显示运动性，过氧 化氢酶反应及氧化酶反应均显示阳性。这些性状与阴城假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)的性状基本一致。
因此，D43-1株鉴定为阴城假单胞菌(Pseudomonas umsongensis)。D43-1 株于2012年11月7日以保藏号NITE BP-1453进行了国际保藏。
(4)假单胞菌(Pseudomonas sp.)D25的菌学性质
[表4-1]
Figure BDA0003311327820001451
[表4-2]
Figure BDA0003311327820001461
按照常规方法确定D25株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号4)。
D25株的16S rDNA的部分碱基序列相对于假单胞菌属(Pseudomonas) 的16S rDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于恶臭假单胞菌ATCC 12633 株、褐鞘假单胞菌MAFF301177株、铁角蕨假单胞菌ATCC 23835株及伞菌 假单胞菌LMG 2112株显示出最高同源性，为99.0％。
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，D25株包含 于假单胞菌属(Pseudomonas)的种形成的簇。此外，D25株显示出不同于假 单胞菌属(Pseudomonas)的簇中任一已知种的、独立的分子系统学的位置。
D25株还原硝酸盐，显示出精氨酸水解酶活性，不显示脲酶活性，不水解 明胶，同化葡萄糖、L-阿拉伯糖及D-甘露醇等，不同化D-甘露糖、麦芽糖等， 在Kings’B琼脂培养基中不产生荧光色素，显示运动性，过氧化氢酶反应及氧 化酶反应均显示阳性。这些性状虽然与假单胞菌属(Pseudomonas)的性状一 致，但与启示高同源性的恶臭假单胞菌、褐鞘假单胞菌、铁角蕨假单胞菌及伞 菌假单胞菌在同化性、荧光色素产生方面确认到差异。
因此，D25株鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。D25株于2012年11 月7日以保藏号NITE BP-1454进行了国际保藏。
(5)假单胞菌(Pseudomonas sp.)D26的菌学性质
[表5-1]
Figure BDA0003311327820001481
[表5-2]
Figure BDA0003311327820001491
按照常规方法确定D26株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号5)。
D26株的16S rDNA的部分碱基序列相对于假单胞菌属(Pseudomonas) 的16S rDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于恶臭假单胞菌ATCC 12633 株、褐鞘假单胞菌MAFF301177株及铁角蕨假单胞菌ATCC 23835株显示出 最高同源性，为98.6％。
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，D26株包含 于假单胞菌属(Pseudomonas)的种形成的簇。此外，D25株与恶臭假单胞菌、 褐鞘假单胞菌、铁角蕨假单胞菌及伞菌假单胞菌形成簇，与其中的恶臭假单胞 菌、褐鞘假单胞菌及铁角蕨假单胞菌这3种显示相同的分子系统学的位置。
D26株还原硝酸盐，不显示精氨酸水解酶活性及脲酶活性，不水解明胶， 同化葡萄糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖等，不同化麦芽糖及己二酸，在Kings’B 琼脂培养基中产生荧光色素，显示运动性，过氧化氢酶反应及氧化酶反应均显 示阳性，不水解淀粉。这些性状与显示近缘性的恶臭假单胞菌、褐鞘假单胞菌 及铁角蕨假单胞菌的性状虽然具有相似之处，但也确认到差异。特别是在还原 硝酸盐、不显示精氨酸水解酶活性方面与这些种不同。
因此，D26株鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。D26株于2012年11 月7日以保藏号NITE BP-1455进行了国际保藏。
(6)假单胞菌(Pseudomonas sp.)D29的菌学性质
[表6-1]
Figure BDA0003311327820001511
[表6-2]
Figure BDA0003311327820001521
按照常规方法确定D29株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号6)。
D29株的16S rDNA的部分碱基序列相对于假单胞菌属(Pseudomonas) 的16S rDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于温哥华假单胞菌 (Pseudomonas vancouverensis)DhA-51株显示出最高同源性，为99.6％。
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，D29株与阴 城假单胞菌、Pseudomonas mohnii、禾草假单胞菌形成簇，与其中的阴城假单 胞菌及Pseudomonasmohnii显示出相同的分子系统学的位置。
D29株还原硝酸盐，显示出精氨酸水解酶活性，不显示脲酶活性，不水解 明胶，同化葡萄糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖等，不同化N-乙酰基-D-葡糖胺、 麦芽糖及己二酸，在Kings’B琼脂培养基中不产生荧光色素，显示运动性，过 氧化氢酶反应及氧化酶反应均显示阳性。这些性状与显示近缘性的阴城假单胞 菌及Pseudomonas mohnii的性状虽有相似之处，但也确认到差异。特别是在不 显示精氨酸水解酶活性这点上与这2个种均不同，在还原硝酸盐这点上与 Pseudomonas mohnii的性状不同。
因此，D29株鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。D29株于2012年11 月7日以保藏号NITE BP-1456进行了国际保藏。
(7)假单胞菌(Pseudomonas sp.)D41-2的菌学性质
[表7-1]
Figure BDA0003311327820001541
[表7-2]
Figure BDA0003311327820001551
按照常规方法确定D41-2株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号7)。
D41-2株的16S rDNA的部分碱基序列相对于假单胞菌属(Pseudomonas) 的16SrDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于温哥华假单胞菌DhA-51株 显示出最高同源性，为99.8％。
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，D41-2株包 含于假单胞菌属(Pseudomonas)的种形成的簇。此外，D41-2株与温哥华假 单胞菌及Pseudomonasmoorei形成簇，与这2个种显示相同的分子系统学的位 置。
D41-2株还原硝酸盐，显示出精氨酸水解酶活性，不水解明胶，同化葡萄 糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖等，不同化麦芽糖及己二酸，在Kings’B琼脂培 养基中产生荧光色素，显示运动性，过氧化氢酶反应及氧化酶反应均显示阳性。 这些性状虽然与暗示其归属的温哥华假单胞菌及Pseudomonas moorei的性状 确认到多处相似之处，但也确认到差异。特别是在产生荧光色素、还原硝酸盐 这点上与Pseudomonas moorei的性状不同，在显示精氨酸水解酶活性这点上与 温哥华假单胞菌的性状不同。
因此，D41-2株鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。D41-2株于2012 年11月7日以保藏号NITE BP-1457进行了国际保藏。
(8)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)G1的菌学性质
[表8-1]
Figure BDA0003311327820001571
[表8-2]
Figure BDA0003311327820001581
按照常规方法确定G1株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号9)。
G1株的16S rDNA的部分碱基序列相对于芽孢杆菌属(Bacillus)的16S rDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于苏云金芽孢杆菌ATCC 10792株显 示出最高同源性，为99.8％。
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，G1株包含 于芽孢杆菌属(Bacillus)的种形成的簇。此外，G1株与苏云金芽孢杆菌形成 簇，两者显示相同的分子系统学的位置。
G1株发酵甘油、核糖及葡萄糖，不发酵D-木糖、L-木糖及半乳糖等，不 显示β-半乳糖苷酶活性、脲酶活性，利用柠檬酸，不产生吲哚，产生乙偶姻， 不还原硝酸盐，在45℃不生育，厌氧条件下生育，水解淀粉。这些性状虽然 与显示其归属的苏云金芽孢杆菌的性状基本一致，但在不还原硝酸盐这点与苏 云金芽孢杆菌的典型性状不同。无法否定的是，生理、生物化学性状的差异可 能仅是菌株水平的差异。
因此，G1鉴定为苏云金芽孢杆菌。G1株于2012年11月7日以保藏号 NITE BP-1458进行了国际保藏。
(9)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)G2的菌学性质
[表9-1]
Figure BDA0003311327820001601
[表9-2]
Figure BDA0003311327820001611
按照常规方法确定G2株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号10)。
G2株的16S rDNA的部分碱基序列相对于芽孢杆菌属(Bacillus)的16S rDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于苏云金芽孢杆菌ATCC 17092株显 示出最高同源性，为99.2％。
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，G2株包含 于芽孢杆菌属(Bacillus)的种形成的簇。此外，G2株与苏云金芽孢杆菌形成 簇，两者显示相同的分子系统学的位置。
G2株发酵甘油、核糖及葡萄糖，不发酵D-木糖、L-木糖及半乳糖等，不 显示β-半乳糖苷酶活性、脲酶活性，利用柠檬酸，不产生吲哚，产生乙偶姻， 不还原硝酸盐，在45℃不生育，厌氧条件下生育，水解淀粉。这些性状虽然 与显示其归属的、苏云金芽孢杆菌的性状基本一致，但在不还原硝酸盐这一点 与苏云金芽孢杆菌的典型的性状不同。无法否定的是，生理、生物化学性状的 差异可能仅是菌株水平的差异。
因此，G2株鉴定为苏云金芽孢杆菌。G2株于2012年11月7日以保藏号 NITE BP-1459进行了国际保藏。
(10)芽孢杆菌(Bacillus sp.)R1的菌学性质
[表10-1]
Figure BDA0003311327820001631
[表10-2]
Figure BDA0003311327820001641
按照常规方法确定R1株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号11)。
R1株的16S rDNA的部分碱基序列相对于芽孢杆菌属(Bacillus)的16S rDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于Bacillus oceanisediminis H2株显示 出最高同源性，为98.9％。
基于16S rDNA的部分碱基序列的简易分子系统解析的结果，R1株包含 于芽孢杆菌属(Bacillus)的种形成的簇。此外，R1株与Bacillus oceanisediminis 形成簇，表明二者为近缘。
R1株氧化甘油、核糖及D-木糖等，不氧化D-阿拉伯糖及L-木糖等，不 显示精氨酸水解酶活性，水解明胶，还原硝酸盐，形成芽胞，在45℃不生育， 不水解淀粉。这些性状虽然与显示近缘性的Bacillus oceanisediminis的性状存 在相似之处，但也确认到差异。特别是在不显示精氨酸水解酶活性、在45℃ 不生育、不水解淀粉等方面与Bacillusoceanisediminis的性状不同。
因此，R1株鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。R1株于2012年11月7日 以保藏号NITE BP-1460进行了国际保藏。
(11)鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)B13的菌学性质
[表11-1]
Figure BDA0003311327820001661
[表11-2]
Figure BDA0003311327820001671
按照常规方法确定B13株的16S rDNA的部分碱基序列(序列号16)。
B13株的16S rDNA的部分碱基序列相对于鞘氨醇杆菌属 (Sphingobacterium)的16S rDNA的碱基序列显示出高同源性，相对于泗阳 鞘氨醇杆菌SY1株显示出最高同源性，为97.4％。
B13株不还原硝酸盐，不发酵葡萄糖，显示出脲酶及β-半乳糖苷酶活性， 水解七叶苷及明胶，同化葡萄糖、D-甘露糖及麦芽糖等，不同化L-阿拉伯糖 及D-甘露醇等，不显示运动性，显示过氧化氢酶活性，不产生吲哚。这些性 状虽然可认为与鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)的性状一致，但未发现与B13株的性状一致的已知种。
因此，B13株鉴定为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)。B13株于2012 年11月7日以保藏号NITE BP-1461进行了国际保藏。
＜实施例2：使用合成培养基制造甲基丙烯酸＞
使用实施例1中获得的分离株，在合成培养基中进行甲基丙烯酸的制造。
使D22-1株、D41-2株或D43-1株在琼脂培养基(LB培养基、琼脂1.5％) 中生育，在10ml液体培养基中接种1白金环菌。培养基的组成如下所示。在 30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行19～22小时培养(预培养)。
Figure BDA0003311327820001681
将2ml预培养液接种到100mL液体培养基(培养基100ml/500ml容量三 角烧瓶)。培养基的组成与预培养培养基相同。在30℃、旋转振动筛(230rpm)、 好氧条件下进行44～72小时培养(正式培养)。
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(12000rpm、10分钟)，将 上清液部分分级。通过HPLC对培养液上清液中包含的化合物进行分析。HPLC 分析条件如下所示。
装置：e2695(Waters公司制)
柱：有机酸分析用离子排阻型聚合物柱T-132-E(WAKO公司制)
洗脱液：0.1％(v/v)磷酸溶液
流速：0.5ml/分钟
柱温度：40℃
样品注入量：10μl
分析时间：40min
检测器：UV
分析样品在用洗脱液适当稀释后均用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)进行膜滤器过滤处理后使用。分析的结果是， 在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间(31.15分钟)处确认到峰。“表12”中示出正 式培养结束时的各培养液上清液中的甲基丙烯酸浓度。
[表12]
Figure BDA0003311327820001691
对上述峰进行了CG/MS分析。GC/MS分析条件如下所示。
装置：6890/5875A(Agilent Technologies公司制)
柱：DB-FFAP柱(J&W公司制)
载气：He
烘箱温度：50℃(1分钟)之后以5℃/分钟升温至150℃，进而以20℃/ 分钟升温至250℃。
注入口温度：200℃
柱流量：1ml/分钟(恒流模式)
分流比：1/50
样品注入量：1μl
检测器：MSD(EI)
获得的总离子色谱示于图2，所观测的峰的质谱示于图3。解析的结果是， 确认了在与甲基丙烯酸相同的保持时间(17.15min)处观测到的峰是甲基丙烯 酸。
＜实施例3：使用天然培养基制造甲基丙烯酸＞
使用实施例1中获得的分离株，在天然培养基中进行甲基丙烯酸的制造。
使G2株在琼脂培养基(LB培养基、琼脂1.5％)中生育，在10ml液体 培养基中接种1白金环菌。培养基的组成如下所示。在37℃、旋转振动筛(230 rpm)、好氧条件下进行24小时培养(预培养)。
Figure BDA0003311327820001692
Figure BDA0003311327820001701
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中。培养基的组成与预培养培养基相同。在37℃、旋转振动筛(230rpm)、 好氧条件下进行24小时培养。
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(12000rpm、10分钟)，将 上清液部分分级。通过实施例2所述的方法对培养液上清液中包含的化合物进 行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间(31.15分钟)处确认到 峰。培养液中的甲基丙烯酸浓度为1.0ppm。
＜实施例4：通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸＞
使用实施例1中获得的分离株，通过静止菌体反应进行甲基丙烯酸的制 造。
使B25-2株、D22-1株、D43-1株、D25株、D26株、D29株、D41-2株、 G1株、G2株、R1株、B13株在琼脂培养基(LB培养基、琼脂1.5％)中生 育，在10ml液体培养基中接种1白金环菌。培养基的组成如下所示。在30℃、 旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行19～22小时培养(预培养)。
Figure BDA0003311327820001702
将2mL预培养液接种到100mL液体培养基(培养基100mL/500mL容量 三角烧瓶)中。培养基的组成与预培养培养基相同。在30℃、旋转振动筛 (230rpm)、好氧条件下进行69～76小时培养(正式培养)。
在正式培养后，将正式培养液40mL转移到50mL容量的锥形管中，离心 分离(12000rpm、10分钟)，获得菌体。在该菌体中加入静止菌体反应溶液 10mL，进行静止菌体反应。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、50mM 磷酸缓冲液、pH7.0。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行24小时。
通过实施例2所述的方法对静止菌体反应溶液中包含的化合物进行分析。 其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间(31.15分钟)处确认到峰。“表 13”示出静止菌体反应结束时的各反应液的甲基丙烯酸浓度。
[表13]
Figure BDA0003311327820001711
＜实施例5：使用假单胞菌属在合成培养基中制造甲基丙烯酸＞
使恶臭假单胞菌NBRC12996在琼脂培养基(LB培养基、琼脂1.5％)中 生育。在10ml液体培养基中接种1白金环菌，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、 好氧条件下进行1～4天培养(预培养)。预培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001712
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行2天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001721
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(7500rpm、15分钟)，用 DISMIC-13CPCellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对上清液部分进 行膜滤器过滤处理。培养液上清液中包含的化合物通过2种分析条件进行了分 析。HPLC分析条件如下所示。
分析条件A
装置：e2695(Waters公司制)
柱：有机酸分析用离子排阻型聚合物柱T-132-E(WAKO公司制)
洗脱液：0.1％(v/v)磷酸溶液
流速：0.5ml/分钟
柱温度：40℃
样品注入量：10μl
分析时间：40分钟
检测器：UV
分析条件B
装置：JASCO UV-970、CO-960、PU-980、DG-1580-54(日本分光公司制)
柱：InertsilRODS-3V(GL Science公司制)
洗脱液：20％(v/v)甲醇、0.2％(v/v)磷酸溶液
流速：1.0ml/分钟
柱温度：40℃
样品注入量：5μl
分析时间：15分钟
检测器：UV
分析的结果是，分析条件A和分析条件B下均在与甲基丙烯酸相同的洗 脱时间处确认到峰。正式培养结束时的培养液上清液中的甲基丙烯酸浓度为 0.2ppm。
＜实施例6：使用短波单胞菌属、苍白杆菌属、副球菌属在合成培养基中 制造甲基丙烯酸＞
使近弧状短波单胞菌NBRC16000、贵格纳苍白杆菌NBRC102586、羽扇 豆苍白杆菌NBRC102587、嗜胺副球菌NBRC16710在琼脂培养基中生育(平 板培养)。平板培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001732
在10ml液体培养基中接种1白金环平板培养上生育的菌，在30℃、旋转 振动筛(230rpm)、好氧条件下进行3～4天培养(预培养)。预培养用的培 养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001731
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行2天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001741
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(7500rpm、15分钟)，用 DISMIC-13CPCellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对上清液部分进 行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件A下对培养液上清液中包含 的化合物进行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰。 “表14”示出正式培养结束时的各培养液上清液中的甲基丙烯酸浓度。
[表14]
Figure BDA0003311327820001742
＜实施例7：使用鞘氨醇单胞菌属、苍白杆菌属、类芽孢杆菌属、中间根 瘤菌属在合成培养基中进行甲基丙烯酸的制造＞
使少动鞘氨醇单胞菌NBRC13935、中间苍白杆菌NBRC15820、类芽孢 杆菌NBRC13157、百脉根中间根瘤菌ATCC700743在营养琼脂培养基 (Becton,Dickinson andCompany.公司制、琼脂1.5％)中生育。在10ml液体 培养基中接种1白金环所生育的菌，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧 条件下进行1～4天培养(预培养)。预培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001751
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行3～6天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001752
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(7500rpm、15分钟)，用 DISMIC-13CPCellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对上清液部分进 行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件B下对培养液上清液中包含 的化合物进行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰。 “表15”示出正式培养结束时的各培养液上清液中的甲基丙烯酸浓度。
[表15]
Figure BDA0003311327820001761
＜实施例8：使用芽孢杆菌属在合成培养基中制造甲基丙烯酸＞
使栗褐芽孢杆菌ATCC14574在营养琼脂培养基(Becton,Dickinson and Company.公司制、琼脂1.5％)中生育。在10ml营养培养基中接种1白金环 所生育的菌，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行1天培养(预 培养)。
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行8天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001762
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(7500rpm、15分钟)，用 DISMIC-13CPCellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对上清液部分进 行膜滤器过滤处理。按照实施例5所述的2种分析条件对培养液上清液中包含 的化合物进行分析。其结果是，分析条件A和分析条件B下均在与甲基丙烯 酸相同的洗脱时间处确认到峰。正式培养结束时的培养液上清液中的甲基丙烯 酸浓度在分析条件A下为2.0ppm，在分析条件B下为2.4ppm。
＜实施例9：使用苍白杆菌属在天然培养基中制造甲基丙烯酸＞
使苍白杆菌NBRC12951在营养琼脂培养基(Becton,Dickinson and Company.公司制、琼脂1.5％)中生育。在100ml液体培养基(培养基 100ml/500ml容量三角烧瓶)中接种1白金环所生育的菌，在30℃、旋转振动 筛(230rpm)、好氧条件下进行8天培养(正式培养)。正式培养用的培养 基组成如下所示。
营养培养基 8g/l
L-缬氨酸 2.0g/l
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(7500rpm、15分钟)，用 DISMIC-13CPCellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对上清液部分进 行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件B下对培养液上清液中包含 的化合物进行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰， 正式培养结束时的培养液上清液中的甲基丙烯酸浓度为3.1ppm。
＜实施例10：使用短波单胞菌属在天然培养基中制造甲基丙烯酸＞
使缺陷短波单胞菌ATCC11568在营养琼脂培养基(Becton,Dickinson andCompany.公司制、琼脂1.5％)中生育。在10ml营养培养基中接种1白金环 所生育的菌，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行1天培养(预 培养)。将预培养液与40％甘油水溶液以1：1进行混合，在-80℃冷冻保存。
使冷冻保存的预培养液在室温下融解，将0.5ml接种到100ml液体培养基 (培养基100ml/500ml容量三角烧瓶)中。在30℃、旋转振动筛(230rpm)、 好氧条件下进行2天培养(正式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
营养培养基 8g/l
L-缬氨酸 2.0g/l
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(7500rpm、15分钟)，用 DISMIC-13CPCellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对上清液部分进 行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件B下对培养液上清液中包含 的化合物进行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰， 正式培养结束时的培养液上清液中的甲基丙烯酸浓度为37.0ppm。
＜实施例11：使用酵母制造甲基丙烯酸＞
使产朊假丝酵母NBRC1086在营养琼脂培养基(Becton,Dickinson and Company.公司制、琼脂1.5％)中生育。在10ml液体培养基中接种1白金环 所生育的菌，在24℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行1天培养(预 培养)。预培养用的培养基组成如下所示。
酵母提取物(Becton,Dickinson and Company.公司制) 20g/l
聚蛋白胨(Becton,Dickinson and Company.公司制) 20g/l
葡萄糖 20g/l
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在24℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行2天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001781
复合维生素的组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001791
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(7500rpm、15分钟)，用 DISMIC-13CPCellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对上清液部分进 行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件A下对培养液上清液中包含 的化合物进行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰， 正式培养结束时的培养液上清液中的甲基丙烯酸浓度为0.1ppm。
＜实施例12：使用霉菌制造甲基丙烯酸＞
使黄曲霉NBRC8558、米曲霉NBRC4255在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(日 水制药公司制)中生育。将生育的菌丝和孢子悬浮在灭菌水5ml中，将其1ml 接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角烧瓶)中。在24℃、 旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行2天培养(正式培养)。正式培养 用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001792
在正式培养后，对正式培养液进行离心分离(7500rpm、15分钟)，用 DISMIC-13CPCellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对上清液部分进 行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件A和分析条件B下对培养液 上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，分析条件A和分析条件B下均 在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰。“表16”示出正式培养结束时的 各培养液上清液中的甲基丙烯酸浓度。
[表16]
Figure BDA0003311327820001801
＜实施例13：使用鞘氨醇单胞菌属、土地杆菌属、芽孢杆菌属、利斯顿 氏菌属通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸＞
使少动鞘氨醇单胞菌NBRC13935、肝素土地杆菌NBRC12017、枯草芽 孢杆菌NBRC12210、鳗利斯顿氏菌ATCC19264在营养琼脂培养基(Becton, Dickinson andCompany.公司制、琼脂1.5％)中生育。在10ml液体培养基中 接种1白金环所生育的菌，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进 行1～3天培养(预培养)。预培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001802
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行3～6天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001811
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的50mM磷 酸缓冲液。
在静止菌体反应开始5小时后和24小时后采集1.6ml反应液。反应液在 离心分离(15000rpm、5分钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm (ADVANTEC公司制)对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述 的分析条件A下对反应液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，在与 甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰。“表17”示出静止菌体反应中的反应 液上清液中的甲基丙烯酸浓度。
[表17]
Figure BDA0003311327820001821
(ND：未检测到)
＜实施例14：使用苍白杆菌属、副球菌属通过静止菌体反应制造甲基丙 烯酸＞
使贵格纳苍白杆菌NBRC102586、羽扇豆苍白杆菌NBRC102587、嗜胺 副球菌NBRC16710在琼脂培养基中生育(平板培养)。平板培养用的培养基 组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001822
在10ml液体培养基中接种1白金环平板培养上生育的菌，在30℃、旋转 振动筛(230rpm)、好氧条件下进行3～4天培养(预培养)。预培养用的培 养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001823
Figure BDA0003311327820001831
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行2天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001832
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的50mM磷 酸缓冲液。
在静止菌体反应开始5小时后和24小时后采集1.6ml反应液。反应液在 离心分离(15000rpm、5分钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm (ADVANTEC公司制)对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述 的分析条件A下对反应液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，在与 甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰。“表18”示出静止菌体反应中的反应 液上清液中的甲基丙烯酸浓度。
[表18]
Figure BDA0003311327820001841
＜实施例15：使用芽孢杆菌属、链霉菌属通过静止菌体反应制造甲基丙 烯酸＞
使巨兽芽孢杆菌NBRC15308、简单芽孢杆菌ATCC49097、灰色链霉菌 NBRC13350在营养琼脂培养基(Becton,Dickinson and Company.公司制、琼脂 1.5％)中生育。在10ml营养培养基中接种1白金环所生育的菌，在30℃、旋 转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行1天培养(预培养)。
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行2天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001842
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的50mM磷 酸缓冲液。
灰色链霉菌NBRC13350的情况下在静止菌体反应开始5小时后采集 1.6ml反应液，巨兽芽孢杆菌NBRC15308和简单芽孢杆菌ATCC49097则在 反应开始24小时后采集1.6ml反应液。反应液在离心分离(15000rpm、5分 钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对 上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件A下对反应液 上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间 处确认到峰。“表19”示出静止菌体反应中的反应液上清液中的甲基丙烯酸浓 度。
[表19]
Figure BDA0003311327820001851
＜实施例16：使用丛毛单胞菌属、不动杆菌属、黄色杆菌属通过静止菌 体反应制造甲基丙烯酸＞
使土生丛毛单胞菌NBRC13299、琼氏不动杆菌ATCC17908、自养黄色 杆菌ATCC35674在营养琼脂培养基(Becton,Dickinson and Company.公司制、 琼脂1.5％)中生育。在10ml营养培养基中接种1白金环所生育的菌，在30℃、 旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行1天培养(预培养)。
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行2天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
营养培养基 8g/l
L-缬氨酸 2.0g/l
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸或异丁酸、pH7.0的50mM磷酸缓冲液。
在静止菌体反应开始5小时后和24小时后采集1.6ml反应液。反应液在 离心分离(15000rpm、5分钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm (ADVANTEC公司制)对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述 的分析条件A下对反应液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，在与 甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰。“表20”示出静止菌体反应中的反应 液上清液中的甲基丙烯酸浓度。
[表20]
Figure BDA0003311327820001861
(ND：未检测到)
＜实施例17：使用苍白杆菌属、无色小杆菌属、不动杆菌属通过静止菌 体反应制造甲基丙烯酸＞
使苍白杆菌NBRC12951、中间苍白杆菌NBRC13694、人苍白杆菌 ATCC49237、脱氮无色小杆菌NBRC12669、溶血不动杆菌ATCC17906在营 养琼脂培养基(Becton,Dickinson andCompany.公司制、琼脂1.5％)中生育。 在100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角烧瓶)中接种1白金环所 生育的菌，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行3～4天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
营养培养基 8g/l
L-缬氨酸 2.0g/l
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的50mM磷 酸缓冲液。
苍白杆菌属的情况下在静止菌体反应开始5小时后和24小时后采集1.6ml 反应液，脱氮无色小杆菌NBRC12669和溶血不动杆菌ATCC17906则在静 止菌体反应开始5小时后采集1.6ml反应液。反应液在离心分离(15000rpm、 5分钟)后，用DISMIC-13CP CelluloseAcetate 0.2μm(ADVANTEC公司制) 对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件A下对反应 液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时 间处确认到峰。“表21”和“表22”示出静止菌体反应中的反应液上清液中的甲 基丙烯酸浓度。
[表21]
Figure BDA0003311327820001871
[表22]
Figure BDA0003311327820001881
＜实施例18：使用希瓦氏菌属通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸＞
使Shewanella fodinae NBRC 105216在营养琼脂培养基(Becton,Dickinson andCompany.公司制、琼脂1.5％)中生育。在100ml液体培养基(培养基 100ml/500ml容量三角烧瓶)中接种1白金环所生育的菌，在30℃、旋转振动 筛(230rpm)、好氧条件下进行3天培养(正式培养)。正式培养用的培养 基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001882
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的50mM磷 酸缓冲液。
在静止菌体反应开始24小时后采集1.6ml反应液。反应液在离心分离 (15000rpm、5分钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC 公司制)对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件A 下对反应液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同 的洗脱时间处确认到峰，甲基丙烯酸浓度为0.1ppm。
＜实施例19：使用土壤杆菌属通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸＞
使藤黄土壤杆菌NBRC15768在25℃在琼脂培养基中生育(平板培养)。
平板培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001891
将所生育的菌接种在100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角烧 瓶)中，在25℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行3天培养(正式 培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001892
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的50mM磷 酸缓冲液。
在静止菌体反应开始5小时后和24小时后采集1.6ml反应液。反应液在 离心分离(15000rpm、5分钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm (ADVANTEC公司制)对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述 的分析条件A和B下对反应液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是， 在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰，甲基丙烯酸浓度在5小时后为 0.1ppm、在24小时后为0.1ppm。
＜实施例20：使用短波单胞菌属、根瘤菌属通过静止菌体反应制造甲基 丙烯酸＞
使泡囊短波单胞菌ATCC11426、豌豆根瘤菌ATCC10004在营养琼脂培 养基(Becton,Dickinson and Company.公司制、琼脂1.5％)中生育。在10ml 液体培养基中接种1白金环所生育的菌，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、 好氧条件下进行4天培养(预培养)。预培养用的培养基组成如下所示。将预 培养液与40％甘油水溶液以1：1进行混合，在-80℃冷冻保存。
Figure BDA0003311327820001901
将冷冻保存的预培养液在室温下融解后，将0.5ml接种到100ml液体培养 基(培养基100ml/500ml容量三角烧瓶)中。在30℃、旋转振动筛(230rpm)、 好氧条件下进行2天培养(正式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
营养培养基 8g/l
L-缬氨酸 2.0g/l
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的50mM磷 酸缓冲液。
泡囊短波单胞菌ATCC11426的情况下在静止菌体反应开始5小时后采集 1.6ml反应液，豌豆根瘤菌ATCC10004则在24小时后采集1.6ml反应液。反 应液在离心分离(15000rpm、5分钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm(ADVANTEC公司制)对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5 所述的分析条件B下对反应液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是， 在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰，泡囊短波单胞菌ATCC11426为 0.7ppm，豌豆根瘤菌ATCC10004为1.6ppm。
＜实施例21：使用短波单胞菌属通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸＞
使缺陷短波单胞菌ATCC11568在营养琼脂培养基(Becton,Dickinson andCompany.公司制、琼脂1.5％)中生育。在10ml营养培养基中接种1白金环 所生育的菌，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行1天培养(预 培养)。将预培养液与40％甘油水溶液以1：1进行混合，在-80℃冷冻保存。
将冷冻保存的预培养液在室温下融解后，将0.5ml接种到100ml液体培养 基(培养基100ml/500ml容量三角烧瓶)中。在30℃、旋转振动筛(230rpm)、 好氧条件下进行2天培养(正式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
营养培养基 8g/l
L-缬氨酸 2.0g/l
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)后，除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml 的pH7.0的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上 清液，获得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液， 制备菌体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体 反应溶液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的 50mM磷酸缓冲液。
在静止菌体反应开始5小时后和24小时后采集1.6ml反应液。反应液在 离心分离(15000rpm、5分钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm (ADVANTEC公司制)对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述 的分析条件B下对反应液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，在与 甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰，甲基丙烯酸浓度在5小时后为 33.0ppm、在24小时后为37.0ppm。
＜实施例22：使用嗜热菌通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸＞
使嗜热嗜脂肪地芽孢杆菌NBRC 12983在营养琼脂培养基(Becton, Dickinsonand Company.公司制、琼脂1.5％)中生育。在10ml液体培养基中 接种1白金环所生育的菌，在37℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进 行2天培养(预培养)。预培养用的培养基组成如下所示。
营养培养基 8g/l
葡萄糖 2.0g/l
将所生育的菌接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角烧 瓶)中，在25℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行5天培养(正式 培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
营养培养基 8g/l
L-缬氨酸 2.0g/l
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的50mM磷 酸缓冲液。
在静止菌体反应开始5小时后和24小时后采集1.6ml反应液。反应液在 离心分离(15000rpm、5分钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm (ADVANTEC公司制)对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述 的分析条件A下对反应液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，在与 甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰，甲基丙烯酸浓度在5小时后为 0.4ppm、在24小时后为0.3ppm。
＜实施例23：使用酵母通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸＞
使酿酒酵母NBRC1136、酿酒酵母NBRC2347、奇异酵母NBRC10609、 近平滑假丝酵母ATCC22019在琼脂培养基中生育(平板培养)。平板培养用 的培养基组成如下所示。酵母属在30℃进行培养，假丝酵母属在24℃进行培 养。
Figure BDA0003311327820001931
在10ml液体培养基中接种1白金环所生育的菌，在旋转振动筛(230rpm)、 好氧条件下进行2～7天培养(预培养)。酵母属在30℃进行培养，假丝酵母 属在24℃进行培养，预培养的培养基使用培养基1或2。培养基组成如下所示。
培养基1
酵母提取物(Becton,Dickinson and Company.公司制) 20g/l
聚蛋白胨(Becton,Dickinson and Company.公司制) 20g/l
葡萄糖 20g/l
培养基2
Figure BDA0003311327820001932
Figure BDA0003311327820001941
复合维生素的组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001942
将1ml预培养液接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中，在旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行2～3天培养(正式培 养)。此外，酵母属在30℃进行培养，假丝酵母属在24℃进行培养。正式培 养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001943
Figure BDA0003311327820001951
复合维生素的组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001952
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加3ml的pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌 体悬浮液。在50mL容量锥形管中加入3ml菌体悬浮液和3ml静止菌体反应溶 液，进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸或异丁酸、pH7.0的50mM磷酸缓冲液。“表23”示出培养及静止菌体反应条件。
[表23]
Figure BDA0003311327820001961
酿酒酵母NBRC2347和近平滑假丝酵母ATCC22019的情况下在静止菌 体反应开始5小时后采集1.6ml反应液，酿酒酵母NBRC1136和奇异酵母 NBRC10609则在24小时后采集1.6ml反应液。反应液在离心分离(15000rpm、 5分钟)后，用DISMIC-13CP CelluloseAcetate 0.2μm(ADVANTEC公司制) 对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述的分析条件A下对反应 液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是，在与甲基丙烯酸相同的洗脱时 间处确认到峰。“表24”示出静止菌体反应中的反应液上清液中的甲基丙烯酸 浓度。
[表24]
Figure BDA0003311327820001962
＜实施例24：使用霉菌通过静止菌体反应制造甲基丙烯酸＞
使黑曲霉ATCC6275、黄曲霉NBRC8558、米曲霉NBRC4255在马铃薯 葡萄糖琼脂培养基(日水制药公司制)中生育。生育的菌丝或孢子悬浮在灭菌 水5ml中，将其1ml接种到100ml液体培养基(培养基100ml/500ml容量三角 烧瓶)中。在24℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下进行2天培养(正 式培养)。正式培养用的培养基组成如下所示。
Figure BDA0003311327820001971
在正式培养后，将正式培养液全部转移到225ml容量的离心管中，离心分 离(5000rpm、15分钟)除去上清液，获得菌体。在该菌体中添加40ml的pH7.0 的50mM磷酸缓冲液将菌体悬浮，再次在相同条件下离心，除去上清液，获 得洗涤菌体。在洗涤菌体中添加10ml pH7.0的50mM磷酸缓冲液，制备菌体 悬浮液。将菌体悬浮液转移到50mL容量锥形管中，加入10ml静止菌体反应 溶液进行静止菌体反应。反应在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条件下 进行24小时。静止菌体反应溶液的组成为5.0g/l L-缬氨酸、pH7.0的50mM磷 酸缓冲液。
在静止菌体反应开始5小时后和24小时后采集约2ml的反应液。反应液 在离心分离(15000rpm、5分钟)后，用DISMIC-13CP Cellulose Acetate 0.2μm (ADVANTEC公司制)对上清液部分进行膜滤器过滤处理。在实施例5所述 的分析条件A和B下对反应液上清液中包含的化合物进行分析。其结果是， 在与甲基丙烯酸相同的洗脱时间处确认到峰。“表25”示出静止菌体反应中的 反应液上清液中的甲基丙烯酸浓度。
[表25]
Figure BDA0003311327820001981
(ND：未检测到)
＜实施例25：使用假单胞菌属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、苍白杆菌 属、不动杆菌属进行的同源性比较＞
使用GENETYX CORPORATION的遗传信息处理软件GENETYX ver.10 的同源性解析程序，分别比较序列号1～8、9～15、18～20、22～26、30～31、 42～44、45～46、47～49所示的各微生物的16S rDNA或LSU rDNA的碱基 序列的同源性。“表26～33”中示出结果。
序列号1～8
[表26]
Figure BDA0003311327820001991
序列号9～15
[表27]
Figure BDA0003311327820002001
序列号18～20
[表28]
Figure BDA0003311327820002002
序列号22～26
[表29]
Figure BDA0003311327820002011
序列号30～31
[表30]
Figure BDA0003311327820002021
序列号42～44
[表31]
Figure BDA0003311327820002022
序列号45～46
[表32]
Figure BDA0003311327820002031
序列号47～49
[表33]
Figure BDA0003311327820002032
＜参考例1：接合转导用受体PR4KS的制作＞
通过日本特开2011-200133号公报中所述的方法改变红串红球菌 (Rhodococcuserythropolis)PR4(制品评价技术基盘机构生物遗传资源部门； 保藏号：NBRC 100887)，制作对120mg/L的氯霉素表现出耐性且缺失卡那霉 素耐性基因的衍生株，命名为PR4KS株。
具体而言，为了增强氯霉素耐性，将MYK培养基(0.5％多聚蛋白胨、0.3％ 细菌用酵母提取物、0.3％麦芽提取物、0.2％KH2PO4、0.2％K2HPO4)中的氯 霉素浓度从10mg/mL开始分阶段逐渐提高到120mg/mL，同时通过对PR4株 进行继代培养诱发自然变异，获得对120mg/mL的氯霉素具有耐性的衍生株 RhCmSR-09株。
接下来，将上述RhCmSR-09株与日本特开2011-200133号公报所述的保 有卡那霉素耐性基因缺失变异导入用质粒pKM043的大肠杆菌株按照1：1的 比例进行混合并培养，通过接合转导将pKM043导入RhCmSR-09株内后，通 过在包含卡那霉素硫酸盐200mg/L及氯霉素50mg/L的MYK琼脂培养基 (0.5％多聚蛋白胨、0.3％细菌用酵母提取物、0.3％麦芽提取物、0.2％KH2PO4、 0.2％K2HPO4、1.5％琼脂)中进行培养，获得pKM043插入到RhCmSR-09株基因组内的同源重组株。将上述同源重组株在包含10％蔗糖的MYK琼脂培养 基中进行培养，从获得的菌落中获得变成卡那霉素感受性株的衍生株、即卡那 霉素耐性基因缺失变异衍生株PR4KS株。
＜参考例2：LigD同源基因的克隆和基因缺失用质粒的制作＞
将PR4KS株的LigD同源基因(登录号：YP_002767969)作为靶基因。 通过PCR扩增包含LigD基因周边序列的约5.4kb的DNA后，克隆到日本特 开2011-200133号公报所述的、将sacB基因沿着相同方向导入到卡那霉素耐 性基因的下游的质粒载体pK19mobsacB1，从而获得质粒pTJ001。PCR条件如 下所述。
引物
GB-138：5’-GGCCTGCAGGTACCGATCATCACCATCGGTGTC-3’(序列 号94)
GB-139：5’-GGTCTAGACTGAGCAGTGTTCCAATGCG-3’(序列号95)
反应液组成：
Figure BDA0003311327820002051
温度循环
将98℃10秒、55℃10秒及72℃120秒的反应进行35个循环
使pTJ001内部的LigD同源基因全长(约2.3kb)缺失，且仅残留LigD 同源基因的上游及下游序列，制作了LigD同源基因缺失用质粒pTJ002(参照 图4)。pTJ002如下所述地获得：利用设计成包含作为靶的LigD同源基因的 起始密码子附近的序列和终止密码子附近序列两者、分别从起始密码子向上游 方向延伸或从终止密码子向下游方向延伸的引物GB-140和GB-141，对pTJ001 内部的序列进行扩增，利用由此获得的不含LigD同源基因的PCR产物对大肠 杆菌JM109株进行转化，形成环状DNA。PCR的条件如下所述。
引物
GB-140：GAGGAAATGGTCACAGGGCGAGAATAGGTTG(序列号96)
GB-141：GCCCTGTGACCATTTCCTCATTGTGCTGG(序列号97)
反应液组成
Figure BDA0003311327820002052
温度循环
将98℃10秒、50℃10秒及72℃180秒的反应进行30个循环
PCR结束后，使用样品1μl，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳对片段进行确认， 结果确认了片段的扩增。在上述质粒pTJ002的制造步骤中，在从PR4株进行 基因组提取时使用Wizard Genomic DNAPurification Kit(Promega公司制)， 在限制酶所切断的DNA片段及PCR产物的纯化时使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司制)，在DNA彼此连接时使用DNALigation Kit＜Mighty Mix＞(宝生物公司制)，在质粒的提取时使用QIAprepminiprep kit(QIAGEN 公司制)。
＜参考例3：PR4KS的LigD同源基因缺失衍生株的制作＞
以通过pTJ002转化大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1λpir获得的产物作 为供体，将通过参考例1的方法获得的PR4KS作为受体，与日本特开 2011-200133号公报所述的方法同样地进行接合转导，获得基于同源重组产生 的13株LigD同源基因缺失衍生株。从上述缺失衍生株中选择1株，命名为 PR4KSΔligD衍生株。
＜实施例26：红球菌属细菌用质粒pLK005及使用它的腈水合酶表达用质 粒pSJ201的制作＞
(1)pLK005的获得和解析
使用pK4(参照日本特开平5-64589号公报)，通过上述电穿孔法对红球 菌N775(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-961)进行转化。将获得的转化体接种到10ml的MYK培养基中，在30℃ 培养1天。通过在洁净工作台上进行紫外线照射来对其进行变异处理。将实施 了变异处理的培养液涂布在包含50～400μg/ml的卡那霉素的MYK琼脂培养 基中，在30℃培养3天。
将琼脂培养基上出现的多个菌落分别用MYK培养基培养，由转化体回收 质粒。使用回收的质粒再次对红球菌N775进行转化，研究转化体的卡那霉素 耐药程度是否提高。其结果是，确认多株卡那霉素耐药程度明显提高的转化体。
对确认卡那霉素耐药程度提高的质粒的碱基序列进行研究，结果发现pK4 的卡那霉素耐性基因的上游区域的序列发生了变化(8碱基序列GTTGTAGG 重复)。将该确认到卡那霉素耐药程度提高的质粒命名为pLK005。
(2)pSJ040的制作
质粒pSJ034是根据日本特开平10-337185号公报所述的方法由质粒pSJ023制作的。pSJ034中存在3个EcoRI限制酶位点，制作了将其中的一个 位点转化为SpeI位点的质粒pSJ040。制作方法如下，通过限制酶EcoRI将 pSJ034进行部分分解，使用宝生物Blunting试剂盒进行切断位点的平滑化。 在SpeI接头存在下进行连接反应，使用反应液转化大肠杆菌JM109株。对转 化体进行培养后，提取质粒，筛选插入了SpeI接头的质粒。将在pSJ034的3个EcoRI位点中的、存在于卡那霉素耐性基因的下游的EcoRI位点插入了SpeI 接头的质粒命名为pSJ040。
(3)pSJ201的建构
通过HindIII切断pLK005，制备约2.1kb的片段。另一方面，通过HindIII 切断pSJ040，制备约9.8kb的片段。使用这两个片段进行连接反应，使用反应 液转化大肠杆菌JM109株。对转化体进行培养后，提取质粒，确认其碱基序 列，结果将带有来源于pLK005的变异序列(GTTGTAGG重复)、除此之外具 有与pSJ040同样序列的质粒命名为pSJ201。
＜实施例27：PR4KSΔligD衍生株的RE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB 基因缺失衍生株的制作＞
(1)使用In Fusion法的基因缺失用质粒的制作。
以PR4KS株的RE_acd1/RE_echA/RE_hchA/RE_mmsB基因作为靶基因， 使用In-Fusion HD Cloning kit(宝生物公司制)制作基因缺失用质粒(参照图 5)。
通过PCR对靶基因的上游及下游序列的DNA进行扩增。PCR条件如下 所述。
片段1用引物
MMA-061：CGACTCTAGAGGATCGCTCAGTACATCTACGAGAC(序列 号98)
MMA-062：AGTGTGAGGAAAGTGTTCCGATCAGTTCAT(序列号99)
片段2用引物
MMA-063：CACTTTCCTCACACTCGTCGAGAGTATGAG(序列号100)
MMA-064：CGGTACCCGGGGATCAGCGCGACGAACAACGAGAC(序 列号101)
反应液组成
Figure BDA0003311327820002081
温度循环
将98℃10秒、60℃10秒及72℃120秒的反应进行30个循环
PCR结束后，使用样品1μl，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳对片段进行确认， 结果确认了片段的扩增。使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司制) 对PCR产物(片段1及片段2)进行缓冲液置换后，用于以下所示的利用 In-Fusioon HD Cloning Kit的反应。
(2)利用In-Fusion HD Cloning Kit进行的载体与目标片段的连接及转化
使用In-Fusion HD Cloning Kit，将上述片段和载体进行连接。反应条件如 下所述。
反应液组成
Figure BDA0003311327820002082
将上述反应液在50℃保温15分钟后，在冰上冷却，用于大肠杆菌JM109 株的转化。大肠杆菌转化体的选择通过包含卡那霉素硫酸盐50mg/L的LB琼 脂培养基(以下，LB Km50琼脂培养基)来进行。使用Mini prep Kit(QIAGEN 公司)由获得的转化体来制备质粒，获得目标质粒。质粒的确认通过研究XbaI 限制酶处理后的片段尺寸及插入片段与载体的连接区域的序列来进行。将目标 质粒命名为pMMA302。
(3)PR4KSΔligD衍生株的同源重组衍生株及基因缺失衍生株的制作
在PR4KSΔligD株感应细胞20μl中添加1μl的pMMA302，在冰上保温10 分钟。将经过保温的上述溶液全部转移到经过冰冷却的电穿孔杯中(0.1cm) 中，施加1.5kV(200Ω)的高电压，立即加入600μl的LB液体培养基，在30℃ 静置6小时。将200μl接种到LB Km10琼脂培养基中，在30℃培养4天。将 生育的菌落在LB Km10琼脂培养基上划线，培养4天后，通过以下所示的条 件进行菌落PCR，确认同源重组衍生株。
引物
MMA-069：GCGCATCTACAAGGAAGAGATC(序列号102)
MMA-070：GCGACGCTCATCGAGATCTC(序列号103)
反应液组成
Figure BDA0003311327820002091
温度循环
将98℃10秒、68℃180秒的反应进行30个循环
将确认为同源重组衍生株的菌落悬浮于LB培养基200μl中，将100μl接 种到LB+10％蔗糖琼脂培养基中，培养3天。从生育的菌落中选择变为卡那 霉素感受性的，通过菌落PCR对这些菌落确认其目标基因缺失。其结果是， 由PR4KSΔligD衍生株获得缺失RE_acd1、RE_echA、RE_hchA、RE_mmsB 这4个基因的菌株，命名为DMA008株。
＜实施例28：用于在红球菌属细菌中表达ACD或AAT的质粒的制作＞
制作用于在属于红球菌属的微生物中表达ACD或AAT的质粒。
为了制作ACD或AAT各自的表达用质粒，通过PCR分别扩增了各自的 基因DNA。PCR条件如下所示。
RE_acd1用引物
MMA-114GGTCTAGAATGTTTACTCTGACCGATGACGAGCG(序列号 126)
MMA-022GGCCTGCAGGCCGTCACGCTTTTCGATCAATAC(序列号 115)
MpAAT1用引物
MMA-109GGTCTAGAATGAAATCATTCTCAGTACTTCAG(序列号 127)
MMA-045CGGTACGCGCGGATCTTCCAGAG(序列号83)
RE_acd1用模板
红串红球菌PR4野生株基因组DNA
MpAAT1用模板
质粒pAAT001(参照实施例45)
反应液组成
模板1μl
2×PrimeSTAR Max Premix(TAKARA公司制)25μl
Fw引物(20μM)1μl
Rv引物(20μM)1μl
D.W.22μl
总计50μl
温度循环：
将98℃10秒、60℃10秒、72℃60秒的反应进行30个循环
PCR结束后，使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司制)对PCR 产物进行缓冲液置换，用限制酶XbaI及Sse8387I对获得的片段进行处理。此 外，实施例26中制作的pSJ201也在用XbaI及Sse8387I进行处理、进行乙醇 沉淀后再次用灭菌水溶解并进行虾碱性磷酸酶(SAP)处理。对于上述PCR 片段及pSJ201来源大片段，在经过0.7％琼脂糖凝胶电泳后使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司制)进行纯化。限制酶处理反应条件、SAP 处理条件及连接反应条件如下所示。
限制酶处理反应组成
Figure BDA0003311327820002111
连接反应组成
Figure BDA0003311327820002112
使用按照上述组成混合的连接反应液进行大肠杆菌JM109株的转化。由 获得的转化体提取质粒，在经过限制酶XbaI及Sse8387I处理后进行琼脂糖电 泳，确认插入了目标尺寸的片段。此外，通过对插入片段和载体的连接区域的 碱基序列进行解析，确认了其为目标质粒。将导入有RE_acd1基因及MpAAT1 基因的质粒分别命名为pMMA401及pAAT301。
＜实施例29：红球菌属转化用ACD及AAT双表达质粒的制作＞
以下用实施例27中获得的红球菌属微生物制作用于制造甲基丙烯酸酯的 质粒。
在RE_acd1基因表达用质粒pMMA401的RE_acd1基因的下游，插入以 MpAAT1基因表达用质粒pAAT301为模板通过PCR反应获得的“腈水解酶启 动子+MpAAT1基因”片段。
如下述那样对“腈水解酶启动子+MpAAT1基因”片段进行扩增。
引物
MMA-133(Sse-ProFw)： TGACCTGCAGGTGCACTCCGCTGCGACATGTATCGA(序列号104)
MMA-131(Sse-001Rv)： ACTCTAGCCTGCAGGTCATTGACTAGTTGATCTAAGGTTGTTACA(序列号 105)
PCR反应组成
Figure BDA0003311327820002121
温度循环
将98℃5秒、60℃5秒及72℃45秒的反应进行30个循环
通过限制酶Sse8387I，对如上述那样获得的“腈水解酶启动子+MpAAT1 基因”片段进行处理。另一方面，将pMMA401也用Sse8387I进行处理，然后 进行SAP处理。对这些DNA片段进行0.7％琼脂糖凝胶电泳后，使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司制)进行纯化。限制酶处理反应条件及连接 反应条件如下所示。
限制酶处理反应组成(AAT片段)
Figure BDA0003311327820002122
限制酶处理反应组成(载体片段)
Figure BDA0003311327820002123
Figure BDA0003311327820002131
连接反应组成
Figure BDA0003311327820002132
使用按照上述组成混合的连接反应液，进行大肠杆菌JM109株的转化。 由获得的转化体提取质粒。经过限制酶Sse8387I处理后进行琼脂糖电泳，确 认插入了目标尺寸的片段。通过对获得的质粒的插入片段的连接区域的碱基序 列进行解析，确认其为目标质粒，将该质粒命名为pACDAAT1。使用与上述 方法同样的方法制作了共计6种序列不同的ACD及AAT双表达用质粒 (pACDAAT2、pACDAAT3、pACDAAT4、pACDAAT6、及pACDAAT8)(参 照图6)。
＜实施例30：使用红球菌属制造甲基丙烯酸＞
利用质粒pMMA401对实施例27的(3)中获得的DMA008株进行转化。 使用获得的重组体(DMA008/pMMA401)通过静止菌体反应进行甲基丙烯酸 的制造。在以下所示的M9/Frc/Km10液体培养基(瓦塞尔曼试管)2mL中接 种1白金环菌，在30℃、旋转振动筛(180rpm)、好氧条件下进行2天培养 (预培养)。
M9/Frc/Km10液体培养基
6.0g/L Na2HPO4
3.0g/L KH2PO4
0.5g/L NaCl
1.0g/L NH4Cl
1mM MgSO4·7H2O
1mM CaCl2
0.01g/L硫胺素
2.0g/L果糖
10μg/L卡那霉素
将1mL预培养液接种到100mLM9/Frc/Km10液体培养基(培养基 100mL/500mL容量三角烧瓶)中，在30℃、旋转振动筛(230rpm)、好氧条 件下进行3天培养(正式培养)。
在正式培养后，将正式培养液40mL转移到50mL容量锥形管中，离心分 离(12000rpm、10分钟)，获得菌体。使用该菌体进行以下的反应。在50mL 容量的锥形管中加入1ml的反应液，在30℃、旋转振动筛(180rpm)、好氧 条件下进行24小时。
反应液组成
OD630＝10菌体(终浓度)
5.0g/l 2-氧代异戊酸(终浓度)
50mM磷酸缓冲液/pH7.0(终浓度)
反应后采集适量的反应液上清液，按照以下的HPLC条件进行分析，结果 检测到12ppm的甲基丙烯酸。
HPLC分析条件
装置：Waters 2695
柱：ICsep USP L-17，
Figure BDA0003311327820002141
流动相：0.01N H2SO4
流量：0.35ml/分钟
运行时间：20分钟
柱温度：40℃
样品温度：20℃
检测：UV 210nm
＜实施例31：使用红球菌属制造甲基丙烯酸丁酯的制造＞
将质粒pACDAAT1、pACDAAT2、pACDAAT3、pACDAAT4、pACDAAT6、 及pACDAAT8分别转化到实施例27的(3)中获得的DMA008株中。使用获 得的重组体(DMA008/pACDAAT1、DMA008/pACDAAT2、 DMA008/pACDAAT3、DMA008/pACDAAT4、DMA008/pACDAAT6及 DMA008/pACDAAT8)通过静止菌体反应进行甲基丙烯酸酯的制造。在2mlLB Km10液体培养基(瓦塞尔曼试管)中接种1白金环菌，在30℃、旋转振动筛 (180rpm)、好氧条件下进行2天培养(预培养)。将1ml预培养液接种到 100mLLB Km10(培养基100mL/500mL容量三角烧瓶)中，在30℃、旋转振 动筛(230rpm)、好氧条件下进行3天培养(正式培养)。另外，对照使用 质粒DMA008/pLK005。
在正式培养后，将培养液40mL转移到50mL容量锥形管中，离心分离 (12000rpm、10分钟)，获得菌体。使用该菌体进行以下的反应。在10ml 容量的玻璃样品瓶中加入1ml的反应液，在30℃、旋转振动筛(180rpm)、 好氧条件下进行18小时。
反应液组成
OD630＝10菌体(终浓度)
5.0g/l 2-氧代异戊酸(终浓度)
40mM醇(终浓度)
50mM磷酸缓冲液/pH7.5(终浓度)
使用正丁醇作为醇。
反应后，在反应液中添加1mL的乙腈，充分混合后，使用注射器式过滤 器DISMIC/孔径0.45μm(ADVANTEC公司制)过滤后，通过实施例49所述 的HPLC分析进行分析。表34示出18小时后的生成物的分析结果。
利用ACD及AAT双表达红球菌重组体生成甲基丙烯酸丁酯
[表34]
重组体 甲基丙烯酸丁酯的生成量(μM)
DMA0008/pLK005 0
DMA008/pACDAAT1 7.51
DMA008/pACDAAT2 2.06
DMA008/pACDAAT3 4.34
DMA008/pACDAAT4 0.46
DMA008/pACDAAT6 2.18
DMA008/pACDAAT8 0.52
＜实施例32：使用红球菌属制造甲基丙烯酸酯＞
利用质粒pACDAAT1对实施例27的(3)中获得的DMA008株分别进 行转化。使用获得的重组体(DMA008/pACDAAT1)，通过静止菌体反应制造 甲基丙烯酸酯。此外，使用DMA008/pLK005作为对照。使用实施例31所述 的方法进行重组体的培养从而获得菌体。
反应液组成
OD630＝10菌体(终浓度)
5.0g/l2-氧代异戊酸(终浓度)
40mM醇(终浓度)
50mM磷酸缓冲液/pH7.5(终浓度)
使用正丁醇、异丁醇、2-乙基己醇作为醇。
反应后，在反应液中添加1mL的乙腈，充分混合后，使用注射器式过滤 器DISMIC/孔径0.45μm(ADVANTEC公司制)过滤后，通过实施例9B所述 的HPLC分析进行分析。表35示出18小时后的生成物的分析结果。
利用ACD及AAT双表达红球菌属重组体生成甲基丙烯酸酯
[表35]
Figure BDA0003311327820002161
＜实施例33：由绿脓杆菌PAO1克隆ACD同源(ACD)基因和制作高 表达重组体＞
对具有甲基丙烯酸生产能力的假单胞菌属微生物的甲基丙烯酸合成相关 基因进行了分离。
＜基因组DNA的制备＞
将在LB琼脂培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、0.5％ NaCl、1.5％琼脂)上生育的绿脓杆菌PAO1株(NBRC106052)接种到10mL 的LB液体培养基中，在37℃振荡培养15小时。培养结束后，通过离心由2mL 的培养液回收菌体，使用Wizard GenomicDNA Purification Kit(promega株式 会社)获得基因组DNA 50μL。
＜向表达载体的克隆＞
以获得的基因组DNA为模板，按照成为附加有能够容易地导入到表达载 体的限制酶识别位点的方式设计寡核苷酸，通过PCR法制备了包含推定编码 ACD的基因的DNA片段。
[表36]
Figure BDA0003311327820002171
寡核苷酸引物
MMA-003：5’-GACCCATGGATTTCGACCTCACCGAAGAAC-3’(序 列号106)
MMA-004：5’-GCCCTGCAGGATGCGATGGTTCGCGGCGTTC-3’(序 列号107)
MMA-020：5’-GGACATGTTTCGTGATCCGGAAACCCTGAAC-3’(序 列号108)
MMA-006：5’-GGCCTGCAGGCGAAGGATCGACGCTAGCCCTG-3’(序列号109)
MMA-018：5’-GGACATGTTTCCCTGCGAAGAAGAGATCCAG-3’(序 列号110)
MMA-008：5’-GGCCTGCAGGCGCCGTTGCGGAAACGACGG-3’(序 列号111)
MMA-019：5’-GGCCATGGTACCGAGAACCCTGTTCAGCTC-3’(序 列号112)
MMA-010：5’-GGCCTGCAGGCTGGACGAGGAGGTGCTCGC-3’(序 列号113)
反应液组成
Figure BDA0003311327820002181
温度循环
将98℃10秒、55℃15秒及72℃150秒的反应进行30个循环
通过QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)对获得的扩增产物的条带 (band)进行纯化。对于PA_acd1，将纯化的DNA用限制酶NcoI(正向引物中 包含切断识别位点)及Sse8387I(反向引物中包含切断识别位点)切断。对于 PA_acd2～PA_acd4，用限制酶BspHI(正向引物中包含切断识别位点)及 Sse8387I(反向引物中包含切断识别位点)切断。通过琼脂糖凝胶电泳进行分 离，从凝胶切出目标条带，进行纯化。纯化中使用Gel/PCRPurification Kit (FAVORGEN公司制)溶解于30μL的灭菌水中。
将纯化的DNA(5μL)、用NcoI以及Sse8387I进行预消化的载体pTrc99A (1μL)、蒸馏水(4μL)以及solution I(DNA Ligation Kit ver.2(宝生物株式 会社))(10μL)混合，在16℃保温12小时，将PCR扩增产物与载体进行连 接。
将大肠杆菌JM109株接种到LB培养基1mL中，在37℃好氧下进行5小 时预培养，将该培养物0.4mL加入SOB培养基40mL(2％细菌用胰蛋白胨、 0.5％细菌用酵母提取物、10mMNaCl、2.5mM KCl、1mM MgSO4、1mM MgCl2) 中，在18℃培养20小时。通过离心分离对该培养物收集菌体后，加入13mL 冷却的TF溶液(20mM PIPES-KOH(pH6.0)、200mM KCl、10mM CaCl2、40mM MnCl2)，在0℃放置10分钟。然后再次离心，除去上清液后将沉淀的 大肠杆菌悬浮在冷却的TF溶液3.2mL中，加入0.22mL的二甲亚砜，在0℃ 放置10分钟。
在这样制作的感应细胞200μL中加入10μL上述连接溶液，在0℃放置30 分钟后在42℃热休克30秒，在0℃冷却2分钟后添加SOC培养基(20mM葡 萄糖、2％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、 1mM MgSO4、1mM MgCl2)1mL，在37℃振荡培养1小时。
培养后，分别将100μL涂布到LBAmp琼脂培养基(包含氨苄青霉素 100mg/L、1.5％琼脂的LB培养基)中，进而在37℃培养。将在琼脂培养基上 生育的多个转化体菌落在1.5mL的LBAmp培养基(包含氨苄青霉素100mg/L 的LB培养基)中在37℃培养一夜，收集菌体后使用QIAprep Spin Miniprep kit (QIAGEN公司)制备质粒DNA。
对于获得的重组质粒DNA，使用CEQ DTCS Quick Start Kit以及荧光测序 仪CEQ2000XL DNA Analysis(均为BECKMAN COULTER，美国)确认其碱 基序列，并命名为质粒pMMA002～pMMA005(表36)。
对pET16b载体也通过同样的操作插入ACD同源基因，将获得的质粒命 名为pMMA102～pMMA105(表36)。但是，由于pET16b上没有Sse8387I 位点，因此预先制作了在pET16b的BamHI位点插入有包含Sse8387I切断序 列的接头的序列，并且将其作为载体来使用。
＜实施例34：来源于红串红球菌PR4株的ACD同源基因的克隆和高表达 重组体的制作＞
对具有甲基丙烯酸生产能力的红球菌属微生物的甲基丙烯酸合成相关基 因进行了分离。
＜基因组DNA的制备＞
将在LB琼脂培养基培养基(LB培养基、1.5％琼脂)上生育的红串红球 菌PR4株(NBRC100887)接种到10mL的LB液体培养基中，在30℃振荡培 养36小时。培养结束后，通过离心由2mL的培养液回收菌体，使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(promega株式会社)获得基因组DNA 100μL。
＜向高表达载体的克隆＞
以获得的基因组DNA为模板，按照成为附加有能够容易地导入到表达载 体的限制酶识别位点的方式设计寡核苷酸，通过PCR法制备了包含推定编码 ACD的基因的DNA片段。
[表37]
Figure BDA0003311327820002201
寡核苷酸引物
MMA-021：5’-GGACATGTTTACTCTGACCGATGACGAGCG-3’(序 列号114)
MMA-022：5’-GGCCTGCAGGCCGTCACGCTTTTCGATCAATAC-3’ (序列号115)
MMA-023：5’-CCACATGTCCGATTACCTTGCCACCGGAGC-3’(序 列号116)
MMA-024：5’-GGCCTGCAGGATCTTCTTGGGGTTCGTCACAAC-3’ (序列号117)
利用PCR反应进行的扩增与实施例33同样地进行。
使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)对获得的扩增产物的条带进 行纯化，用限制酶PciI(正向引物中包含切断识别位点)及Sse8387I(反向引 物中包含切断识别位点)切断。以下的操作与实施例33同样地进行，获得以 pTrc99A为载体的质粒pMMA009及010、以pET16b为载体的质粒pMMA109 及110(表37)。
＜实施例35：来源于表达ACD同源基因的重组体的细胞提取液的制备和 蛋白质的表达解析＞
使用实施例33及34中制作的包含ACD同源基因的表达质粒，转化大肠 杆菌JM109(pMMA002～pMMA005、pMMA009及010的情况下)或大肠杆 菌BL21(DE3)(pMMA102～pMMA105、pMMA109及110的情况下)。 大肠杆菌JM109的转化株按照下述方式进行培养。
将大肠杆菌重组体接种到1mL的包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基 中，在37℃进行7小时预培养。取0.1mL培养液加入100mL的同一培养基(包 含100μg/mL氨苄青霉素、1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(以下，IPTG))， 在37℃振荡培养15小时。通过离心分离(3700×g、10分钟、4℃)由获得的 培养液回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤后悬浮在同一缓冲液 中。使用JM109/pTrc99A作为对照菌株。
大肠杆菌BL21(DE3)的转化株按照以下方式进行培养。将大肠杆菌重 组体接种到1mL的包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃预培 养14小时。取0.1mL培养液加入到100mL的同一培养基(100μg/mL氨苄青 霉素)中，在37℃振荡培养至OD达到0.3后，按照终浓度为1mM的方式添 加IPTG进而振荡培养数小时。通过离心分离(3,700×g、10分钟、4℃)由获 得的培养液回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤后悬浮在同一缓 冲液中。使用BL21(DE3)/pET16b作为对照菌株。
从获得的菌体悬浮液中取出1mL，按照下述方式制备细胞提取液。使用 超声波破碎机VP-300(TIETECH、日本)，一边用冰冷却一边以1秒的间隔 脉冲输出破碎3分钟。然后进行离心分离(10,000×g、5分钟、4℃)采集获得 的上清液作为细胞提取液。
利用SDS凝胶电泳进行的蛋白质分析按照以下方式进行。将细胞提取液 适当稀释后，与聚丙烯酰胺凝胶电泳用样品溶液(0.1M Tris-HCl(pH6.8)、4％ w/v SDS、0.2M二硫苏糖醇、20％v/v甘油、微量溴酚蓝)混合，在98℃加热 5分钟进行变性处理。制作10％聚丙烯酰胺凝胶，在每一泳道中各使用5μL 变性处理过的样品，进行电泳分析(图7)。
＜实施例36：细胞提取液的ACD活性的测定＞
按照下述方式通过以异丁酰辅酶A为底物的甲基丙烯酰辅酶A的生成来 测定ACD活性。在100mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中包含终浓度分别为6mM 的1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐、0.4mM的黄素腺嘌呤二核苷酸及1mM的 异丁酰辅酶A的溶液1.84mL中，加入如实施例35那样获得的细胞提取液 0.16mL而成为2mL。在37℃反应30分钟后，使用CentricutUltraminiW-10 (KURABO INDUSTRIES LTD)进行超滤，通过去除蛋白质使反应停止，按 照以下的条件通过HPLC进行分析。结果示于表38。PA_acd1及RE_acd1确 认到高ACD活性，确认通过这些酶能够由异丁酰辅酶A生产甲基丙烯酰辅酶 A。
HPLC分析条件
柱：Inertsil ODS-3V，4.6mm×250mm
流动相：30％MeOH，50mM H3PO4，pH5.7
流量：1.0ml/分钟柱温度：35℃检测：UV254nm(210nm)
注入量10μl用流动相将反应溶液稀释10倍后进行测定。
[表38]
Figure BDA0003311327820002221
＜实施例37：BCKAD基因的克隆和高表达重组体的制作、细胞提取液的 制备、及蛋白质的表达解析＞
基因的克隆和表达质粒的制作以及重组体的制作与实施例33同样地进 行。以绿脓杆菌PAO1株的基因组DNA为模板，使用表39所示的引物通过 PCR法制备了包含编码BCKAD复合体基因的完整基因操纵子的DNA片段。 通过限制酶BspHI和Sse8387I对获得的片段进行消化，与实施例33同样地插 入到载体pTrc99A及pET16b中获得重组质粒(pWA108及pWA008)。
[表39]
Figure BDA0003311327820002231
寡核苷酸引物
MAA-15：5’-GGCCTGTCATGAGTGATTACGAGCCG-3’(序列号118)
MAA-16：5’-CGGCCCTGCAGGTTCGCGGGAATCAGATGTGC-3’(序 列号119)
将如上述那样获得的大肠杆菌重组体JM109/pWA108与实施例35同样地 进行培养。(但是在该重组体的情况下，即使不添加IPTG也能确认到高蛋白 质表达，其原因不明，因此未添加IPTG而进行。)大肠杆菌重组体BL21(DE3) /pWA008的情况下，与实施例35同样地进行培养。细胞提取液的制备及通过 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行的蛋白质的表达解析与实施例35同样地实施。
＜实施例38：来源于红球菌属细菌的BCKAD基因(簇1)的克隆和高表 达重组体的制作＞
由于不存在红球菌属细菌中的BCKAD基因的知识，因此以绿脓杆菌 PAO1株的BCKAD复合体基因的氨基酸序列为基础对红串红球菌PR4株的基 因组序列进行了同源性检索，结果发现2个候选基因簇。将它们设为簇1和簇 2。
簇1与绿脓杆菌PAO1株同样，4个基因由序列号63、65、67、69表示 的碱基序列组成，其编码的氨基酸序列为序列号62、64、66、68。簇2的3 个基因分别由序列号71、73、75表示的碱基序列组成，其编码的氨基酸序列 分别为序列号70、72、74。
簇1的BCKAD复合体基因的克隆和表达质粒的制作及重组体的制作与实 施例33同样地进行。以红串红球菌PR4株的基因组DNA为模板，使用下述 所示的引物通过PCR法制备包含编码BCKAD复合体基因的完整基因操纵子 的DNA片段。通过限制酶BspHI和Sse8387I消化所获得的片段，与实施例33同样地插入到载体pTrc99A中，获得重组质粒(pMMA019)。
寡核苷酸引物
MMA-187：5’-GGTCATGACTCTTGTCGAGCCCTTG-3’(序列号120)
MMA-140：5’-GACCTGCAGGTCCTCTTCTGGTCATGGTTC-3’(序 列号121)
＜实施例39：来源于红球菌属细菌的BCKAD基因(簇2)的克隆和高表 达重组体的制作＞
簇2的BCKAD复合体基因的克隆和表达质粒的制作及重组体的制作按照 下述方式进行。以红串红球菌PR4株的基因组DNA为模板使用下述所示的 引物通过PCR法进行制备。
寡核苷酸引物
MMA-188：5’-AGGAAACAGACCATGATCGACAACCTCGATTA-3’ (序列号122)
MMA-189：5’-CTTGCATGCCTGCAGGCTCACTCGTTCCTTTTTACAG -3’(序列号123)
将上述PCR产物及用NcoI及Sse8387I预消化的载体pTrc99A使用 In-Fusion HDCloning Kit(宝生物株式会社)按照制品说明书进行末端序列的 重组而连接。使用上述注入反应液2μL，与实施例33同样地进行大肠杆菌 JM109株的转化，由获得的转化体得到重组质粒(pMMA020)。
＜实施例40：BCKAD基因高表达重组体的细胞提取液的活性测定＞
按照下述方式通过以2-氧代异戊酸为底物的异丁酰辅酶A的生成来测定 BCKAD活性。
在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中包含终浓度分别为1mM的MgCl2、 0.2mM的焦磷酸硫胺素、1mM的CoA-SH及2mM DTT的溶液0.7mL中，加 入如实施例37那样获得的细胞提取液0.2mL而成为0.9mL。在其中加入2-氧 代异戊酸钙盐0.1mL(终浓度4mM)，在37℃反应30分钟后，使用Centricut UltraminiW-10(KURABO INDUSTRIES LTD)进行超滤，通过去除蛋白质使 反应停止，按照以下的条件通过HPLC进行分析。其结果是，在JM109/pWA108 的情况下确认生成0.83mM异丁酰辅酶A，在BL21(DE3)/pWA008的情况 下确认生成0.88mM的异丁酰辅酶A。
HPLC分析条件
柱：Inertsil ODS-3V，4.6mm×250mm
流动相：35％MeOH，50mM H3PO4，pH5.7
流量：1.0ml/分钟柱温度：35℃检测：UV 254nm(210nm)
注入量10μl用流动相将反应溶液稀释10倍后进行测定。
＜实施例41：利用来源于BCKAD基因高表达重组体以及表达ACD同源 基因的重组体的细胞提取液混合物由2-氧代异戊酸来合成甲基丙烯酰辅酶A] ＞
在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中包含终浓度分别为1mM MgCl2、0.2mM 焦磷酸硫胺素、1mM CoA-SH、2mM DTT、2mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)、0.04mM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、2mM缬氨酸的溶液0.6mL 中，添加如实施例35及40那样获得的细胞提取液(JM109/pMMA002及 JM109/pWA108)各0.1mL而成为0.8mL。在其中添加2-氧代异戊酸钙盐0.1mL (终浓度4mM)，在37℃反应30分钟后，通过HPLC确认异丁酰辅酶A的生 成，并添加0.1mL的1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(终浓度6mM)，使其 进而反应3小时。反应后，使用CentricutUltraminiW-10(KURABO INDUSTRIES LTD)进行超滤。通过去除蛋白质使反应停止，通过HPLC进行 分析。其结果是，确认生成了0.2mM的甲基丙烯酰辅酶A。
＜实施例42：甲基丙烯酸丁酯的合成＞
在100mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中包含终浓度分别为6mM1-甲氧基-5- 甲基酚嗪硫酸甲酯盐、0.4mMFAD及1mM异丁酰辅酶A的溶液1.84mL中， 加入实施例35那样获得的具有ACD活性的细胞提取液0.16mL，制备2mL反 应液。在37℃反应30分钟，按照实施例41所示的HPLC条件进行分析。其 结果是，异丁酰辅酶A的峰消失，确认生成了甲基丙烯酰辅酶A。
通过使用这样获得的生成了甲基丙烯酰辅酶A的反应液使具有AAT活性 的香蕉的果肉及正丁基醇反应，确认了甲基丙烯酸丁酯的生成。即，将香蕉去 皮，用刀将果肉切成约1毫米厚的片，进而将其4等分。在50mL烧瓶中依次 加入已经切片的香蕉1g、上述甲基丙烯酰辅酶A合成反应液0.9mL、3.5M KCl 溶液0.1mL及正丁基醇5μL，密闭，使其在30℃反应2小时。反应后从100mL 烧瓶的顶空采集150μL，按照以下的GC条件进行分析，结果生成了0.015mM 的甲基丙烯酸丁酯。
GC分析条件
柱：DB-WAX，30m×0.32mm
柱温度：50℃·5分钟→5℃/分钟→100℃(合计15分钟)
载气：He
注入量：200℃200℃不分流(进样时间1分钟)
检测器：250℃FID注入量：150μL
另外，关于甲基丙烯酸丁酯的浓度，制备已知浓度的水溶液，并在100mL 烧瓶中装入该水溶液2mL，在30℃保温30分钟后，按照同样的方法从顶空采 样并进行GC分析，制作标准曲线而计算。
＜实施例43：大肠杆菌用BCKAD和ACD的共表达用质粒的制作＞
使用In-Fusion HD Cloning kit(宝生物公司制TAKARA)将包含ACD基 因(PA_acd1基因)的DNA片段插入实施例37中制作的pWA108的BCKAD 的下游，制作BCKAD和ACD的共表达用质粒pMMA201及pMMA202。此 外，同样地制作了在实施例33所制作的pMMA002的PA_acd1基因的下游插 入了包含BCKAD基因的DNA片段的共表达用质粒pMMA203及pMMA204。 具体如下所示。
(1)质粒pMMA201的制作
以实施例33中制作的pMMA102为模板，通过PCR法扩增PA_acd1基因。 PCR条件如下所示。
Fw引物
MMA-039TAGAGTCGACCTGCACGAGATCTCGATCCCGCGAAAT(序 列号128)
Rv引物
MMA-040GCTTGCATGCCTGCACAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTT (序列号129)
反应液组成
Figure BDA0003311327820002271
温度循环
将98℃10秒、60℃10秒及72℃120秒的反应进行30个循环
PCR结束后，使用样品1μl通过0.7％琼脂糖凝胶电泳进行片段的确认， 结果确认扩增了约1.1kb的片段。使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN 公司制)对PCR产物进行简易纯化，获得PCR片段。
另一方面，通过限制酶Sse8387I将质粒pWA108切断作为载体侧片段。 将上述两片段用于如下所示的利用In-Fusioon HD Cloning Kit的反应。
反应液组成
Figure BDA0003311327820002272
将上述反应液在50℃保温15分钟后，在冰上冷却，用于大肠杆菌JM109 株的转化。大肠杆菌转化体的选择通过LBAmp琼脂培养基进行。通过实施例 33所述的方法由获得的转化体制备质粒，获得目标质粒。质粒的确认通过研 究限制酶XbaI及Sse8387I处理后的片段尺寸及插入片段和载体的连接区域的 序列而进行。目标质粒命名为pMMA201。
(2)质粒pMMA202的制作
以实施例33中制作的pMMA102为模板，通过PCR法扩增PA_acd1基因。 PCR引物如下所示。
Fw引物
MMA-042TAGAGTCGACCTGCACCTCTAGAAATAATTTTGTTTA(序 列号130)
Rv引物
MMA-040GCTTGCATGCCTGCACAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTT (序列号129)
与上述同样地使用In-Fusioon HD Cloning Kit将该PCR片段和被限制酶Sse8387I切断的质粒pWA108连接，将目标质粒命名为pMMA202。
(3)质粒pMMA203的制作
以实施例37中制作的pWA008为模板，通过PCR法扩增BCKAD基因。 PCR引物如下所示。
Fw引物
MMA-041CCATCGCATCCTGCACGAGATCTCGATCCCGCGAAAT (序列号131)
Rv引物
MMA-040GCTTGCATGCCTGCACAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTT (序列号129)
反应方法和PCR片段的获得按照(1)中记载的方式进行。
另一方面，通过限制酶Sse8387I将包含PA_acd1基因的质粒pMMA002 切断作为载体侧片段。与(1)同样地使两片段进行利用In-Fusioon HD Cloning Kit的反应，使用反应液转化大肠杆菌JM109株。由获得的转化体得到质粒， 与(1)同样地进行质粒的确认。将目标质粒命名为pMMA203。
(4)质粒pMMA204的制作
以实施例37中制作的pWA008为模板，通过PCR法扩增BCKAD基因。 PCR引物如下所示。
Fw引物
MMA-043CCATCGCATCCTGCACCTCTAGAAATAATTTTGTTTA(序 列号132)
Rv引物
MMA-040GCTTGCATGCCTGCACAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTT (序列号129)
反应方法和PCR片段的获得按照(1)所述的方式进行。与上述同样地使 用In-Fusioon HD Cloning Kit将该PCR片段和被限制酶Sse8387I切断的质粒 pMMA002连接，将目标质粒命名为pMMA204。
＜实施例44：利用表达BCKAD及ACD的大肠杆菌重组体细胞提取液由 2-氧代异戊酸合成甲基丙烯酰辅酶A(体外)＞
与实施例35所述的方法同样地获得JM109/pMMA204株的细胞提取液。 使用JM109/pTrc99A作为对照菌株。与实施例40所述的方法同样地在 JM109/pMMA204细胞提取液中加入2-氧代异戊酸钙盐0.1mL(终浓度4mM)， 在37℃反应30分钟后，通过HPLC对异丁酰辅酶A的生成进行确认，并加入 0.1mL的1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(终浓度6mM)使其进而反应3小 时。反应后，使用Centricut UltraminiW-10(KURABO INDUSTRIES LTD)进 行超滤去除蛋白质(使反应停止)，按照以下的条件通过HPLC进行分析。
HPLC分析条件
柱：Capcell Pak ODS-UG120(资生堂)、粒径μm、2.0mm I.D.×250mm
流动相：25％MeOH，50mM H3PO4，pH5.7
流量：1.0ml/分钟
柱温度：35℃
检测：UV254nm(210nm)
注入量10μl用流动相将反应溶液稀释10倍后进行测定。
其结果是，确认生成了0.1mM的甲基丙烯酰辅酶A。确认了由大肠杆菌 重组体表达的BCKAD及ACD能够在1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐存在下 由2-氧代异戊酸制造甲基丙烯酰辅酶A。
＜参考例4：使用表达BCKAD及ACD的大肠杆菌重组体由2-氧代异戊 酸合成甲基丙烯酸(体内)＞
使用表达BCKAD及ACD的大肠杆菌重组体实施由2-氧代异戊酸合成甲 基丙烯酸或甲基丙烯酰辅酶A。
将JM109/pMMA201株、JM109/pMMA202株、JM109/pMMA203株及 JM109/pMMA204株接种到1mL的包含100μg/mL氨苄青霉素的LBAmp培养 基(氨苄青霉素100mg/L)中，在37℃预培养6小时。取0.1mL培养液加入 到100mL的同一培养基(包含1mM IPTG)中，在37℃振荡培养18小时。取 出所获得的培养液10mL加入到包含0.5％2-氧代异戊酸钙的90mL的LBAmp 培养基中，在37℃振荡培养25小时。培养结束后，使用膜滤器过滤培养液， 按照以下的条件通过HPLC进行分析。
HPLC分析条件
柱：Wakopak Wakobeads-T-132-E、
Figure BDA0003311327820002301
流动相：0.1％磷酸
流量：0.5ml/分钟
柱温度：40℃
检测：UV 210nm
注入量：5ul
其结果是，没有确认到甲基丙烯酸及甲基丙烯酰辅酶A的生成，确认生 成了14.2mM的异丁酸。即表明，在大肠杆菌的体内反应中无法合成甲基丙烯 酸或甲基丙烯酰辅酶A。
生成的异丁酸浓度
[表40]
菌株名 异丁酸浓度(mM)
JM109/pMMA201 13.5
JM109/pMMA202 13.4
JM109/pMMA203 13.4
JM109/pMMA204 14.2
＜参考例5：使用表达BCKAD及ACD的大肠杆菌重组体的静止菌体由 2-氧代异戊酸合成甲基丙烯酸＞
与实施例35所述的方法同样地培养JM109/pMMA201株。通过离心分离 (3,700×g、10分钟、4℃)由获得的培养液回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲 液(pH7.0)洗涤后，悬浮在相同缓冲液中获得菌体悬浮液。使用该菌体悬浮 液按照下述方式制备静止菌体反应液3mL，在30℃、180rpm下进行24小时 反应。
静止菌体反应液组成
50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)
0.5％2-氧代异戊酸钙
OD10菌体悬浮液
反应结束后，对反应液进行膜滤器过滤，按照参考例4所述的条件利用 HPLC进行分析。其结果是，没有确认到甲基丙烯酸的生成，确认生成了 15.2mM的异丁酸。与参考例4同样地表明，通过静止菌体反应无法在大肠杆 菌中合成甲基丙烯酸或甲基丙烯酰辅酶A。
＜参考例6：来源于天蓝色链霉菌A3(2)的ACD基因(acdH)的克隆 和表达重组体的制作、细胞提取液的制备、蛋白质的表达解析及ACD活性的 测定＞
通过实施例33～32中所述的方法制作重组有天蓝色链霉菌A3(2)来源 的acdH基因的表达重组体，进行细胞提取液的制备、蛋白质的表达解析及ACD 活性的测定。蛋白质的表达解析结果示于图7(C)，酶活性测定结果示于表 38。另外，在制作质粒时，PCR中使用的寡核苷酸如下。
寡核苷酸引物
MMA-001：5’-CACCATGGACCACAAGCTCTCCCCCGAAC-3’(序 列号124)
MMA-002：5’-GCCCTGCAGGCTCAGCCCACCAGCCCCAAC-3’(序 列号125)
＜参考例7：利用AAT合成甲基丙烯酸异丁酯＞
将香蕉去皮，用刀将果肉切成约1毫米厚的片，进而将其4等分。在100ml 烧瓶中依次加入已经切片的香蕉2g、包含2.3mM甲基丙烯酰辅酶A以及0.35M KCl的溶液2ml以及5μl异丁醇。密闭，使其在30℃进行反应。从100ml烧瓶 的顶空采集反应1、2或3小时后的包含生成的甲基丙烯酸异丁酯的反应混合 物150μl，按照以下的GC条件进行分析。其结果示于表41。
[表41]
甲基丙烯酸异丁酯的生成量
时间 甲基丙烯酸异丁酯的生成量(mM)
1 0.19
2 0.38
3 0.45
GLC分析条件
柱：DB-WAX，30m×0.32mm
柱温度：50℃.5分钟→5℃/分钟→100℃(合计15分钟)
载气：He
注入量：200℃不分流(进样时间1分钟)
检测器：250℃FID注入量：150μl
另外，关于甲基丙烯酸酯的浓度，在最初制备已知浓度的水溶液，并在 100ml烧瓶中装入该水溶液2ml，在30℃保温30分钟后，按照同样的方法从 顶空采样并进行GC分析，制作标准曲线并计算。
＜参考例8：利用AAT合成甲基丙烯酸丁酯＞
除了使用正丁醇代替异丁醇以外，与参考例7同样地实施。其结果示于表 42。
[表42]
甲基丙烯酸丁酯的生成量
时间 甲基丙烯酸丁酯的生成量(mM)
2 0.20
5.5 0.30
＜参考例9：利用AAT合成甲基丙烯酸丁酯之2＞
在100ml烧瓶中依次加入表43所示的植物片2g、包含2.3mM甲基丙烯 酰辅酶A及0.35M KCl的溶液2ml及10μl的正丁醇。密闭，使其在30℃进行 反应。甲基丙烯酸酯的分析与参考例7同样实施。其结果示于表43。
[表43]
甲基丙烯酸丁酯的生成量
Figure BDA0003311327820002331
＜参考例10：利用AAT合成甲基丙烯酸乙酯＞
在100ml烧瓶中依次加入表44所示的植物片2g、包含2.3mM甲基丙烯 酰辅酶A以及0.35M KCl的溶液2ml以及6.4μl乙醇。密闭，使其在30℃进 行反应。甲基丙烯酸酯的分析与参考例7同样实施。其结果示于表44。
[表44]
甲基丙烯酸乙酯的生成量
Figure BDA0003311327820002332
＜参考例11：利用AAT合成甲基丙烯酸甲酯＞
在100ml烧瓶中依次加入表45所示的植物片2g、包含2.3mM甲基丙烯 酰辅酶A以及0.35M KCl的溶液2ml以及4.4μl甲醇。密闭，使其在30℃进 行反应。甲基丙烯酸酯的分析与参考例7同样实施。其结果示于表45。
[表45]
甲基丙烯酸甲酯的生成量
Figure BDA0003311327820002333
＜实施例45：导入了来源于植物的AAT基因的大肠杆菌重组体的制作＞
将序列号77、79及81所示的来源于植物的AAT基因委托宝生物株式会 社进行合成。
苹果AAT(MpAAT1)：氨基酸序列(序列号76)、碱基序列(序列号77)
草莓AAT(SAAT)：氨基酸序列(序列号78)、碱基序列(序列号79)
草莓AAT(VAAT)：氨基酸序列(序列号80)、碱基序列(序列号81)
这些合成的基因片段被插入到载体pMD19中，分别命名为pAAT001～ 003。将(表46)这些pAAT001～003作为模板，按照成为附加有能够容易地 导入到表达载体的限制酶识别位点的形式而设计寡核苷酸，通过PCR法制备 了包含AAT基因的DNA片段。
寡核苷酸引物
MMA-044：5’-GTTTGCACGCCTGCCGTTCGACG-3’(序列号82)
MMA-045：5’-CGGTACGCGCGGATCTTCCAGAG-3’(序列号83)
反应液组成
灭菌水22μL
2×PrimeSTAR(宝生物公司制)25μL
正向引物 1μL
反向引物 1μL
基因组DNA 1μL
总量50μL
温度循环
将98℃10秒、55℃15秒及72℃150秒的反应进行30个循环
通过QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)对获得的扩增产物的条带进 行纯化。通过限制酶PagI(正向引物中包含切断识别位点)以及Sse8387I(反 向引物中包含切断识别位点)切断所纯化的各DNA。通过琼脂糖凝胶电泳进 行分离，从凝胶中切出目标条带，进行纯化。纯化中使用Gel/PCR Purification Kit(FAVORGEN公司制)，溶解到30μL的灭菌水中。
将纯化的DNA(5μL)、用NcoI以及Sse8387I进行预消化的载体pTrc99A (1μL)、蒸馏水(4μL)以及solution I(DNALigation Kit ver.2(宝生物株式 会社))(10μL)混合，通过在16℃保温12小时将PCR扩增产物与载体进行 连接。
在与实施例33的方法同样制作的感应细胞200μL中加入上述连接溶液10μL，在0℃放置30分钟后，在42℃热休克30秒，然后在0℃冷却2分钟后， 添加SOC培养基1mL，在37℃振荡培养1小时。
培养后，分别将100μL涂布到LBAmp琼脂培养基(包含氨苄青霉素 100mg/L、1.5％琼脂的LB培养基)，进而在37℃进行培养。将在琼脂培养基 上生育的多个转化体菌落在1.5mL的LBAmp培养基(包含氨苄青霉素 100mg/L的LB培养基)上，在37℃培养一夜，收集菌体后使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司)制备质粒DNA。
对获得的重组各质粒DNA，使用CEQ DTCS Quick Start Kit以及荧光测序 仪CEQ2000XL DNA Analysis(均为BECKMAN COULTER，美国)确认其碱 基序列，并命名为质粒pAAT101～pAAT103(表46)。
对pET16b载体也通过同样操作插入AAT基因，将获得的质粒命名为 pAAT201～pAAT203(表46)。但是，由于pET16b上没有Sse8387I位点，因 此预先制作了在pET16b的BamHI位点插入有包含Sse8387I切断序列的接头 的序列，并且将其作为载体来使用。
将质粒pAAT101～pAAT103导入到JM109株中，获得重组体 JM109/pAAT101～pAAT103。将质粒pAAT201～pAAT203导入到BL21(DE3) 株中，获得重组体BL21(DE3)/pAAT201～pAAT203。
[表46]
植物来源AAT基因表达用质粒
Figure BDA0003311327820002351
＜实施例46：由表达AAT基因的大肠杆菌重组体制备细胞提取液＞
(1)使用pTrc99A作为载体的大肠杆菌重组体的培养
将实施例45中获得的大肠杆菌重组体JM109/pAAT101～pAAT103接种到 1ml的包含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃预培养7小时。取 培养液0.1ml，加入到100ml的同一培养基(包含100μg/ml氨苄青霉素、1mM IPTG)中，在37℃振荡培养15小时。通过离心分离(3700×g、10分钟、4℃) 从获得的培养液中回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤后，悬浮 到同一缓冲液中。使用JM109/pTrc99A作为对照菌株。
(2)使用pET16b作为载体的大肠杆菌重组体的培养
将实施例45中获得的大肠杆菌重组体BL21(DE3)/pAAT201～pAAT203 接种到1ml的包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃预培养14 小时。取培养液0.1mL，加入到100ml的同一培养基(100μg/mL氨苄青霉素) 中，在37℃振荡培养直到OD变为0.3后，按照终浓度为1mM的方式添加IPTG， 并进而振荡培养数小时。通过离心分离(3,700×g、10分钟、4℃)从获得的培 养液中回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤后，悬浮到该缓冲液中使其达到OD6(630nm)。使用BL21(DE3)/pET16b作为对照菌株。
(3)细胞提取液的制备
由获得的菌体悬浮液制备细胞提取液。使用超声波破碎机VP-15S (TIETECH、日本)，在输出控制4、DUTY CYCLE40％、PULS、TIMER＝B 模式10s的条件下，将菌体悬浮液在冰冷却的同时破碎1分钟。然后进行离心 分离(10,000×g、5分钟、4℃)，采集获得的上清液(细胞提取液)1ml。
＜实施例47：使用AAT基因重组体细胞提取液合成甲基丙烯酸丁酯]
使用按照实施例46所述的方法制备的细胞提取液，进行以下的反应。在 按照使反应液的终浓度为7mM甲基丙烯酰辅酶A和40.5mM正丁醇的方式加 入了甲基丙烯酰辅酶A和醇的溶液0.8ml的10ml容量的带隔垫样品瓶(GC 用)中，添加0.2ml的细胞提取液来开始反应。使带隔垫样品瓶在30℃保温1～ 5小时来进行反应。
与参考例7同样地分析带隔垫样品瓶的顶空气体。结果示于表47。
[表47]
使用AAT基因重组体的甲基丙烯酸丁酯的生成
Figure BDA0003311327820002361
＜实施例48：使用AAT基因重组体细胞提取液合成甲基丙烯酸酯＞
使用甲醇、乙醇或正丁醇作为醇，细胞提取液使用来源于BL21(DE3) /pAAT201(苹果)的细胞提取液，与实施例47同样地进行反应。表48示出5 小时后的生成物的分析结果。
[表48]
使用AAT基因重组体的甲基丙烯酸酯的生成
Figure BDA0003311327820002371
＜实施例49：使用AAT基因重组体细胞提取液合成甲基丙烯酸酯之2＞
使用异丁醇、苯酚、苯甲醇或2-乙基己醇作为醇，用实施例46中获得的 BL21(DE3)/pAAT201(苹果)的细胞提取液进行以下的反应。
在按照使反应液的终浓度为1mM甲基丙烯酰辅酶A和40mM的醇的方式 加入了包含甲基丙烯酰辅酶A和醇的溶液0.8ml的10ml容量的带隔垫样品瓶 (GC用)中，添加0.2ml的细胞提取液来开始反应。使带隔垫样品瓶在30℃ 保温1～5小时来进行反应。反应结束后，在带隔垫样品瓶中的反应液中添加 1mL的乙腈，充分混合。然后，使用注射器式滤器DISMIC/孔径0.45μm (ADVANTEC公司制)过滤后，供于HPLC分析。表49示出5小时后的生 成物的分析结果。
使用AAT基因重组体合成甲基丙烯酸酯(甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯 酸苯酯、甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯)
[表49]
Figure BDA0003311327820002372
HPLC分析条件
装置：Waters 2695
柱：Shiseido CAPCELL PAK C18 UG1205μm
流动相：65％MeOH、0.2％磷酸
流量：0.25ml/分钟
柱温度：35℃
检测：UV 210nm
注入量：10μL
＜比较例1：利用来源于酵母的AAT基因重组体细胞提取液进行的甲基 丙烯酸酯的合成反应＞
与实施例45同样地制作来源于酵母的AAT基因表达质粒(表50)，使 用这些转化大肠杆菌，获得AAT表达重组体。
酵母来源AAT基因表达用质粒
[表50]
Figure BDA0003311327820002381
与实施例46同样地制备细胞提取液，与实施例47同样地以甲基丙烯酰辅 酶A和正丁醇为底物进行甲基丙烯酸丁酯的合成反应。其结果是，没有确认 到甲基丙烯酸丁酯的生成。另一方面，在以乙酰辅酶A和正丁醇为底物时， 确认到乙酸丁酯的生成。即，来源于酵母的AAT没有确认到甲基丙烯酸酯制 造能力。
使用酵母AAT基因重组体的酯的生成
[表51]
Figure BDA0003311327820002382
产业可利用性
根据本发明的甲基丙烯酸的制造方法，能够不依赖化学方法地利用微生物 由能够循环的生物来源的资源(可再生原料)制造甲基丙烯酸。现有的ACH 法中，需要利用酸进行丙酮合氰化氢的酸化处理，会产生大量的废酸。此外， 各步骤中需要分离、纯化，能量消耗大。另一方面，根据本发明的甲基丙烯酸 的制造方法能够由生物质直接通过单一工序高效且简便地生产甲基丙烯酸。与 此相伴的是，安全方面、环境方面、设备方面、作业方面及成本方面等的负担 降低。此外，通过将甲基丙烯酸的原料转为生物质来源的物质还能够减少二氧 化碳向环境中的排出量。
序列号82：MMA-044
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序列号130：MMA-042
序列号131：MMA-041
序列号132：MMA-043。
菌株：B25-2；菌株分类命名：假单胞菌属(Pseudomonas)B25-2；保藏编号：NITEBP-1451。
菌株：D22-1；菌株分类命名：假单胞菌属(Pseudomonas)D22-1；保藏编号：NITEBP-1452。
菌株：D43-1；菌株分类命名：假单胞菌属(Pseudomonas)D43-1；保藏编号：NITEBP-1453。
菌株：D25；菌株分类命名：假单胞菌属(Pseudomonas)D25；保藏编号： NITE BP-1454。
菌株：D26；菌株分类命名：假单胞菌属(Pseudomonas)D26；保藏编号：NITE BP-1455。
菌株：D29；菌株分类命名：假单胞菌属(Pseudomonas)D29；保藏编号： NITE BP-1456。
菌株：D41-2；菌株分类命名：假单胞菌属(Pseudomonas)D41-2；保藏编号：NITEBP-1457。
菌株：G1；菌株分类命名：芽孢杆菌属(Bacillus)G1；保藏编号：NITE BP-1458。
菌株：G2；菌株分类命名：芽孢杆菌属(Bacillus)G2；保藏编号：NITE BP-1459。
菌株：R1；菌株分类命名：芽孢杆菌属(Bacillus)R1；保藏编号：NITE BP-1460。
菌株：B13；菌株分类命名：鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)B13；保藏编号：NITEBP-1461。
以上菌株均于2012年11月7日，保藏于日本国千叶县木更津市上总镰足 2-5-8(邮政编码292-0818)，保藏单位：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(即NPMD)。
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Claims (11)

1.一种由作为碳源和/或能源的、可再生原料和/或利用该可再生原料所产生的生物质，使用能够由包含异丁酸或缬氨酸的有机物生成甲基丙烯酸的天然的微生物或它们的衍生株，制造甲基丙烯酸和/或其酯的方法，所述微生物为能够代谢异丁酰辅酶A的天然的微生物或它们的衍生株，所述衍生株为使烯酰辅酶A水合酶基因、3-羟基异丁酰辅酶A水解酶基因和/或3-羟基异丁酸脱氢酶基因缺失或失活而得的基因改变株。
2.根据权利要求1所述的方法，积累0.04ppm以上甲基丙烯酸和/或其酯。
3.根据权利要求1所述的方法，具有甲基丙烯酸生成能力的微生物为具有如下16SrRNA基因的微生物，所述16S rRNA基因由相对于序列号1～41中所述的碱基序列中的任一者显示81％以上的同源性的碱基序列组成。
4.根据权利要求2所述的方法，具有甲基丙烯酸生成能力的微生物为具有如下16SrRNA基因的微生物，所述16S rRNA基因由相对于序列号1～41中所述的碱基序列中的任一者显示81％以上的同源性的碱基序列组成。
5.根据权利要求1所述的方法，具有甲基丙烯酸生成能力的微生物为具有如下LSUrRNA基因的微生物，所述LSUrRNA基因由相对于序列号42～49中所述的碱基序列中的任一者显示81％以上的同源性的碱基序列组成。
6.根据权利要求2所述的方法，具有甲基丙烯酸生成能力的微生物为具有如下LSUrRNA基因的微生物，所述LSUrRNA基因由相对于序列号42～49中所述的碱基序列中的任一者显示81％以上的同源性的碱基序列组成。
7.根据权利要求1～6中的任一项所述的方法，具有甲基丙烯酸生成能力的微生物为属于以下属的微生物：假单胞菌(Pseudomonas)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)属、丛毛单胞菌(Comamonas)属、短波单胞菌(Brevundimonas)属、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)属、苍白杆菌(Ochrobactrum)属、土地杆菌(Pedobacter)属、类芽孢杆菌(Paenibacillus)属、无色小杆菌(Achromobacter)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、希瓦氏菌(Shewanella)属、利斯顿氏菌(Listonella)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、中间根瘤菌(Mesorhizobium)属、根瘤菌(Rhizobium)属、副球菌(Paracoccus)属、黄色杆菌(Xanthobacter)属、链霉菌(Streptomyces)属、地芽孢杆菌(Geobacillus)属、红球菌(Rhodococcus)属、酵母(Saccharomyces)属、假丝酵母(Candida)属或曲霉(Aspergillus)属。
8.根据权利要求1～6中的任一项所述的方法，在醇酰基转移酶的存在下使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A从而制造甲基丙烯酸酯。
9.根据权利要求7所述的方法，在醇酰基转移酶的存在下使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A从而制造甲基丙烯酸酯。
10.根据权利要求8所述的方法，醇酰基转移酶来源于植物。
11.根据权利要求9所述的方法，醇酰基转移酶来源于植物。
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