DE10394214T5

DE10394214T5 - Lichen methyl B-orcinol carboxylate (Everniastrum cirrhatum) for use in the treatment of fungal infections and cancer

Info

Publication number: DE10394214T5
Application number: DE10394214T
Authority: DE
Inventors: Suman Preet Singh Khanuja; Ranganathan Santha Kumar Tiruppadirip-Uliyur; Vivek Kumar Gupta; Preeti Chand; Ankur Garg; Santosh Kumar Srivastava; Subash Chandra Verma; Dharmendra Saikia; Mahendra Pandurang Darokar; Ajit Kumar Shasany; Anirban Pal
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2006-03-16
Also published as: CA2521055A1; WO2004087128A1; GB2415379B; AU2003226628A1; GB0522200D0; JP4498930B2; JP2006514969A; GB2415379A

Abstract

Antimykotische Zusammensetzung/Zusammensetzung gegen Krebs, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von Methyl-β-orcinoicarboxylat der Formel I und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

Formel I An antifungal composition / anti-cancer composition comprising a pharmaceutically effective amount of methyl β-orcinoicarboxylate of Formula I and a pharmaceutically acceptable carrier.

Formula I

Description

Gebiet der ErfindungTerritory of invention

Die vorliegende Erfindung betrifft die neuartige Verwendung eines bereits bekannten Biomoleküls, das aus einer Flechte (Everniastrum cirrhatum) isolierte Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I, zur Behandlung von krankheitserregenden Pilzinfektionen beim Menschen, welche gegenüber Polyen- und Azolantibiotika, wie Amphotericin B, Nystatin, Clotrimazol etc., resistent sind.The The present invention relates to the novel use of one already known biomolecule, the braid (Everniastrum cirrhatum) isolated methyl β-orcinol carboxylate of formula I, for the treatment of pathogenic fungal infections in humans, those opposite Polyene and azole antibiotics, such as amphotericin B, nystatin, clotrimazole etc., are resistant.

Formel I

Formula I

Hintergrund der Erfindungbackground the invention

Flechten sind symbiotische Verbindungen zwischen Pilzen, Grünalgen und/oder Cyanobakterien. Sie weisen eine abwechslungsreiche Chemie auf und erzeugen viele von einem Polyketid abgeleitete Verbindungen, einschließlich einiger Verbindungen, wie Depside und Depsidone, die kaum woanders beschrieben sind. Depside stellen eine Klasse von Verbindungen dar, die für Flechten einzigartig zu sein scheinen. Diese Verbindungen sind dimere Ester von verschiedenartig substituierten Orsellinsäuren und die Hauptherkunft der sogenannten Flechtensäuren. Obwohl Flechten in der traditionellen Medizin genutzt wurden, wurde deren Wert durch die moderne pharmazeutische Industrie weitgehend verkannt, da die Schwierigkeiten bei der Herstellung von axenischen Kulturen und die Bedingungen für das schnelle Wachstum deren routinemäßige Verwendung in den meisten herkömmlichen Screening-Verfahren ausschließen.weave are symbiotic associations between fungi, green algae and / or Cyanobacteria. They have a varied chemistry and produce many polyketide-derived compounds, including some Compounds, such as depside and depsidone, which are hardly described elsewhere are. Depside represent a class of compounds that are used for lichens seem to be unique. These compounds are dimeric esters of variously substituted orsellic acids and the main origin the so-called lichen acids. Although lichens have been used in traditional medicine their value by the modern pharmaceutical industry largely misunderstood, because the difficulties in the production of axenic Cultures and conditions for the rapid growth of their routine use in most usual Exclude screening procedures.

Die Verbindung zwischen Pilzen und Algen ist spezifisch und gezielt. Der Name der Pilzkomponente wird der gesamten Flechte gegeben, und es gibt > 13500 beschrieben Arten, umfassend beinahe ein Fünftel aller bekannten Pilze (Hawckswort und Hill, 1984; The Lichen Forming Fungi, Mecorquodale Ltd.). Obwohl die einzelnden Mycobionten und Photobionten (der Pilz und die photosynthetischen Algen bzw. Cyanobacterien) bei der Kultivierung in einer Laborschale klein und uninteressant sind, zeigen die symbiotischen Bestandteile zusammen in der Natur eine große Vielfalt von unterschiedlichen und schönen Formen, und einige, wie Ramalina menziesii (die "Fischnetz"-Flechte) können gesamte Bäume drapieren, wodurch ein auffallendes Erscheinungsbild erzeugt wird (Arvis, W.O., 2000; Lichens, Smithsonian Situation Press). Diese erfüllen eine Vielzahl von ökologischen Funktionen, wie die Besiedelung von Randhabitaten in der Antarktis, die Stabilisierung des Bodens in der semi-ariden Wüste von Australien und tragen zum Stickstoffumsatz in den nordpazifischen Wäldern von Nordamerika bei.The Connection between fungi and algae is specific and targeted. The name of the mushroom component is given to the entire lichen, and there are> 13500 described Species, comprising almost a fifth of all known mushrooms (Hawckswort and Hill, 1984; The Lichen Forming Fungi, Mecorquodale Ltd.). Although the individual mycobionts and photobionts (the fungus and the photosynthetic algae or cyanobacteria) Cultivation in a laboratory dish are small and uninteresting, The symbiotic ingredients together in nature show one size Variety of different and beautiful shapes, and some, like Ramalina menziesii (the "fishnet") can whole Draping trees, creating a striking appearance (Arvis, W.O., 2000; Lichens, Smithsonian Situation Press). These fulfill one Variety of ecological Functions, such as the colonization of peripheral habitats in the Antarctic, the stabilization of the soil in the semi-arid desert of Australia and contribute to nitrogen sales in the North Pacific woods from North America.

Sie erzeugen charakteristische Sekundärmetaboliten, welche bezüglich derjenigen von höheren Pflanzen einzigartig sind. Flechten erzeugen eine Vielzahl von chemischen Verbindungen, unter denen ungefähr 350 Sekundärmetaboliten identifiziert wurden. Diese von Mycobionten abgeleiteten Produkte sammeln sich üblicherweise als extrazelluläre Kristalle auf der Zellwand der Symbionten an und machen bis zu 10% (in außergewöhnlichen Fällen bis zu 40%) der Thallus-Trockenmasse aus (Galun, M. und Shomer-Ilan, A. (1988) in CRC Handbook of Lichenology, Band III; Galun, M., Herausgeber), S. 3-8, CRC Press); vielen kommen nur in Flechten vor. Die meisten Sekundärverbindungen von Flechten werden durch den Polyketidweg gebildet, während andere vom Shikimisäure- und Mevalonsäureweg abstammen, welche die Hauptwege des Sekundärmetabolismuses in allen Organismen sind. Etliche Flechtenextrakte wurden in der Volksmedizin als verschiedene Heilmittel verwendet, und Screeningversuche mit Flechten haben das häufige Auftreten von Metaboliten mit antibiotischen, antimykobakteriellen, antiviralen, schmerzstillenden und fiebersenkenden Eigenschaften gezeigt.she produce characteristic secondary metabolites which are related to those from higher plants unique. Lichens produce a variety of chemical Compounds under which approximately 350 secondary metabolites were identified. These products derived from mycobionts usually gather as extracellular Crystals on the cell wall of symbionts and make up to 10% (in exceptional make up to 40%) of thallus dry matter (Galun, M. and Shomer-Ilan, A. (1988) in CRC Handbook of Lichenology, Volume III; Galun, M., editor), Pp. 3-8, CRC Press); many occur only in lichens. Most Secondary connections of lichens are formed by the polyketide path, while others of shikimic acid and mevalonic acid path which are the main routes of secondary metabolism in all organisms are. Several lichens extracts were used in folk medicine as different Remedies and lupine screening tests have that frequent Occurrence of metabolites with antibiotic, antimycobacterial, antiviral, analgesic and antipyretic properties shown.

Des Weiteren sind die Pepside eine charakteristische Klasse von Flechtenmetaboliten. Diese Arten von Verbindungen werden durch Kondensation von zwei oder mehr Hydroxybenzoesäuren gebildet, wodurch die Carboxylgruppe eines Moleküls mit der phenolischen Hydroxylgruppe eines zweiten Moleküls verestert wird. Wegen der phenolischen Beschaffenheit ihrer chemischen Strukturen sind diese Moleküle interessante Kandidaten im Hinblick auf die Ermittlung ihrer Wirkungen auf die Biosynthese von Leukotrienen, da eine Hauptklasse von Inhibitoren oft einen hydroxylierten aro matischen Ring enthält (Fitzsimmons et al., 1989). Überdies wurde für zwei von Flechten abgeleitete Kleinmolekülmetaboliten, Protolichesterinsäure und Lobarsäure, berichtet, dass diese 5-LO aus Schweineleukozyten hemmen (Ogmundsdottir et al. 1998). Für Letzere wurde zudem gezeigt, dass diese die Peptidleukotrienbildung hemmt (Gissurarson et al. 1997). Für Depside aus Flechten wurde auch beschrieben, dass diese die Prostaglandinbiosynthese hemmen (Sankawa et al. 1982).Of Furthermore, the pepside are a characteristic class of lichen metabolites. These types of compounds are made by condensation of two or more hydroxybenzoic acids forming the carboxyl group of a molecule having the phenolic hydroxyl group a second molecule is esterified. Because of the phenolic nature of their chemical Structures are these molecules interesting candidates with a view to identifying their effects on the biosynthesis of leukotrienes, as a major class of inhibitors often contains a hydroxylated aromatic ring (Fitzsimmons et al., 1989). moreover was for two lichen-derived small molecule metabolites, protolichesteric acid and Lobarsäure, reported that these 5-LO inhibit porcine leukocytes (Ogmundsdottir et al. 1998). For The latter has also been shown to promote peptide leukotriene formation inhibits (Gissurarson et al., 1997). For depside was made of lichens also described that they inhibit prostaglandin biosynthesis (Sankawa et al., 1982).

Flechten und Flechtenprodukte wurden in der traditionellen Medizin jahrhundertelang verwendet und haben immer noch eine beträchtliche Bedeutung als alternative Behandlungen in verschiedenen Teilen der Welt. Heutzutage kann in der Tat eine Vielzahl von Flechten-basierten Tonika, Lotionen und Lutschbonbons in Island gekauft werden, wo diese medizinisch sind. Die Flechten wurden jedoch durch die moderne pharmazeutische Industrie trotz der Tatsache, dass Flechten eine große Anzahl von Molekülen mit geringem Molekulargewicht und unterschiedlichen Strukturen produzieren und Studien den Nachweis der biologischen Aktivität von Extrakten aus gesamten Flechten erbracht haben (Tabelle 1), ignoriert. Hierzu tragen zwei Gründe bei: (1) Flechten wachsen in der Natur langsam und (2) sie sind schwierig in Kulturen zu vermehren und erneut künstlich zu erzeugen (Ahmadjian, 1993; The Lichen Symbiosis, Blaisdell Publishing Company). Ernten im industriellen Maßstab sind weder ökologisch sinnvoll noch nachhaltig und für viele Arten nicht praktikabel. Selbst wenn die Flechtenkulturen in vitro etabliert werden, produzieren diese nicht die typischen Flechtensubstanzen und ein Verfahren, um dies zu fördern, ist immer noch nicht bekannt.weave and lichen products have been used in traditional medicine for centuries used and still have considerable significance as an alternative Treatments in different parts of the world. Nowadays in indeed a variety of lichen-based tonic, lotions and Lollies are bought in Iceland, where these are medical. The lichens were, however, by the modern pharmaceutical industry despite the fact that lichens have a large number of molecules produce low molecular weight and different structures and studies demonstrating the biological activity of extracts from entire lichens (Table 1), ignored. For this carry two reasons in: (1) lichens grow slow in nature and (2) they are difficult to replicate in cultures and to reproduce artificially (Ahmadjian, 1993; The Lichen Symbiosis, Blaisdell Publishing Company). To harvest on an industrial scale are neither ecological meaningful yet sustainable and for many types not practicable. Even if the lichen cultures In vitro, these do not produce the typical ones Lichen substances and a method to promote this is still not known.

Tabelle 1: Bereits beschriebene bioaktive Bestandteile aus verschiedenen Flechten

Table 1: Already described bioactive constituents from different lichens

Man nimmt an, dass die meisten Sekundärmetaboliten von Flechten durch den Mycobionten erzeugt werden (Huneck und Yoshimura, (1996) Identification of Lichen Substances, Springer-Verlag). Dies ist nicht überraschend, da pilzliche Bestandteile in der Medizin gut bekannt sind (z.B. Penicillin und Cyclosporin). Es ist jedoch möglich, dass die Photobionten auch zu dem Repertoir von Flechten-Metaboliten beitragen. Cyanobakterien erzeugen viele bioaktive Sekundärmetaboliten (Namikoshi, M. und Rinehart, K.L. (1996) Bioactive compounds produced by cyanobacteria, J. Ind. Microbiol. 17, 373-143), und es gibt ein Beispiel einer patentierten antimykotischen Verbindung, die durch einen aus einer Flechte isolierten Stamm von Nostoc erzeugt wird (US Pat. Nr. 4,946,835, Merck & Co.).you assumes that most of the secondary metabolites of lichens the mycobionts (Huneck and Yoshimura, (1996) Identification of Lichen Substances, Springer-Verlag). This is not surprising since fungal components are well known in medicine (e.g. Penicillin and cyclosporin). It is possible, however, that the photobionts contribute to the repertoire of lichen metabolites. cyanobacteria produce many bioactive secondary metabolites (Namikoshi, M. and Rinehart, K.L. (1996) Bioactive compounds produced by cyanobacteria, J. Ind. Microbiol. 17, 373-143), and there is one Example of a patented antifungal compound by a strain of Nostoc isolated from a lichen is produced (U.S. Pat. No. 4,946,835, Merck & Co.).

Es gibt überzeugende Gründe für die Ausdehnung der Suche nach Naturproduktarzneimitteln, da bisher zuverlässige Standardantibiotika gegen neue Stämme von Multidrug-resistenten Pathogenen immer weniger wirksam werden. Es wurde sogar behauptet, dass das Ende der Antibiotika-Ära schnell heranrückt. In der Vergangenheit konzentrierte sich die Suche nach pharmazeutisch aktiven Molekülen auf die Produkte von Mikroorganismen, die im Labor kultiviert werden können. In neuester Zeit haben chemische Synthesemethoden große Aufmerksamkeit auf sich gelenkt und die kombinatorische Chemie wurde als Quelle für Moleküle für automatisierte Hochdurchsatz-Screeningverfahren gefördert. Obwohl diese Ansätze einige Leitmoleküle hervorgebracht haben, besteht weiterhin ein großes Interesse, neue chemische Substanzen für die therapeutische Verwendung zu entdecken.There are convincing reasons for expanding the search for natural product drugs, as previously reliable standard antibiotics against new strains of multidrug-resistant pathogens always Weni be effective. It has even been said that the end of the antibiotic era is fast approaching. In the past, the search for pharmaceutically active molecules has focused on the products of microorganisms that can be cultured in the laboratory. Recently, chemical synthesis methods have attracted much attention and combinatorial chemistry has been promoted as a source of molecules for automated high-throughput screening methods. Although these approaches have produced some lead molecules, there is still much interest in discovering new chemical substances for therapeutic use.

Systemische und oberflächliche Pilzinfektionen betreffen Millionen von Personen überall auf der Welt. Die meisten dieser Krankheiten werden durch Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus sp., Trichophyton sp., Microsporum gypseum, Epidermophyton floccossum verursacht, welche ihrer Natur nach infektiös sind. In Indien ist eine große Zahl von Personen mit der Landwirtschaft verbunden, wobei ein Großteil dieser Personen in Dörfern lebt, in denen aufgrund der weitverbreiteten unhygienischen Bedingungen das Vorkommen von Pilzinfektionen häufig ist. Pilzinfektionen erlangen auch zunehmende Bedeutung wegen einer Schwächung des Immunsystems, hauptsächlich aufgrund von Organtransplantationsoperationen, Krebschemotherapie und dem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS). Überdies verbreiten sich Hautinfektionen aufgrund von schlechten hygienischen Bedingungen als auch einem ansteigenden Umweltverschmutzungsgrad schnell in der Bevölkerung. Um diesen Infektionen entgegenzuwirken, sind nur eine Handvoll antimykotischer Agenzien, wie Griseofulvin, Amphotericin und Nystatin auf dem Markt verfügbar, obschon eine Übersättigung hinsichtlich der verfügbaren antibakteriellen Mittel besteht. Die meisten dieser Antimykotika sind synthetische Derivate mit bekannten Nebeneffekten für Menschen und Tiere. Dieses Problem wird durch die Entwicklung von Resistenzen gegen herkömmlich verwendete Arzneimittel verstärkt, wodurch die Chemotherapie weniger verwendbar wird. Deshalb müssen neue anti mykotische Substanzen aus natürlichen Quellen erzeugt werden, um diesem Resistenzphänomen gegenzutreten. Während 1990-96 betrug der Weltmarkt für Antimykotika mehr als 1500 Millionen US$, was 1,5% des gesamten weltweiten Antiinfektiva-Marktes ausmacht. Zur Zeit machen Antimykotika (sowohl topische als auch systemische) mehr als 6% aller Antiinfektiva aus. Der Weltmarkt für Antimykotika expandiert mit einer Rate von 20% pro Jahr und erreicht voraussichtlich mehr als 600 Millionen US$/Jahr. Viele der synthetischen Arzneimittel erzeugen jedoch Nebeneffekte in immungestressten Personen. Andererseits werden die natürlichen Produkte und deren aus Kräutern hergestellten Formulierungen eine breitere Akzeptanz finden als die synthetischen Antimykotika.systemic and superficial Fungal infections affect millions of people everywhere of the world. Most of these diseases are caused by Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus sp., Trichophyton sp., Microsporum gypseum, Epidermophyton floccossum causes what its nature after infectious are. In India is a big one Number of people associated with agriculture, with much of this People in villages lives, due to the widespread unhygienic conditions the occurrence of fungal infections is common. Get fungal infections also increasing importance due to a weakening of the immune system, mainly due to of organ transplant operations, cancer chemo and the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). moreover Skin infections spread due to poor hygienic Conditions as well as an increasing level of environmental pollution fast in the population. To counter these infections, only a handful are antifungal Agents such as griseofulvin, amphotericin and nystatin on the market available, although a supersaturation in terms of available antibacterial agent. Most of these antifungals are synthetic derivatives with known side effects for humans and animals. This problem is caused by the development of resistance against conventional used drugs, which makes chemotherapy less usable. That's why new ones have to anti mycotic substances are produced from natural sources, around this resistance phenomenon gegenzutreten. While 1990-96 was the world market for Antifungals more than $ 1500 million, which is 1.5% of the total global anti-infective market. Currently make antimycotics (both topical and systemic) more than 6% of all anti-infective agents out. The world market for Antifungals expanded at a rate of 20% per annum and reached Expected to exceed $ 600 million / year. Many of the synthetic ones However, drugs produce side effects in immune-compromised individuals. On the other hand, the natural ones Products and their herbs formulations are more widely accepted than synthetic antimycotics.

Aufgaben der ErfindungTasks of invention

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung eines Flechtenextrakts, der spezifisch Pilzinfektionen beim Menschen bekämpfen kann, die gegenüber Polyenarzneimittel resistent sind.The The main object of the present invention is the identification of a lichen extract that specifically fungal infections in humans fight can, the opposite Polyenazneimittel are resistant.

Es ist auch die Aufgabe der Erfindung, die Natur des bioaktiven Moleküls aus dem aktiven Flechtenextrakt mittels Bioaktivität-geleiteter Fraktionierung zu isolieren, charakterisieren und nachzuweisen.It is also the object of the invention, the nature of the bioactive molecule from the active lichen extract by bioactivity-guided fractionation to isolate, characterize and prove.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Ergosterinbindungsfähigkeit des bioaktiven Moleküls unter Verwendung von in in vitro-Assays zu untersuchen.A Another object of the invention is the ergosterol binding ability of the bioactive molecule using in vitro assays.

Zusammenfassung der ErfindungSummary the invention

Die vorliegende Erfindung stellt demzufolge eine antimykotische Zusammensetzung/Zusamnmensetzung gegen Krebs, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I und einen pharmazeutisch verträglichen Träger bereit.The The present invention accordingly provides an antifungal composition / composition against cancer, comprising a pharmaceutically effective amount of methyl β-orcinol carboxylate of the formula I and a pharmaceutically acceptable carrier.

Formel I

Formula I

In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Zusammensetzung antimykotisch und das Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I liegt in einer Konzentration im Bereich von 10-400 μg/ml vor.In an embodiment invention, the composition is antimycotic and the methyl-β-orcinolcarboxylate of the formula I is present in a concentration in the range of 10-400 μg / ml.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Zusammensetzung gegen Krebs wirksam und das Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I liegt in einer Konzentration von 1-10 μg/ml vor.In another embodiment invention, the composition is effective against cancer and the Methyl-β-orcinolcarboxylat of the formula I is present in a concentration of 1-10 ug / ml.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung stammt der Pilz aus der Gruppe von Hefen, umfassend Candida sp., beispielsweise Candida albicans In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der Krebs Leber-, Dickdarm-, Eierstock- oder Mundkebs (Oralkrebs) beim Menschen.In another embodiment invention, the fungus is from the group of yeasts comprising Candida sp., For example Candida albicans In another embodiment The invention is the cancer of liver, colon, ovarian or oral biscuits (Oral cancer) in humans.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Pilzinfektionen in einem Patienten, umfassend das Verabreichen einer antimykotischen Zusammensetzung an die Person, die eine pharmzeutisch wirksame Menge von Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.The The invention also relates to a method for the treatment of fungal infections in a patient, comprising administering an antifungal Composition to the person having a pharmaceutically effective amount of methyl β-orcinol carboxylate of the formula I and a pharmaceutically acceptable carrier.

Formel I

Formula I

In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I aus der Flechte Everniastrum cirrhatum isoliert.In an embodiment The invention is the methyl-β-orcinolcarboxylat of formula I isolated from the lichen Everniastrum cirrhatum.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfaßt der Pilz einen Multidrug- oder Single-Drug-resistenten Stamm.In another embodiment of the invention the mushroom a multidrug or Single-drug resistant strain.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung liegt das Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I in einer Konzentration im Bereich von 10-400 μg/ml vor.In another embodiment The invention is the methyl-β-orcinolcarboxylat of formula I at a concentration in the range of 10-400 μg / ml.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung stammt der Pilz aus der Gruppe von Hefen, umfassend Candida sp., beispielsweise Candida albicans.In a further embodiment invention, the fungus is from the group of yeasts comprising Candida sp., For example Candida albicans.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Pilz ein Polyenarzneimittelresistenter Stamm, wobei als Beispiel für das Polyenarzneimittel Nystatin und Amphotericin dienen.In a further embodiment In the invention, the fungus is a polyene drug resistant strain, wherein as an example for the polyene drug nystatin and amphotericin.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfaßt der Pilz einen Azolresistenten Stamm, wobei als Beispiel für das Azolarzneimittel Clotrimazol, Flucanoazol, Itracanoazol und Micanazol dienen.In a further embodiment of the invention the fungus is an azole-resistant strain, taking as an example the azole drug Clotrimazole, flucanoazole, itracanoazole and micanazole.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Pilz gleichzeitig resistent gegenüber Antibiotika der Polyenklasse als auch der Azolklasse.In a further embodiment invention, the fungus is at the same time resistant to antibiotics the polyene class as well as the azole class.

Der Patient ist vorzugsweise ein Mensch.Of the Patient is preferably a human.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem Patienten, wie einem Menschen bereit, wobei der Krebs entweder Leber-, Dickdarm-, Eierstock- und Mundkrebs (Oralkrebs) ist, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge von Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers an den Patienten umfaßt.The The present invention also provides a method for the treatment of Cancer in a patient, like a human ready, taking the cancer either liver, colon, ovarian and oral cancer (oral cancer), the administration of a pharmaceutically effective amount of methyl β-orcinol carboxylate of the formula I and a pharmaceutically acceptable carrier to the patient.

Formel I

Formula I

In einer Ausführungsform der Erfindung liegt die Konzentration von Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I im Bereich von 1-10 μg/ml.In an embodiment the invention is the concentration of methyl-β-orcinolcarboxylat of formula I in the range of 1-10 μg / ml.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I

Formel I zur Behandlung einer Pilzinfektion oder Krebs bei einem Patienten.The present invention also relates to the use of methyl-β-orcinolcarboxylate of the formula I.

Formula I for the treatment of a fungal infection or cancer in a patient.

Ausführliche Beschreibung der ErfindungFull Description of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des aus einer Flechte (Everniastrum cirrhatum) isolierten Biomoleküls Methyl-β-orcinolcarbolat der Formel I

Formel I zur Behandlung von krankheitserregenden Pilzinfektionen beim Menschen, welche gegenüber Polyenantibiotika, wie Amphotericin B, Nystatin etc. resistent sind. Die Biomoleküle besitzen jedoch keine Ergosterinbindungseigenschaft.The present invention relates to the use of the isolated from a lichen (Everniastrum cirrhatum) biomolecule methyl-β-orcinolcarbolat of the formula I.

Formula I for the treatment of pathogenic fungal infections in humans, which are resistant to polyene antibiotics, such as amphotericin B, nystatin, etc. The biomolecules, however, have no ergosterol binding property.

Infektionen aufgrund von Candida sp. sind für etwa 80% aller wichtigeren systemischen Pilzinfektionen verantwortlich. Candida ist heute der vierthäufigste Organismus, der in Blutbahninfektionen gefunden wird und ist die häufigste Ursache von Pilzinfektionen in immunsupprimierten Personen. Die vaginale Candidiasis betrifft gewöhnlich Frauen, einschließlich derjenigen mit einer normalen Immunität, insbesondere nach der Verwendung von Antibiotika.Infections due to Candida sp. accounts for about 80% of all major systemic fungal infections. Candida is now the fourth most common organism found in bloodstream infections and is the most common cause of fungal infections in immunosuppressed individuals. Vaginal candidiasis usually affects women, including those with normal immunity, especially after the use of antibiotics.

Die Flechten wurden im Monat April 2002 in Narayan Ashram, Pithoragarh; Uttaranchal, Indien, gesammelt. Danach wurden die Flechten taxonomisch als Everniastrum cirrhatum identifiziert. Die gesammelten Flechten wurden im Schatten an der Luft getrocknet und zu einem feinen Pulver zermahlen. Das gepulverte Flechtenmaterial wurde für die weitere chemische Analyse verwendet. Es wurde ein Ethanolextrakt hergestellt und gegenüber Candida albicans MTCC 1637 (identisch mit ATCC 18804), dem Pilz, der verschiedene Formen von Candidiasis beim Menschen verursacht, und arzneimittelresistenten Mutanten des Pilzes getestet. Amphotericin und Nystatin sind in der Chemotherapie verwendete Standardpolyenantimykotika. Candida albicans-Isolate, die gegenüber diesen Polyenantibiotika resistent sind, sind bereits beschrieben. Eine hochgradige Resistenz gegenüber Amphotericin B, die in allen bedeutenden Candida-Arten beobachtet wird, ist am häufigsten in neutropenischen Patienten, denen anhaltend Amphotericin B verabreicht wurde. Solche arneimittelresistente Infektionen sind klinisch schwierig zu behandeln und sind der Alptraum jeden Arztes. Folglich haben wir solche polyenresistente Stämme von Candida albicans in vitro entwickelt und die Anticandida-Wirkung von Flechtenextrakten/Verbindungen gegen dieselben evaluiert. Es wurde gefunden, dass der Extrakt und die nachfolgenden Lösungsmittel (Hexan und Ethylacetat)-Fraktionen gegenüber Amphotericin- und Nystatin-resistenter Candida wirksam ist. Die Bioaktivität-geleitete Fraktionierung der aktiven Fraktionen führte zur Isolierung der aktiven Verbindungen durch Säulenchromatographie. Die aktive Verbindung konnte aus der 96% Hexan: 4% Ethylacetat-Fraktion kristallisiert werden. Das gereinigte Produkt wurde mittels spektroskopischer Verfahren unter Verwendung von ¹H & ¹³C NMR, LC-MS etc. analysiert, um die chemische Struktur zu entschlüsseln. Die Verbindung wurde als Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I identifiziert. Die Verbindung ist ein farbloser Kristall mit einer Schmelztemperatur von 137°C. Caccamese et al. (1985) haben bereits gefunden, dass das Methyl-β-orcinolcarboxylat das Wachstum von Hefestämmen, wie Saccharomyces cerevisiae, hemmt. In dieser Studie zeigen wir jedoch eine einzigartige Eigenschaft von Methyl-β-orcinolcarboxylat auf, indem die Verbindung das Wachstum von Polyen- und Azolarzneimittel-resistenten Stämmen von Candida albicans und Saccharomyces cerevisiae spezifisch hemmt. Das Hauptsterin in der Pilzcytoplasmamembran ist die Zielwirkstelle von Amphotericin B und den Azolen. Amphotericin B, ein Polyen, bindet irreversibel an Ergosterin, was zu einer Störung der Membranintegrität und letztlich zum Zelltod führt. Deshalb wurde auch die Fähigkeit der Flechtenverbindungen an Ergosterin zu binden unter Verwendung eines in vitro Ergosterinbindungsassays (Antonio & Molinski 1993; J.Natl.Prod. 56:54-61) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verbindungen keinerlei Spezifität gegenüber Ergosterin im Wildtyp und in den arneimittelresistenten Stämmen von Candida sp. besitzen.The lichens were planted in the month of April 2002 in Narayan Ashram, Pithoragarh; Uttaranchal, India, collected. Thereafter, the lichens were taxonomically identified as Everniastrum cirrhatum. The collected lichens were air dried in the shade and ground to a fine powder. The powdered lichen material was used for further chemical analysis. An ethanol extract was prepared and tested against Candida albicans MTCC 1637 (identical to ATCC 18804), the fungus that causes various forms of human candidiasis, and drug-resistant mutants of the fungus. Amphotericin and Nystatin are standard polyene antimycotics used in chemotherapy. Candida albicans isolates resistant to these polyene antibiotics have already been described. High-level resistance to amphotericin B, which is observed in all major Candida species, is most prevalent in neutropenic patients who were given continuous amphotericin B. Such drug-resistant infections are clinically difficult to treat and are the nightmare of any physician. Thus, we have developed such polyenoresistant strains of Candida albicans in vitro and evaluated the anticandidaidal activity of lichen extracts / compounds against them. It has been found that the extract and subsequent solvents (hexane and ethyl acetate) fractions are effective against amphotericin and nystatin resistant Candida. The bioactivity-guided fractionation of the active fractions led to the isolation of the active compounds by column chromatography. The active compound could be crystallized from the 96% hexane: 4% ethyl acetate fraction. The purified product was analyzed by spectroscopic methods using ¹ H & ¹³ C NMR, LC-MS, etc. to decrypt the chemical structure. The compound was identified as methyl-β-orcinolcarboxylate of the formula I. The compound is a colorless crystal with a melting temperature of 137 ° C. Caccamese et al. (1985) have already found that the methyl β-orcinol carboxylate inhibits the growth of yeast strains such as Saccharomyces cerevisiae. In this study, however, we show a unique property of methyl β-orcinol carboxylate in that the compound specifically inhibits the growth of polyene and azole drug resistant strains of Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae. The main sterol in the mushroom cytoplasmic membrane is the target site of amphotericin B and the azoles. Amphotericin B, a polyene, irreversibly binds to ergosterol resulting in disruption of membrane integrity and ultimately cell death. Therefore, the ability of the lichen compounds to bind to ergosterol was also examined using an in vitro ergosterol binding assay (Antonio & Molinski 1993; J. Natl. Prod. 56: 54-61). The results show that the compounds have no specificity towards ergosterol in the wild type and in the drug-resistant strains of Candida sp. have.

Die vorliegende Erfindung stellt deshalb eine antimykotische Zusammensetzung/Zusammensetzung gegen Krebs bereit, umfassend eine pharmazeutisch wirk same Menge von Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Eine Konzentration des Methyl-β-orcinolcarboxylats der Formel I im Bereich von 10-400 μg/ml stellt eine antimykotische Aktivität gegen die Gruppe von Hefen, umfassend Candida sp., beispielsweise Candida albicans, bereit. Eine Konzentration des Methyl-β-orcinolcarboxylats der Formel I im Bereich von 1-10 μg/ml stellt eine Antikrebsaktivität gegen Leber-, Dickdarm-, Eierstock- oder Mundkrebs (Oralkrebs) beim Menschen bereit.The The present invention therefore provides an antifungal composition / composition A cancerous composition comprising a pharmaceutically effective amount of methyl β-orcinol carboxylate of the formula I and a pharmaceutically acceptable carrier. A concentration of Methyl-β-orcinolcarboxylats of formula I in the range of 10-400 μg / ml provides an antifungal activity against the group of yeasts, including Candida sp., for example Candida albicans, ready. A concentration of methyl β-orcinol carboxylate of formula I in the range of 1-10 μg / ml represents an anticancer activity against liver, colon, ovarian or oral cancer (oral cancer) People ready.

Das Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I ist aus der Flechte Everniastrum cirrhatum isoliert.The Methyl-β-orcinolcarboxylat of formula I is isolated from the lichen Everniastrum cirrhatum.

Der Pilz kann entweder ein Multidrug- oder Singel-Drug-resistenter Stamm sein. Beispielsweise kann der Pilz aus der Gruppe von Hefen, umfassend Candida sp., beispielsweise Candida albicans, stammen. Die besagten Arzneimittel können ein Polyenarzneimittel, beispielsweise Nystatin und Amphotericin, oder ein Azolarzneimittel sein, beispielsweise Clotrimazol, Flucanoazol, Itracanoazol und Micanazol, sein.Of the Mushroom can be either a multi-drug or single-drug resistant strain be. For example, the fungus may be selected from the group of yeasts Candida sp., For example Candida albicans, come. The said Medicines can a polyene drug, for example, nystatin and amphotericin, or an azole medicine, for example clotrimazole, flucanoazole, Itracanoazole and Micanazol.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sollten nicht als den Umfang der Erfindung auf irgendeine Art und Weise beschränkend ausgelegt werden.The The following examples are illustrative and should not be used as limiting the scope of the invention in any way become.

1. Isolation von Polyenarzneimittel-resistenten Mutantenstämme von Candida albicans MTCC 1637 (identisch zu ATCC 18804)1. Isolation of polyene drug-resistant mutant strains of Candida albicans MTCC 1637 (identical to ATCC 18804)

C. albicans wurde bis zur log-Phase in Sabouraud's Dextrosenährlösung (5 ml) für 48 h bei 37°C in einem Schüttler bei 250 U/min wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 5000 U/min bei 4°C pelletiert und das Pellet wurde in 5 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 6,8) gelöst. Die Kultur wurde in fünf Gruppen von jeweils 1 ml in Eppendorf-Reaktionsgefäße aufteilt.C. albicans was grown to log phase in Sabouraud's dextrose broth (5 ml) for 48 h at 37 ° C in a shaker at 250 rpm. The cells were added by centrifugation at 5000 rpm Pelleted at 4 ° C and the pellet was dissolved in 5 ml of phosphate buffered saline (PBS, pH 6.8). The culture was divided into five groups of 1 ml each in Eppendorf tubes.

Ethylmethansulfonat (EMS) wurde zu jedem der Kultur-Reaktionsgefäße @ 0,1% (v/v) gegeben und für 40 min wachsen gelassen. Dann wurde das Mutagen dreimal vollständig herausgewaschen, indem die Zellen wiederholt pelletiert und erneut in PBS gelöst wurden. Die mutagenisierten Ansätze wurden dann in Sabouraud's Dextrosenährlösung zweifach verdünnt und für 6 h bei 37°C in einem Schüttler bei 250 U/min wachsen gelassen. Der Titer der Zellen vor der Behandlung mit EMS und unmittelbar nach der Behandlung mit EMS wurde berechnet, um den Abtötungsprozent satz in jedem der fünf Reaktionsgefäße zu berechnen. Die mutagenisierten und fixierten Kulturen wurden dann auf Sabouraud's Dextrose-Agar, der unterschiedliche Konzentrationen von Amphotericin, Nystatin und Clotrimazol enthielt, ausplattiert.ethyl methane sulfonate (EMS) was added to each of the culture tubes @ 0.1% (v / v) and for 40 min let grow. Then the mutagen was completely washed out three times, by repeatedly pelleting the cells and redissolving in PBS. The mutagenized approaches were then in Sabouraud's Dextrose broth twice dilute and for 6 h at 37 ° C in a shaker grown at 250 rpm. The titer of cells before treatment with EMS and immediately after treatment with EMS was calculated around the mortality rate in each of the five To calculate reaction vessels. The mutagenized and fixed cultures were then grown on Sabouraud's dextrose agar, the different concentrations of amphotericin, nystatin and Clotrimazole contained, plated.

Die nach dem 5. Tag wachsenden Kolonien von jedem der fünf mutagenisierten Ansätze wurden dann einzeln durch Ausstreichen auf dasselbe Medium, das die Antibiotika enthielt, dreimal gereinigt.The after the 5th day growing colonies of each of the five mutagenized approaches were then single by brushing on the same medium, the which contained antibiotics, cleaned three times.

2. Arzneimittelresistenz von Mutantenstämmen gegen Polyene und Azole2. Drug resistance of mutant strains against polyenes and azoles

Die Arzneimittelresistenzeigenschaften der Mutanten wurde durch den gering modifizierten standardisierten Plättchendiffusionsassay untersucht (Bauer et al. 1966, American Journal of Clinical Pathology 45: 493-496). Die Plättchen wurden hergestellt (5 mm Durchmesser, aus Whatman #3 Filterpapier), indem diese mit 8 μl der Testverbindung beschichtet wurden und auf die bereits beimpfte Agaroberfläche gelegt wurden.The Drug resistance properties of the mutants were assessed by the low-modified standardized platelet diffusion assay examined (Bauer et al., 1966, American Journal of Clinical Pathology 45: 493-496). The tiles were made (5 mm diameter, Whatman # 3 filter paper), by adding 8 μl the test compound were coated and already inoculated agar surface were laid.

Ein Plättchen, das nur das Lösungsmittel enthielt, wurde als Kontrolle verwendet. Der das Plättchen umgebende Bereich der Wachstumshemmung zeigt die Resistenz der Stämme gegenüber der Antibiotika an. Wie angesichts dieses Beispiels offensichtlich ist, zeigen die Ergebnisse, dass alle Mutantenstämme hochresistent gegenüber Amphotericin und Nystatin waren, da der Bereich der Wachstumshemmung in den Mutanten sehr viel geringer war als derjenige des Wildtyp-Ausgangsstammes. Es waren jedoch nur Amph C7R, Amph C6R, Clo 31R und Clo 28R resistent gegenüber Clotrimazol, was durch einen geringeren Bereich der Wachstumshemmung anzeigt wird.One Tile, that's just the solvent contained, was used as a control. The surrounding the platelets The area of growth inhibition shows the resistance of the strains to the Antibiotics on. As is evident in the light of this example, The results show that all mutant strains are highly resistant to amphotericin and nystatin were very high because of the range of growth inhibition in the mutants was much lower than that of the wild type parent strain. It however, only Amph C7R, Amph C6R, Clo 31R and Clo 28R were resistant across from Clotrimazole, resulting in a lower range of growth inhibition is displayed.

Tabelle 2

Table 2

3. Einsammeln und Extrahieren der Flechtenmaterialien3. Collect and extract the lichen materials

Zwei Kilogramm des Flechtenmaterials (Everniastrum cirrhatum) wurden während dem Monat April 2002 in Narayan Ashram, Pithoragargh, Uttaranchal, gesammelt. Diese wurden aufgeteilt und im Schatten bei Raumtemperatur (35°C-40°C) luftgetrocknet. Nach dem Lufttrocknen wurden diese in einer Mischmühle zu einem feinen Pulver zerkleinert und gesiebt. 1,5 kg des gepulverten Materials wurden in einem Perkolator für 72 h bei Raumtemperatur (35°C-40°C) in absoluten Ethanol getaucht.Two kilos of lichen material (Everniastrum cirrhatum) were collected during the month of April 2002 at Narayan Ashram, Pithoragargh, Uttaranchal. These were split and air dried in the shade at room temperature (35 ° C-40 ° C). After air-drying, they were crushed in a mixing mill to a fine powder and sieved. 1.5 kg of the powdered material was placed in a percolator for 72 h at room temperature (35 ° C-40 ° C) immersed in absolute ethanol.

Der Ethanolextrakt wurde unter Verwendung von Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert und unter verringertem Druck bei 60°C eingeengt. Der ethanolische Extrakt wurde dann lyophilisiert, wodurch 15,5 g des Rohextrakts erhalten wurden. Ansätze von 100 mg/ml wurden in DMSO hergestellt und hinsichtlich ihrer Bioaktivität untersucht.Of the Ethanol extract was extracted using Whatman filter paper no. 1 and concentrated under reduced pressure at 60 ° C. The ethanolic Extract was then lyophilized, yielding 15.5 g of the crude extract were obtained. approaches of 100 mg / ml were prepared in DMSO and given their bioactivity examined.

4. Bioaktivit-geleitete Fraktionierung der Flechtenmaterialien4. Bioactivity-directed Fractionation of the lichen materials

Die Lösungsmittelfraktionierung der aktiven Rohextrakte wurde durchgeführt, um den aktiven Grundbestandteil zu isolieren. Der ethanolische Extrakt wurde in 500 ml Hexan gelöst. Anschließend wurde er unter Verwendung von Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert. Der unlösliche Anteil wurde in 500 ml Ethylacetat gelöst. Alle Lösungsmittelfraktionen wurden unter verringertem Druck bei 40°C eingeengt, wodurch 3 g Hexan- und 1,5 g Ethylacetatextrakt erhalten wurden, und getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die aus dem Rohextrakt erhaltene Ethylacetat- als auch die aus dem Rohextrakt erhaltene Hexanfraktion gegen die arzneimittelresistenten Stämme von C.albicans bioaktiv waren. Die Hexanfraktion war wesentlich wirksamer als der Ethylacetatextrakt.The solvent fractionation The active crude extracts were made to be the active principle to isolate. The ethanolic extract was dissolved in 500 ml of hexane. Subsequently was filtered using Whatman # 1 filter paper. Of the insoluble Portion was dissolved in 500 ml of ethyl acetate. All solvent fractions were under reduced pressure at 40 ° C concentrated to give 3 g of hexane and 1.5 g of ethyl acetate extract were tested and tested. The results show that both the the crude extract obtained ethyl acetate as well as from the crude extract obtained hexane fraction against the drug resistant strains of C.albicans were bioactive. The hexane fraction was much more effective as the ethyl acetate extract.

Tabelle 3

Table 3

5. Reinigung und Charakterisierung des aktiven Moleküls5. Cleaning and Characterization of the active molecule

Die so erhaltenen Hexan- und Ethylacetatfraktionen werden zusammengemischt und in einer Glassäule mit einem Innendurchmesser von 3,0 cm und einer Länge von 72,0 cm weiter aufgetrennt. Hexan wurde als mobile Anfangsphase und Kieselgel (Teilchengröße 6-120 Mesh) als stationäre Phase verwendet. Es wurden verschiedene Fraktionen mit ungefähr 100 ml gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Die konzentrierten Fraktionen wurden dann auf TLC-Platten laufen gelassen und Fraktionen mit einem ähnlichen TLC-Muster wurden vereinigt. Nachdem etwa 3 Liter Hexanfraktionen gesammelt wurden, wurde die Polarität der mobilen Phase ab der Fraktion Nr. 36 leicht erhöht, indem Ethylacetat zu Hexan gegeben wurde (4% Ethylacetat im Endvolumen). Die Fraktionen Nr. 64 bis 78 wurden, basierend auf den in der TLC auftretenden identischen 7-Fleck-Banden, in gleicher Weise miteinander kombiniert. Die obigen Fraktionen wurden in 50 ml Aceton gelöst und zur Kristallisation der Verbindungen bei Raumtemperatur (25-30°C) aufbewahrt. Die so erhaltenen Kristalle wurden nochmals gründlich mit Aceton gewaschen und eine TLC der Kristalle wurde unter Verwendung von 98% Benzol plus 2% Aceton als mobile Phase durchgeführt. Die TLC-Platten zeigten nach dem Aussetzen gegenüber Ioddampf einen einzigen Fleck. Diese TLC-Platten wiesen einen einzelnen, dunkelrot gefärbten Fleck auf, wenn diese in Bacopa-Reagens (3,5 g Vanilin, 17,8 g H₂SO₄, 332,5 ml absoluter Alkohol) getaucht und für 5 min bei 120°C erhitzt wurden. Etwa 40 mg des Kristalls konnten aus dem obigen Lauf gesammelt werden. Die Schmelztemperatur der so erhaltenen Kristalle betrug 137°C.The hexane and ethyl acetate fractions thus obtained are mixed together and further separated in a glass column having an inner diameter of 3.0 cm and a length of 72.0 cm. Hexane was used as the initial mobile phase and silica gel (6-120 mesh particle size) as the stationary phase. Various fractions of about 100 ml were collected and dried under vacuum. The concentrated fractions were then run on TLC plates and fractions with a similar TLC pattern were pooled. After about 3 liters of hexane fractions were collected, the polarity of the mobile phase was slightly increased from fraction # 36 by adding ethyl acetate to hexane (4% ethyl acetate in final volume). Fraction Nos. 64 to 78 were similarly combined based on the identical 7-spot bands appearing in the TLC. The above fractions were dissolved in 50 ml of acetone and stored to crystallize the compounds at room temperature (25-30 ° C). The crystals thus obtained were again thoroughly washed with acetone, and TLC of the crystals was carried out by using 98% benzene plus 2% acetone as the mobile phase. The TLC plates showed a single spot after exposure to iodine vapor. These TLC plates had a single, dark red stain when in Bacopa reagent (3.5 g vanilin, 17.8 g H ₂ SO ₄ , 332.5 ml absolute alcohol). dipped and heated for 5 min at 120 ° C. About 40 mg of the crystal could be collected from the above run. The melting temperature of the crystals thus obtained was 137 ° C.

Der durch TLC erhaltene aktive Fleck wurde durch wiederholte Säulenchromatographie, die durch einen Fachmann durchgeführt werden kann, weiter gereinigt und dann mittels ¹H & ¹³C NMR, LC-MS analysiert, um die Struktur der aktiven Reinverbindung zu bestimmen. Auf der Basis der spektroskopischen Daten wurde die isolierte Verbindung als Methyl-β-orcinolcarboxylat identifiziert.The active spot obtained by TLC was further purified by repeated column chromatography, which can be performed by a person skilled in the art, and then analyzed by ¹ H & ¹³ C NMR, LC-MS to determine the structure of the active pure compound. Based on the spectroscopic data, the isolated compound was identified as methyl-β-orcinolcarboxylate.

6. Spezifische Anticandida-Aktivität von Methyl-β-orcinolcarboxylsäure gegen Polyen- und Azol-resistente Stämme6. Specific anticandida activity of methyl β-orcinolcarboxylic acid against Polyene and azole resistant strains

Die isolierte Reinverbindung wurde dann gegen Polyen- und Azol-resistente Stämme von Candida albicans getestet. Die unten beschriebenen Daten zeigen, dass die Verbindung Methyl-β-orsellinsäure das Wachstum von arzneimittelresistenten Stämmen in einer dosisabhängigen Art und Weise hemmen konnte, während diese gegenüber dem Wildtypstamm nicht wirksam war. In einem anderen Experiment wurden gut definierte Amphotericin- und Nystatin-resistente Stämme von Saccharomyces cerevisiae in dem Assay verwendet. Diese Stämme, die als erg 2 und erg 6 bezeichnet werden, weisen Mutationen in dem Ergosterin-Biosyntheseweg auf und können daher kein Ergosterin synthetisieren, welches die Bindungsstellen der Polyenarzneimittel sind. Deshalb führt die Abwesenheit von Ergosterin zu einer Polyenresistenz. Die Ergebnisse legen nahe, dass das Methyl-β-orcinolcarboxylat in der Lage ist, das Wachstum von Polyenarzneimittel-resistenter Saccharomyces cerevisiae spezifisch zu hemmen.The isolated pure compound was then polyene and azole resistant strains tested by Candida albicans. The data described below show that compound methyl-β-orsellinic growth of drug-resistant strains in a dose-dependent manner Way could inhibit while these opposite the wild-type strain was not effective. In another experiment were well defined amphotericin and nystatin resistant strains of Saccharomyces cerevisiae used in the assay. These tribes, the are referred to as erg 2 and erg 6, have mutations in the Ergosterol biosynthetic pathway and therefore can not produce ergosterol synthesize the binding sites of the polyene drug are. Therefore leads the absence of ergosterol to a polyene resistance. The results suggest that the methyl β-orcinol carboxylate is able to increase the growth of polyene drug-resistant Specifically to inhibit Saccharomyces cerevisiae.

Tabelle 4

Table 4

Tabelle 5

Table 5

7. Antikrebs-Eigenschaft der Methyl-β-orsellinsäure gegen humane Krebszelllinien7. Anticancer property the methyl-β-orsellin against human cancer cell lines

Die Zytotoxititätsprüfung in vitroerfolgte durch das Verfahren von Woerdenbag et al. (1993; J.Nat.Prod. 56 (6): 849-856). 2 × 10³ Zellen/Well wurden in einem 5% CO₂-Inkubator für 24 h inkubiert, so dass sich diese richtig an die Polystyrol-Mikroplatte mit 96 Wells (Grenier, Deutschland) anhaften konnten. Die in 100% DMSO (Merck, Deutschland) gelösten Testverbindungen wurden in wenigstens 5 Dosen zugegeben und für 6 h dort belassen, wonach die Verbindung plus Medium durch frisches Medium ausgetauscht wurde, und die Zellen für weitere 48 h in dem CO₂-Inkubator bei 37°C inkubiert wurden. Die in unseren Experimenten verwendete Konzentration von DMSO überstieg nie 1,25%, die für die Zellen nicht toxisch ist. Anschließend wurden 10 μl MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma M 2128] zugegeben, und die Platten wurden für 4 h bei 37°C inkubiert. Es wurden 100 μl Dimethylsulfoxid (DMSO, Merck, Deutschland) zu allen Wells gegeben und gründlich gemischt, um die dunkelblauen Kristalle aufzulösen. Nach einigen Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass sich alle Kristalle aufgelöst hatten, wurden die Platten mittels eines SpectraMax 190 Mikroplatten-Elisa-Lesegeräts (Molecular Devices Inc., USA) bei 570 nm ausgelesen. Die Platten wurden üblicherweise innerhalb 1 h nach der Zugabe von DMSO ausgelesen. Das Experiment erfolgte in dreifacher Ausführung und die Werte für die inhibitorische Konzentration (IC) wurden wie folgt berechnet: % Inhibition = [1-OD (570 nm) des Probenwells/OD (570 nm) des Kontrollwells] × 100. IC₉₀ ist die Konzentration in μg/ml, die für eine 90%-ige Hemmung des Zellwachstums, verglichen mit demjenigen einer unbehandelten Kontrolle, benötigt wird. Die beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass der ethanolische Flechtenrohextrakt und die isolierte Reinverbindung Methyl-β-orcinolcarboxylat gegen humane Leber- (WRL-68); Dickdarm- (Caco-2); Eierstock- (MCF-7 & PA-1) und Mund- (KB 403) Krebszelllinien wirksam sind. Tabelle 6

* Die Daten sind als μg/ml angegeben.

The cytotoxicity assay in vitro was performed by the method of Woerdenbag et al. (1993; J. Nat. Prod. 56 (6): 849-856). 2 × 10 ³ cells / well were incubated in a 5% CO ₂ incubator for 24 hours so that they could adhere properly to the 96-well polystyrene microplate (Grenier, Germany). The test compounds dissolved in 100% DMSO (Merck, Germany) were added in at least 5 doses and left there for 6 hours, after which the compound plus medium was changed to fresh medium, and the cells continued for a further 48 hours in the CO ₂ incubator 37 ° C were incubated. The concentration of DMSO used in our experiments never exceeded 1.25%, which is not toxic to the cells. Subsequently, 10 μl of MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma M 2128] was added and the plates were incubated for 4 h at 37 ° C. 100 μl of dimethylsulfoxide (DMSO, Merck, Germany) was added to all wells and mixed thoroughly to dissolve the dark blue crystals. After several minutes at room temperature to ensure that all crystals had dissolved, the plates were read using a SpectraMax 190 microplate Elisa reader (Molecular Devices Inc., USA) at 570 nm. The plates were usually read out within 1 h after the addition of DMSO. The experiment was carried out in triplicate and the values for the inhibitory concentration (IC) were calculated as follows:% inhibition = [1-OD (570 nm) of the sample well / OD (570 nm) of the control well] × 100. IC ₉₀ is the Concentration in μg / ml required for a 90% inhibition of cell growth compared to that of an untreated control. The results described show that the crude ethanolic lichen extract and the isolated pure compound methyl-β-orcinol carboxylate against human liver (WRL-68); Large intestine (Caco-2); Ovarian (MCF-7 & PA-1) and oral (KB 403) cancer cell lines are effective. Table 6

* Data are given as μg / ml.

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ZusammenfassungSummary

Die vorliegende Erfindung betrifft die neuartige Verwendung eines bereits bekannten Biomoleküls, das aus einer Flechte (Everniastrum cirrahatum) isolierte Methyl-β-orcinolcarboxylat der Formel I zur Behandlung von krankheitserregenden Pilzinfektionen beim Menschen, welche gegenüber Polyen- und Azolantibiotika, wie Amphotericin B, Nystatin, Clotrimazol etc., resistent sind.The present invention relates to the novel use of an already known biomolecule, the isolated from a lichen (Everniastrum cirrahatum) methyl-β-orcinolcarboxylat of formula I for the treatment of pathogenic fungal infections in humans, which against polyene and Azolantibiotika, such as Amphotericin B, nystatin, clotrimazole etc., are resistant.

Formel I

Formula I

Claims

An antifungal composition / anti-cancer composition comprising a pharmaceutically effective amount of methyl β-orcinoicarboxylate of Formula I and a pharmaceutically acceptable carrier.

Formula I

A composition according to claim 1, wherein the composition is antimycotic and the methyl-β-orcinolcarboxylat of the formula I is present in a concentration in the range of 10-400 μg / ml.

A composition according to claim 1, wherein the composition is an anticancer composition and the methyl β-orcinol carboxylate of formula I is present in a concentration in the range of 1-10 μg / ml.

A composition according to claim 2 wherein the fungus is the group of yeasts including Candida sp.

A composition according to claim 4 wherein the fungus is Candida albicans is.

The composition of claim 3, wherein the cancer Liver, colon, ovarian or oral cancer (oral cancer) in humans is.

A method of treating fungal infections in a subject, comprising administering to a subject an antifungal composition comprising a pharmaceutically effective amount of methyl β-orcinol carboxylate of Formula I and a pharmaceutically acceptable carrier.

Formula I

The method of claim 7 wherein the methyl β-orcinol carboxylate of Formula I is isolated from the lichen Everniastrum cirrhatum.

The method of claim 7, wherein the fungus is a drug resistant Strain includes.

The method of claim 7 wherein the methyl β-orcinol carboxylate of the formula I is present in a concentration in the range of 10-400 μg / ml.

The method of claim 9, wherein the fungus is selected from the Group of yeasts, including Candida sp., Is derived.

The method of claim 11, wherein the fungus is Candida albicans is.

The method of claim 9, wherein the fungus is a multidrug / single drug resistant Trunk is.

The method of claim 13, wherein the fungus is a polyene drug-resistant Trunk is.

The method of claim 14, wherein the polyene drug Nystatin or Amphotericin is.

The method of claim 13, wherein the fungus is a Azole-resistant strain includes.

The method of claim 16, wherein the azole drug from the group consisting of clotrimazole, flucanoazole, itracanoazole and Micanazole selected is.

The method of claim 13, wherein the fungus is contemporaneous against both antibiotics of the polyene class and the azole class is resistant.

The method of claim 7, wherein the patient is a Is human.

A method of treating cancer in a subject, comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of methyl β-orcinol carboxylate of Formula I and a pharmaceutically acceptable carrier.

Formula I

The method of claim 20, wherein the cancer is liver, Colon, ovarian and Oral cancer includes.

The method of claim 20, wherein the patient is a Is human.

The method of claim 20 wherein the methyl β-orcinol carboxylate of Formula I is isolated from the lichen Everniastrum cirrhunt.

The method of claim 20, wherein the concentration of the methyl β-orcinol carboxylate of formula I in the range of 1-10 μg / ml lies.

Use of methyl-β-orcinolcarboxylate of the formula I

Formula I for the treatment of a fungal infection in a patient.

Use according to claim 25, wherein the methyl-β-orcinolcarboxylate of Formula I is isolated from the lichen Everniastrum cirrhatum.

Use according to claim 25, wherein the fungus has a drug-resistant strain.

Use according to claim 25, wherein the methyl-β-orcinolcarboxylate of the formula I is present in a concentration in the range of 10-400 μg / ml.

Use according to claim 27, wherein the fungus is the group of yeasts including Candida sp.

Use according to claim 29, wherein the fungus is Candida albicans is.

Use according to claim 27, wherein the fungus is a Multidrug / Single Drug Resistant strain is.

Use according to claim 31, wherein the fungus is a Polyene drug resistant strain.

Use according to claim 32, wherein the polyene drug is Nystatin or Amphotericin is.

Use according to claim 31, wherein the fungus has a Azole-resistant strain includes.

Use according to claim 34 wherein the azole drug is from the group consisting of clotrimazole, flucanoazole, itracanoazole and Micanazole selected is.

Use according to claim 31, wherein the fungus is against Antibiotics of the polyene class and azole class is resistant.

Use according to claim 25, wherein the patient is a Is human.

Use of a methyl-β-orcinolcarboxylate of the formula I

Formula I for the treatment of cancer in a patient.

Use according to claim 38, wherein the methyl β-orcinol carboxylate of Formula I is isolated from the lichen Everniastrum cirrhatum.

Use according to claim 38, wherein the cancer is liver, Colon, ovarian and Oral cancer includes.

Use according to claim 38, wherein the patient is a Is human.

Use according to claim 38, wherein the concentration of methyl β-orcinol carboxylate of formula I in the range of 1-10 μg / ml lies.