JP2016520525A - 植物の生育を刺激し、植物を保護し、および、植物上にバチルスの芽胞を固定するための融合タンパク質および方法 - Google Patents

植物の生育を刺激し、植物を保護し、および、植物上にバチルスの芽胞を固定するための融合タンパク質および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は概して、融合タンパク質をBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに向かわせる標的化配列を含有する融合タンパク質を目的とするものである。本発明はまた、そのような融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、および、当該融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する製剤に関するものである。植物または植物生育環境に、当該組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または当該製剤を適用することによる、植物の生育を刺激する方法、病原体から植物を防御する方法、および、植物におけるストレス耐性を増強させる方法もまた記述される。本発明はまた、融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を植物に固定する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/799,262号の利益を主張し、その全体が、参照により本明細書に援用される。
本発明は、概して、Bacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムへと融合タンパク質を向かわせる標的化配列、エキソスポリウム(exosporium)タンパク質、または、エキソスポリウムタンパク質断片を含有する融合タンパク質に関する。本発明はまた、そのような融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または、当該融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する製剤に関する。本発明はさらに、植物または植物生育環境に、組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、もしくは当該製剤を適用することによる、植物の生育を刺激する、病原体から植物を保護する、および、植物におけるストレス耐性を増強させるための方法に関する。本発明はまた、植物または植物物質上に融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を固定する方法に関する。
植物根の周囲は、根圏と呼ばれる領域である。根圏において、細菌、真菌および他の生物は栄養素を奪い合い、および、植物の根組織へ競い合って結合する。有害な細菌および真菌、ならびに有益な細菌および真菌のどちらも根圏を支配することができる。細菌、真菌および植物の根系はすべて、根圏のペプチド、酵素および他のタンパク質の作用により影響を受け得る。土壌添加物、または、これらペプチド、酵素または他のタンパク質のうち特定のものを用いて植物を処置することにより、有益な土壌細菌および真菌の群全体に有益な効果をもたらし、植物の生育、とってより健康的な土壌環境が創り出され、植物の生育を改善し、および、特定の細菌病原体および真菌病原体に対し植物が保護される。しかしながら、植物に対しそのような有益な効果をもたらすため、ペプチド、酵素および他のタンパク質を導入しようと過去に試みられたことがあったが、土壌中では酵素、タンパク質およびペプチドの活性維持が困難であり、失敗に終わっている。さらに、土壌中には広く自然に存在しているプロテアーゼがあるため、土壌中ではタンパク質が分解されてしまう。植物根の周囲環境(根圏)は、元々の土壌の質とは異なる、ユニークな、細菌、真菌、栄養素および根の混合体である。これら生物体の間の共生関係はユニークであり、外来性タンパク質を含有させ、より良いものに改変することができうる。根圏中に高濃度の真菌および細菌が存在すると、土壌中のタンパク質に対するプロテアーゼおよび有害な他の因子が異常な高レベルとなり、そのためにタンパク質の分解がさらに多くなる。その上、土壌中に導入された酵素および他のタンパク質は、植物根から速やかに消散されてしまう。
ゆえに、当分野において、植物(たとえば、植物根系)へ、ペプチド、酵素および他のタンパク質を効率的に送達し、それら分子が活性を維持している期間を延長させるための方法が求められている。さらに、当分野において、根圏および植物の葉および、特に植物根へ、それらペプチド、酵素およびタンパク質を選択的に向かわせる方法が求められている。
本発明は、植物生育刺激タンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、植物のストレス耐性を増強させるタンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、または、植物結合タンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、含有する融合タンパク質を目的とする。植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、ペプチドホルモン、非ホルモンペプチド、または、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有する。融合タンパク質はまた、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、(a)配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する標的化配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は少なくとも約54%である、標的化配列;(b)配列番号1のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;(c)配列番号1のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;(d)配列番号1を含有する標的化配列;(e)配列番号2と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(f)配列番号3のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;(g)配列番号3のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;(h)配列番号3を含有する標的化配列;(i)配列番号4と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(j)配列番号5のアミノ酸1〜38を含有する標的化配列;(k)配列番号5のアミノ酸23〜38を含有する標的化配列;(l)配列番号5を含有する標的化配列;(m)配列番号6と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(n)配列番号7のアミノ酸1〜28を含有する標的化配列;(o)配列番号7のアミノ酸13〜28を含有する標的化配列;(p)配列番号7を含有する標的化配列;(q)配列番号8と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(r)配列番号9のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;(s)配列番号9のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;(t)配列番号9を含有する標的化配列;(u)配列番号10と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(v)配列番号11のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(w)配列番号11のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(x)配列番号11を含有する標的化配列;(y)配列番号12と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(z)配列番号13のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(aa)配列番号13のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(ab)配列番号13を含有する標的化配列;(ac)配列番号14と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ad)配列番号15のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;(ae)配列番号15のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;(af)配列番号15を含有する標的化配列;(ag)配列番号16と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ah)配列番号17のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;(ai)配列番号17のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;(aj)配列番号17を含有する標的化配列;(ak)配列番号18と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(al)配列番号19のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(am)配列番号19のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(an)配列番号19を含有する標的化配列;(ao)配列番号20と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ap)配列番号21のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(aq)配列番号21のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(ar)配列番号21を含有する標的化配列;(as)配列番号22と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(at)配列番号23のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;(au)配列番号23のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;(av)配列番号23を含有する標的化配列;(aw)配列番号24と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ax)配列番号25のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;(ay)配列番号25のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;(az)配列番号25を含有する標的化配列;(ba)配列番号26と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bb)配列番号27のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;(bc)配列番号27のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;(bd)配列番号27を含有する標的化配列;(be)配列番号28と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bf)配列番号29のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(bg)配列番号29のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(bh)配列番号29を含有する標的化配列;(bi)配列番号30と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bj)配列番号31のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;(bk)配列番号31のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;(bl)配列番号31を含有する標的化配列;(bm)配列番号32と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bn)配列番号33のアミノ酸1〜15を含有する標的化配列;(bo)配列番号33を含有する標的化配列;(bp)配列番号34と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bq)配列番号35のアミノ酸1〜16を含有する標的化配列;(br)配列番号35を含有する標的化配列;(bs)配列番号36と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bt)配列番号43のアミノ酸1〜29を含有する標的化配列;(bu)配列番号43のアミノ酸14〜29を含有する標的化配列;(bv)配列番号43を含有する標的化配列;(bw)配列番号44と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bx)配列番号45のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;(by)配列番号45のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;(bz)配列番号45を含有する標的化配列;(ca)配列番号46と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cb)配列番号47のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;(cc)配列番号47のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;(cd)配列番号47を含有する標的化配列;(ce)配列番号48と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cf)配列番号49のアミノ酸1〜32を含有する標的化配列;(cg)配列番号49のアミノ酸17〜32を含有する標的化配列;(ch)配列番号49を含有する標的化配列;(ci)配列番号50と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cj)配列番号51のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(ck)配列番号51のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(cl)配列番号51を含有する標的化配列;(cm)配列番号52と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cn)配列番号53のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(co)配列番号53のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(cp)配列番号53を含有する標的化配列;(cq)配列番号54と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cr)配列番号55のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;(cs)配列番号55のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;(ct)配列番号55を含有する標的化配列;(cu)配列番号56と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cv)配列番号57のアミノ酸1〜130を含有する標的化配列;(cw)配列番号57のアミノ酸115〜130を含有する標的化配列;(cx)配列番号57を含有する標的化配列;(cy)配列番号58と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cz)配列番号59と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質断片;(da)配列番号60を含有する標的化配列;(db)配列番号61を含有する標的化配列;(dc)配列番号62を含有する標的化配列;(dd)配列番号63を含有する標的化配列;(de)配列番号64を含有する標的化配列;(df)配列番号65を含有する標的化配列;(dg)配列番号66を含有する標的化配列;(dh)配列番号67を含有する標的化配列;(di)配列番号68を含有する標的化配列;(dj)配列番号69を含有する標的化配列;(dk)配列番号70を含有する標的化配列;(dl)配列番号71と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dm)配列番号72と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dn)配列番号73と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(do)配列番号74と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dp)配列番号75と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dq)配列番号76と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dr)配列番号77と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ds)配列番号78と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dt)配列番号79と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(du)配列番号80と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dv)配列番号81と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dw)配列番号82と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dx)配列番号83と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dy)配列番号84と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dz)配列番号1のアミノ酸22〜31を含有する標的化配列;(ea)配列番号1のアミノ酸22〜33を含有する標的化配列;(eb)配列番号1のアミノ酸20〜31を含有する標的化配列;(ec)配列番号3のアミノ酸14〜23を含有する標的化配列;(ed)配列番号3のアミノ酸14〜25を含有する標的化配列;または、(ef)配列番号3のアミノ酸12〜23を含有する標的化配列、であっても良い。
本発明はまた、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、または、エキソスポリウムタンパク質断片、および、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を目的とする。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、(a)16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列からなる標的化配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は少なくとも約54%である、標的化配列;(b)配列番号1のアミノ酸1〜35からなる標的化配列;(c)配列番号1のアミノ酸20〜35からなる標的化配列;(d)配列番号1からなる標的化配列;(e)配列番号60を含有する標的化配列;(f)配列番号3のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;(g)配列番号3のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;(h)配列番号3を含有する標的化配列;(i)配列番号4と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(j)配列番号5のアミノ酸1〜38を含有する標的化配列;(k)配列番号5のアミノ酸23〜38を含有する標的化配列;(l)配列番号5を含有する標的化配列;(m)配列番号6と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(n)配列番号7のアミノ酸1〜28を含有する標的化配列;(o)配列番号7のアミノ酸13〜28を含有する標的化配列;(p)配列番号7を含有する標的化配列;(q)配列番号8と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(r)配列番号9のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;(s)配列番号9のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;(t)配列番号9を含有する標的化配列;(u)配列番号10と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(v)配列番号11のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(w)配列番号11のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(x)配列番号11を含有する標的化配列;(y)配列番号12と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(z)配列番号13のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(aa)配列番号13のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(ab)配列番号13を含有する標的化配列;(ac)配列番号14と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ad)配列番号15のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;(ae)配列番号15のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;(af)配列番号15を含有する標的化配列;(ag)配列番号16と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ah)配列番号17のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;(ai)配列番号17のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;(aj)配列番号17を含有する標的化配列;(ak)配列番号18と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(al)配列番号19のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(am)配列番号19のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(an)配列番号19を含有する標的化配列;(ao)配列番号20と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ap)配列番号21のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(aq)配列番号21のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(ar)配列番号21を含有する標的化配列;(as)配列番号22と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(at)配列番号23のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;(au)配列番号23のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;(av)配列番号23を含有する標的化配列;(aw)配列番号24と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ax)配列番号25のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;(ay)配列番号25のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;(az)配列番号25を含有する標的化配列;(ba)配列番号26と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bb)配列番号27のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;(bc)配列番号27のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;(bd)配列番号27を含有する標的化配列;(be)配列番号28と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bf)配列番号29のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(bg)配列番号29のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(bh)配列番号29を含有する標的化配列;(bi)配列番号30と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bj)配列番号31のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;(bk)配列番号31のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;(bl)配列番号31を含有する標的化配列;(bm)配列番号32と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bn)配列番号33のアミノ酸1〜15を含有する標的化配列;(bo)配列番号33を含有する標的化配列;(bp)配列番号34と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bq)配列番号35のアミノ酸1〜16を含有する標的化配列;(br)配列番号35を含有する標的化配列;(bs)配列番号36と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bt)配列番号43のアミノ酸1〜29を含有する標的化配列;(bu)配列番号43のアミノ酸14〜29を含有する標的化配列;(bv)配列番号43を含有する標的化配列;(bw)配列番号44と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(bx)配列番号45のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;(by)配列番号45のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;(bz)配列番号45を含有する標的化配列;(ca)配列番号46と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cb)配列番号47のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;(cc)配列番号47のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;(cd)配列番号47を含有する標的化配列;(ce)配列番号48と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cf)配列番号49のアミノ酸1〜32を含有する標的化配列;(cg)配列番号49のアミノ酸17〜32を含有する標的化配列;(ch)配列番号49を含有する標的化配列;(ci)配列番号50と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cj)配列番号51のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(ck)配列番号51のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(cl)配列番号51を含有する標的化配列;(cm)配列番号52と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cn)配列番号53のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;(co)配列番号53のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;(cp)配列番号53を含有する標的化配列;(cq)配列番号54と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cr)配列番号55のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;(cs)配列番号55のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;(ct)配列番号55を含有する標的化配列;(cu)配列番号56と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cv)配列番号57のアミノ酸1〜130を含有する標的化配列;(cw)配列番号57のアミノ酸115〜130を含有する標的化配列;(cx)配列番号57を含有する標的化配列;(cy)配列番号58と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(cz)配列番号59と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質断片;(da)配列番号61を含有する標的化配列;(db)配列番号62を含有する標的化配列;(dc)配列番号63を含有する標的化配列;(dd)配列番号64を含有する標的化配列;(de)配列番号65を含有する標的化配列;(df)配列番号66を含有する標的化配列;(dg)配列番号67を含有する標的化配列;(dh)配列番号68を含有する標的化配列;(di)配列番号69を含有する標的化配列;(dj)配列番号70を含有する標的化配列;(dk)配列番号71と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dl)配列番号72と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dm)配列番号73と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dn)配列番号74と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(do)配列番号75と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dp)配列番号76と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dq)配列番号77と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dr)配列番号78と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(ds)配列番号79と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dt)配列番号80と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(du)配列番号81と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dv)配列番号82と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dw)配列番号83と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dx)配列番号84と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;(dy)配列番号1のアミノ酸22〜31を含有する標的化配列;(dz)配列番号1のアミノ酸22〜33を含有する標的化配列;(ea)配列番号1のアミノ酸22〜33からなる標的化配列;(eb)配列番号3のアミノ酸14〜23を含有する標的化配列;(ec)配列番号3のアミノ酸14〜25を含有する標的化配列;または、(ed)配列番号3のアミノ酸12〜23を含有する標的化配列、であってもよい。
本発明はさらに、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を目的とする。病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、ハーピン(harpin)、αエラスチン、βエラスチン、システミン、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、エリシチン、ディフェンシン、クリプトゲイン、フラジェリンタンパク質、フラジェリンペプチド、バクテリオシン、リゾチーム、リゾチームペプチド、シデロフォア、非リボソーム活性ペプチド、コンアルブミン、アルブミン、ラクトフェリン、ラクトフェリンペプチド、またはTasAを含有しても良い。あるいは、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、殺虫活性、殺蠕虫活性を有するか、または、昆虫もしくは蠕虫の捕食を抑制するか、またはそれらの組み合わせである。あるいは、病原体から植物を防御するタンパク質は、酵素を含有する。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、上述の[0005]段落に列記される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかであっても良い。
本発明はまた、対象のタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ、およびエキソスポリウムタンパク質を含有する融合タンパク質を目的とする。エキソスポリウムタンパク質は、配列番号71、75、80、81、82、83、および84のうちのいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質であっても良い。
本発明はさらに、融合タンパク質のいずれかを発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーに関するものである。
本発明はまた、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれか、および、農学的に受容可能な担体を含有する製剤を目的とする。
本発明はまた、植物の生育を刺激する方法に関する。当該方法には、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれか、または、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する製剤のいずれかを植物生育環境へと導入すること、を含む。あるいは、当該方法には、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれか、または、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する製剤のいずれかを、植物もしくは植物の種子へと適用すること、または、植物もしくは植物の種子の周辺域へと適用すること、を含む。植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、組換えBacillus科のメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
本発明はまた、植物の生育を刺激する方法を目的とするものである。当該方法には、融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを植物生育環境へと導入すること、または、植物、植物の種子、または、植物もしくは植物種子の周辺域へ、融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを適用すること、が含まれる。融合タンパク質は、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ、および、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質もしくはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、上述の[0005]段落に列記されるもののいずれかであっても良い。植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
本発明はさらに、病原体から植物を防御する、または、植物におけるストレス耐性を増強する方法に関する。当該方法には、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、または、植物におけるストレス耐性を増強するタンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれか、または、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、または、植物におけるストレス耐性を増強するタンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれかを含有する製剤のいずれか、を植物生育環境へ導入することが含まれる。あるいは、当該方法には、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、または、植物におけるストレス耐性を増強するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれか、または、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、または、植物におけるストレス耐性を増強するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれかを含有する製剤のいずれか、を植物、植物種子、または植物周辺域へと適用することが含まれる。病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、または、植物におけるストレス耐性を増強するタンパク質もしくはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
本発明はまた、植物に組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を固定する方法を目的とする。当該方法には、植物結合タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれか、または、植物結合タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのうちのいずれかを含有する製剤のいずれかを、植物生育環境へ導入することが含まれる。あるいは、当該方法には、植物結合タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれか、または、植物結合タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのうちのいずれかを含有する製剤のいずれかを、植物、植物種子、または、植物もしくは植物種子の周辺域に適用することが含まれる。当該植物結合タンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
他の目的および特性は、以下において、ある部分において明らかであり、ある部分において指摘される
Bacillus anthracis Sterne株 BclAのアミノ末端部分のアミノ酸配列と、Bacillus cereusファミリーのメンバー由来の様々なエキソスポリウムタンパク質の対応する領域とのアライメントを示す。
エキソスポリウム上で、mCherryレポーターに連結された、様々なエキソスポリウムタンパク質を含有する融合タンパク質の発現の例示的な蛍光顕微鏡の結果を示す。
定義
本明細書において、「1つの」(a、an、one)、「当該」(the)、および「上述の」(said)が用いられる場合、その意味は、他で示されない限り、「少なくとも1つ」または「1以上」である。
「含有する」「含む」および「有する」という用語は、包括的であることが意図され、および、列記される因子以外の追加の因子がありうることを意味する。
「生物活性ペプチド」という用語は、生物学的活性を発揮する任意のペプチドを指す。「生物活性ペプチド」は、たとえば、プロテアーゼまたはペプチダーゼによる、タンパク質、ペプチド、プロタンパク質、またはプレプロタンパク質の開裂を介して作製されても良い。
「植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素」には、植物の生育を刺激する、または、植物の構造を変える化合物の生物学的合成経路における任意の工程を触媒する任意の酵素、または、植物の生育を刺激するもしくは植物の構造を変える化合物の不活性または低活性の誘導体の、当該化合物の活性型またはより高い活性型への転換を触媒する任意の酵素が含まれる。そのような化合物としては、たとえば、限定されないが、たとえばオーキシン、およびサイトカイニン等の小分子植物ホルモン、生物活性ペプチド、および、根圏中の細菌または真菌により合成される植物生育刺激小分子(たとえば、2,3−ブタンジオール)が挙げられる。
本明細書において使用される、「融合タンパク質」という用語は、2以上の別のタンパク質から得た配列を含有するポリペプチド配列を有するタンパク質を指す。融合タンパク質は、発現された際に、各々の元のタンパク質に由来する機能的特性を有する1つのポリペプチドを産生する核酸配列を生成するために、第一のポリペプチドのすべてまたは一部をコードする核酸分子と、第二のポリペプチドのすべてまたは一部をコードする核酸分子を共に結合することにより作製されても良い。
「組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を植物上に固定する」という用語は、植物(たとえば、植物の根、または、たとえば葉、幹、花、もしくは実等の植物の空中の部分)に、Bacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を結合させ、当該芽胞が、植物生育環境中または植物の空中部分の周辺環境中に消散される代わりに、植物の根の構造もしくは空中の部分に維持されることを指す。
「植物生育環境」には、植物の生育をサポートすることができる任意の物質が含まれる。
本明細書において使用される、「植物免疫システム増強タンパク質またはペプチド」には、植物の免疫システムに有益な効果を有する任意のタンパク質またはペプチドが含まれる。
本明細書において使用される、「植物生育刺激タンパク質またはペプチド」という用語には、当該タンパク質またはペプチドに曝された植物において、植物の生育を増加させる任意のタンパク質またはペプチドが含まれる。
本明細書において使用される、「病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチド」とは、当該タンパク質またはペプチドに曝された植物を病原体に感染しにくくする任意のタンパク質またはペプチドが含まれる。
本明細書において使用される、「植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチド」には、当該タンパク質またはペプチドに曝された植物を、ストレスに対して、より耐性とさせる任意のタンパク質またはペプチドが含まれる。
「植物結合タンパク質またはペプチド」という用語は、植物の任意の部分(たとえば、植物の根、または、たとえば枝葉、幹、花または実等の空中部分)または植物物質に特異的に、または非特異的に結合することができる任意のペプチドまたはタンパク質を指す。
本明細書において使用される、「標的化配列」という用語は、より長いポリペプチドまたはタンパク質の一部として存在する際、特定の細胞内部位に、当該より長いポリペプチドまたはタンパク質を局在させるポリペプチド配列を指す。本明細書に記述される標的化配列は、Bacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムへのタンパク質の局在化をもたらす。
本発明は、Bacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムへと融合タンパク質を向かわせる標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、または、エキソスポリウムタンパク質断片、および:(a)植物生育刺激タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ;(b)病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ;(c)植物のストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ;または(d)植物結合タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ、含有する融合タンパク質に関する。Bacillus cereusファミリーのメンバーの細菌中で発現された際、これら融合タンパク質は、芽胞のエキソスポリウム層に向かわされ、および、当該タンパク質またはペプチドが、当該芽胞の外側に提示されるよう、物理的に方向づけられる。
このBacillusエキソスポリウム提示(BEMD)システムは、ペプチド、酵素、および他のタンパク質を植物(たとえば、植物の枝葉、実、花、幹または根)へと送達、または、植物生育環境(たとえば土壌等)へと送達するために用いることができる。土壌または、本方法における他の植物生育環境へ送達されるペプチド、酵素およびタンパク質は、長期間、土壌中で活性を維持し、活性を示す。本明細書に記述される融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの細菌を土壌または植物の根圏へ導入することにより、多くの異なる土壌条件下において、植物の生育が有益に増強される。これら酵素を生成するBEMDを使用することにより、植物の発育の最初の数か月にわたり、植物および根圏に対し、有益な効果を発揮し続けることが可能となる。
標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、およびエキソスポリウムタンパク質断片
参照しやすくするために、本明細書において言及されるペプチドおよびタンパク質の配列番号を以下の表1に列記する。
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Bacillusは、桿菌属である。細菌のBacillus cereusファミリーには、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Bacillus mycoides、Bacillus pseudomycoides、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、および、Bacillus weihenstephensisの種が含まれる。ストレスのかかった環境下において、Bacillus cereusファミリー細菌は胞子形成を経て、長期間、休眠状態となることができる長円状の芽胞を形成する。芽胞の最外層はエキソスポリウム(exosporium)として知られており、毛髪様の突起の外けばにより囲まれた基底層を含有する。毛髪様のけば上のフィラメントは主にコラーゲン様糖タンパク質BclAにより形成されており、一方、基底層は、多くの異なるタンパク質から構成される。他のコラーゲン関連タンパク質であるBclBもまた、エキソスポリウム中に存在し、Bacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞上に露出されている。表面けばの主成分であるBclAは、基底層に位置づけられたそのアミノ末端(N末端)でエキソスポリウムに付着され、および、そのカルボキシ末端(C末端)は、芽胞の外側に伸びていることが示されている。
従前に、BclAおよびBclBのN末端領域のある配列を用いて、ペプチドまたはタンパク質をBacillus cereusの芽胞のエキソスポリウムへと向かわせることができたことが見出されている(米国特許出願第2010/0233124号および同第2011/0281316号、ならびに、Thompson et al.、Targeting of the BclA and BclB proteins to the Bacillus anthracis spore surface、Molecular Microbiology 70(2):421−34 (2008)を参照のこと。それら各々の全体が、参照により本明細書に援用される)。また、Bacillus anthracisのBetA/BAS3290タンパク質は、エキソスポリウムに局在化したことが発見された。
特に、Bacillus anthracis Sterne株のBclAのアミノ酸20〜35で、エキソスポリウムへと向かわせるには十分であることが判明している。BclAのアミノ酸1〜41(配列番号1)と、関連配列を有する数種の他のBacillus cereusファミリーのエキソスポリウムタンパク質およびBacillus cereusファミリーのタンパク質の対応するN末端領域との配列アライメントを、図1に示す。図1から明らかであるように、BclAのアミノ酸20〜41に相当する領域において、すべてのタンパク質の間で高い相同性の領域が存在する。しかしながら、これら配列において、BclAのアミノ酸36〜41に相当するアミノ酸は、二次構造を有し、エキソスポリウムへの融合タンパク質の局在化には必須ではない。BclAの保存標的化配列領域(配列番号1のアミノ酸20〜35)を、図1に太字で示しており、それらは、エキソスポリウムへの局在に必要とされる最小限の標的化配列に相当する。図1で下線を引いた配列は、より高度に保存された領域(標的化配列内のBclAのアミノ酸25〜35にわたる)であり、および、ExsFA/BxpB/ExsFBおよびホモログに対する認識配列であり、記述されるタンパク質をエキソスポリウムの表面上に向かわせ、集合させる。図1の配列番号3、5および7のアミノ酸配列は、それぞれ、Bacillus anthracis Sterne株BetA/BAS3290のアミノ酸1〜33、メチオニン、それに続きBacillus anthracis Sterne株BAS4623のアミノ酸2〜43、および、Bacillus anthracis Sterne株のBclBのアミノ酸1〜34である。(BAS4623については、天然型タンパク質の第1位に存在するバリンをメチオニンと置換することで、より良い発現をもたらしたことが判明した)。図1に明らかなように、これら配列の各々は、BclAのアミノ酸20〜35に相当する保存領域を含有し(配列番号1の太字)、および、BclAのアミノ酸20〜35に相当するより高度に保存された領域を含有する(下線)。
Bacillus cereusファミリーのメンバー由来のさらなるタンパク質もまた、保存標的化領域を含有する。特に、図1において、配列番号9は、Bacillus anthracis Sterne株BAS1882のアミノ酸1〜30、配列番号11は、Bacillus weihenstephensis KBAB4 2280遺伝子産物のアミノ酸1〜39、配列番号13は、Bacillus weihenstephensis KBAB4 3572遺伝子産物のアミノ酸1〜39、配列番号15は、Bacillus cereus VD200エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸1〜49、配列番号17は、Bacillus cereus VD166エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸1〜33、配列番号19は、Bacillus cereus VD200仮想タンパク質IKG_04663のアミノ酸1〜39、配列番号21は、Bacillus weihenstephensis KBAB4 YVTN βプロペラタンパク質のアミノ酸1〜39、配列番号23は、Bacillus weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2363のアミノ酸1〜30、配列番号25は、Bacillus weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2131のアミノ酸1〜30、配列番号27は、Bacillus weihenstephensis KBAB4三重ヘリックスリピート含有コラーゲンのアミノ酸1〜36、配列番号29は、Bacillus mycoides 2048仮想タンパク質bmyco0001_21660のアミノ酸1〜39、配列番号31は、Bacillus mycoides 2048仮想タンパク質bmyc0001_22540のアミノ酸1〜30、配列番号33は、Bacillus mycoides 2048仮想タンパク質bmyc0001_21510のアミノ酸1〜21、配列番号35は、Bacillus thuringiensis 35646コラーゲン三重ヘリックスリピートタンパク質のアミノ酸1〜22、配列番号43は、Bacillus cereus仮想タンパク質WP_69652のアミノ酸1〜35、配列番号45は、Bacillus cereusエキソスポリウムリーダーWP016117717のアミノ酸1〜41、配列番号47は、Bacillus cereusエキソスポリウムペプチドWP002105192のアミノ酸1〜49、配列番号49は、Bacillus cereus仮想タンパク質WP87353のアミノ酸1〜38、配列番号51は、Bacillus cereusエキソスポリウムペプチド02112369のアミノ酸1〜39、配列番号53は、Bacillus cereusエキソスポリウムタンパク質WP016099770のアミノ酸1〜39、配列番号55は、Bacillus thuringiensis仮想タンパク質YP006612525のアミノ酸1〜36、および、配列番号57は、Bacillus mycoides仮想タンパク質TIGR03720のアミノ酸1〜36である。図1に示されるように、これらタンパク質のN末端領域のそれぞれは、BclAのアミノ酸20〜35(配列番号1)と共に保存されている領域、および、BclAのアミノ酸25〜35に相当する、より高度に保存された領域を含有している。
本発明の融合タンパク質において、アミノ酸20〜35を含有するBclAの任意の部分は、本発明において、標的化配列として用いることができる。さらに、全長エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、エキソスポリウムへと当該融合タンパク質を向かわせるために用いることができる。ゆえに、全長BclAまたは、アミノ酸20〜35を含有するBclAの断片は、エキソスポリウムへの標的化のために用いることができる。たとえば、全長BclA(配列番号2)または、たとえば配列番号59(BclAのアミノ酸1〜196)等のカルボキシ末端を欠いた中間サイズのBclA断片を、エキソスポリウムへと当該融合タンパク質を向かわせるために用いることができる。たとえば、配列番号59の断片等の中間サイズの断片は、全長BclAより二次構造が少なく、および、標的化配列としての使用に適していることが判明している。標的化配列はまた、アミノ酸20〜35を含有する、たとえば配列番号1(BclAのアミノ酸1〜41)、配列番号1のアミノ酸1〜35、配列番号1のアミノ酸20〜35、または、配列番号60(BclAのアミノ酸20〜35にメチオニン残基が連結)等を含有する、さらに短いBclA部分を含有しても良い。アミノ酸20〜35の一部のみを含有する、さらに短いBclA断片もまた、エキソスポリウムへと融合タンパク質を向かわせる能力を示す。たとえば、標的化配列は、配列番号1のアミノ酸22〜31、配列番号1のアミノ酸22〜33、または、配列番号1のアミノ酸20〜31を含有しても良い。
あるいは、BetA/BAS3290、BAS4623、BclB、BAS1882、KBAB4 2280遺伝子産物、KBAB4 3572遺伝子産物、B.cereus VD200エキソスポリウムリーダーペプチド、B.cereus VD166エキソスポリウムリーダーペプチド、B.cereus VD200仮想タンパク質IKG_04663、B.weihenstephensis KBAB4 YVTN βプロペラタンパク質、B.weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2363、B.weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2131、B.weihenstephensis KBAB4三重ヘリックスリピート含有コラーゲン、B.mycoides 2048仮想タンパク質bmyco0001_21660、B.mycoides 2048仮想タンパク質bmyc0001_22540、B.mycoides 2048仮想タンパク質bmyc0001_21510、B.thuringiensis 35646コラーゲン三重ヘリックスリピートタンパク質、B.cereus仮想タンパク質WP_69652、B.cereusエキソスポリウムリーダーWP016117717、B.cereusエキソスポリウムペプチドWP002105192、B.cereus仮想タンパク質WP87353、B.cereusエキソスポリウムペプチド02112369、B.cereusエキソスポリウムタンパク質WP016099770、B. thuringiensis仮想タンパク質YP006612525、または、B.mycoides仮想タンパク質TIGR03720の任意の部分(それらは、BclAのアミノ酸20〜35に相当するアミノ酸を含有する)を、標的化配列として用いても良い。図1に示されるように、BetA/BAS3290のアミノ酸12〜27、BAS4623のアミノ酸23〜38、BclBのアミノ酸13〜28、BAS1882のアミノ酸9〜24、KBAB4 2280遺伝子産物のアミノ酸18〜33、KBAB4 3572遺伝子産物のアミノ酸18〜33、B.cereus VD200エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸28〜43、B.cereus VD166エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸12〜27、B.cereus VD200仮想タンパク質IKG_04663のアミノ酸18〜33、B.weihenstephensis KBAB4 YVTN βプロペラタンパク質のアミノ酸18〜33、B.weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2363のアミノ酸9〜24、B.weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2131のアミノ酸9〜24、B.weihenstephensis KBAB4三重ヘリックスリピート含有コラーゲンのアミノ酸15〜30、B.mycoides 2048仮想タンパク質bmyco0001_21660のアミノ酸18〜33、B.mycoides 2048仮想タンパク質bmyc0001_22540のアミノ酸9〜24、B.mycoides 2048仮想タンパク質bmyc0001_21510のアミノ酸1〜15、B.thuringiensis 35646コラーゲン三重ヘリックスリピートタンパク質のアミノ酸1〜16、B.cereus仮想タンパク質WP_69652のアミノ酸14〜29、B.cereusエキソスポリウムリーダーWP016117717のアミノ酸20〜35、B.cereusエキソスポリウムペプチドWP002105192のアミノ酸28〜43、B.cereus仮想タンパク質WP87353のアミノ酸17〜32、B.cereusエキソスポリウムペプチド02112369のアミノ酸18〜33、B.cereusエキソスポリウムタンパク質WP016099770のアミノ酸18〜33、B.thuringiensis仮想タンパク質YP006612525のアミノ酸15〜30、および、B.mycoides仮想タンパク質TIGR03720のアミノ酸115〜130は、BclAのアミノ酸20〜35に相当する。ゆえに、上述の対応するアミノ酸を含有するこれらタンパク質の任意の部分を、標的化配列として用いても良い。
さらに、BclAのアミノ酸20〜35または、上述の対応する任意のアミノ酸を含有する任意のアミノ酸配列を、標的化配列として用いても良い。
ゆえに、標的化配列は、配列番号1のアミノ酸1〜35、配列番号1のアミノ酸20〜35、配列番号1、配列番号60、配列番号1のアミノ酸22〜31、配列番号1のアミノ酸22〜33、または、配列番号1のアミノ酸20〜31を含有しても良い。あるいは、標的化配列は、配列番号1のアミノ酸1〜35、配列番号1のアミノ酸20〜35、配列番号1、または、配列番号60からなる。あるいは、標的化配列は、配列番号1のアミノ酸22〜31、配列番号1のアミノ酸22〜33、または、配列番号1のアミノ酸20〜31からなっても良い。あるいは、エキソスポリウムタンパク質は、全長BclA(配列番号2)を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質断片は、たとえば配列番号59(BclAのアミノ酸1〜196)等のカルボキシ末端を欠いたBclAの中間サイズの断片を含有しても良い。あるいは、エキソスポリウムタンパク質断片は、配列番号59からなっても良い。
標的化配列はまた、配列番号3のアミノ酸1〜27、配列番号3のアミノ酸12〜27、または配列番号3を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長BetA/BAS3290(配列番号4)を含有しても良い。また、BetA/BAS3290のアミノ酸12〜27に連結されたメチオニン残基を標的配列として用いることができることが明らかになっている。ゆえに、標的化配列は、配列番号61を含有しても良い。標的化配列はまた、配列番号3のアミノ酸14〜23、配列番号3のアミノ酸14〜25、または、配列番号3のアミノ酸12〜23を含有しても良い。
標的化配列はまた、配列番号5のアミノ酸1〜38、配列番号5のアミノ酸23〜38、または配列番号5を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長BAS4623(配列番号6)を含有しても良い。
あるいは、標的化配列は、配列番号7のアミノ酸1〜28、配列番号7のアミノ酸13〜28、または配列番号7を含有しても良く、またはエキソスポリウムタンパク質は、全長BclB(配列番号8)を含有しても良い。
標的化配列はまた、配列番号9のアミノ酸1〜24、配列番号9のアミノ酸9〜24、または、配列番号9を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長BAS1882(配列番号10)を含有しても良い。BAS1882のアミノ酸9〜24に連結されたメチオニン残基もまた、標的化配列として用いることができる。ゆえに、標的化配列は、配列番号69を含有しても良い。
標的化配列はまた、配列番号11のアミノ酸1〜33、配列番号11のアミノ酸18〜33、または配列番号11を含有してもよく、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.weihenstephensis KBAB4 2280遺伝子産物(配列番号12)を含有しても良い。B.weihenstephensis KBAB4 2280遺伝子産物のアミノ酸18〜33に連結されたメチオニン残基もまた、標的化配列として用いることができる。ゆえに、標的化配列は、配列番号62を含有しても良い。
標的化配列は、配列番号13のアミノ酸1〜33、配列番号13のアミノ酸18〜33、または配列番号13を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.weihenstephensis KBAB4 3572遺伝子産物(配列番号14)を含有しても良い。B.weihenstephensis KBAB4 3572遺伝子産物のアミノ酸18〜33に連結されたメチオニン残基もまた、標的化配列として用いることができる。ゆえに、標的化配列は、配列番号63を含有しても良い。
あるいは、標的化配列は、配列番号15のアミノ酸1〜43、配列番号15のアミノ酸28〜43、または配列番号15を含有しても良く、またはエキソスポリウムタンパク質は、全長B.cereus VD200エキソスポリウムリーダーペプチド(配列番号16)を含有しても良い。
標的化配列は、配列番号17のアミノ酸1〜27、配列番号17のアミノ酸12〜27、または配列番号17を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.cereus VD166エキソスポリウムリーダーペプチド(配列番号18)を含有しても良い。B.cereus VD166エキソスポリウムリーダーペプチドのアミノ酸12〜27に連結されたメチオニン残基もまた、標的化配列として用いることができる。ゆえに、標的化配列は、配列番号64を含有しても良い。
標的化配列は、配列番号19のアミノ酸1〜33、配列番号19のアミノ酸18〜33、または配列番号19を含有しても良く、またはエキソスポリウムタンパク質は、全長B. cereus VD200仮想タンパク質IKG_04663(配列番号20)を含有しても良い。
あるいは、標的化配列は、配列番号21のアミノ酸1〜33、配列番号21のアミノ酸18〜33、または配列番号21を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.weihenstephensis KBAB4 YVTN βプロペラタンパク質(配列番号22)を含有しても良い。B.weihenstephensis KBAB4 YVTN βプロペラタンパク質のアミノ酸18〜33に連結されたメチオニン残基もまた、標的化配列として用いることができる。ゆえに、標的化配列は、配列番号65を含有しても良い。
標的化配列はまた、配列番号23のアミノ酸1〜24、配列番号23のアミノ酸9〜24、または、配列番号23を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B. weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2363(配列番号24)を含有しても良い。B. weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2363のアミノ酸9〜24に連結されたメチオニン残基もまた、標的化配列として用いることができる。ゆえに、標的化配列は、配列番号66を含有しても良い。
標的化配列はまた、配列番号25のアミノ酸1〜24、配列番号25のアミノ酸9〜24、または、配列番号25を含有し、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2131(配列番号26)を含有しても良い。B.weihenstephensis KBAB4仮想タンパク質bcerkbab4_2131のアミノ酸9〜24に連結されたメチオニン残基もまた、標的化配列として用いることができる。ゆえに、標的化配列は、配列番号67を含有しても良い。
あるいは、標的化配列は、配列番号27のアミノ酸1〜30、配列番号27のアミノ酸15〜30、または配列番号27を含有し、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.weihenstephensis KBAB4三重へリックスリピート含有コラーゲン(配列番号28)を含有しても良い。
標的化配列は、配列番号29のアミノ酸1〜33、配列番号29のアミノ酸18〜33、または配列番号29を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B. mycoides 2048仮想タンパク質bmyco0001_21660(配列番号30)を含有しても良い。
標的化配列はまた、配列番号31のアミノ酸1〜24、配列番号31のアミノ酸9〜24、または、配列番号31を含有しても良く、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B. mycoides 2048仮想タンパク質bmyc0001_22540(配列番号32)を含有しても良い。B. mycoides 2048仮想タンパク質bmyc0001_22540のアミノ酸9〜24に連結されたメチオニン残基もまた、標的化配列として用いることができる。ゆえに、標的化配列は、配列番号68を含有しても良い。
あるいは、標的化配列は、配列番号33のアミノ酸1〜15、配列番号33を含有し、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.mycoides 2048 仮想タンパク質bmyc0001_21510(配列番号34)を含有する。
標的化配列はまた、配列番号35のアミノ酸1〜16、配列番号35を含有してもよく、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.thuringiensis 35646コラーゲン三重ヘリックスリピートタンパク質(配列番号36)を含有してもよい。
標的化配列は、配列番号43のアミノ酸1〜29、配列番号43のアミノ酸14〜29、または配列番号43を含有してもよく、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.cereus仮想タンパク質WP_69652(配列番号44)を含有してもよい。
あるいは、標的化配列は、配列番号45のアミノ酸1〜35、配列番号45のアミノ酸20〜35、または、配列番号45を含有し、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.cereusエキソスポリウムリーダーWP016117717(配列番号46)を含有しても良い。B.cereusエキソスポリウムリーダーWP016117717のアミノ酸20〜35に連結されたメチオニン残基もまた、標的化配列として用いることができる。ゆえに、標的化配列は、配列番号70を含有しても良い。
標的化配列は、配列番号47のアミノ酸1〜43、配列番号47のアミノ酸28〜43、または配列番号47を含有してもよく、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B. cereusエキソスポリウムペプチドWP002105192(配列番号48)を含有してもよい。
標的化配列は、配列番号49のアミノ酸1〜32、配列番号49のアミノ酸17〜32、または配列番号49を含有してもよく、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.cereus仮想タンパク質WP87353(配列番号50)を含有してもよい。
あるいは、標的化配列は、配列番号51のアミノ酸1〜33、配列番号51のアミノ酸18〜33、または配列番号51を含有してもよく、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.cereusエキソスポリウムペプチド02112369(配列番号52)を含有してもよい。
標的化配列は、配列番号53のアミノ酸1〜33、配列番号53のアミノ酸18〜33、または配列番号53を含有してもよく、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.cereusエキソスポリウムタンパク質WP016099770(配列番号54)を含有してもよい。
あるいは、標的化配列は、配列番号55のアミノ酸1〜30、配列番号55のアミノ酸15〜30、または配列番号55を含有してもよく、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.thuringiensis仮想タンパク質YP006612525(配列番号56)を含有してもよい。
標的化配列はまた、配列番号57のアミノ酸1〜130、配列番号57のアミノ酸115〜130、または配列番号57を含有してもよく、または、エキソスポリウムタンパク質は、全長B.mycoides仮想タンパク質TIGR03720(配列番号58)を含有してもよい。
さらに、BclAのアミノ酸20〜35が保存されているが、アミノ酸25〜35はさらに保存されており、エキソスポリウムへとタンパク質を向かわせる標的化配列の能力に影響を与えることなく、この領域にある程度のバリエーションが存在しうることが図1の配列アライメントから明らかであろう。図1において、BclAのアミノ酸20〜35(「20〜35同一性%」)および、BclAのアミノ酸25〜35(「25〜35同一性%」)に対する、各配列の対応するアミノ酸各々の同一性のパーセントを列記する。ゆえに、たとえば、BclAのアミノ酸20〜35との比較と比較して、BetA/BAS3290の対応するアミノ酸は、約81.3%の同一性であり、BAS4623の対応するアミノ酸は、約50.0%の同一性であり、BclBの対応するアミノ酸は約43.8%の同一性であり、BAS1882の対応するアミノ酸は約62.5%の同一性であり、KBAB4 2280遺伝子産物の対応するアミノ酸は約81.3%の同一性であり、および、KBAB4 3572遺伝子産物の対応するアミノ酸は約81.3%の同一性である。残りの配列に対する、この領域上の配列同一性は、図1に列記する。
BclAのアミノ酸25〜35に関しては、BetA/BAS3290の対応するアミノ酸は、約90.9%の同一性であり、BAS4623の対応するアミノ酸は、約72.7%の同一性であり、BclBの対応するアミノ酸は、約54.5%の同一性であり、BAS1882の対応するアミノ酸は、72.7%の同一性であり、KBAB4 2280遺伝子産物の対応するアミノ酸は、約90.9%の同一性であり、および、KBAB4 3572遺伝子産物の対応するアミノ酸は、約81.8%の同一性である。残りの配列に関する、この領域上の配列同一性は図1に列記する。
ゆえに、標的化配列は、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列を含有しても良く、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約54%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約54%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約56%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約56%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約62%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約62%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約68%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約68%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約90%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約90%である。
当業者であれば、標的化配列が、BclAのアミノ酸20〜35、BetA/BAS3290、BAS4263、BclB、BAS1882、KBAB4 2280遺伝子産物、もしくは、KBAB 3572遺伝子産物の対応するアミノ酸を含有する限り、または、BclAのアミノ酸20〜35および25〜35に対する上述の配列同一性のいずれかを含有する配列が存在している限り、上記の配列の変異体もまた、標的化配列としても用いることができることを理解するであろう。
さらに、BclAのアミノ酸25〜35との相同性を有する領域が欠落している、あるBacillus cereusファミリーのエキソスポリウムタンパク質もまた、Bacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムへペプチドまたはタンパク質を向かわせるために用いることができることが、判明している。特に、融合タンパク質は、配列番号71(B. mycoides InhA)を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号72(B. anthracis Sterne BAS1141(ExsY))を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号73(B.anthracis Sterne BAS1144 (BxpB/ExsFA))を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号74(B.anthracis Sterne BAS1145(CotY))を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号75(B.anthracis Sterne BAS1140)を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号76(B.anthracis H9401 ExsFB)を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号77(B.thuringiensis HD74 InhA1)を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号78(B.cereus ATCC 10876 ExsJ)を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号79(B.cereus ExsH)を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号80(B.anthracis Ames YjcA)を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号81(B.anthracis YjcB)を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号82(B.anthracis Sterne BclC)を含有するエキソスポリウムタンパク質、配列番号83(Bacillus thuringiensis血清型konkukian株97−27酸ホスファターゼ)を含有するエキソスポリウムタンパク質、または、配列番号84(B.thuringiensis HD74 InhA2)を含有するエキソスポリウムタンパク質、を含有しても良い。本明細書に記述される融合タンパク質中に配列番号71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または84を含有するエキソスポリウムタンパク質を包含することにより、B.cereus科のメンバーのエキソスポリウムへの標的化がもたらされる。
さらに、上述の全長エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかと、高度の配列同一性を有するエキソスポリウムタンパク質を用いて、Bacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムへペプチドまたはタンパク質を向かわせることができる。ゆえに、融合タンパク質は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、および84のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質を含有してもよい。あるいは、融合タンパク質は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、および84のいずれか1つと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも100%の同一性を有するエキソスポリウムタンパク質を含有しても良い。
あるいは、融合タンパク質は、配列番号59と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるエキソスポリウムタンパク質断片を含有しても良い。あるいは、融合タンパク質は、配列番号59と、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列からなるエキソスポリウムタンパク質断片を含有しても良い。
本明細書に記述される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかにおいて、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、そのカルボキシ末端でGXTのアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、Xは、任意のアミノ酸である。
本明細書に記述される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかにおいて、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、配列番号1のアミノ酸20に相当する標的化配列の位置で、アラニン残基を含有しても良い。
融合タンパク質
本発明は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、少なくとも1つの植物生育刺激タンパク質またはペプチドを含有する融合タンパク質に関するものであり、ここで、当該植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、ペプチドホルモン、非ホルモン性ペプチド、または、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有する。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、上述の[0005]段落に記述される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかであっても良い。
本発明はさらに、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、植物においてストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質に関する。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、上述の[0005]段落に記述される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかであっても良い。
さらに、本発明は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、植物結合タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質に関する。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、上述の[0005]段落に記述される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかであっても良い。
また、本発明は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質に関する。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、上述の[0006]段落に記述される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかであっても良い。
本発明はさらに、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質に関する。病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、ハーピン、αエラスチン、βエラスチン、システミン、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、エリシチン、ディフェンシン、クリプトゲイン、フラジェリンタンパク質、フラジェリンペプチド、バクテリオシン、リゾチーム、リゾチームペプチド、シデロフォア、非リボソーム活性ペプチド、コンアルブミン、アルブミン、ラクトフェリン、ラクトフェリンペプチド、またはTasAを含有する。あるいは、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、殺虫活性、殺蠕虫活性を有するか、または、昆虫もしくは蠕虫の捕食を抑制するか、またはそれらの組み合わせである。あるいは、病原体から植物を防御するタンパク質は、酵素を含有する。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、上述の[0005]段落に列記される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかであっても良い。
融合タンパク質は、当分野公知の標準的なクローニング法および分子生物学法を用いて作製されても良い。たとえば、タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子(たとえば、植物生育刺激タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子)は、融合タンパク質をコードするDNA分子を形成するために、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)により増幅され、および、上述の標的化配列のいずれかをコードするDNAにライゲートされても良い。融合タンパク質をコードするDNA分子は、任意の適切なベクター(たとえば、プラスミドベクター)にクローニングされても良い。ベクターは、融合タンパク質をコードするDNA分子が容易に挿入されうる、多重クローニング部位を適切に含有する。ベクターで形質転換、トランスフェクト、または作製された細菌が容易に特定および単離できるよう、ベクターは、たとえば抗生物質抵抗性遺伝子等の選択可能マーカーもまた、適切に含有する。ベクターがプラスミドである場合、プラスミドは、複製起点もまた、適切に含有する。融合タンパク質をコードするDNAは、B.cereus科のメンバーの芽胞のエキソスポリウムで融合タンパク質の発現を誘導する、胞子形成プロモーター(たとえば、B.cereus科のメンバー由来の天然型bclAプロモーター)の適切な制御下にある。あるいは、融合タンパク質をコードするDNAは、B.cereus科のメンバーの宿主の染色体DNAに組み込まれても良い。
融合タンパク質はまた、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、エキソスポリウムタンパク質断片、または、植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質もしくはペプチド、または、植物結合タンパク質もしくはペプチドの一部ではない、追加のポリペプチド配列を含有しても良い。たとえば、融合タンパク質は、融合タンパク質の精製または可視化(たとえば、ポリヒスチジンタグ、または蛍光タンパク質(たとえば、GFPまたはYFP))、または、融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーメンバーの芽胞の可視化を容易にするためのタグもしくはマーカーを含有してもよい。
本明細書に記述される標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、およびエキソスポリウムタンパク質断片を用いた、エキソスポリウムでの融合タンパク質の発現は、これら配列のアミノ末端における二次構造の欠落により増強され、それにより、融合タンパク質の天然型のフォールディングおよび活性の維持が可能となる。適切なフォールディングは、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、エキソスポリウムタンパク質断片と、融合パートナータンパク質の間に、短いアミノ酸リンカーを含有させることによりさらに増強されることができる。
ゆえに、本明細書に記述される任意の融合タンパク質は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片と、植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質もしくはペプチド、または、植物結合タンパク質もしくはペプチドとの間にアミノ酸リンカーを含有してもよい。
リンカーは、ポリアラニンリンカーまたはポリグリシンリンカーを含有しても良い。アラニン残基とグリシン残基の両方の混合物を含有するリンカーを用いても良い。たとえば、標的化配列が配列番号1を含有する場合、融合タンパク質は、以下の構造のうちの1つを有しても良い:
リンカー無し:配列番号1−融合パートナータンパク質
アラニンリンカー:配列番号1−A−融合パートナータンパク質
グリシンリンカー:配列番号1−G−融合パートナータンパク質
混合アラニンおよびグリシンリンカー:配列番号1−(A/G)−融合パートナータンパク質
ここで、A、G、および(A/G)は、それぞれ、任意の数のアラニン、任意の数のグリシン、または、任意の数のアラニンとグリシンの混合物である。たとえば、nは、1〜25、好ましくは6〜10であっても良い。リンカーがアラニン残基とグリシン残基の混合物を含有する場合、グリシン残基とアラニン残基の任意の組み合わせを用いても良い。上述の構造において、「融合パートナータンパク質」とは、植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、植物におけるストレス耐性を増強するタンパク質もしくはペプチド、または、植物結合タンパク質もしくはペプチドを表す。
あるいは、またはさらに、リンカーは、プロテアーゼ認識部位を含有しても良い。プロテアーゼ認識部位を含有することで、当該プロテアーゼ認識部位を認識するプロテアーゼに曝されると、植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、植物におけるストレス耐性を増強するタンパク質もしくはペプチド、または、植物結合タンパク質もしくはペプチドの標的化された除去が可能となる。
植物生育刺激タンパク質およびペプチド
上述のように、本発明は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質に関するものであり、ここで、当該植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、ペプチドホルモン、非ホルモン性ペプチド、または、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有する。
たとえば、植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、ペプチドホルモンを含有する場合、当該ペプチドホルモンは、フィトスルホカイン(たとえば、フィトスルホカイン−α)、クラバータ3(clavata3)(CLV3)、システミン、ZmlGF、またはSCR/SP11を含有しても良い。
植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、非ホルモン性ペプチドを含有する場合、当該非ホルモン性ペプチドは、RKN 16D10、Hg−Syv46、eNOD40ペプチド、メリチン(melittin)、マストパラン、Mas7、RHPP、POLARIS、または、kunitzトリプシンインヒビター(KTI)を含有してもよい。
植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有しても良い。植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素は、植物の生育を刺激する化合物もしくは植物の構造を変える化合物の生物学的合成経路における任意の工程を触媒する任意の酵素、または、植物の生育を刺激する化合物もしくは植物の構造を変える化合物の不活性または低活性誘導体の、当該化合物の活性型または、より高い活性型への転換を触媒する任意の酵素であっても良い。
植物生育刺激化合物は、根圏中で細菌または真菌により産生される化合物(たとえば、2,3−ブタンジオール)を含有しても良い。
あるいは、植物生育刺激化合物は、植物成長ホルモン(たとえば、サイトカイニンもしくはサイトカイニン誘導体、エチレン、オーキシンもしくはオーキシン誘導体、ジベレリン酸もしくはジベレリン酸誘導体、アブシジン酸もしくはアブシジン酸誘導体、または、ジャスモン酸もしくはジャスモン酸誘導体)を含有しても良い。
植物生育刺激化合物がサイトカイニンまたはサイトカイニン誘導体を含有する場合、当該サイトカイニンまたはサイトカイニン誘導体は、キネチン、シス−ゼアチン、トランス−ゼアチン、6−ベンジルアミノプリン、ジヒドロキシゼアチン、N6−(D2−イソペンテニル)アデニン、リボシルゼアチン、N6−(D2−イソペンテニル)アデノシン、2−メチルチオ−シス−リボシルゼアチン、シス−リボシルゼアチン、トランス−リボシルゼアチン、2−メチルチオ−トランス−リボシルゼアチン、リボシルゼアチン−5−モノスホスフェート、N6−メチルアミノプリン、N6−ジメチルアミノプリン、2’−デオキシゼアチンリボシド、4−ヒドロキシ−3−メチル−トランス−2−ブテニルアミノプリン、オルト−トポリン、メタ−トポリン、ベンジルアデニン、オルト−メチルトポリン、メタ−メチルトポリン、または、それらの組み合わせを含有しても良い。
植物生育刺激化合物が、オーキシンまたはオーキシン誘導体を含有する場合、当該オーキシンまたはオーキシン誘導体は、活性オーキシン、不活性オーキシン、結合オーキシン、天然型オーキシンまたは合成オーキシン、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。たとえば、オーキシンまたはオーキシン誘導体は、インドール−3−酢酸、インドール−3−ピルビン酸、インドール−3−アセトアルドキシム、インドール−3−アセトアミド、インドール−3−アセトニトリル、インドール−3−エタノール、インドール−3−ピルビン酸塩、インドール−3−アセトアルドキシム、インドール−3−酪酸、フェニル酢酸、4−クロロインドール−3−酢酸、グルコース結合オーキシン、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素は、アセトイン還元酵素、インドール−3−アセトアミド加水分解酵素、トリプトファンモノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、αアセト乳酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ジアセチル還元酵素、ブタンジオール脱水素酵素、アミノトランスフェラーゼ(たとえば、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ)、トリプトファンデカルボキシラーゼ、アミンオキシダーゼ、インドール−3−ピルビン酸デカルボキシラーゼ、インドール−3−アセトアルデヒド脱水素酵素、トリプトファン側鎖オキシダーゼ、ニトリル加水分解酵素、ニトリラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、アデノシンホスフェートイソペンテニルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、アデノシンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、CYP735A、5’リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、ゼアチン シス−トランスイソメラーゼ、ゼアチン O−グルコシルトランスフェラーゼ、β−グルコシダーゼ、シス−ヒドロキシラーゼ、CKシス−ヒドロキシラーゼ、CK N−グルコシルトランスフェラーゼ、2,5−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ゼアチン還元酵素、ヒドロキシルアミン還元酵素、2−オキソグルタレートジオキシゲナーゼ、ジべレリン2B/3B加水分解酵素、ジベレリン3−オキシダーゼ、ジベレリン20−オキシダーゼ、キトシナーゼ、キチナーゼ、β−1,3−グルカナーゼ、β−1,4−グルカナーゼ、β−1,6−グルカナーゼ、アミノシクロプロパン−1−カルボン酸デアミナーゼ、または、ノッド因子の産生に関与する酵素(たとえば、nodA、nodBまたはnodI)を含有しても良い。
酵素が、プロテアーゼまたはペプチダーゼを含有する場合、当該プロテアーゼまたはペプチダーゼは、タンパク質、ペプチド、プロタンパク質またはプレプロタンパク質を開裂し、生物活性ペプチドを産生するプロテアーゼまたはペプチダーゼであっても良い。生物活性ペプチドは、生物学的活性を発揮する任意のペプチドであっても良い。
生物活性ペプチドの例としては、RKN 16D10およびRHPPが挙げられる。
タンパク質、ペプチド、プロタンパク質またはプレプロタンパク質を開裂し、生物活性ペプチドを産生するプロテアーゼまたはペプチダーゼは、サブチリシン、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼを含有しても良い。
プロテアーゼまたはペプチダーゼは、タンパク質が豊富な食品中のタンパク質を開裂することができる(たとえば、大豆食または酵母抽出物)。
病原体から植物を防御するタンパク質およびペプチド
本発明は、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する融合タンパク質に関するものである。
病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、植物の免疫応答を刺激するタンパク質またはペプチドを含有しても良い。たとえば、植物の免疫応答を刺激するタンパク質またはペプチドは、植物免疫システムのエンハンサータンパク質またはペプチドを含有しても良い。植物免疫システムのエンハンサータンパク質またはペプチドは、植物の免疫システムに有益な効果を有する任意のタンパク質またはペプチドであっても良い。適切な植物免疫システムエンハンサータンパク質またはペプチドとしては、ハーピン、αエラスチン、βエラスチン、システミン、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、エリシチン、ディフェンシン、クリプトゲイン、フラジェリンタンパク質およびフラジェリンペプチド(たとえば、flg22)が挙げられる。
あるいは、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、抗菌活性、抗真菌活性、または抗菌活性と抗真菌活性の両方を有するタンパク質またはペプチドであっても良い。そのようなタンパク質またはペプチドの例としては、バクテリオシン、リゾチーム、リゾチームペプチド(たとえば、LysM)、シデロフォア、非リボソーム活性ペプチド、コンアルブミン、アルブミン、ラクトフェリン、ラクトフェリンペプチド(たとえば、LfcinB)、およびTasAが挙げられる。
病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、殺虫活性、殺蠕虫活性を有するか、または、昆虫もしくは蠕虫の捕食を抑制するか、またはそれらの組み合わせである、タンパク質またはペプチドであっても良い。たとえば、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、殺虫性細菌毒素(たとえば、VIP殺虫タンパク質)、エンドトキシン、Cry毒素(たとえば、Bacillus thuringiensis由来のCry毒素)、プロテアーゼ阻害タンパク質またはペプチド(たとえば、トリプシンインヒビター、または、クワイプロテアーゼインヒビター)、システインプロテアーゼ、またはキチナーゼを含有しても良い。Cry毒素が、Bacillus thuringiensis由来のCry毒素である場合、Cry毒素は、Cry5Bタンパク質またはCry21Aタンパク質であっても良い。Cry5BおよびCry21Aは、殺虫活性および殺線虫活性の両方を有している。
病原体から植物を防御するタンパク質は、酵素を含有しても良い。適切な酵素としては、プロテアーゼおよびラクトナーゼが挙げられる。プロテアーゼおよびラクトナーゼは、細菌のシグナル伝達分子に対して特異的であっても良い(たとえば、細菌ラクトンホモセリンシグナル伝達分子)。
酵素がラクトナーゼである場合、ラクトナーゼは、1,4−ラクトナーゼ、2−ピロン−4,6−ジカルボキシレートラクトナーゼ、3−オキソアジペートエノールラクトナーゼ、アクチノマイシンラクトナーゼ、デオキシリモネートA環−ラクトナーゼ、グルコノラクトナーゼL−ラムノノ−1、4−ラクトナーゼ、リモニン−D環−ラクトナーゼ、ステロイド−ラクトナーゼ、トリアセテート−ラクトナーゼ、または、キシロノ−1,4−ラクトナーゼを含有しても良い。
酵素はまた、細菌または真菌の細胞成分に特異的な酵素であっても良い。たとえば、酵素は、β−1,3−グルカナーゼ、β−1,4−グルカナーゼ、β−1,6−グルカナーゼ、キトシナーゼ、キチナーゼ、キトシナーゼ様酵素、リチカーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、プロテアーゼ(たとえば、アルカリプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、または中性プロテアーゼ等)、ムタノリシン(mutanolysin)、スタホリシン(stapholysin)、またはリゾチームを含有しても良い。
病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを含有する任意の上述の融合タンパク質に対し、病原体は、細菌性の病原体または真菌性の病原体であっても良い。たとえば、病原体は、αクラスプロテオバクテリア、βクラスプロテオバクテリア、γクラスプロテオバクテリア、または、それらの組み合わせを含有しても良い。特定の細菌性病原体としては、Agrobacterium tumefaciens、Pantoea stewartii、Erwinia carotovora、Ralstonia solanacearum、Pseudomonas syringae、Pseudomonas aeruginosa、Xanthomonas campestris、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
他の細菌性病原体および真菌性病原体としては、Acarosporina microspora、Aceria guerreronis、Achlya conspicua、Achlya klebsiana、Achlysiella williamsi、Acholeplasmataceae、Acidovorax avenae、Acremonium strictum、Acrocalymma medicaginis、Acrodontium simplex、Acrophialophora fusispora、Acrosporium tingitaninum、Aecidium、Aecidium aechmantherae、Aecidium amaryllidis、Aecidium breyniae、Aecidium campanulastri、Aecidium cannabis、Aecidium cantensis、Aecidium caspicum、Aecidium foeniculi、Agrobacterium tumefaciens、Albonectria rigidiuscula、Albugo bliti、Albugo candida、Albugo ipomoeae−panduratae、Albugo laibachii、Albugo occidentalis、Albugo tragopogonis、Alternaria、Alternaria alternata、Alternaria brassicae、Alternaria brassicicola、Alternaria carthami、Alternaria cinerariae、Alternaria citri、Alternaria dauci、Alternaria dianthi、Alternaria dianthicola、Alternaria euphorbiicola、Alternaria helianthi、Alternaria helianthicola、Alternaria japonica、Alternaria leucanthemi、Alternaria limicola、Alternaria linicola、Alternaria mali、Alternaria padwickii、Alternaria panax、Alternaria radicina、Alternaria raphani、Alternaria saponariae、Alternaria senecionis、Alternaria solani、Alternaria tenuissima、Alternaria triticina、Alternaria zinniae、Amazonia、Amphobotrys ricini、Anguillosporella vermiformis、Anguina(属)、Anguina agrostis、Anguina amsinckiae、Anguina australis、Anguina balsamophila、Anguina funesta、Anguina graminis、Anguina spermophaga、Anguina tritici、Anisogramma anomala、Anthostomella pullulans、Antrodia albida、Antrodia serialiformis、Antrodia serialis、Aphanomyces cladogamus、Aphanomyces cochlioides、Aphanomyces euteiches、Aphanomyces euteiches f.sp. pisi、Aphanomyces raphani、Aphelenchoides、Aphelenchoides arachidis、Aphelenchoides besseyi、Aphelenchoides fragariae、Aphelenchoides parietinus、Aphelenchoides ritzemabosi、Aphelenchus avenae、Apiognomonia errabunda、Apiognomonia veneta、Apiospora montagnei、Appendiculella、Armillaria、Armillaria affinis、Armillaria apalosclera、Armillaria camerunensis、Armillaria duplicate、Armillaria fellea、Armillaria fumosa、Armillaria fuscipes、Armillaria griseomellea、Armillaria heimii、Armillaria mellea、Armillaria melleorubens、Armillaria montagnei、Armillaria omnituens、Armillaria pallidula、Armillaria paulensis、Armillaria pelliculata、Armillaria procera、Armillaria puiggarii、Armillaria singular、Armillaria socialis、Armillaria solidipes、Armillaria tabescens、Armillaria tigrensis、Armillaria umbrinobrunnea、Armillaria viridiflava、Armillaria yungensis、Arthrocladiella、Arthuriomyces peckianus、Ascochyta asparagine、Ascochyta bohemica、Ascochyta caricae、Ascochyta doronici、Ascochyta fabae f.sp. lentis、Ascochyta graminea、Ascochyta hordei、Ascochyta humuli、Ascochyta pisi、Ascochyta prasadii、Ascochyta sorghi、Ascochyta spinaciae、Ascochyta tarda、Ascochyta tritici、Ascospora ruborum、Ashbya gossypii、Aspergillus aculeatus、Aspergillus fischerianus、Aspergillus niger、Asperisporium caricae、Asperisporium minutulum、Asteridiella、Asteridiella perseae、Asteroma caryae、Asteroma coryli、Asteroma inconspicuum、Athelia arachnoidea、Athelia rolfsii、Aurantiporus fissilis、Belonolaimus、Belonolaimus gracilis、Belonolaimus longicaudatus、Beniowskia sphaeroidea、Bionectria ochroleuca、Bipolaris、Bipolaris cactivora、Bipolaris cookie、Bipolaris incurvata、Bipolaris sacchari、Biscogniauxia capnodes var. capnodes、Biscogniauxia marginata、Biscogniauxia nummularia、Bjerkandera adusta、Blakeslea trispora、Blumeria graminis、Botryodiplodia oncidii、Botryodiplodia ulmicola、Botryosphaeria cocogena、Botryosphaeria corticola、Botryosphaeria disrupta、Botryosphaeria dothidea、Botryosphaeria marconii、Botryosphaeria obtuse、Botryosphaeria quercuum、Botryosphaeria rhodina、Botryosphaeria ribis、Botryosphaeria stevensii、Botryosporium pulchrum、Botryotinia、Botryotinia fuckeliana、Botrytis anthophila、Botrytis cinerea、Botrytis fabae、Bremia lactucae、Brenneria salicis、Briosia ampelophaga、Bulbomicrosphaera、Burkholderia andropogonis、Burkholderia caryophylli、Burkholderia glumae、Cadophora malorum、Caespitotheca、Calonectria indusiata、Calonectria kyotensis、Calonectria quinqueseptata、Calvatia versispora、Camarosporium pistaciae、Camarotella acrocomiae、Camarotella costaricensis、Candidatus Liberibacter、Capitorostrum cocoes、Capnodium footii、Capnodium mangiferum、Capnodium ramosum、Capnodium theae、Caulimoviridae、Cephaleuros virescens、Cephalosporium gramineum、Ceratobasidium cereal、Ceratobasidium cornigerum、Ceratobasidium noxium、Ceratobasidium ramicola、Ceratobasidium setariae、Ceratobasidium stevensii、Ceratocystis adiposa、Ceratocystis coerulescens、Ceratocystis fimbriata、Ceratocystis moniliformis、Ceratocystis paradoxa、Ceratocystis pilifera、Ceratocystis pluriannulata、Ceratorhiza hydrophila、Ceratospermopsis、Cercoseptoria ocellata、Cercospora、Cercospora angreci、Cercospora apii、Cercospora apii f.sp. clerodendri、Cercospora apiicola、Cercospora arachidicola、Cercospora asparagi、Cercospora atrofiliformis、Cercospora beticola、Cercospora brachypus、Cercospora brassicicola、Cercospora brunkii、Cercospora cannabis、Cercospora cantuariensis、Cercospora capsici、Cercospora carotae、Cercospora corylina、Cercospora fragariae、Cercospora fuchsiae、Cercospora fusca、Cercospora fusimaculans、Cercospora gerberae、Cercospora halstedii、Cercospora handelii、Cerc
ospora hayi、Cercospora hydrangea、Cercospora kikuchii、Cercospora lentis、Cercospora liquidambaris、Cercospora longipes、Cercospora longissima、Cercospora mamaonis、Cercospora mangiferae、Cercospora medicaginis、Cercospora melongenae、Cercospora minima、Cercospora minuta、Cercospora nicotianae、Cercospora odontoglossi、Cercospora papaya、Cercospora penniseti、Cercospora pisa−sativae、Cercospora platanicola、Cercospora puderii、Cercospora pulcherrima、Cercospora rhapidicola、Cercospora rosicola、Cercospora rubrotincta、Cercospora sojina、Cercospora solani、Cercospora solani−tuberosi、Cercospora sorghi、Cercospora theae、Cercospora tuberculans、Cercospora vexans、Cercospora vicosae、Cercospora zeae−maydis、Cercospora zebrina、Cercospora zonata、Cercosporella rubi、Cereal cyst nematode、Ceriporia spissa、Ceriporia xylostromatoides、Cerrena unicolor、Ceuthospora lauri、Choanephora、Choanephora cucurbitarum、Choanephora infundibulifera、Chondrostereum purpureum、Chrysomyxa ledi var. rhododendri、Chrysomyxa ledicola、Chrysomyxa piperiana、Chrysomyxa roanensis、Cladosporium、Cladosporium arthropodii、Cladosporium caryigenum、Cladosporium cladosporioides、Cladosporium cladosporioides f.sp. pisicola、Cladosporium cucumerinum、Cladosporium herbarum、Cladosporium musae、Cladosporium oncobae、Clavibacter michiganensis、Claviceps fusiformis、Claviceps purpurea、Claviceps sorghi、Claviceps zizaniae、Climacodon pulcherrimus、Climacodon septentrionalis、Clitocybe parasitica、Clonostachys rosea f. rosea、Clypeoporthe iliau、Cochliobolus、Cochliobolus carbonum、Cochliobolus cymbopogonis、Cochliobolus hawaiiensis、Cochliobolus heterostrophus、Cochliobolus lunatus、Cochliobolus miyabeanus、Cochliobolus ravenelii、Cochliobolus sativus、Cochliobolus setariae、Cochliobolus spicifer、Cochliobolus stenospilus、Cochliobolus tuberculatus、Cochliobolus victoriae、Coleosporium helianthi、Coleosporium ipomoeae、Coleosporium madiae、Coleosporium pacificum、Coleosporium tussilaginis、Colletotrichum acutatum、Colletotrichum arachidis、Colletotrichum capsici、Colletotrichum cereale、Colletotrichum crassipes、Colletotrichum dematium、Colletotrichum dematium f. spinaciae、Colletotrichum derridis、Colletotrichum destructivum、Colletotrichum fragariae、Colletotrichum gossypii、Colletotrichum higginsianum、Colletotrichum kahawae、Colletotrichum lindemuthianum、Colletotrichum lini、Colletotrichum mangenotii、Colletotrichum musae、Colletotrichum nigrum、Colletotrichum orbiculare、Colletotrichum pisi、Colletotrichum sublineolum、Colletotrichum trichellum、Colletotrichum trifolii、Colletotrichum truncatum、Coniella castaneicola、Coniella diplodiella、Coniella fragariae、Coniothecium chomatosporum、Coniothyrium celtidis−australis、Coniothyrium henriquesii、Coniothyrium rosarum、Coniothyrium wernsdorffiae、Coprinopsis psychromorbida、Cordana johnstonii、Cordana musae、Coriolopsis floccose、Coriolopsis gallica、Corticium invisum、Corticium penicillatum、Corticium theae、Coryneopsis rubi、Corynespora cassiicola、Coryneum rhododendri、Crinipellis sarmentosa、Cronartium ribicola、Cryphonectriaceae、Cryptocline cyclaminis、Cryptomeliola、Cryptoporus volvatus、Cryptosporella umbrina、Cryptosporiopsis tarraconensis、Cryptosporium minimum、Curvularia caricae−papayae、Curvularia penniseti、Curvularia senegalensis、Curvularia trifolii、Cylindrocarpon candidum、Cylindrocarpon ianthothele var. ianthothele、Cylindrocarpon magnusianum、Cylindrocarpon musae、Cylindrocladiella camelliae、Cylindrocladiella parva、Cylindrocladium clavatum、Cylindrocladium lanceolatum、Cylindrocladium peruvianum、Cylindrocladium pteridis、Cylindrosporium cannabinum、Cylindrosporium juglandis、Cylindrosporium rubi、Cymadothea trifolii、Cytospora、Cytospora palmarum、Cytospora personata、Cytospora platani、Cytospora sacchari、Cytospora sacculus、Cytospora terebinthi、Cytosporina ludibunda、Dactuliophora elongata、Daedaleopsis confragosa、Dasineura urticae、Datronia scutellata、Davidiella carinthiaca、Davidiella dianthi、Davidiella tassiana、Deightoniella papuana、Deightoniella torulosa、Dendrophoma marconii、Dendrophora erumpens、Denticularia mangiferae、Dermea pseudotsugae、Diaporthaceae、Diaporthe、Diaporthe arctii、Diaporthe citri、Diaporthe dulcamarae、Diaporthe eres、Diaporthe helianthi、Diaporthe lagunensis、Diaporthe lokoyae、Diaporthe melonis、Diaporthe orthoceras、Diaporthe perniciosa、Diaporthe phaseolorum、Diaporthe phaseolorum var. caulivora、Diaporthe phaseolorum var. phaseolorum、Diaporthe phaseolorum var. sojae、Diaporthe rudis、Diaporthe tanakae、Diaporthe toxica、Dibotryon morbosum、Dicarpella dryina、Didymella bryoniae、Didymella fabae、Didymella lycopersici、Didymosphaeria arachidicola、Didymosphaeria taiwanensis、Dilophospora alopecuri、Dimeriella sacchari、Diplocarpon earlianum、Diplocarpon mali、Diplocarpon mespili、Diplocarpon rosae、Diplodia laelio−cattleyae、Diplodia manihoti、Diplodia paraphysaria、Diplodia theae−sinensis、Discosia artocreas、Guignardia fulvida、Discostroma corticola、Distocercospora、Distocercospora livistonae、Ditylenchus、Ditylenchus africanus、Ditylenchus angustus、Ditylenchus destructor、Ditylenchus dipsaci、Dolichodorus heterocephalus、Dothideomycetes、Dothiorella aromatic、Dothiorella dominicana、Dothiorella gregaria、Dothiorella ulmi、Drechslera avenacea、Drechslera campanulata、Dre
chslera dematioidea、Drechslera gigantea、Drechslera glycines、Drechslera musae−sapientium、Drechslera teres f. maculate、Drechslera wirreganensis、Durandiella pseudotsugae、Eballistra lineata、Eballistra oryzae、Eballistraceae、Echinodontium tinctorium、Ectendomeliola、Elsinoe ampelina、Elsinoe australis、Elsinoe batatas、Elsinoe brasiliensis、Elsinoe fawcettii、Elsinoe leucospila、Elsinoe mangiferae、Elsinoe piri、Elsinoe randii、Elsinoe rosarum、Elsinoe sacchari、Elsinoe theae、Elsinoe veneta、Endomeliola、Endothia radicalis、Endothiella gyrosa、Entoleuca mammata、Entorrhizomycetes、Entyloma ageratinae、Entyloma dahlia、Entyloma ellisii、Epicoccum nigrum、Ergot、Erwinia、Erwinia chrysanthemi、Erwinia psidii、Erysiphaceae、 Erysiphales、Erysiphe、Erysiphe alphitoides、Erysiphe betae、Erysiphe brunneopunctata、Erysiphe cichoracearum、Erysiphe cruciferarum、Erysiphe flexuosa、Erysiphe graminis f. sp. avenae、Erysiphe graminis f.sp. tritici、Erysiphe heraclei、Erysiphe pisi、Eutypella parasitica、Eutypella scoparia、Exobasidium burtii、Exobasidium reticulatum、Exobasidium vaccinii var. japonicum、Exobasidium vaccinii−uliginosi、Exobasidium vexans、Exophiala、Flavescence doree、Fomes fasciatus、Fomes lamaensis、Fomes meliae、Fomitopsis cajanderi、Fomitopsis palustris、Fomitopsis rosea、Fomitopsis spraguei、Fomitopsis supina、Forma specialis、Frommeella tormentillae、Fusarium、Fusarium affine、Fusarium arthrosporioides、Fusarium circinatum、Fusarium crookwellense、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium incarnatum、Fusarium solani、Fusarium merismoides、Fusarium oxysporum f.sp. albedinis、Fusarium oxysporum f.sp. asparagi、Fusarium oxysporum f.sp. batatas、Fusarium oxysporum f.sp. betae、Fusarium oxysporum f.sp. cannabis、Fusarium oxysporum f.sp. citri、Fusarium oxysporum f.sp. coffea、Fusarium oxysporum f.sp. cubense、Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis、Fusarium oxysporum f.sp. dianthi、Fusarium oxysporum f.sp. lentis、Fusarium oxysporum f.sp. lini、Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici、Fusarium oxysporum f.sp. medicaginis、Fusarium oxysporum f.sp. pisi、Fusarium oxysporum f.sp. radicis−lycopersici、Fusarium pallidoroseum、Fusarium proliferatum、Fusarium redolens、Fusarium sacchari、Fusarium solani f.sp. pisi、Fusarium sporotrichioides、Fusarium subglutinans、Fusarium sulphureum、Fuscoporia torulosa、Fusicladium pisicola、Fusicoccum aesculi、Fusicoccum amygdali、Gaeumannomyces graminis var tritici、Gaeumannomyces graminis var. avenae、Gaeumannomyces graminis var. graminis、Galactomyces candidum、Ganoderma brownii、Ganoderma lobatum、Ganoderma orbiforme、Ganoderma philippii、Ganoderma tornatum、Ganoderma zonatum、Geastrumia polystigmatis、Georgefischeriaceae、Georgefischeriales、Geosmithia morbida、Geotrichum、Geotrichum candidum、Geotrichum candidum var. citri−aurantii、Geotrichum klebahnii、Gibberella、Gibberella acuminata、Gibberella avenacea、Gibberella baccata、Gibberella cyanogena、Gibberella fujikuroi、Gibberella fujikuroi var. subglutinans、Gibberella intricans、Gibberella pulicaris、Gibberella stilboides、Gibberella xylarioides、Gibberella zeae、Gibellina cerealis、Gilbertella persicaria、Gjaerumiaceae、Gliocladium vermoeseni、Globodera pallida、Globodera rostochiensis、Globodera tabacum、Gloeocercospora sorghi、Gloeocystidiellum porosum、Gloeophyllum mexicanum、Gloeophyllum trabeum、Gloeoporus dichrous、Gloeosporium cattleyae、Gloeosporium theae−sinensis、Glomerella cingulate、Glomerella glycines、Glomerella graminicola、Glomerella tucumanensis、Gnomonia caryae、Gnomonia comari、Gnomonia dispora、Gnomonia iliau、Gnomonia leptostyla、Gnomonia nerviseda、Gnomonia rubi、Golovinomyces cichoracearum var. latisporus、Granulobasidium vellereum、Graphiola phoenicis、Graphium rigidum、Graphium rubrum、Graphyllium pentamerum、Grovesinia pyramidalis、Guignardia bidwellii f. muscadinii、Guignardia camelliae、Guignardia citricarpa、Guignardia mangiferae、Guignardia musae、Guignardia philoprina、Gummosis、Gymnoconia nitens、Gymnopus dryophilus、Gymnosporangium clavipes、Gymnosporangium sabinae、Gymnosporangium globosum、Gymnosporangium juniperi−virginianae、Gymnosporangium kernianum、Gymnosporangium nelsonii、Gymnosporangium yamadae、Haematonectria haematococca、Hansenula subpelliculosa、Hapalosphaeria deformans、Haplobasidion musae、Haustorium、Helicobasidium compactum、Helicobasidium longisporum、Helicobasidium purpureum、Helicoma muelleri、Helicotylenchus、Helicotylenchus dihystera、Helicotylenchus multicinctus、Helminthosporium cookei、Helminthosporium papulosum、Helminthosporium solani、Helotiales、Hemicriconemoides kanayaensis、Hemicriconemoides mangiferae、Hemicycliophora arenaria、Hemlock woolly adelgid、Hendersonia creberrima、Hendersonia theicola、Hericium coralloides、Heterobasidion annosum、Heterodera、Heterodera amygdali、Heterodera arenaria、Heterodera aucklandica、Heterodera avenae、Heterodera bergeniae、Heterodera bifenestra、Heterodera cacti、Heterodera cajani、Heterodera canadensis、Heterodera cardiolata、Heterodera carotae、Heterodera ciceri、Heterodera cruciferae、Heterodera delvii、Heterodera elachista、Heterodera filipjevi、Heterodera gambiensis、Heterodera goettingiana、Heterodera hordecalis、Heterodera humuli、Heterodera latipons、Heterodera medicaginis、Heterodera oryzae、Heterodera oryzicola、Heterodera rosii、Heterodera sacch
ari、Heterodera schachtii、Heterodera tabacum、Heterodera trifolii、Heteroderidae、Hexagonia hydnoides、Hirschmanniella oryzae、Hoplalaimus galeatus、Hoplolaimidae、Hoplolaimus columbus、Hoplolaimus indicus、Hoplolaimus magnistylus、Hoplolaimus pararobustus、Hoplolaimus seinhorsti、Hoplolaimus uniformis、Huanglongbing、Hyaloperonospora、Hyaloperonospora arabidopsidis、Hyaloperonospora brassicae、Hyaloperonospora parasitica、Hymenula affinis、Hyphodermella corrugata、Hyphodontia aspera、Hyphodontia sambuci、Hypochnus、Hypoxylon tinctor、Idriella lunata、Inonotus arizonicus、Inonotus cuticularis、Inonotus dryophilus、Inonotus hispidus、Inonotus ludovicianus、Inonotus munzii、Inonotus tamaricis、Irenopsis、Irpex destruens、Irpex lacteus、Isariopsis clavispora、Johncouchia mangiferae、Kabatiella caulivora、Kabatiella lini、Karnal bunt、Khuskia oryzae、Kretzschmaria deusta、Kretzschmaria zonata、Kuehneola uredinis、Kutilakesa pironii、Labrella coryli、Laeticorticium roseum、Laetiporus baudonii、Lagenocystis radicicola、Laricifomes officinalis、Lasiodiplodia theobromae、Leandria momordicae、Leifsonia xyli xyli、Lentinus tigrinus、Lenzites betulina、Lenzites elegans、Lepteutypa cupressi、Leptodontidium elatius var. elatius、Leptographium microsporum、Leptosphaeria acuta、Leptosphaeria cannabina、Leptosphaeria coniothyrium、Leptosphaeria libanotis、Leptosphaeria lindquistii、Leptosphaeria maculans、Leptosphaeria musarum、Leptosphaeria pratensis、Leptosphaeria sacchari、Leptosphaeria woroninii、Leptosphaerulina crassiasca、Leptosphaerulina trifolii、Leptothyrium nervisedum、Leptotrochila medicaginis、Leucocytospora leucostoma、Leucostoma auerswaldii、Leucostoma kunzei、Leucostoma persoonii、Leveillula compositarum f. helianthi、Leveillula leguminosarum f. lentis、Leveillula taurica、Ligniera pilorum、Limacinula tenuis、Linochora graminis、Longidorus africanus、Longidorus maximus、Longidorus sylphus、Lopharia crassa、Lophodermium、Lophodermium aucupariae、Lophodermium schweinitzii、Lophodermium seditiosum、Macrophoma mangiferae、Macrophoma theicola、Macrophomina phaseolina、Macrosporium cocos、Magnaporthe、Magnaporthe grisea、Magnaporthe salvinii、Mamianiella coryli、Marasmiellus cocophilus、Marasmiellus inoderma、Marasmiellus scandens、Marasmiellus stenophyllus、Marasmius crinis−equi、Marasmius sacchari、Marasmius semiustus、Marasmius stenophyllus、Marasmius tenuissimus、Massarina walkeri、Mauginiella scaettae、Melampsora、Melampsora lini var. lini、Melampsora medusae、Melampsora occidentalis、Melanconis carthusiana、Melanconium juglandinum、Meliola、Meliola mangiferae、Meliolaceae、Meloidogyne acronea、Meloidogyne arenaria、Meloidogyne artiellia、Meloidogyne brevicauda、Meloidogyne chitwoodi、Meloidogyne enterolobii、Meloidogyne fruglia、Meloidogyne gajuscus、Meloidogyne incognita、Meloidogyne javanica、Meloidogyne naasi、Meloidogyne partityla、Meloidogyne thamesi、Meripilus giganteus、Merlinius brevidens、Meruliopsis ambigua、Mesocriconema xenoplax、Microascus brevicaulis、Microbotryum violaceum、Microdochium bolleyi、Microdochium dimerum、Microdochium panattonianum、Microdochium phragmitis、Microsphaera、Microsphaera coryli、Microsphaera diffusa、Microsphaera ellisii、Microsphaera euphorbiae、Microsphaera hommae、Microsphaera penicillata、Microsphaera penicillata var. vaccinii、Microsphaera vaccinii、Microsphaera verruculosa、Microstroma juglandis、Moesziomyces bullatus、Monilinia azaleae、Monilinia fructicola、Monilinia fructigena、Monilinia laxa、Monilinia mali、Moniliophthora perniciosa、Moniliophthora roreri、Monilochaetes infuscans、Monochaetia coryli、Monochaetia mali、Monographella albescens、Monographella cucumerina、Monographella nivalis var. neglecta、Monographella nivalis var. nivalis、Mononegavirales、Monosporascus cannonballus、Monosporascus eutypoides、Monostichella coryli、Mucor circinelloides、Mucor hiemalis、Mucor hiemalis f. silvaticus、Mucor mucedo、Mucor paronychius、Mucor piriformis、Mucor racemosus、Mycena citricolor、Mycena maculate、Mycocentrospora acerina、Mycoleptodiscus terrestris、Mycosphaerella angulata、Mycosphaerella arachidis、Mycosphaerella areola、Mycosphaerella berkeleyi、Mycosphaerella bolleana、Mycosphaerella brassicicola、Mycosphaerella caricae、Mycosphaerella caryigena、Mycosphaerella cerasella、Mycosphaerella citri、Mycosphaerella coffeicola、Mycosphaerella confusa、Mycosphaerella cruenta、Mycosphaerella dendroides、Mycosphaerella eumusae、Mycosphaerella fragariae、Mycosphaerella gossypina、Mycosphaerella graminicola、Mycosphaerella henningsii、Mycosphaerella horii、Mycosphaerella juglandis、Mycosphaerella lageniformis、Mycosphaerella linicola、Mycosphaerella louisianae、Mycosphaerella musae、Mycosphaerella musicola、Mycosphaerella palmicola、Mycosphaerella pinodes、Mycosphaerella pistaciarum、Mycosphaerella pistacina、Mycosphaerella platanifolia、Mycosphaerella polymorpha、Mycosphaerella pomi、Mycosphaerella punctiformis、Mycosphaerella pyri、Didymella rabiei、Mycosphaerella recutita、Mycosphaerella rosicola、Mycosphaerella rubi、Mycosphaerella stigmina−platani、Mycosphaerella striatiformans、Mycovellosiella concors、Mycovellosiella fulva、Mycovellosiella koepkei、Mycovellosiella vaginae、Myriogenospora aciculispora、Myrothecium roridum、Myrothecium verrucaria、Nacobbus aberrans、Nacobbus dorsalis、Naevala perexigua、Naoh
idemyces vaccinii、Nectria、Nectria cinnabarina、Nectria coccinea、Nectria ditissima、ectria foliicola、Nectria mammoidea var. rubi、Nectria mauritiicola、Nectria peziza、Nectria pseudotrichia、Nectria radicicola、Nectria ramulariae、Nectriella pironii、Nemania diffusa、Nemania serpens var. serpens、Nematospora coryli、Neocosmospora vasinfecta、Neodeightonia phoenicum、Neoerysiphe、Neofabraea malicorticis、Neofabraea perennans、Neofusicoccum mangiferae、Neonectria galligena、Oidiopsis gossypii、Oidium(属)、Oidium arachidis、Oidium caricae−papayae、Oidium indicum、Oidium mangiferae、Oidium manihotis、Oidium tingitaninum、Olpidium brassicae、Omphalia tralucida、Oncobasidium theobromae、Onnia tomentosa、Ophiobolus anguillides、Ophiobolus cannabinus、Ophioirenina、Ophiostoma ulmi、Ophiostoma wageneri、Ovulariopsis papayae、Ovulinia azaleae、Ovulitis azaleae、Oxyporus corticola、Oxyporus latemarginatus、Oxyporus populinus、Oxyporus similis、Ozonium texanum var. parasiticum、Paecilomyces fulvus、Paralongidorus maximus、Paratrichodorus christiei、Paratrichodorus minor、Paratylenchus curvitatus、Paratylenchus elachistus、Paratylenchus hamatus、Paratylenchus macrophallus、Paratylenchus microdorus、Paratylenchus projectus、Paratylenchus tenuicaudatus、Pathovar、Pauahia、Peach latent mosaic viroid、Pectobacterium carotovorum、Peltaster fructicola、Penicillium aurantiogriseum、Penicillium digitatum、Penicillium expansum、Penicillium funiculosum、Penicillium glabrum、Penicillium italicum、Penicillium purpurogenum、Penicillium ulaiense、Peniophora、Peniophora albobadia、Peniophora cinerea、Peniophora quercina、Peniophora sacrata、Perenniporia fraxinea、Perenniporia fraxinophila、Perenniporia medulla−panis、Perenniporia subacida、Periconia circinata、Periconiella cocoes、Peridermium californicum、Peronosclerospora miscanthi、Peronosclerospora sacchari、Peronosclerospora sorghi、Peronospora、Peronospora anemones、Peronospora antirrhini、Peronospora arborescens、Peronospora conglomerata、Peronospora destructor、Peronospora dianthi、Peronospora dianthicola、Peronospora farinosa、Peronospora farinosa f.sp. betae、Peronospora hyoscyami f.sp. tabacina、Peronospora manshurica、Peronospora potentillae、Peronospora sparsa、Peronospora trifoliorum、Peronospora valerianellae、Peronospora viciae、Pestalosphaeria concentrica、Pestalotia longiseta、Pestalotia longisetula、Pestalotia rhododendri、Pestalotiopsis、Pestalotiopsis adusta、Pestalotiopsis arachidis、Pestalotiopsis disseminata、Pestalotiopsis guepini、Pestalotiopsis leprogena、Pestalotiopsis longiseta、Pestalotiopsis mangiferae、Pestalotiopsis palmarum、Pestalotiopsis sydowiana、Pestalotiopsis theae、Pestalotiopsis versicolor、Phacidiopycnis padwickii、Phacidium infestans、Phaeochoropsis mucosa、Phaeocytostroma iliau、Phaeocytostroma sacchari、Phaeoisariopsis bataticola、Phaeolus schweinitzii、Phaeoramularia angolensis、Phaeoramularia dissiliens、Phaeoramularia heterospora、Phaeoramularia manihotis、Phaeoseptoria musae、Phaeosphaerella mangiferae、Phaeosphaerella theae、Phaeosphaeria avenaria f.sp. avenaria、Phaeosphaeria avenaria f.sp. triticae、Phaeosphaeria herpotrichoides、Phaeosphaeria microscopica、Phaeosphaeria nodorum、Phaeosphaeriopsis obtusispora、Phaeotrichoconis crotalariae、Phakopsora gossypii、Phakopsora pachyrhizi、Phanerochaete allantospora、Phanerochaete arizonica、Phanerochaete avellanea、Phanerochaete burtii、Phanerochaete carnosa、Phanerochaete chrysorhizon、Phanerochaete radicata、Phanerochaete salmonicolor、Phanerochaete tuberculata、Phanerochaete velutina、Phellinus ferreus、Phellinus gilvus、Phellinus igniarius、Phellinus pini、Phellinus pomaceus、Phellinus weirii、Phialophora asteris、Phialophora cinerescens、Phialophora gregata、Phialophora tracheiphila、Phloeospora multimaculans、Pholiota variicystis、Phoma、Phoma caricae−papayae、Phoma clematidina、Phoma costaricensis、Phoma cucurbitacearum、Phoma destructiva、Phoma draconis、Phoma eupyrena、Phoma exigua、Phoma exigua var. exigua、Phoma exigua var. foveata、Phoma exigua var. linicola、Phoma glomerata、Phoma glycinicola、Phoma herbarum、Phoma insidiosa、Phoma medicaginis、Phoma microspora、Phoma nebulosa、Phoma oncidii−sphacelati、Phoma pinodella、Phoma scabra、Phoma sclerotioides、Phoma strasseri、Phoma tracheiphila、Phomopsis arnoldiae、Phomopsis asparagi、Phomopsis asparagicola、Phomopsis azadirachtae、Phomopsis cannabina、Phomopsis caricae−papayae、Phomopsis coffeae、Phomopsis elaeagni、Phomopsis ganjae、Phomopsis javanica、Phomopsis lokoyae、Phomopsis mangiferae、Phomopsis obscurans、Phomopsis perseae、Phomopsis prunorum、Phomopsis scabra、Phomopsis sclerotioides、Phomopsis tanakae、Phomopsis theae、Photoassimilate、Phragmidium、Phragmidium mucronatum、Phragmidium rosae−pimpinellifoliae、Phragmidium rubi−idaei、Phragmidium violaceum、Phyllachora cannabis、Phyllachora graminis var. graminis、Phyllachora gratissima、Phyllachora musicola、Phyllachora pomigena、Phyllachora sacchari、Phyllactinia、Phyllactinia angulata、Phyllactinia guttata、Phyllody、Phyllosticta、Phyllosticta alliariaefoliae、Phyllosticta anacardiacearum、Phyllosticta arachidis−hypogaeae、Phyllosticta batatas、Phyllosticta capitalensis、Phyllosticta caricae−papayae、Phyllosticta carpogena、Phyllosticta circumscissa、Phyllosticta coffeicola、Phyllosticta concentrica、Phyllosticta co
ryli、Phyllosticta cucurbitacearum、Phyllosticta cyclaminella、Phyllosticta erratica、Phyllosticta hawaiiensis、Phyllosticta lentisci、Phyllosticta manihotis、Phyllosticta micropuncta、Phyllosticta mortonii、Phyllosticta nicotianae、Phyllosticta palmetto、Phyllosticta penicillariae、Phyllosticta perseae、Phyllosticta platani、Phyllosticta pseudocapsici、Phyllosticta sojaecola、Phyllosticta solitaria、Phyllosticta theae、Phyllosticta theicola、Phymatotrichopsis omnivora、Physalospora abdita、Physalospora disrupta、Physalospora perseae、Physarum cinereum、Physoderma alfalfae、Physoderma leproides、Physoderma trifolii、Physopella ampelopsidis、Phytophthora、Phytophthora alni、Phytophthora boehmeriae、Phytophthora cactorum、Phytophthora cajani、Phytophthora cambivora、Phytophthora capsici、Phytophthora cinnamomi、Phytophthora citricola、Phytophthora citrophthora、Phytophthora cryptogea、Phytophthora drechsleri、Phytophthora erythroseptica、Phytophthora fragariae、Phytophthora fragariae var. rubi、Phytophthora gallica、Phytophthora hibernalis、Phytophthora infestans、Phytophthora inflata、Phytophthora iranica、Phytophthora katsurae、Phytophthora kernoviae、Phytophthora lateralis、Phytophthora medicaginis、Phytophthora megakarya、Phytophthora megasperma、Phytophthora nicotianae、Phytophthora palmivora、Phytophthora phaseoli、Phytophthora plurivora、Phytophthora ramorum、Phytophthora sojae、Phytophthora syringae、Phytophthora tentaculata、Phytoplasma、Pichia membranifaciens、Pichia subpelliculosa、Pileolaria terebinthi、Pilidiella quercicola、Plasmodiophora brassicae、Plasmopara、Plasmopara halstedii、Plasmopara helianthi f. helianthi、Plasmopara lactucae−radicis、Plasmopara nivea、Plasmopara obducens、Plasmopara penniseti、Plasmopara pygmaea、Plasmopara viticola、Platychora ulmi、Plenodomus destruens、Plenodomus meliloti、Pleochaeta、Pleosphaerulina sojicola、Pleospora alfalfae、Pleospora betae、Pleospora herbarum、Pleospora lycopersici、Pleospora tarda、Pleospora theae、Pleurotus dryinus、Podosphaera、Podosphaera clandestina var. clandestine、Podosphaera fusca、Podosphaera leucotricha、Podosphaera macularis、Podosphaera pannosa、Podosphaera tridactyla、Podosphaera tridactyla var. tridactyla、Podosphaera xanthii、Polymyxa graminis、Polyscytalum pustulans、Polystigma fulvum、Poria hypobrunnea、Postia tephroleuca、Potato cyst nematode、Pratylenchus alleni、Pratylenchus brachyurus、Pratylenchus coffeae、Pratylenchus crenatus、Pratylenchus dulscus、Pratylenchus fallax、Pratylenchus flakkensis、Pratylenchus goodeyi、Pratylenchus hexincisus、Pratylenchus loosi、Pratylenchus minutus、Pratylenchus mulchandi、Pratylenchus musicola、Pratylenchus neglectus、Pratylenchus penetrans、Pratylenchus pratensis、Pratylenchus reniformia、Pratylenchus scribneri、Pratylenchus thornei、Pratylenchus vulnus、Pratylenchus zeae、Pseudocercospora、Pseudocercospora arecacearum、Pseudocercospora cannabina、Pseudocercospora fuligena、Pseudocercospora gunnerae、Pseudocercospora kaki、Pseudocercospora mali、Pseudocercospora pandoreae、Pseudocercospora puderi、Pseudocercospora purpurea、Pseudocercospora rhapisicola、Pseudocercospora subsessilis、Pseudocercospora theae、Pseudocercospora vitis、Pseudocercosporella capsellae、Pseudocochliobolus eragrostidis、Pseudoepicoccum cocos、Pseudomonas amygdali、Pseudomonas asplenii、Pseudomonas avellanae、Pseudomonas caricapapayae、Pseudomonas cichorii、Pseudomonas coronafaciens、Pseudomonas corrugate、Pseudomonas ficuserectae、Pseudomonas flavescens、Pseudomonas fuscovaginae、Pseudomonas helianthi、Pseudomonas marginalis、Pseudomonas meliae、Pseudomonas oryzihabitans、Pseudomonas palleroniana、Pseudomonas papaveris、Pseudomonas salomonii、Pseudomonas savastanoi、Pseudomonas syringae、Pseudomonas tomato、Pseudomonas tremae、Pseudomonas turbinellae、Pseudomonas viridiflava、Pseudoperonospora cannabina、Pseudoperonospora cubensis、Pseudoperonospora humuli、Pseudopezicula tetraspora、Pseudopezicula tracheiphila、Pseudopeziza jonesii、Pseudopeziza medicaginis、Pseudopeziza trifolii、Pseudoseptoria donacis、Puccinia、Puccinia angustata、Puccinia arachidis、Puccinia aristidae、Puccinia asparagi、Puccinia cacabata、Puccinia campanulae、Puccinia carthami、Puccinia coronate、Puccinia coronata var. hordei、Puccinia dioicae、Puccinia erianthi、Puccinia extensicola var. hieraciata、Puccinia helianthi、Puccinia hordei、Puccinia jaceae var. solstitialis、Puccinia kuehnii、Puccinia mariae−wilsoniae、Puccinia melanocephala、Puccinia menthae、Puccinia pelargonii−zonalis、Puccinia pittieriana、Puccinia poarum、Puccinia psidii、Puccinia purpurea、Puccinia recondita、Puccinia schedonnardii、Puccinia sessilis、Puccinia striiformis f. sp. hordei、Puccinia striiformis var. striiformis、Puccinia subnitens、Puccinia substriata var. indica、Puccinia verruca、Puccinia xanthii、Pucciniaceae、Pucciniastrum、Pucciniastrum americanum、Pucciniastrum arcticum、Pucciniastrum coryli、Pucciniastrum epilobii、Pucciniastrum hydrangeae、Punctodera chalcoensis、Pycnoporus cinnabarinus、Pycnoporus sanguineus、Pycnostysanus azaleae、Pyrenochaeta lycopersici、Pyrenochaeta terrestris、Pyrenopeziza brassicae、Pyrenophora、Pyrenophora avenae、Pyrenophora chaetomioides、Pyrenophora graminea、Pyrenophora seminiperda、Pyrenophora teres、Pyrenophora teres f. maculata、Pyrenophora teres f. teres、Pyre
nophora tritici−repentis、Pythiaceae、Pythiales、Pythium、Pythium acanthicum、Pythium aphanidermatum、Pythium aristosporum、Pythium arrhenomanes、Pythium buismaniae、Pythium debaryanum、Pythium deliense、Pythium dissotocum、Pythium graminicola、Pythium heterothallicum、Pythium hypogynum、Pythium irregulare、Pythium iwayamae、Pythium mastophorum、Pythium middletonii、Pythium myriotylum、Pythium okanoganense、Pythium paddicum、Pythium paroecandrum、Pythium perniciosum、Pythium rostratum、Pythium scleroteichum、Pythium spinosum、Pythium splendens、Pythium sulcatum、Pythium sylvaticum、Pythium tardicrescens、Pythium tracheiphilum、Pythium ultimum、Pythium ultimum var. ultimum、Pythium vexans、Pythium violae、Pythium volutum、Quinisulcius acutus、Quinisulcius capitatus、Radopholous similis、Radopholus similis、Ralstonia solanacearum、Ramichloridium musae、Ramularia、Ramularia beticola、Ramularia brunnea、Ramularia coryli、Ramularia cyclaminicola、Ramularia macrospora、Ramularia menthicola、Ramularia necator、Ramularia primulae、Ramularia spinaciae、Ramularia subtilis、Ramularia tenella、Ramulispora sorghi、Ramulispora sorghicola、Resinicium bicolor、Rhabdocline pseudotsugae、Rhabdocline weirii Rhabdoviridae、Rhinocladium corticola、Rhizoctonia、Rhizoctonia leguminicola、Rhizoctonia rubi、Rhizoctonia solani、Rhizomorpha subcorticalis、Rhizophydium graminis、Rhizopus arrhizus、Rhizopus circinans、Rhizopus microsporus var. microspores、Rhizopus oryzae、Rhodococcus fascians、Rhynchosporium、Rhynchosporium secalis、Rhytidhysteron rufulum、Rhytisma acerinum、Rhytisma vitis、Rigidoporus lineatus、Rigidoporus microporus、Rigidoporus ulmarius、Rigidoporus vinctus、Rosellinia arcuata、Rosellinia bunodes、Rosellinia necatrix、Rosellinia pepo、Rosellinia subiculata、Rotylenchulus、Rotylenchulus parvus、Rotylenchulus reniformis、Rotylenchus brachyurus、Rotylenchus robustus、Saccharicola taiwanensis、Saccharomyces florentinus、Saccharomyces kluyveri、Sarocladium oryzae、Sawadaea、Sawadaea tulasnei、Schiffnerula cannabis、Schizoparme straminea、Schizophyllum commune、Schizopora flavipora、Schizothyrium pomi、Scleroderris canker、Sclerophthora macrospora、Sclerophthora rayssiae、Sclerospora graminicola、Sclerospora mischanthi、Sclerotinia borealis、Sclerotinia minor、Sclerotinia ricini、Sclerotinia sclerotiorum、Sclerotinia spermophila、Sclerotinia trifoliorum、Sclerotium、Sclerotium cinnamomi、Sclerotium delphinii、Scutellonema brachyurum、Scutellonema cavenessi、Scytinostroma galactinum、Seimatosporium mariae、Seimatosporium rhododendri、Selenophoma linicola、Septobasidium、Septobasidium bogoriense、Septobasidium pilosum、Septobasidium pseudopedicellatum、Septobasidium theae、Septocyta ruborum、Septogloeum potentillae、Septoria、Septoria aciculosa、Septoria ampelina、Septoria azalea、Septoria bataticola、Septoria campanulae、Septoria cannabis、Septoria caryae、Septoria citri、Septoria cucurbitacearum、Septoria darrowii、Septoria dianthi、Septoria eumusae、Septoria fragariae、Septoria fragariaecola、Septoria glycines、Septoria helianthi、Septoria humuli、Septoria hydrangeae、Septoria lactucae、Septoria liquidambaris、Septoria lycopersici、Septoria lycopersici var. malagutii、Septoria menthae、Septoria ostryae、Septoria passerinii、Septoria pisi、Septoria pistaciae、Septoria platanifolia、Septoria rhododendri、Septoria secalis、Septoria selenophomoides、Setosphaeria rostrata、Setosphaeria turcica、Sirosporium diffusum、Sparassis、Sphaceloma、Sphaceloma arachidis、Sphaceloma coryli、Sphaceloma menthae、Sphaceloma perseae、Sphaceloma poinsettiae、Sphaceloma pyrinum、Sphaceloma randii、Sphaceloma sacchari、Sphaceloma theae、Sphacelotheca reiliana、Sphaerella platanifolia、Sphaeropsis tumefaciens、Sphaerotheca、Sphaerotheca castagnei、Sphaerotheca fuliginea、Sphaerulina oryzina、Sphaerulina rehmiana、Sphaerulina rubi、Sphenospora kevorkianii、Spiniger meineckellus、Spiroplasma、Spongipellis unicolor、Sporisorium cruentum、Sporisorium ehrenbergi、Sporisorium scitamineum、Sporisorium sorghi、Sporonema phacidioides、Stagonospora avenae f.sp. triticae、Stagonospora meliloti、Stagonospora recedens、Stagonospora sacchari、Stagonospora tainanensis、Steccherinum ochraceum、Stegocintractia junci、Stegophora ulmea、Stemphylium alfalfa、Stemphylium bolickii、Stemphylium cannabinum、Stemphylium globuliferum、Stemphylium lycopersici、Stemphylium sarciniforme、Stemphylium solani、Stemphylium vesicarium、Stenella anthuriicola、Stereum、Stereum hirsutum、Stereum rameale、Stereum sanguinolentum、Stigmatomycosis、Stigmella platani−racemosae、Stigmina carpophila、Stigmina liquidambaris、Stigmina palmivora、Stigmina platani、Stigmina platani−racemosae、Subanguina radicicola、Subanguina wevelli、Sydowia polyspora、Sydowiella depressula、Sydowiellaceae、Synchytrium endobioticum、Synchytrium fragariae、Synchytrium liquidambaris、Taiwanofungus camphoratus、Tapesia acuformis、Tapesia yallundae、Taphrina aurea、Taphrina bullata、Taphrina caerulescens、Taphrina coryli、Taphrina deformans、Taphrina entomospora、Taphrina johansonii、Taphrina potentillae、Taphrina ulmi、Taphrina wiesneri、Thanatephorus cucumeris、Thielaviopsis、Thielaviopsis basicola、Thyrostroma compactum、Tilletia barclayana、Tilletia caries、Tilletia controversa、Tilletia laevis、Tilletia tritici、Tilletia walkeri、Tilletiariaceae、Tobacco necrosis virus、To
gniniaceae、Trachysphaera fructigena、Trametes gibbosa、Trametes hirsute、Trametes nivosa、Trametes pubescens、Tranzschelia discolor f.sp. persica、Tranzschelia pruni−spinosae var. discolor、Trichaptum biforme、Trichoderma harzianum、Trichoderma koningii、Trichoderma viride、Trichothecium roseum、Tripospermum acerinum、Truncatella、Truncatella laurocerasi、Tubercularia lateritia、Tubercularia ulmea、Tubeufia pezizula、Tunstallia aculeata、Tylenchorhynchus、Tylenchorhynchus brevilineatus、Tylenchorhynchus claytoni、Tylenchorhynchus dubius、Tylenchorhynchus maximus、Tylenchorhynchus nudus、Tylenchorhynchus phaseoli、Tylenchorhynchus vulgaris、Tylenchorhynchus zeae、Tylenchulus semipenetrans、Typhula idahoensis、Typhula incarnate、Typhula ishikariensis、Typhula ishikariensis var. canadensis、Typhula variabilis、Typhulochaeta、Tyromyces calkinsii、Tyromyces chioneus、Tyromyces galactinus、Ulocladium atrum、Ulocladium consortiale、Uncinula、Uncinula macrospora、Uncinula necator、Uredo behnickiana、Uredo kriegeriana、Uredo musae、Uredo nigropuncta、Uredo rangelii、Urocystis、Urocystis agropyri、Urocystis brassicae、Urocystis occulta、Uromyces、Uromyces apiosporus、Uromyces beticola、Uromyces ciceris−arietini、Uromyces dianthi、Uromyces euphorbiae、Uromyces graminis、Uromyces inconspicuus、Uromyces lineolatus subsp. nearcticus、Uromyces medicaginis、Uromyces musae、Uromyces oblongus、Uromyces pisi−sativi、Uromyces proeminens var. poinsettiae、Uromyces trifolii−repentis var. fallens、Uromyces viciae−fabae var. viciae−fabae、Urophlyctis leproides、Urophlyctis trifolii、Urophora cardui、Ustilaginales、Ustilaginoidea virens、Ustilaginomycetes、Ustilago、Ustilago avenae、Ustilago hordei、Ustilago maydis、Ustilago nigra、Ustilago nuda、Ustilago scitaminea、Ustilago tritici、Valsa abietis、Valsa ambiens、Valsa auerswaldii、Valsa ceratosperma、Valsa kunzei、Valsa nivea、Valsa sordida、Valsaria insitiva、Venturia carpophila、Venturia inaequalis、Venturia pirina、Venturia pyrina、Veronaea musae、Verticillium、Verticillium albo−atrum、Verticillium albo−atrum var. menthae、Verticillium dahliae、Verticillium longisporum、Verticillium theobromae、Villosiclava virens、Virescence、Waitea circinata、Wuestneiopsis Georgiana、Xanthomonas ampelina、Xanthomonas axonopodis、Xanthomonas campestris、Xanthomonas campestris pv. campestris、Xanthomonas oryzae、Xeromphalina fraxinophila、Xiphinema americanum、Xiphinema bakeri、Xiphinema brevicolle、Xiphinema diversicaudatum、Xiphinema insigne、Xiphinema rivesi、Xiphinema vuittenezi、Xylaria mali、Xylaria polymorpha、Xylella fastidiosa、Xylophilus、Xylophilus ampelinus、Zopfia rhizophila、Zygosaccharomyces bailii、および、Zygosaccharomyces florentinus、が挙げられる。
昆虫および蠕虫の病原体としては、Acalymma、Acyrthosiphon pisum、African armyworm、アフリカ蜂化ミツバチ、Agromyzidae、Agrotis munda、Agrotis porphyricollis、Aleurocanthus woglumi、Aleyrodes proletella、Alphitobius diaperinus、Altica chalybea、Anasa tristis、Anguina tritici、Anisoplia austriaca、Anthonomus pomorum、Anthonomus signatus、Aonidiella aurantii、Apamea apamiformis、Apamea niveivenosa、Aphelenchoides spp.、アブラムシ、Aphis gossypii、apple maggot、アルゼンチンアリ、army cutworm、Arotrophora arcuatalis、Asterolecanium coffeae、Athous haemorrhoidalis、Aulacophora、Australian plague locust、Bactericera cockerelli、Bactrocera、Bactrocera correcta、Bagrada hilaris、banded hickory borer、ビートアワヨトウ、Belonolaimus spp.、black bean aphid、Blepharidopterus chlorionis、Bogong moth、ワタミハナゾウムシ、Bradysia similigibbosa、Brassica pod midge、Brevicoryne brassicae、brown locust、クサギカメムシ、brown planthopper、Bursephelenchus spp.、コナガ、アオムシ、Callosobruchus maculatus、cane beetle、carrot fly、ムギシストセンチュウ、Cecidomyiidae、Ceratitis capitata、Ceratitis rosa、cereal leaf beetle、Chlorops pumilionis、citrus long−horned beetle、Coccus viridis、コドリンガ、コーヒーノミキクイムシ、コロラドハムシ、ヒラタコクヌストモドキ、crambus、cucumber beetle、Curculio nucum、Curculio occidentis、ヨトウムシ、Cyclocephala borealis、dark sword−grass、date stone beetle、Delia spp.、Delia antiqua、Delia floralis、Delia radicum、サバクバッタ、Diabrotica、Diabrotica balteata、Diabrotica speciosa、コナガ、Diaphania indica、Diaphania nitidalis、Diaphorina citri、Diaprepes abbreviatus、Diatraea saccharalis、differential grasshopper、Ditylenchus spp.、Dociostaurus maroccanus、Drosophila suzukii、Dryocosmus kuriphilus、Earias perhuegeli、Epicauta vittata、Epilachna varivestis、Erionota thrax、Eriosomatinae、Euleia heraclei、Eumetopina flavipes、Eupoecilia ambiguella、European corn borer、Eurydema oleracea、Eurygaster integriceps、forest bug、Frankliniella tritici、Galleria mellonella、garden dart、glassy−winged sharpshooter、温室シロバエ、Gryllotalpa orientalis、Gryllus pennsylvanicus、マイマイガ、Helicoverpa armigera、Helicoverpa gelotopoeon、Helicoverpa punctigera、Helicoverpa zea、Heliothis virescens、Henosepilachna vigintioctopunctata、Hessian fly、Heterodera spp.、Jacobiasca formosana、マメコガネ、ヒメアカカツオブシムシ、Lampides boeticus、潜葉性昆虫、Lepidiota consobrina、Lepidosaphes beckii、Lepidosaphes ulmi、Leptoglossus zonatus、Leptopterna dolabrata、lesser wax moth、Leucoptera(ガ)、Leucoptera caffeina、light brown apple moth、Lissorhoptrus oryzophilus、オナガセセリ、Lygus、Lygus hesperus、Maconellicoccus hirsutus、Macrodactylus subspinosus、Macrosiphum euphorbiae、コクゾウ、Manduca sexta、Mayetiola hordei、コナカイガラムシ、Meloidogyne spp.、Megacopta cribraria、Metcalfa pruinosa、ガ、leek moth、Myzus persicae、Naccobus spp.、Nezara viridula、oak processionary、olive fruit fly、Ophiomyia simplex、Opisina arenosella、Opomyza、Opomyza florum、Opomyzidae、Oscinella frit、Ostrinia furnacalis、Oxycarenus hyalinipennis、papaya mealy bug、Papilio demodocus、Paratachardina pseudolobata、Pentatomoidea、Phthorimaea operculella、Phyllophaga、Phylloxera、Phylloxeridae、Phylloxeroidea、Pieris brassicae、ワタアカミムシ、Planococcus citri、Platynota idaeusalis、Plum curculio、Pratylenchus spp.、Prionus californicus、Pseudococcus viburni、Pyralis farinalis、red imported fire ant、red locust、ネグサレセンチュウ、ネコブセンチュウ、Radopholus spp.、Rotylenchulus spp.、Rhagoletis cerasi、Rhagoletis indifferens、Rhagoletis mendax、Rhopalosiphum maidis、Rhyacionia frustrana、Rhynchophorus ferrugineus、Rhynchophorus palmarum、Rhyzopertha、ガイマイツヅリガ、rice stink bug、Russian wheat aphid、San Jose scale、カイガラムシ、Schistocerca americana、Sciaridae、Scirtothrips dorsalis、Scutelleridae、Scutiphora pedicellata、seed gall nematodes、serpentine leaf miner、シルバーリーフコナジラミ、Sipha flava、small hive beetle、Southwestern corn borer、soybean aphid、Spodoptera cilium、Spodoptera litura、spotted cucumber beetle、squash vine borer、stem Nematodes、Stenotus binotatus、Strauzia longipennis、キスジノミハムシ、sunn pest、sweetpotato bug、サビイロメクラガメ、アザミウマ、Thrips angusticeps、Thrips palmi、Toxoptera citricida、Trichodorus spp.、Trioza erytreae、カブラヤガ、Tuta absoluta、Tylenchulus spp.、ヒメマルカツオブシムシ、Virachola isocrates、waxworm、Western corn rootworm、ミカンキイロアザミウマ、wheat fly、wheat weevil、コナジラミ、winter moth、および、Xiphenema sppが挙げられる。
たとえば、昆虫または蠕虫病原体は、ヨトウムシ(army worm)、タマナヤガ、European corn borer、ツマジロクサヨトウ、ヨトウムシ(cutworm)、マメコガネ、lesser cornstalk borer、maize billbug、seed corn maggot、webworm、southern cornstalk borer、southern corn rootworm、southern potato wireworm、stalk borer、sugarcane beetle、コガネムシの幼虫、cabbage looper、ワタミハナゾウムシ、yellow striped armyworm、cereal leaf beetle、ヒメコガネナガカメムシ、アブラムシ、ビートアワヨトウ、インゲンテントウ、soybean looper、soybean stem borer、またはそれらの組み合わせであっても良い。
植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質およびペプチド
本発明はまた、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片、および、植物におけるストレス耐性を増強させる少なくとも1つのタンパク質またはペプチドを含有する融合タンパク質に関するものである。
たとえば、植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドは、ストレス関連化合物を分解させる酵素を含有する。ストレス関連化合物としては、限定されないが、アミノシクロプロパン−1−カルボン酸(ACC)、活性酸素種、一酸化窒素、オキシリピン、フェノール類が挙げられる。具体的な活性酸素種としては、ヒドロキシル、過酸化水素、酸素およびスーパーオキシドが挙げられる。ストレス関連化合物を分解する酵素は、スーパーオキシドジスムターゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ、アミノシクロプロパン−1−カルボン酸デアミナーゼ、ペルオキシダーゼ、抗酸化酵素、または、抗酸化ペプチドを含有しても良い。
植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドはまた、環境ストレスから植物を防御するタンパク質またはペプチドを含有しても良い。環境ストレスは、たとえば、干ばつ、洪水、高温、凍結、塩、重金属、低pH、高pH、またはそれらの組み合わせが挙げられる。たとえば、環境ストレスから植物を防御するタンパク質またはペプチドは、氷核形成タンパク質、プロリナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、イソコリスミ酸シンターゼ、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ、またはコリン脱水素酵素が挙げられる。
植物結合タンパク質およびペプチド
本発明はまた、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質、および、少なくとも植物結合タンパク質またはペプチドを含有する融合タンパク質に関するものである。植物結合タンパク質またはペプチドは、植物の任意の部分(たとえば、植物の根、または、たとえば葉、幹、花または実等の空中部分)または植物物質に特異的に、または非特異的に結合することができる任意のタンパク質またはペプチドであっても良い。ゆえに、たとえば、植物結合タンパク質またはペプチドは、根結合タンパク質もしくはペプチド、または、葉結合タンパク質もしくはペプチドであっても良い。
適切な植物結合タンパク質およびペプチドとしては、アドヘシン(たとえば、リカドヘシン(rhicadhesin))、フラジェリン、オムプチン(omptin)、レクチン、エクスパンシン、バイオフィルム構造タンパク質(たとえば、TasAまたはYuaB)、線毛タンパク質、カーラス(curlus)タンパク質、インチミン(intimin)、インベーシン、アグルチニン、および、非線毛(afimbrial)タンパク質が挙げられる。
他の融合タンパク質
本発明はさらに、少なくとも1つの対象のタンパク質またはペプチド、および、配列番号71、75、80、81、82、83、および84のいずれか1つと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質を含有するエキソスポリウムタンパク質、を含有する融合タンパク質に関するものである。あるいは、当該エキソスポリウムタンパク質は、配列番号71、75、80、81、82、83、および84のいずれか1つと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の同一性を有するアミノ酸配列を含有しても良い。
対象のタンパク質またはペプチドは、任意のタンパク質またはペプチドを含有しても良い。たとえば、対象のタンパク質またはペプチドは、本明細書に記述される任意のタンパク質またはペプチドを含有しても良い。たとえば、対象のタンパク質またはペプチドは、本明細書に記述される任意の植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、本明細書に記述される病原体から植物を防御する任意のタンパク質もしくはペプチド、本明細書に記述される植物におけるストレス耐性を増強させる任意のタンパク質もしくはペプチド、または、本明細書に記述される任意の植物結合タンパク質もしくはペプチド、を含有しても良い。
ゆえに、対象のタンパク質またはペプチドが、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを含有する場合、当該植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、ペプチドホルモン、非ホルモン性ペプチド、または、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有しても良い。あるいは、植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、以下に記述される細菌、真菌、または植物の栄養源を分解または改変する任意の酵素を含有しても良い。
融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバー
本発明はまた、融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーに関するものである。当該融合タンパク質は、上述の任意の融合タンパク質であっても良い。
組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、上述の任意の融合タンパク質を2つ以上、共発現しても良い。たとえば、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、植物結合タンパク質またはペプチドを含有する少なくとも1つの融合タンパク質を、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを含有する少なくとも1つの融合タンパク質、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを含有する少なくとも1つの融合タンパク質、または、植物におけるストレス耐性を増強させる少なくとも1つのタンパク質またはペプチドと共に、共発現しても良い。
組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Bacillus mycoides、Bacillus pseudomycoides、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、Bacillus weihenstephensis、またはそれらの組み合わせを含有してもよい。たとえば、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Bacillus pseudomycoides、または、Bacillus mycoidesを含有しても良い。特に、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、Bacillus thuringiensis、または、Bacillus mycoidesを含有しても良い。
融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを作製するために、任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、当分野公知の標準的な方法を用いて(たとえば、エレクトロポレーションにより)、融合タンパク質をコードするベクターと結合、形質導入、または形質転換しても良い。次いで、細菌をスクリーニングし、任意の当分野公知の方法により形質転換体を特定しても良い。たとえば、ベクターが抗生物質耐性遺伝子を含有する場合、当該細菌は、抗生物質耐性に対してスクリーニングされても良い。あるいは、融合タンパク質をコードするDNAを、B.cereusファミリーのメンバーの宿主の染色体DNAに組み込んでも良い。組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、次いで、芽胞形成が誘導される条件下に曝しても良い。芽胞形成誘導の適切な条件は当分野に公知である。たとえば、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、寒天プレート上に置き、数日間(たとえば、3日間)、約30℃の温度でインキュベートしても良い。
上述の任意の種の不活性株、非毒性株、または遺伝子操作株が、適切に使用されても良い。たとえば、Cry毒素を欠いたBacillus thuringiensisを用いても良い。あるいは、またはさらに、融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーの芽胞が作製された時点で、使用されてさらに発芽することを防ぐために不活化されても良い。当分野公知の、細菌性芽胞を不活化する任意の方法を用いても良い。適切な方法としては、限定されないが、加熱処置、ガンマ線照射、x線照射、UV−A照射、UV−B照射、化学処置(たとえば、グルタルアルデヒド(gluteraldehyde)、ホルムアルデヒド、過酸化水素、酢酸、漂白、または任意のそれらの組み合わせを用いた処置)、またはそれらの組み合わせが挙げられる。あるいは、毒素産生株、または、遺伝的に不活化された、もしくは物理的に不活化された株由来の芽胞を用いても良い。
植物生育刺激効果、および/または、他の有益か特性を有する組換えBacillus cereusファミリーのメンバー
多くのBacillus cereusファミリーのメンバーの株が、固有の有益な特性を有している。たとえば、一部の株は、植物生育刺激効果を有している。本明細書に記述される任意の融合タンパク質を、そのような株で発現しても良い。
たとえば、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、植物生育刺激細菌株を含有しても良い。
植物生育刺激細菌株は、殺虫性毒素(たとえば、Cry毒素)を産生、殺真菌性化合物(たとえば、β−1,3−グルカナーゼ、キトシナーゼ、リチカーゼ、またはそれらの組み合わせ)を産生、殺線虫性化合物(たとえば、Cry毒素)を産生、殺菌性化合物を産生する、1以上の抗生物質に対して抵抗性である、1以上の遊離複製プラスミドを含有する、植物の根に結合する、植物の根にコロニー形成する、バイオフィルムを形成する、栄養素を可溶化する、有機酸を分泌する、または、それらの任意の組み合わせである細菌株を含有しても良い。
たとえば、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーが、植物生育刺激細菌株を含有する場合、当該植物生育刺激細菌株は、Bacillus mycoides BT155(NRRL No.B−50921)、Bacillus mycoides EE118(NRRL No.B−50918)、Bacillus mycoides EE141(NRRL No.B−50916)、Bacillus mycoides BT46−3(NRRL No.B−50922)、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE128(NRRL No.B−50917)、Bacillus thuringiensis BT013A(NRRL No.B−50924)、または、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE349(NRRL No.B−50928)を含有しても良い。これら株の各々は、2014年3月10日にUnited States Department of Agriculture(USDA) Agricultural Research Service(ARS)(住所は、1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 U.S.A.)に寄託されており、および、カッコ内に示されるNRRL寄託番号により特定される。
これら植物生育刺激株は、様々な活力のある植物の根圏から単離され、および、16S rRNAの配列(本明細書において、配列番号104〜110に提示)および生化学アッセイを介して特定された。当該株は、標準的な生化学的指標および形態学的指標により、少なくともその属指定に対して特定された。たとえばBacillus等のグラム陽性株確定のための生化学的アッセイとしては、たとえば、PEA培地および普通寒天上での増殖、顕微鏡観察、5%および7.5%NaCl培地での増殖、pH5およびpH9での増殖、42℃および50℃での増殖、セロビオース、ラクトース、グリセロール、グルコース、スクロース、d−マンニトールおよびデンプンを用いた発酵で酸を産生する能力;蛍光色素の産生;ゼラチンの加水分解;硝酸塩還元;カタラーゼ産生、デンプン加水分解;オキシダーゼ反応、ウレアーゼ産生ならびに運動性が挙げられる。これら株の特定および、植物生育刺激効果の証明に関しては、以下の実施例に詳述する。
たとえば、植物生育刺激細菌株を含有する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、Bacillus mycoides BT155、Bacillus mycoides EE141、または、Bacillus thuringiensis BT013Aを含有しても良い。組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、本明細書に記述される任意の融合タンパク質(たとえば、配列番号60の標的化配列および、非ホルモン性ペプチド(たとえば、kunitzトリプシンインヒビター(KTI))、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素(たとえば、キトシナーゼ)、植物結合タンパク質もしくはペプチド(たとえば、TasA);病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド(たとえば、TasA)、または、細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素(たとえば、PhoAまたはフィターゼ等のホスファターゼ、またはエンドグルカナーゼ)を含有する融合タンパク質)を発現しても良い。
プロモーター
本明細書に記述される任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて、融合タンパク質は、融合タンパク質の標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウム断片に固有のプロモーターの制御下で発現されても良い。たとえば、融合タンパク質が、B.anthracis sterne BclA由来の標的化配列(たとえば、配列番号1のアミノ酸20〜35、配列番号1のアミノ酸1〜35、配列番号1または配列番号60)を含有する場合、または、融合タンパク質が、全長BclA(配列番号2)または全長BclAの断片(配列番号59)を含有する場合、当該融合タンパク質は、B.anthracis sterneのゲノムにおいて、BclA遺伝子と通常関連するプロモーター(たとえば、配列番号85のプロモーター)の制御下で発現されても良い。
あるいは、融合タンパク質は、高発現型胞子形成プロモーターの制御下で発現されても良い。一部の例において、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片に固有のプロモーターは、高発現型胞子形成プロモーターである。他の例において、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片に固有のプロモーターは、高発現型胞子形成プロモーターではない。後者の場合において、高発現型胞子形成プロモーターと、天然型プロモーターを置き換えることが有益であり得る。高発現型胞子形成プロモーターの制御下での融合タンパク質の発現により、Bacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムタンパク質上での当該融合タンパク質の発現増加がもたらされる。
高発現型胞子形成プロモーターは、1以上のシグマ−K胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列を含有しても良い。
Bacillus cereusファミリーのメンバーにおける融合タンパク質の発現に適切な高発現型胞子形成プロモーターとしては、以下の表2のものが挙げられる:
Figure 2016520525

Figure 2016520525

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上述の表2のプロモーター配列において、シグマ−K胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列の位置は、太字および下線文字で示されている。Cry1Aプロモーター(B. thuringiensis HD−73;配列番号90)は、総合で4つのシグマ−K配列(そのうちの2つは互いに重複しており、表2において二重下線で示されている)を有している。
Bacillus cereusファミリーのメンバーでの融合タンパク質の発現における使用に好ましい高発現型胞子形成プロモーターとしては、BetAプロモーター(B.anthracis Sterne;配列番号86)、BclAプロモーター(B.anthracis Sterne;配列番号85)、BclAクラスターグリコシルトランスフェラーゼオペロン1および2プロモーター(B.anthracis Sterne;配列番号:101および102)、および、YVTN βプロペラタンパク質プロモーター(B.weihenstephensis KBAB 4;配列番号89)が挙げられる。
本明細書に記述される任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて、融合タンパク質は、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する核酸配列を含有する芽胞形成プロモーターの制御下で発現されても良い。
芽胞形成プロモーターが配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含有する場合、シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーターの配列(複数含む)は、好ましくは、配列番号85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、または、103の対応するヌクレオチドと100%の同一性を有する。たとえば、上述の表2に示されているように、B.anthracis sterneのBclAプロモーター(配列番号85)は、24〜32、35〜43、および129〜137のヌクレオチドで、シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列を有する。ゆえに、もし芽胞形成プロモーターが、配列番号85の核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含有する場合、配列番号85の24〜32、35〜43、および129〜137のヌクレオチドに相当する芽胞形成プロモーターのヌクレオチドは、配列番号85の24〜32、35〜43、および129〜137のヌクレオチドと100%の同一性を有することが好ましい。
製剤
本発明はまた、前述の項で検討された任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーおよび農学的に受容可能な担体を含有する製剤に関する。
農学的に受容可能な担体は、農学的使用に適した任意の担体であっても良い。たとえば、適切な農学的に受容可能な担体としては、限定されないが、分散剤、界面活性剤、添加剤、水、増粘剤、凝固防止剤、残基分解物、たい肥化剤、粒状塗布物、珪藻土、油、着色剤、安定化剤、防腐剤、ポリマー類、コーティング、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
添加剤は、油、ゴム、樹脂、粘土、ポリオキシエチレングリコール、テルペン、粘着性有機物、脂肪酸エステル、硫酸化アルコール、スルホン酸アルキル、硫酸化石油、アルコール硫酸、ナトリウムアルキルブタンジアメート(sodium alkyl butane diamate)、ナトリウムチオブタンジオエートのポリエステル、ベンゼンアセトニトリル誘導体、タンパク質性物質(たとえば、乳製品、小麦粉、大豆ミール、血液、アルブミン、ゼラチン、またはそれらの組み合わせ)、または、それらの組み合わせを含有しても良い。
増粘剤は、ポリエチレングリコールの長鎖スルホン酸アルキル、オレイン酸ポリオキシエチレン、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
界面活性剤は、重油、重油蒸留物、ポリオール脂肪酸エステル、ポリエトキシル化脂肪酸エステル、アリールアルキルポリオキシエチレングリコール、アルキル酢酸アミン、アルキルスルホン酸アリール、多価アルコール、リン酸アルキル、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
凝固防止剤は、ナトリウム塩、炭酸カルシウム、珪藻土、またはそれらの組み合わせを含有する。たとえば、ナトリウム塩は、モノメチルスルホン酸ナフタレンのナトリウム塩、ジメチルスルホン酸ナフタレンのナトリウム塩、亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
適切な農学的に受容可能な担体としては、バーミキュライト、木炭、製糖工場の炭酸化プレス泥、もみ殻、カルボキシメチルセルロース、泥炭、パーライト、細砂、炭酸カルシウム、粉末、ミョウバン、デンプン、滑石、ポリビニルピロリドン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
製剤は、植物もしくは植物生育環境への適用のために、種子被覆製剤、液体製剤、または、植物もしくは植物生育環境への適用のために固形製剤を含有しても良い。
たとえば、種子被覆製剤は、種子への適用のために、水性または油性の溶液を含有しても良い。あるいは、種子被覆製剤は、種子への適用のために、粉末または顆粒の製剤を含有しても良い。
植物または植物生育環境への適用のための液体製剤は、濃縮製剤または、すぐに使える(ready−to−use)製剤を含有しても良い。
植物または植物生育環境への適用のための固形製剤は、顆粒剤または粉末剤を含有しても良い。
また、任意の上述の製剤は、たとえば、肥料、微量栄養素肥料物質、殺虫剤、除草剤、植物生育改善物質、防かび剤、殺虫剤、軟体動物駆除剤、殺藻剤、細菌接種剤、真菌接種剤、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
肥料は、液体肥料を含有しても良い。
肥料は、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、重硫酸アンモニウム、ポリ硫化アンモニウム、チオ硫化アンモニウム、アンモニア水、無水アンモニア、ポリリン酸アンモニウム、硫酸アルミニウム、硝酸カルシウム、カルシウム硝酸アンモニウム、硫酸カルシウム、か焼マグネサイト、方解石質石灰岩、酸化カルシウム、硝酸カルシウム、ドロマイト質石灰石、消石灰、炭酸カルシウム、リン酸2アンモニウム、リン酸1アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸カリウム、塩化カリウム、硫酸カリウムマグネシウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム、苦灰質石灰岩、マグネシア、尿素、尿素−ホルムアルデヒド、尿素硝酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、ポリマー被覆尿素、イソブチリデンジウレア、KSO−2MgSO、カイナイト、シルビナイト、キーゼル石、Epsom塩、元素状硫黄、泥灰土、粉末牡蠣、魚粉、油かす、魚肥料、血粉、リン鉱石、過リン酸肥料、スラグ、骨粉、木灰、肥料、バットグアノ、ピートモス、堆肥、生砂、綿実粉、羽毛粉、蟹粉、魚乳濁液、フミン酸、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
微量栄養素肥料物質は、ホウ酸、ホウ酸塩、ホウ素フリット、硫酸銅、銅フリット、銅キレート、四ホウ酸ナトリウム十水和物、硫酸鉄、酸化鉄、硫酸鉄アンモニウム、鉄フリット、鉄キレート、硫酸マンガン、酸化マンガン、マンガンキレート、塩化マンガン、マンガンフリット、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸、硫酸亜鉛、酸化亜鉛、炭酸亜鉛、亜鉛フリット、リン酸亜鉛、亜鉛キレート、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
殺虫剤は、有機リン酸塩、カルバミン酸塩、ピレスロイド、ダニ駆除剤、フタル酸アルキル、ホウ酸、ホウ酸塩、フッ化物、硫黄、ハロ芳香族置換尿素、炭化水素エステル、生物ベースの殺虫剤、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
除草剤は、クロロフェノキシ化合物、ニトロフェノール化合物、ニトロクレゾール化合物、ジピリジル化合物、アセトアミド、脂肪酸、アニリド、ベンズアミド、安息香酸、安息香酸誘導体、アニス酸、アニス酸誘導体、ベンゾニトリル、ベンゾチアジアジノン二酸化物、チオカルバミド酸塩、カルバミン酸塩、カルバニレート、クロロピリジニル、シクロヘキセノン誘導体、ジニトロアミノベンゼン誘導体、フルオロジニトロトルイジン化合物、イソキサゾリジノン、ニコチン酸、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン誘導体、オキサジアゾリノン、リン酸塩、フタル酸塩、ピコリン酸化合物、トリアジン、トリアゾール、ウラシル、尿素誘導体、エンドサル、塩素酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
防かび剤は、置換ベンゼン、チオカルバマート、エチレンビスジチオカルバマート、チオフタリドアミド、銅化合物、有機水銀化合物、有機スズ化合物、カドミウム化合物、アニラジン、ベノミル、シクロへキサミド、ドジン(dodine)、エトリジアゾール、イプロジオン、メトラキシル(metlaxyl)、チアミメホン(thiamimefon)、トリホリン、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
真菌接種剤は、Glomeraceae科の真菌接種剤、Claroidoglomeraceae科の真菌接種剤、Gigasporaceae科の真菌接種剤、Acaulosporaceae科の真菌接種剤、Sacculosporaceae科の真菌接種剤、Entrophosporaceae科の真菌接種剤、Pacidsporaceae科の真菌接種剤、Diversisporaceae科の真菌接種剤、Paraglomeraceae科の真菌接種剤、Archaeosporaceae科の真菌接種剤、Geosiphonaceae科の真菌接種剤、Ambisporaceae科の真菌接種剤、Scutellosporaceae科の真菌接種剤、Dentiscultataceae科の真菌接種剤、Racocetraceae科の真菌接種剤、phylum Basidiomycota科の真菌接種剤、phylum Ascomycota科の真菌接種剤、phylum Zygomycota科の真菌接種剤、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
細菌接種剤は、Rhizobium属の細菌接種剤、Bradyrhizobium属の細菌接種剤、Mesorhizobium属の細菌接種剤、Azorhizobium属の細菌接種剤、Allorhizobium属の細菌接種剤、Sinorhizobium属の細菌接種剤、Kluyvera属の細菌接種剤、Azotobacter属の細菌接種剤、Pseudomonas属の細菌接種剤、Azospirillium属の細菌接種剤、Bacillus属の細菌接種剤、Streptomyces属の細菌接種剤、Paenibacillus属の細菌接種剤、Paracoccus属の細菌接種剤、Enterobacter属の細菌接種剤、Alcaligenes属の細菌接種剤、Mycobacterium属の細菌接種剤、Trichoderma属の細菌接種剤、Gliocladium属の細菌接種剤、Glomus属の細菌接種剤、Klebsiella属の細菌接種剤、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
細菌接種剤は、植物生育刺激細菌株を含有しても良い。植物生育刺激細菌株は、殺虫性毒素(たとえば、Cry毒素)を産生する細菌株、抗真菌化合物(たとえば、β−1,3−グルカナーゼ、キトシナーゼ、リチカーゼ、またはそれらの組み合わせ)を産生する細菌株、殺線虫性化合物(たとえば、Cry毒素)を産生する細菌株、殺菌性化合物を産生する細菌株、1以上の抗生物質に対して抵抗性である細菌株、1以上の遊離複製プラスミドを含有する細菌株、植物の根に結合する細菌株、植物の根にコロニー形成する細菌株、バイオフィルムを形成する細菌株、栄養素を可溶化する細菌株、有機酸を分泌する細菌株、または、それらの任意の組み合わせである細菌株を含有しても良い。
たとえば、細菌接種剤は、Bacillus aryabhattai CAP53(NRRL No. B−50819)、Bacillus aryabhattai CAP56(NRRL No. B−50817)、Bacillus flexus BT054(NRRL No. B−50816)、Paracoccus kondratievae NC35(NRRL No. B−50820)、Bacillus mycoides BT155(NRRL No. B−50921)、Enterobacter cloacae CAP12(NRRL No. B−50822)、Bacillus nealsonii BOBA57(NRRL No. NRRL B−50821)、Bacillus mycoides EE118(NRRL No. B−50918)、Bacillus subtilis EE148(NRRL No. B−50927)、Alcaligenes faecalis EE107(NRRL No. B−50920)、Bacillus mycoides EE141(NRRL NO. B−50916)、Bacillus mycoides BT46−3(NRRL No. B−50922)、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE128(NRRL No. B−50917)、Bacillus thuringiensis BT013A(NRRL No. B−50924)、Paenibacillus massiliensis BT23(NRRL No. B−50923)、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE349(NRRL No. B−50928)、Bacillus subtilis EE218(NRRL No. B−50926)、Bacillus megaterium EE281(NRRL No. B−50925)、または、それらの組み合わせを含有しても良い。これら株のそれぞれは、United States Department of Agriculture (USDA) Agricultural Research Service (ARS)(住所は、1815 North University Street、Peoria、Illinois 61604 U.S.A.)に、2013年3月11日に(Bacillus aryabhattai CAP53、Bacillus aryabhattai CAP56、Bacillus flexus BT054、Paracoccus kondratievae NC35、Enterobacter cloacae CAP12、および、Bacillus nealsonii BOBA57)寄託されており、または、2014年3月10日に(Bacillus mycoides BT155、Bacillus mycoides EE118、Bacillus subtilis EE148、Alcaligenes faecalis EE107、Bacillus mycoides EE141、Bacillus mycoides BT46−3、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE128、Bacillus thuringiensis BT013A、Paenibacillus massiliensis BT23、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE349、Bacillus subtilis EE218、および、Bacillus megaterium EE281)寄託されており、ならびに、カッコ内に示されるNRRL番号によって特定される。
これら植物生育刺激株は、様々な活力のある植物の根圏から単離され、および、16S rRNAの配列(本明細書において、配列番号104〜121に提示)および生化学アッセイを介して特定された。当該株は、標準的な生化学的指標および形態学的指標により、少なくともその属指定に対して特定された。たとえばParacoccus kondratievae、Alcaligenes faecalis、および、Enterobacter cloacae等のグラム陰性株確定のための生化学的アッセイとしては、たとえば、MacConkey培地および普通寒天上での増殖、顕微鏡観察、5%および7.5%NaCl培地での増殖、pH5およびpH9での増殖、42℃および50℃での増殖、セロビオース、ラクトース、グリセロール、グルコース、スクロース、d−マンニトールおよびデンプンを用いた発酵で酸を産生する能力;蛍光色素の産生;ゼラチンの加水分解;硝酸塩還元;デンプン加水分解;オキシダーゼ反応、カタラーゼ産生、ウレアーゼ産生ならびに運動性が挙げられる。同様に、たとえばBacillusおよびPaenibacillus等のグラム陽性株確定のための生化学的アッセイとしては、PEA培地および普通寒天上での増殖、顕微鏡観察、5%および7.5%NaCl培地での増殖、pH5およびpH9での増殖、42℃および50℃での増殖、セロビオース、ラクトース、グリセロール、グルコース、スクロース、d−マンニトールおよびデンプンを用いた発酵で酸を産生する能力;蛍光色素の産生;ゼラチンの加水分解;硝酸塩還元;カタラーゼ産生、デンプン加水分解;オキシダーゼ反応、ウレアーゼ産生ならびに運動性が挙げられる。これら株の特定および、植物生育刺激効果の証明に関しては、以下の実施例に詳述する。
たとえば、製剤は、Paracoccus kondratievae NC35、Bacillus aryabhattai CAP53、またはBacillus megaterium EE281を含有する植物生育刺激細菌株を含有しても良く、ここで、当該製剤はさらに、本明細書に記述される組換えBacillus cereusファミリーのメンバー(本明細書の組換え植物生育刺激Bacillus cereusファミリーのメンバーの株(たとえば、組換えBacillus mycoides BT155、Bacillus mycoides EE141、または、Bacillus thuringiensis BT013A等))のいずれかを含有する。組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、本明細書に記述される任意の融合タンパク質(たとえば、配列番号60の標的化配列および、非ホルモン性ペプチド(たとえば、kunitzトリプシンインヒビター(KTI))、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素(たとえば、キトシナーゼ)、植物結合タンパク質もしくはペプチド(たとえば、TasA);病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド(たとえば、TasA)、または、細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解もしくは改変する酵素(たとえば、たとえばPhoAまたはフィターゼ等のホスファターゼ、またはエンドグルカナーゼ)を含有する融合タンパク質)を発現しても良い。
植物生育を刺激する方法
本発明はまた、植物の生育を刺激する方法に関するものである。植物の生育を刺激する方法には、上述の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのいずれか、または、上述の製剤のいずれかを植物生育環境へと導入することが含まれる。あるいは、上述の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の製剤のいずれかを、植物、植物の種子、または、植物もしくは植物種子の周辺域へと適用しても良い。そのような方法において、植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、組換えBacillusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
あるいは、植物生育刺激方法は、融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、植物生育環境へと導入すること、または、融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、植物、植物種子、または、植物もしくは植物種子の周辺域へと適用することを含有する。融合タンパク質は、少なくとも1つの植物生育刺激タンパク質またはペプチド、および、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する。植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片は、上述の[0005]段落に列記されている標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のいずれかであっても良い。
さらに、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約54%である。あるいは、標的化配列は、配列番号1のアミノ酸1〜35、配列番号1のアミノ酸20〜35、配列番号1、または配列番号60からなる。
標的化配列は、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である。
標的化配列は、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約56%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約56%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である。
標的化配列は、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約62%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約62%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。
標的化配列は、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約68%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約68%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。
標的化配列はまた、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である。
標的化配列は、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。
標的化配列は、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である。
標的化配列は、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有してもよく、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約90%である。あるいは、標的化配列は、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約90%である。
あるいは、エキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、および84のいずれか1つと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含有しても良い。
植物生育刺激タンパク質は、酵素を含有しても良い。たとえば、酵素は、細菌源、真菌源、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素を含有しても良い。そのような酵素としては、セルラーゼ、リパーゼ、リグニンオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシド加水分解酵素、ホスファターゼ、ニトロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵素、アミラーゼ、アンモニアオキシダーゼ、リグニナーゼ、グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ぺクチナーゼ、グルカナーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、キシラナーゼ、および親鉄剤(シデロフォア)が挙げられる。植物生育環境へと導入、または、植物、種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用された場合、細菌源、真菌源、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素を含有する融合タンパク質は、植物の周辺で栄養源を処理し、および、植物による栄養の取り込みの増強、または、植物周辺の有益な細菌または真菌による栄養の取り込みの増強をもたらす。
適切なセルラーゼとしては、エンドセルラーゼ(たとえば、Bacillus subtilisエンドグルカナーゼ、Bacillus thuringiensisエンドグルカナーゼ、Bacillus cereusエンドグルカナーゼ、または、Bacillus clausiiエンドグルカナーゼ)、エキソセルラーゼ(たとえば、Trichoderma reeseiエキソセルラーゼ)、および、β−グルコシダーゼ(たとえば、Bacillus subtilis β−グルコシダーゼ、Bacillus thuringiensis β−グルコシダーゼ、Bacillus cereus β−グルコシダーゼ、または、Bacillus clausii B−グルコシダーゼ)が挙げられる。
リパーゼは、Bacillus subtilisリパーゼ、Bacillus thuringiensisリパーゼ、Bacillus cereusリパーゼ、または、Bacillus clausiiリパーゼを含有しても良い。
適切なリグニンオキシダーゼは、リグニンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グリオキサルオキシダーゼ、リグニナーゼ、およびマンガンペルオキシダーゼを含有する。
プロテアーゼは、サブチリシン、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼを含有しても良い。
ホスファターゼは、リン酸モノエステル加水分解酵素、ホスホモノエステラーゼ(たとえば、PhoA4)、リン酸ジエステル加水分解酵素、ホスホジエステラーゼ、三リン酸モノエステル加水分解酵素、無水ホスホリル加水分解酵素、ピロホスファターゼ、フィターゼ(たとえば、Bacillus subtilis EE148フィターゼ、または、Bacillus thuringiensis BT013Aフィターゼ)、トリメタホスファターゼ、またはトリホスファターゼを含有しても良い。
ニトロゲナーゼは、Nifファミリーのニトロゲナーゼ(たとえば、Paenibacillus massiliensis NifBDEHKNXV)を含有しても良い。
植物の生育を刺激する上述のいずれかの方法において、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する植物生育環境中で育った植物は、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有していない同一の植物生育環境中での生育と比較し、生育の増強を示す。
植物の生育を刺激する上述のいずれかの方法において、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、上述の組換え植物生育刺激細菌株のいずれかを含有しても良い。
植物の生育を刺激する上述のいずれかの方法において、融合タンパク質は、上述のいずれかのプロモーターの制御下で発現されても良い。
病原体から植物を防御する方法
本発明はさらに、病原体から植物を防御する方法に関するものである。当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を植物生育環境中へと導入することが含まれる。あるいは、当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用することが含まれる。これら方法において、病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する植物生育環境中で育った植物は、当該組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有しない同一の植物生育環境中で育った植物と比較し、病原体に感染しにくい。病原体に対する抵抗性の高さは、病原体から植物を防御する当該タンパク質またはペプチドによる、植物の免疫システムの刺激の結果であってもよく、または、病原体から植物を防御する当該タンパク質またはペプチドの、病原体に対する間接的効果または直接的効果の結果であっても良い。
植物におけるストレス耐性を増強させる方法
本発明はさらに、植物におけるストレス耐性を増強させる方法に関するものである。当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を植物生育環境中へと導入することが含まれる。あるいは、当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用することが含まれる。これら方法において、植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する植物生育環境中で育った植物は、当該組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有しない同一の植物生育環境中で育った植物と比較し、ストレスの影響を受けにくい。
植物にBacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を固定する方法
本発明はまた、植物に組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を固定する方法を目的とするものである。これら方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を植物生育環境中へと導入することが含まれる。あるいは、当該方法には、上述の任意の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または上述の任意の製剤を、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用することが含まれる。植物結合タンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている。
これら方法により、Bacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞が、植物に結合することが可能となり、それにより、当該芽胞は当該植物上に維持される。たとえば、これら方法により、Bacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞が、植物の根に結合することが可能となり、または、植物の空中の部分(たとえば、葉、幹、花、もしくは実等)に結合することが可能となり、それにより、当該芽胞は、植物生育環境中へと消散することなく、または、植物の空中部分の周辺環境へと消散することなく、植物の根構造、または、植物の空中部分に維持される。
植物に組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を固定する任意の方法において、当該植物結合タンパク質またはペプチドは、植物、または植物構造、または植物下部構造(たとえば、植物の根、および、植物の根の下部構造、または、植物の空中部分もしくは植物の空中部分の下部構造)に選択的にBacillus cereusファミリーのメンバーを向かわせ、および維持させることができる。
植物生育環境
上述の任意の方法において、植物生育環境は、植物の生育をサポートすることができる物質である。植物生育環境は、土壌、水、水性溶液、砂、砂利、多糖、マルチ、堆肥、ピートモス、わら、丸太、粘土、大豆ミール、酵母抽出物、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。たとえば、植物生育環境は、土壌、堆肥、ピートモス、またはそれらの組み合わせを含有する。
植物生育環境は、土壌は、任意選択的に、酵素の基質を補充されても良い。たとえば、基質は、トリプトファン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸(たとえば、アデノシン−3−三リン酸)、インドール、トリメタホスフェート、フェロドキシン、アセトイン、ジアセチル、ピルビン酸、アセト乳酸、ペクチン、セルロース、メチルセルロース、デンプン、キチン、ペクチン、タンパク質食品、セルロース誘導体、リン酸、アセトイン、キトサン、インドール−3−酢酸の不活性型誘導体、ジベレリン酸の不活性型誘導体、キシラン、コリン、コリン誘導体、プロリン、ポリプロリン、プロリン富化食、プロリン富化タンパク質、フェニルアラニン、コリスミ酸、アラビノキシラン、脂質、ワックス、油、フィチン酸、リグニン、フミン酸、コリン、コリン誘導体、またはそれらの組み合わせを含有しても良い。
応用方法
上述の任意の方法において、組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または製剤を、植物生育環境へと導入してもよく、または、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用しても良い。
たとえば、当該方法は、植え付けの前に、組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する製剤を用いて、種子をコーティングすることを含有しても良い。
あるいは、当該方法は、組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または製剤を、植物の空中部分(たとえば、枝葉、幹、実、または花等)に適用することを含有しても良い。たとえば、組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または製剤は、植物の葉、または他の空中部分に、スプレー、ブラッシング、浸す、または他の方法で適用されても良い。
当該方法は、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する液体製剤または固形製剤を、当該環境(たとえば、土壌、堆肥、ピートモス、またはそれらの組み合わせ)に適用することにより、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、植物の生育環境中へと導入することを含有しても良い。
製剤は、植物生育環境に種子、苗、挿し木、球根または植物を植え付ける前、植え付けと同時、または植え付けの後に、植物生育環境へと適用されても良い。
農薬の同時適用
上述の任意の方法にはさらに、植物生育環境中に少なくとも1つの農薬を導入すること、または、植物もしくは種子に少なくとも1つの農薬を適用することを含有しても良い。農薬は、製剤に含有される上述の任意のもの、またはそれらの組み合わせであっても良い。
植物
上述の方法は、様々な植物で実施することができる。たとえば、植物は、双子葉植物、単子葉植物、または裸子植物であっても良い。
たとえば、植物が双子葉植物である場合、当該双子葉植物は、豆、エンドウ、トマト、コショウ、カボチャ、アルファルファ、アーモンド、アニスシード、リンゴ、アプリコット、arracha、アーティチョーク、アボカド、フタゴマメ、ビート、ベルガモット、黒コショウ、brack wattle、ブラックベリー、ブルーベリー、ダイダイ、青梗菜、ブラジル・ナッツ、パンノキ、ブロッコリ、ソラマメ、芽キャベツ、ソバ、キャベツ、アマナズナ、白菜、カカオ、カンタループ、ヒメウイキョウ種子、カルドン、イナゴマメ、ニンジン、カシューナッツ、キャッサバ、トウゴマの実、カリフラワー、根用セロリ、セロリ、チェリー、クリ、ヒヨコマメ、チコリ、チリペッパー、菊、シナモン、シトロン、クレメンタイン、クローブ、クローバー、コーヒー、コーラナット、西洋アブラナ、トウモロコシ、綿、綿実、ササゲ、ハマナ、クランベリー、クレソン、キュウリ、干しぶどう、カスタードアップル、ナンバンサイカチ、アメリカヤブマメ、ナス、キクヂシャ、ウイキョウ、コロハ、イチジク、ムラサキハシバミ、アマ、ゼラニウム、グーズベリー、ヒョウタン、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、麻、麻実、ヘンナ、ホップ、馬豆、セイヨウワサビ、インディゴ、ジャスミン、キクイモ、ジュート、ケール、カポック、ケナフ、カブキャベツ、キンカン、ラベンダー、レモン、ヒラマメ、ハギ、レタス、ライム、カンゾウ、レイシ、ビワ、ルピナス、マカデミアナッツ、メイス、マンダリン、テンサイ、マンゴー、セイヨウカリン、メロン、ミント、桑、マスタード、ネクタリン、ニジェール種子、ナツメグ、オクラ、オリーブ、アヘン、オレンジ、パパイヤ、パースニップ、エンドウ、モモ、ピーナッツ、洋ナシ、ペカンナット、柿、キマメ、ピスタチオ、オオバコ、プラム、ザクロ、ポメロ、ケシの実、ジャガイモ、サツマイモ、プルーン、カボチャ、ケブラチョ、マルメロ、Cinchona属の樹木、キノア、ハツカダイコン、ラミー、ナタネ、ラズベリー、レア、ルバーブ、バラ、ゴム、ルタバガ、ベニバナ、イガマメ、バラモンジン、サポディラ、ウンシュウミカン、フタナミソウ、ゴマ、シアバターノキ、大豆、ホウレンソウ、トウナス、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スウェーデンカブラ、ピーマン、タンジェリン、茶、テフ、タバコ、トマト、シロツメクサ、アブラギリ、カブ、ボンテンカ、カラスノエンドウ、クルミ、スイカ、イエルバ マテ、フユガラシ、ナズナ、コショウソウ(garden cress)、コショウソウ(pepper cress)、クレソン、グンバイナズナ、トウシミキ、ローレル、月桂樹、桂皮、jamun、ヒメウイキョウ、タマリンド、ペパーミント、オレガノ、ローズマリー、セージ、トゲバンレイシ、ルリソウ、テリハボク属、にがうり、ククイの実、タヒチセイヨウトチノキ、バジル、ハックルベリー、ハイビスカス、パッションフルーツ、スターアップル、サッサフラス、サボテン、セイヨウオトギリソウ、ミソハギ、サンザシ、コリアンダーの葉、カレープラント、キウィ、タイム、ズッキーニ、ウルーコ、クズイモ、ウォーターリーフ、spiny monkey orange、yellow mombin、スターフルーツ、アマランス、ワサビ、トウガラシ、イエロープラム、mashua、Chinese toon、つるな、bower spinach、ugu、エゾヨモギギク、ハコベ、ジョコテ、蒲桃、paracress、ケシアザミ、Chinese potato、horse parsley、垣根芥子、センノウ、agate、cassod tree、アザミ、オランダワレモコウ、スターグーズベリー、オカヒジキ、アツケシソウ、silver lace fern、collard greens、サクラソウ、キバナクリンソウ、スベリヒユ、ミチヤナギ、トクノウコウ、ツリーレタス、wild betel、West African pepper、サンタ草、タラゴン、パセリ、チャービル、land cress、オランダワレモコウユキノシタ、honeyherb、フキ、シソ、ヤナギタデ、エゴマ、苦豆、oca、kampong、中国セロリ、レモンバジル、タイバジル、水含羞草、ヤブニンジン、キャベツヤシ、moringa、mauka、こごみ、rice paddy herb、イエローサワーレタス、トウキ草、コショウ草、マカ、ヒョウタン、フジマメ、空芯菜、catsear、fishwort、沖縄ホウレンソウ、lotus sweetjuice、gallant soldier、culantro、キバナスズシロ、カルドン、caigua、ミツバ、chipilin、サムファイア、mampat、ebolo、ivy gourd、cabbage thistle、ハマナ、chaya、huauzontle、エチオピアマスタード、magenta spreen、good king henry、epazole、lamb‘s quarters、centella plumed cockscomb、セイヨウフウチョウボク、rapini、白菜、ミズナ、Chinese savoy、kai−lan、マスタードグリーン、Malabar spinach、フダンソウ、ウスベニタチアオイ、climbing wattle、China jute、パプリカ、ベニノキ種、スペアミント、キダチハッカ、マヨラナ、クミン、カモミール、レモンバーム 、オールスパイス、コケモモ、チェリモヤ、野生キイチゴ、セイヨウスモモ、ピタヤ、ドリアン、セイヨウニワトコ、フェイジョア、インドパンノキ、ジャンブル、ナツメ、ほおずき、紫マンゴスチン、ランブータン、アカフサスグリ、クロスグリ、サラルベリー、温州ミカン、アグリ、アズキ豆、黒豆、ササゲ、borlotti bean、インゲンマメ(common bean)、緑豆、インゲンマメ(kidney bean)、アオイマメ、ヤエナリ、白インゲンマメ、うずら豆、ベニバナインゲン、キヌサヤ、スナップエンドウ、ロマネスコ、calabrese、イラクサ、ピーマン、raddichio、ダイコン、白ハツカダイコン、ムカゴニンジン、tato soi、broccolini、黒ハツカダイコン、ゴボウ、ソラマメ、broccoli raab、フジマメ、ルピナス、アオギリ科ステルクリア属の高木、ムクナ、シカクマメ、ヤムビーン、マルガ、ヤグルマギク、umbrella bush、tjuntjula、wakalpulka、witchetty bush、wiry wattle、チーア、beech nut、ククイノキ、コロシント、メリコッカノキ、Maya nut、モンゴンゴ、ogbono nut、paradise nut、および、チェンぺダック、からなる群から選択されても良い。
あるいは、双子葉植物は、Acanthaceae(アカンサス)、Aceraceae(メープル)、Achariaceae、Achatocarpaceae(achatocarpus)、Actinidiaceae(チャイニーズグーズベリー)、Adoxaceae(連複草)、Aextoxicaceae、Aizoaceae(マツバギク)、Akaniaceae、Alangiaceae、Alseuosmiaceae、Alzateaceae、Amaranthaceae(アマランサス)、Amborellaceae、Anacardiaceae(ウルシ)、Ancistrocladaceae、Anisophylleaceae、Annonaceae(牛心梨)、Apiaceae(人参)、Apocynaceae(バシクルモン)、Aquifoliaceae(セイヨウヒイラギ)、Araliaceae(チョウセンニンジン)、Aristolochiaceae(ウマノスズクサ)、Asclepiadaceae(トウワタ)、Asteraceae(アスター)、Austrobaileyaceae、Balanopaceae、Balanophoraceae(ツチトリモチ)、Balsaminaceae(オジギソウ)、Barbeyaceae、Barclayaceae、Basellaceae(basella)、Bataceae(オカヒジキ)、Begoniaceae(ベゴニア)、Berberidaceae(メギ)、Betulaceae(カバノキ)、Bignoniaceae(アメリカノウゼンカズラ)、Bixaceae(lipstick tree)、Bombacaceae(カポックノキ)、Boraginaceae(ルリジサ)、Brassicaceae(カラシ、または、Cruciferae)、Bretschneideraceae、Brunelliaceae(brunellia)、Bruniaceae、Brunoniaceae、Buddlejaceae(ブッドレア)、Burseraceae(フランキンセンス)、Buxaceae(ツゲの木)、Byblidaceae、Cabombaceae(ジュンサイ)、Cactaceae(サボテン)、Caesalpiniaceae、Callitrichaceae(water starwort)、Calycanthaceae(strawberry shrub)、Calyceraceae(calycera)、Campanulaceae(ホタルブクロ)、Canellaceae(ハッケイ)、Cannabaceae(麻)、Capparaceae(ケッパー)、Caprifoliaceae(セイヨウスイカズラ)、Cardiopteridaceae、Caricaceae(パパイヤ)、Caryocaraceae(souari)、Caryophyllaceae(ナデシコ)、Casuarinaceae(she−oak)、Cecropiaceae(セクロピア)、Celastraceae(アメリカウメモドキ)、Cephalotaceae、Ceratophyllaceae(ツノゴケ)、Cercidiphyllaceae(カツラの木)、Chenopodiaceae(アカザ)、Chloranthaceae(ヒトリシズカ)、Chrysobalanaceae(ココア果実)、Circaeasteraceae、Cistaceae(キスツス・クレティクス)、Clethraceae(リョウブ)、Clusiaceae(マンゴスチン、または、Guttiferae)、Cneoraceae、Columelliaceae、Combretaceae(モモタマナ)、Compositae(アスター)、Connaraceae(cannarus)、Convolvulaceae(アサガオ)、Coriariaceae、Cornaceae(ハナミズキ)、Corynocarpaceae(karaka)、Crassulaceae(マンネングサ)、Crossosomataceae(クロッソソマ)、Crypteroniaceae、Cucurbitaceae(キュウリ)、Cunoniaceae(クノニア)、Cuscutaceae(ネナシカズラ)、Cyrillaceae(cyrilla)、Daphniphyllaceae、Datiscaceae(datisca)、Davidsoniaceae、Degeneriaceae、Dialypetalanthaceae、Diapensiaceae(イワウメ)、Dichapetalaceae、Didiereaceae、Didymelaceae、Dilleniaceae(ビワモドキ)、Dioncophyllaceae、Dipentodontaceae、Dipsacaceae(ナベナ)、Dipterocarpaceae(メランチ)、Donatiaceae、Droseraceae(モウセンゴケ)、Duckeodendraceae、Ebenaceae(黒檀)、Elaeagnaceae(グミ)、Elaeocarpaceae(ホルトノキ)、Elatinaceae(waterwort)、Empetraceae(ガンコウラン)、Epacridaceae(エパクリス)、Eremolepidaceae(catkin−mistletoe)、Ericaceae(ヒース)、Erythroxylaceae(コカ)、Eucommiaceae、Eucryphiaceae、Euphorbiaceae(トウダイグサ)、Eupomatiaceae、Eupteleaceae、Fabaceae(エンドウまたはlegume)、Fagaceae(ブナノキ)、Flacourtiaceae(イイギリ)、Fouquieriaceae(オコチョウ)、Frankeniaceae(frankenia)、Fumariaceae(カラクサケマン)、Garryaceae(silk tassel)、Geissolomataceae、Gentianaceae(リンドウ)、Geraniaceae(ゼラニウム)、Gesneriaceae(gesneriad)、Globulariaceae、Gomortegaceae、Goodeniaceae(クサトベラ)、Greyiaceae、Grossulariaceae(スグリ)、Grubbiaceae、Gunneraceae(グンネラ)、Gyrostemonaceae、Haloragaceae(フサモ)、Hamamelidaceae(マンサク)、Hernandiaceae(ハスノハギリ)、Himantandraceae、Hippocastanaceae(トチノキ)、Hippocrateaceae(hippocratea)、Hippuridaceae(スギナモ)、Hoplestigmataceae、Huaceae、Hugoniaceae、Humiriaceae、Hydnoraceae、Hydrangeaceae(アジサイ)、Hydrophyllaceae(ウォーターリーフ)、Hydrostachyaceae、Icacinaceae(クロタキカズラ)、Idiospermaceae、Illiciaceae(トウシミキ)、Ixonanthaceae、Juglandaceae(クルミ)、Julianiaceae、Krameriaceae(ラタニア)、Lacistemataceae、Lamiaceae(ミント、またはLabiatae)、Lardizabalaceae(アケビ)、Lauraceae(月桂樹)、Lecythidaceae(ブラジル・ナッツ)、Leeaceae、Leitneriaceae(corkwood)、Lennoaceae(lennoa)、Lentibulariaceae(タヌキモ)、Limnanthaceae(メドウフォーム)、Linaceae(亜麻)、Lissocarpaceae、Loasaceae(ロアサ)、Loganiaceae(フジウツギ)、Loranthaceae(showy mistletoe)、Lythraceae(オカトラノオ)、Magnoliaceae(モクレン)、Malesherbiaceae、Malpighiaceae(アセロラ)、Malvaceae(ゼニアオイ)、Marcgraviaceae(shingle plant)、Medusagynaceae、Medusandraceae、Melastomataceae(ノボタン)、Meliaceae(マホガニー)、Melianthaceae、Mendonciaceae、Menispermaceae(コウモリカズラ)、Menyanthaceae(ミツガシワ)、Mimosaceae、Misodendraceae、Mitrastemonaceae、Molluginaceae(クルマバザクロソウ)、Monimiaceae(monimia)、Monotropaceae(ギンリョウソウモドキ)、Moraceae(桑)、Moringaceae(ワサビノキ)、Myoporaceae(ハマジンチョウ)、Myricaceae(ヤマモモ)、Myristicaceae(ナツメグ)、Myrothamnaceae、Myrsinaceae(ヤブコウジ)、Myrtaceae(ギンバイカ)、Nelumbonaceae(lotus lily)、Nepenthaceae(East Indian pitcherplant)、Neuradaceae、Nolanaceae、Nothofagaceae、Nyctaginaceae(オシロイバナ)、Nymphaeaceae(スイレン)、Nyssaceae(sour gum)、Ochnaceae(ochna)、Olacaceae(olax)、Oleaceae(オリーブ)、Oliniaceae、Onagraceae(マツヨイグサ)、Oncothecaceae、Opiliaceae、Orobanchaceae(ハマウツボ)、Oxalidaceae(カタバミ)、Paeoniaceae(ボタン)、Pandaceae、Papaveraceae(ポピー)、Papilionaceae、Paracryphiaceae、Passifloraceae(トケイソウ)、Pedaliaceae(ゴマ)、Pellicieraceae、Penaeaceae、Pentaphragmataceae、Pentaphylacaceae、Peridiscaceae、Physenaceae、Phytolaccaceae(ヨウシュヤマゴボウ)、Piperaceae(コショウ)、Pittosporaceae(トベラ)、Plantaginaceae(オオバコ)、Platanaceae(プラタナス)、Plumbaginaceae(ルリマツリ)、Podostemaceae(river weed)、Polemoniaceae(フロックス)、Polygalaceae(ヒメハギ)、Polygonaceae(ソバ)、Portulacaceae(スベリヒユ)、Primulaceae(サクラソウ)、Proteaceae(プロテア)、Punicaceae(ザクロ)、Pyrolaceae(イチヤクソウ)、Quiinaceae、Rafflesiaceae(ラフレシア)、Ranunculaceae(buttercup orranunculus)、Resedaceae(モクセイソウ)、Retziaceae、Rhabdodendraceae、Rhamnaceae(クロウメモドキ)、Rhizophoraceae(オオバヒルギ)、Rhoipteleaceae、Rhynchocalycaceae、Rosaceae(バラ)、Rubiaceae(セイヨウアカネ)、Rutaceae(ルー)、Sabiaceae(アワブキ)、Saccifoliaceae、Salicaceae(柳)、Salvadoraceae、Santalaceae(サンダルウッド)、Sapindaceae(ムクロジ)、Sapotaceae(サポディラ)、Sarcolaenaceae、Sargentodox
aceae、Sarraceniaceae(食虫植物)、Saururaceae(アメリカハンゲショウ)、Saxifragaceae(ユキノシタ)、Schisandraceae(マツブサ)、Scrophulariaceae(ゴマノハグサ)、Scyphostegiaceae、Scytopetalaceae、Simaroubaceae(カシア)、Simmondsiaceae(ホホバ)、Solanaceae(ジャガイモ)、Sonneratiaceae(ハマザクロ)、Sphaerosepalaceae、Sphenocleaceae(spenoclea)、Stackhousiaceae(stackhousia)、Stachyuraceae、Staphyleaceae(ミツバウツギ)、Sterculiaceae(カカオ)、Stylidiaceae、Styracaceae(エゴノキ)、Surianaceae(suriana)、Symplocaceae(ハマノキ)、Tamaricaceae(ギョリュウ)、Tepuianthaceae、Tetracentraceae、Tetrameristaceae、Theaceae(茶)、Theligonaceae、Theophrastaceae(テオフラスタ)、Thymelaeaceae(西洋オニシバリ)、Ticodendraceae、Tiliaceae(シナノキ)、Tovariaceae、Trapaceae(ヒシ)、Tremandraceae、Trigoniaceae、Trimeniaceae、Trochodendraceae、Tropaeolaceae(キンレンカ)、Turneraceae(ツルネラ)、Ulmaceae(エルム)、Urticaceae(イラクサ)、Valerianaceae(カノコソウ)、Verbenaceae(バーベナ)、Violaceae(スミレ)、Viscaceae(Christmas mistletoe)、Vitaceae(ブドウ)、Vochysiaceae、Winteraceae(シキミモドキ)、Xanthophyllaceae、および、Zygophyllaceae(メキシコハマビシ)からなる群から選択される科由来のものであっても良い。
植物が単子葉植物である場合、当該単子葉植物は、トウモロコシ、コムギ、オーツ、イネ、オオムギ、キビ、バナナ、タマネギ、ニンニク、アスパラガス、ライグラス、アワ、フォニオ、raishan、nipa grass、ターメリック、サフラン、ガランガル、チャイブ、カルダモン、ナツメヤシ、パイナップル、エシャロット、セイヨウネギ、ハルタマネギ、ヒシの実、ヒラタマネギ、ジュズダマ、竹、シコクビエ、spotless watermeal、arrowleaf elephant ear、Tahitian spinach、マニラアサ、ビンロウジュ、bajra、ビンロウジ、broom millet、broom sorghum、コウスイガヤ、ココナッツ、ココヤム、トウモロコシ、タロイモ、アズキモロコシ、デュラムコムギ、edo、fique、formio、ショウガ、オーチャードグラス、アフリカハネガヤ、スーダングラス、ギニアコーン、マニラアサ、ヘネッケン、雑種トウモロコシ、jowar、レモングラス、リュウゼツラン、bulrush millet、シコクビエ、アワ、ヒエ、キビ、ニュージーランド麻、オーツ、油やし、palm palmyra、サゴヤシ、コヌカグサ、サイザルアサ、ソルガム、スペルトコムギ、スイートコーン、スイートソルガム、タロイモ、テフ、チモシーグラス、ライ小麦、バニラ、コムギ、およびヤムイモからなる群から選択されても良い。
あるいは、単子葉植物は、Acoraceae(ラタン)、Agavaceae(アオノリュウゼツラン)、Alismataceae(サジオモダカ)、Aloeaceae(アロエ)、Aponogetonaceae(キボウホウ)、Araceae(アルム)、Arecaceae(ヤシ)、Bromeliaceae(アナナス)、Burmanniaceae(ヒナノシャクジョウ)、Butomaceae(ハナイ)、Cannaceae(カンナ)、Centrolepidaceae、Commelinaceae(ムラサキツユクサ)、Corsiaceae、Costaceae(コスツス)、Cyanastraceae、Cyclanthaceae(パナマソウ)、Cymodoceaceae(manatee grass)、Cyperaceae(スゲ)、Dioscoreaceae(ヤムイモ)、Eriocaulaceae(星草)、Flagellariaceae、Geosiridaceae、Haemodoraceae(ハエモドラム)、Hanguanaceae(ハングアナ)、Heliconiaceae(ヘリコニア)、Hydatellaceae、Hydrocharitaceae(セキショウモ)、Iridaceae(アイリス)、Joinvilleaceae(ヨインウィレア)、Juncaceae(イグサ)、Juncaginaceae(arrow grass)、Lemnaceae(ウキクサ)、Liliaceae(ユリ)、Limnocharitaceae(ウォーターポピー)、Lowiaceae、Marantaceae(マランタ・レウコネウラ)、Mayacaceae(マヤカ)、Musaceae(バナナ)、Najadaceae(スイレン)、Orchidaceae(ラン)、Pandanaceae(タコノキ)、Petrosaviaceae、Philydraceae(タヌキアヤメ)、Poaceae(イネ)、Pontederiaceae(ホテイアオイ)、Posidoniaceae(posidonia)、Potamogetonaceae(ヒルムシロ)、Rapateaceae、Restionaceae、Ruppiaceae(ditch grass)、Scheuchzeriaceae(ホロムイソウ)、Smilacaceae(サルトリイバラ)、Sparganiaceae(ミクリ)、Stemonaceae(ビャクブ)、Strelitziaceae、Taccaceae(タッカ)、Thurniaceae、Triuridaceae、Typhaceae(ガマ)、Velloziaceae、Xanthorrhoeaceae、Xyridaceae(yellow−eyed grass)、Zannichelliaceae(horned pondweed)、Zingiberaceae(ショウガ)、および、Zosteraceae(アマモ)からなる群から選択される科由来であっても良い。
植物が裸子植物である場合、当該裸子植物は、Araucariaceae、Boweniaceae、Cephalotaxaceae、Cupressaceae、Cycadaceae、Ephedraceae、Ginkgoaceae、Gnetaceae、Pinaceae、Podocarpaceae、Taxaceae、Taxodiaceae、Welwitschiaceae、および、Zamiaceaeからなる群から選択されても良い。
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに解説するために提示されているものである。
実施例1.大豆における、植物の生育を刺激するためのリパーゼまたはエンドグルカナーゼを提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
Bacillus subtilisのリパーゼおよびエンドグルカナーゼ遺伝子は、以下の表3に示されるプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応(PCR)を介して増幅した。
Figure 2016520525
融合構築物を作製するために、重複伸長(overlapping extension、SOE)技術によるスプライシングを用いて、BclAの最初の35アミノ酸(配列番号1のアミノ酸1〜35)をコードするBacillus thuringiensisDNAの天然型bclAプロモーターへと遺伝子を融合した。正しい増幅物を、E.coli/BacillusシャトルベクターのpHP13へとクローニングし、正しいクローンをDNA配列解析によりスクリーニングした。正しいクローンを、Bacillus thuringiensisへとエレクトロポレーションし(Cry−、プラスミド−)、クロラムフェニコール耐性に対してスクリーニングした。正しい形質転換体を、30℃で一晩、脳心臓浸出物液体培地中で増殖させ、普通寒天培地上に置き、3日間、30℃でインキュベートした。融合構築物を発現している芽胞(BEMD芽胞)を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で洗浄することにより、プレートから採取し、遠心により精製し、PBS中で再度洗浄した。非形質転換対照のBacillus thuringiensis(B.t.)の芽胞も同様に作製した。
大豆(株Jake 011−28−04)は、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、2.54cmの深さに植えた。芽胞は、50mlの水で1x10/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各種子に適用された。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり11時間、光に曝した。2週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。2週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照のBacillus thuringiensisの芽胞に対して標準化した。2つの独立した試験を行った。
結果は、平均の標準誤差とともに表4に示す。両試験において、リパーゼまたはエンドグルカナーゼのいずれかを提示するBEMD芽胞の存在下で生育した大豆は、対照のB.t.芽胞処置した大豆よりも有意に高く生育していた(t-検定を用いた統計分析)。
Figure 2016520525
実施例2.トウモロコシにおける、植物の生育を刺激するためのエンドグルカナーゼを提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
エンドグルカナーゼを発現するBEMD芽胞は、上述の実施例1と同じ方法で作製した。トウモロコシは、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、3.8cmの深さで植えた。芽胞、対照、および、エンドグルカナーゼを発現するBEMDは、50mlの水で1x10/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり11時間、光に曝した。1週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。1週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照のBacillus thuringiensisの芽胞に対して標準化した。
結果は、平均の標準誤差とともに表5に示す。エンドグルカナーゼを提示するBEMD芽胞の存在下で生育したトウモロコシは、対照のB.t.芽胞処置した大豆、および水のみの対照植物の両方よりも有意に大きく成長していた(t検定を用いた統計分析)。
Figure 2016520525
実施例3.小麦における、植物の生育を刺激するためのエンドグルカナーゼまたはプロテアーゼを提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
エンドグルカナーゼを発現するBEMD芽胞は、上述の実施例1と同じ方法で作製した。E.coliプロテアーゼPtrBを発現するBEMD芽胞は、上述の実施例1と類似した方法および以下のプライマーを用いて作製した:
ggatccatgctaccaaaagcc (フォワード、配列番号41)、および、
ggatccttagtccgcaggcgtagc (リバース、配列番号42)
秋まき硬質小麦(Winter hard wheat)は、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、2.54cmの深さで植えた。芽胞、対照、および、エンドグルカナーゼまたはプロテアーゼを発現するBEMDは、50mlの水で1x10/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり11時間、光に曝した。1週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。1週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照の水のみの植物に対して標準化した。
結果は、平均の標準誤差とともに表6に示す。エンドグルカナーゼまたはプロテアーゼを提示するBEMD芽胞の存在下で生育した小麦は、対照のB.t.芽胞処置した大豆、および水のみの対照大豆の両方よりも有意に大きく成長していた(t検定を用いた統計分析)。
Figure 2016520525
実施例4.ライグラスにおける、植物の生育を刺激するためのエンドグルカナーゼを提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
エンドグルカナーゼを発現するBEMD芽胞は、上述の実施例1と同じ方法で作製した。ペレニアルライグラスは、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、6.4mmの深さで植えた。芽胞、両方の対照、および、エンドグルカナーゼを発現するBEMDは、50mlの水で1x10/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれている。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり11時間、光に曝した。2週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。2週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照の水のみの植物に対して標準化した。
結果は、平均の標準誤差とともに表7に示す。エンドグルカナーゼを提示するBEMD芽胞の存在下で生育したライグラスは、対照のB.t.芽胞処置したライグラス、および水のみの対照ライグラスよりも有意に大きく成長していた(t検定を用いた統計分析)。
Figure 2016520525
実施例5.植物の生育を刺激する植物ホルモンの合成または活性化に関与する酵素を提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
また、植物ホルモンの合成に関与する酵素を提示させるために、BEMD系を用いても良い。たとえば、植物ホルモンのインドール−3−酢酸は、植物における強力な生育刺激物質である。インドール−3−酢酸は、酵素のトリプトファンモノオキシゲナーゼおよびインドール−3−アセトアミド加水分解酵素により、トリプトファンからin vivoで合成される。インドール−3−酢酸および他のオーキシンホルモンもまた、酵素のニトリラーゼ、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール−3−アセトアルデヒド脱水素酵素、インドール−3−ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アミンオキシダーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、およびトリプトファン側鎖オキシダーゼにより、トリプトファンおよび/またはインドールからin vivoで合成されることができる。
また、植物成長ホルモンの、生物活性型または不活性型への改変に関与する酵素を提示するBEMD系を用いても良い。たとえば、ニトリラーゼをBEMD系上で発現させ、インドール−3−アセトニトリルの、生物活性型のインドール−3−酢酸への転換を触媒することができる。さらに、植物ホルモンの不活性型(たとえば、インドール−3−アセトニトリル)を、BEMD発現されたニトリラーゼと共に植物生育環境中に添加して、植物生育環境中に活性型ホルモンを徐々に放出させることができる。多くの他の植物ホルモンの不活性型、または低活性型は、それらに対応する酵素を用いて改変することができる。
関連植物成長ホルモン(オーキシン)としては、インドール−3−ピルビン酸、インドール−3−アセトアルドキシム、インドール−3−アセトアミド、インドール−3−アセトニトリル、インドール−3−エタノール、インドール−3−ピルビン酸塩、インドール−3−酪酸、フェニル酢酸、4−クロロインドール−3−酢酸、およびインドール−3−アセトアルドキシムが挙げられる。これらホルモンは、酵素のトリプトファンモノオキシゲナーゼ、インドール−3−アセトアミド加水分解酵素、ニトリラーゼ、ニトリル加水分解酵素、アセト乳酸合成酵素、アルファアセト乳酸デカルボキシラーゼ、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール−3−アセトアルデヒド脱水素酵素、インドール−3−ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アミンオキシダーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、およびトリプトファン側鎖オキシダーゼを介して、in vivoでトリプトファンおよび/またはインドールから合成される。
サイトカイニンファミリーの成長ホルモンもまた、BEMD系中で発現される酵素により合成されることができる。サイトカイニンの例としては、キネチン、ゼアチン(シスおよびトランス)、6−ベンジルアミノプリン、ジヒドロキシゼアチン、N6−(D2−イソペンテニル)アデニン、リボシルゼアチン、N6−(D2−イソペンテニル)アデノシン、2メチルチオ−シス−リボシルゼアチン、シスリボシルゼアチン、、リボシルゼアチン−5−モノホスフェート、N6−メチルアミノプリン、N6−ジメチルアミノプリン、2’−デオキシゼアチンリボシド、4−ヒドロキシ−3−メチル−トランス−2−ブテニルアミノプリン、オルト−トポリン、メタ−トポリン、ベンジルアデニン、オルト−メチルトポリン、およびメタ−メチルトポリンが挙げられる。これら植物生育刺激化合物は、アデノシンホスフェートイソペンテニルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、アデノシンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、CYP735A、5’リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、ゼアチン シス−トランスイソメラーゼ、ゼアチンO−グルコシルトランスフェラーゼ、β−グルコシダーゼ、シス−ヒドロキシラーゼ、CKシス−ヒドロキシラーゼ、CK N−グルコシルトランスフェラーゼ、2,5−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびゼアチン還元酵素を含む酵素により、メバロン酸塩、または、アデノシン1リン酸/2リン酸/3リン酸からin vivoで合成される。
上述の実施例1と類似した方法を用いて、これら酵素のいずれかを、BEMD系に組み込ませ、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバー中で発現された際に、発現された酵素をエキソスポリウムへと向かわせる標的化配列および当該酵素を含有する融合構築物を作製することにより、BEMD芽胞上に提示させてもよい。次いで、そのような構築物を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、上述の実施例1と類似した方法を用いて、植物の生育を刺激するために、土壌または他の植物生育環境に添加し、または、植物の葉に直接適用しても良い。
酵素の前駆体または基質を、植物生育環境に補充しても良い。たとえば、トリプトファン、アデノシンモノホスファターゼ、アデノシンジホスファターゼ、アデノシントリホスファターゼ、またはインドールを植物生育環境に補充しても良い。これら基質の適切な濃度は、100nM〜100μMである。
実施例6.植物の生育を刺激するために、タンパク質、ペプチド、プロタンパク質、またはプレプロタンパク質を生物活性型ペプチドへと開裂するプロテアーゼまたはペプチダーゼを提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
植物上で直接または間接的に作用することができる生物活性型のペプチドに、植物生育環境中で利用可能なタンパク質を酵素的に開裂することができるプロテアーゼおよびペプチダーゼを、BEMD系で発現させても良い。例としては、植物の生育を直接刺激することができる活性型ペプチドへの、植物生育環境中に添加された大豆食品、酵母抽出物、または他のタンパク質が豊富な食品の酵素開裂が挙げられる。タンパク質食品の酵素的開裂により生成された生物活性型ペプチドとしては、強力な植物根発育刺激物質であるRHPPおよびRKN 16D10が挙げられる。さらに、BEMDで発現されたプロテアーゼおよびペプチダーゼにより、その生物活性型へと、プロタンパク質またはプレプロプロテインを活性型に開裂しても良い。不活性型プロタンパク質またはプレプロプロテインを植物生育環境中に添加し、BEMDプロテアーゼにより徐々に開裂させ、生物活性型タンパク質を持続放出させても良い。
上述の実施例1に類似の方法を用いて、これらプロテアーゼおよびペプチダーゼのいずれかを、BEMD系に組み込み、プロテアーゼまたはペプチダーゼ、および、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバー中で発現された際にエキソスポリウムへと発現された酵素を向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を作製することにより、BEMD芽胞上に提示させても良い。次いで、そのような構築物を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、大豆食品、酵母抽出物、または別のタンパク質に富んだ食品と共に土壌または他の植物生育環境に添加し、植物の生育を刺激しても良い。大豆食品、酵母抽出物、または他のタンパク質に富んだ食品は、当該タンパク質食品、酵母抽出物、または他のタンパク質に富んだ食品を約10μg/L〜約100mg/Lで含有する液体組成物の形態で、適切に植物生育環境に添加される。
実施例7.植物生育刺激のための、プロテアーゼPtrBを発現するBEMD芽胞の使用
E.coliプロテアーゼPtrBを発現するBEMD芽胞を、実施例3に記述されるように作製した。大豆種子を、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、2.54cmの深さで植えた。芽胞、両方の対照、および、プロテアーゼを発現するBEMDは、50mlの水で1x10/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。25mg/ポットの大豆食品を、植え付けの際に水に加えた。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり13時間、光に曝した。1週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。2週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照の水のみの植物に対して標準化した。
結果は、水対照の割合として、平均の標準誤差とともに表8に示す。プロテアーゼを提示するBEMD芽胞の存在下で生育した大豆は、対照のB.t.芽胞処置した大豆、および水のみの対照大豆よりも有意に高く生育していた(t検定を用いた統計分析)。水対照またはB.thuringiensis対照植物に大豆食品を添加しても、ほとんど効果は無かった。対照的に、大豆食品およびBEMDプロテアーゼ系の存在下では、大豆植物は、他の全ての処置群を有意に超える応答を示した。
Figure 2016520525
実施例8.植物生育の刺激に関与するタンパク質またはペプチドを提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
また、BEMD系を用いて、植物の生育促進に直接関与するタンパク質またはペプチドを提示させても良い。たとえば、植物生育を刺激する植物ペプチドホルモンまたは非ホルモン性ペプチドを、BEMD系中で発現させても良い。たとえば、植物受容体に直接結合し、活性化させる非ホルモン性ペプチドを、BEMD系中で発現させ、植物および標的植物の根の受容体に直接作用させても良い。そのようなペプチドホルモンおよび非ホルモン性ペプチドとしては、フィトスルホカイン、カルカルバ(calcalva)3(CLV3)、システミン、RKN 16D10、Hg−Syv46、eNOD40、NODファミリータンパク質、ZmlGF、SCR/SP11ファミリータンパク質およびペプチダーゼ、RHPP、POLARIS、ならびにKTIが挙げられる。これらペプチドおよび関連ペプチドを、BEMD系中で発現させ、植物生育環境に送達または、葉に直接適用させ、植物の生育を刺激しても良い。
上述の実施例1と類似の方法を用いて、これらタンパク質またはペプチドのいずれかを、BEMD系に組み込み、酵素、および、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバー中で発現された際にエキソスポリウムへと発現された酵素を向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を作製することにより、BEMD芽胞上に提示させても良い。次いで、植物の生育を刺激するために、実施例1と類似の方法を用いて、そのような構築物を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、土壌、または他の植物生育環境に添加し、または、植物の葉に直接適用しても良い。
実施例9.植物生育を刺激するための、POLARISまたはKTIを発現するBEMD芽胞の使用
配列番号60の標的化配列に結合されたPOLARISまたはKTIペプチドをコードする遺伝子を合成することにより、植物ペプチドであるPOLARISおよび大豆ペプチドKTIを発現するBEMD芽胞を作製した。次いで、遺伝子をBacillus thuringiensisに導入し、芽胞を、実施例1に記述されるように作製した。大豆種子を、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、2.54cmの深さで植えた。POLARISまたはKTIを発現するBEMD芽胞は、50mlの水で1x10/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。純粋なPOLARISおよびKTIペプチドもまた、0.05mg/ポットで、大豆に対するその効果を検証した。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり13時間、光に曝した。2週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。2週間の最後に、各植物の高さを測定し、根を測定し、測定値を、対照の水のみの植物に対して標準化した。
結果は、水対照の割合として、平均の標準誤差とともに表9に示す。POLARISを提示するBEMD芽胞の存在下で生育した大豆は、水対照の大豆よりも高く生育し、根の発育に関しては、わずかな増加がみられた。遊離KTIペプチドの存在により、植物の生育が有意に阻害され、高さが6〜8%低かったが、根の長さは15%増えた。BEMD系でKTIを発現することにより、根の生育が促進され、植物の高さに対する阻害効果は無かった。重要なことは、遊離KTIペプチドと対照のBacillus thuringiensis芽胞が存在しても、KTIの発育阻害効果を防止しなかったが、KTIを伴うBEMDは発育阻害を示さなかったことである。
Figure 2016520525
実施例10.植物の生育を刺激するための、および/または、栄養を処理するために、細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素を提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
また、BEMD系を用いて、土壌または他の植物生育環境中に存在する細菌、真菌、または植物の栄養源を有益に分解または改変する酵素を提示しても良い。そのような酵素は、土壌または他の植物生育環境中に存在する産物を、植物、ならびに/または、根圏の有益な細菌および/もしくは真菌が容易に取り込める形態へと分解する。そのような酵素としては、たとえば、炭水化物複合体を分解するグルコシド加水分解酵素、セルロースを分解するセルラーゼ;脂質(油、脂肪、およびワックスを含む)を分解するリパーゼ;リグニンおよびフミン酸を分解するリグニンオキシダーゼ;ポリペプチドを分解するプロテアーゼ;膜を分解するホスホリパーゼ;窒素を戻すアミダーゼおよびニトロゲナーゼ;デンプンを処理するアミラーゼ;ヌクレオチドを戻すヌクレアーゼ;ペクチンを分解するぺクチナーゼ;硫黄を戻すスルファターゼ、ならびに、キシランおよびアラビノキシランを分解するキシラナーゼが挙げられる。得られた産物(単糖、アミノ酸、脂肪酸、および他の栄養を含む)は、植物による直接取り込み、ならびに/または、有益細菌および/もしくは真菌の植物の根圏における増殖、成長のための刺激のために容易に利用可能である。
さらに、土壌中の様々な有機および無機の形態からの植物による取り込みのために、酵素および他の生物分子を用いて、リン酸、窒素、および他の重要な基本的栄養物を放出および隔離しても良い。たとえば、ホスファターゼを用いて、植物が利用可能な無機リン酸へと、環境中のリン酸塩を分解しても良い。リン酸は、植物生育環境中に自然に存在しているリン酸塩であっても良い。あるいは、またはさらに、植物生育環境に、たとえば、標準的な農学的改良物であるトリメタリン酸塩を補充しても良い。有用なホスファターゼの例としては、リン酸モノエステル加水分解酵素、ホスホモノエステラーゼ、リン酸ジエステル加水分解酵素、ホスホジエステラーゼ、トリリン酸モノエステル加水分解酵素、リン酸無水物加水分解酵素、ピロホスファターゼ、フィターゼ、トリメタホスファターゼ、およびトリホスファターゼが挙げられる。たとえば、酵素のトリメタホスファターゼ、トリホスファターゼ、および、ピロホスファターゼは、トリメタリン酸を、有用な無機リン酸へと連続的に分解する。
酵素のニトロゲナーゼファミリーは、大気中の窒素(N)をアンモニアへと転換し、それにより、植物がアクセスできない窒素を、利用可能な形態へと転換することができる。適切な酵素は、ニトロゲナーゼのNifファミリーに属するものが挙げられる。
化学的エネルギーもまた、アデノシン−3−トリリン酸、フェロドキシン、または、そのようなエネルギーをBEMD系内に作製する追加の酵素として、植物生育環境中に直接添加することができる。これらは、ニトロゲナーゼの補因子であり、土壌中に存在が限定されている。ゆえに、そのような補因子を土壌に添加して、上述の反応を増強しても良い。
植物生育環境に添加することができる他のサプリメントとしては、デンプン、セルロースおよびセルロース誘導体、ペクチン、キシランおよびアラビノキシラン、脂肪、ワックス、油、フィチン酸、リグニン、フミン酸、ならびに、上述の酵素類が活性を発揮する他の栄養源が挙げられる。
実施例1に記述される方法と類似の方法を用いて、これら酵素のいずれかを、BEMD系に組み込み、酵素、および、Bacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムへと融合構築物を向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を作製することにより、BEMD芽胞上に提示させても良い。次いで、組換えBacillus cereusファミリーのメンバー中で融合構築物を発現させ、この組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを、植物の生育を刺激するために、実施例1に記述される方法と類似の方法を用いて土壌、または他の植物生育環境に添加しても良い。
実施例11.植物生育刺激のための、ホスファターゼを発現するBEMD芽胞の使用
Bacillus subtilisホスファターゼA4(PhoA4)を発現するBEMD芽胞は、配列番号60の標的化配列に連結されたPhoA4をコードする遺伝子を合成することにより作製した。この遺伝子を、次いで、Bacillus thuringiensisに導入し、芽胞を、実施例1のように作製した。トウモロコシを、標準的なローム表土で満たした、10cmの深さのポット中で、2.54cmの深さで植えた。PhoA4を発現するBEMD芽胞は、50mlの水で1x10/mlの濃度に希釈され、種まきの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。ホスファターゼは、液体中で、0.5mg/ポットの比率でポットに添加された。T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下、植物を生育させ、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下で、1日当たり13時間、光に曝した。2週間の試験期間中、3日ごとに植物に十分に水を与えた。2週間の最後に、各植物の高さを測定し、測定値を、対照の水のみの植物に対して標準化した。
結果を表10に示す。PhoA4を提示するBEMD芽胞の存在下で生育されたトウモロコシは、特にポリリン酸の存在下で、生育の増強を示した。この効果は、ポリリン酸単独の効果よりも強かった。
Figure 2016520525
実施例12.植物の生育刺激のための、2,3−ブタンジオールの合成、または、ジベレリン酸の合成もしくは活性化に関与する酵素を提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
また、BEMD系を用いて、植物生育促進化合物である2,3−ブランジオールの合成に関与する酵素を提示しても良い。in vivoにおいて、2,3−ブタンジオールは、根圏中の有益細菌および有益真菌により、アセトイン、ジアセチル、アセト乳酸、またはピルビン酸から、酵素のアセト乳酸合成酵素、α−アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ジアセチル還元酵素、ブタンジオール脱水素酵素、およびアセトイン還元酵素により合成される。
また、BEMD系を用いて、植物生育促進化合物であるジベレリン酸の合成または活性化に関与する酵素を提示しても良い。ジベレリン酸は、酵素(限定されないが、ヒドロキシルアミン還元酵素、2−オキソグルタレート(2−oxogluturate)ジオキシゲナーゼ、ジベレリン2B/3B加水分解酵素、ジベレリン3−オキシダーゼ、および、ジベレリン20−オキシダーゼが挙げられる)の作用により、不活性型、または低活性型から産生されることができる。
これら酵素のいずれかをBEMD系に組み込み、実施例1に記述される方法と類似の方法を用いて、BEMD芽胞上に提示しても良い。酵素、および、融合タンパク質がBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現された際にエキソスポリウムへと酵素を向かわせる標的化配列を含有する融合構築物が構築されても良い。次いで、融合構築物をBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現させ、当該Bacillus cereusファミリーのメンバーを、植物生育の刺激のために、土壌、または他の植物生育環境へと添加する。
BEMD上に提示される酵素の効果を上げるために、土壌に、酵素の基質を補充しても良い。たとえば、土壌または他の植物生育環境に、アセトイン(アセトイン還元酵素の基質);ピルビン酸(ピルビン酸デカルボキシラーゼの基質);ジアセチル(ジアセチル還元酵素の基質);および/または、アセト乳酸(アセト乳酸デカルボキシラーゼの基質)を補充しても良い。あるいは、またはさらに、土壌または他の植物生育環境に、ジベレリン酸の低活性型または不活性型(土壌または他の植物生育環境中で、上述の酵素により高活性型へと転換される)を補充しても良い。
実施例13.病原体から植物を防御するための、プロテアーゼを提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
また、BEMD系を用いて、1以上の病原体から植物を防御するプロテアーゼを提示させても良い。たとえば、ある細菌性病原体は、細菌のラクトンホモセリンまたは関連シグナル伝達分子の分泌を介して、個々のメンバー間で相互交流を行うことができる。ゆえに、細菌性ラクトンホモセリンシグナル伝達分子に特異的なプロテアーゼは、毒素の分泌および病原性因子の上方制御を行うために細菌にとって必須な工程である、細菌間の相互交流を阻害することにより、そのような細菌性病原体から植物を防御することができる。細菌性ラクトンホモセリンシグナル伝達分子に特異的な適切なプロテアーゼとしては、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼが挙げられる。
細菌性ラクトンホモセリンシグナル伝達分子に特異的なプロテアーゼを、実施例1に記述された方法と類似の方法を用いて、BEMD系に組み込んでも良い。プロテアーゼおよび、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現された際にエキソスポリウムへと当該プロテアーゼを向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を調製しても良い。次いで、融合構築物をBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現させ、当該Bacillus cereusファミリーのメンバーを、土壌、または他の植物生育環境へと添加する。次いで、当該プロテアーゼは、細菌性ラクトンホモセリンシグナル伝達分子を分解し、これら生物体の病原性にとって重要な工程を阻害し、それにより、これら病原体から植物を防御する。他のプロテアーゼおよびペプチダーゼも、実施例6および7に示されるBEMD系上で、この能力を有効に発揮する。
実施例14.病原体から植物を防御するための、抗菌性タンパク質およびペプチドを提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
また、BEMD系を用いて、1以上の病原体から植物を防御することに役立つ抗細菌性活性および/または抗真菌活性を示す酵素を提示させても良い。たとえば、バクテリオシン、リゾチーム(たとえば、LysM)、シデロフォア、コンアルブミン、アルブミン、ラクトフェリン(たとえば、LfcinB)、またはTasA等の抗菌性タンパク質およびペプチドはすべて、BEMD系中で発現させ、植物の細菌性病原体および真菌性病原体にその効果を発揮させても良い。バクテリオシン、アルブミン、コンアルブミン、リゾチーム、およびラクトフェリンは、その標的に直接抗菌活性を発揮し、一方で、シデロフォアは、病原体が病原性を発揮するのに必要な必須栄養素に結合する。たとえば、ラクトフェリンのペプチドLfcinBは、BEMD系の表面上で発現された際、植物生育環境中のラクトフェリンペプチドに感受性のある細菌細胞を溶解する。これらタンパク質およびペプチドは、限定された微生物に対し特異的に作用し、および、植物生育環境中の全ての微生物に影響を与えることなく、病原体群を選択的に標的とすることができる。
これらタンパク質またはペプチドのいずれかを実施例1に記述された方法と類似の方法を用いて、BEMD系に組み込んでも良い。酵素および、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現された際にエキソスポリウムへと当該酵素を向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を調製しても良い。次いで、融合構築物をBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現させ、当該Bacillus cereusファミリーのメンバーを、1以上の病原体から植物を防御するために、土壌、または他の植物生育環境へと添加する。
実施例15.細菌から植物を防御するための抗菌性ペプチドを発現するBEMD芽胞の使用
2つの抗菌性ペプチド(LfcinB(ウシラクトフェリン由来)およびLysM(ニワトリリゾチーム由来))のいずれかをコードする遺伝子を、BclAプロモーター(配列番号85)の制御下で、BclA標的化配列(配列番号60)に連結させ、合成した。当該遺伝子を、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入し、脳心臓滲出培養液中で形質転換されたBacillusを一晩培養して増殖させ、30℃で普通寒天プレート上に置き、3日間増殖させることにより、芽胞を形成させた。プレートから芽胞を洗い流し、PBSで3回洗浄した。Staphylococcus epidermidis培養物を、TSB液体培地において37℃で一晩、増殖させた。次いで、一晩培養させたものを沈殿させ、PBSで洗浄し、Abs595=0.2でPBS中に再懸濁した。LysMまたはLfcinBペプチドを発現する1x10のBEMDを、S.epidermidisと共に、37℃で3時間、PBS中で振とうさせながらインキュベートした。S.epidermidisの対照試料は、未処置のままとした(BEMD芽胞無し)。3時間のインキュベートの後、S.epidermidisの希釈プレートを作製し、37℃で一晩インキュベートした。S.epidermidisの培養物を、翌日に計数し、殺傷割合を定量した。以下の表11にあるように、殺傷活性の値を記録した。BEMD発現ペプチドは、有意に多くのS.epidermidis細胞を殺傷した。これは、根圏、種子、または他の植物物質上の細菌の殺傷にそのまま当てはめられる。ある種の細菌に特異的なペプチドを選択することにより、植物近傍の微生物群を有益なものに変えることができ、または、重要な病原体を選択的に標的とすることもできる。
Figure 2016520525

実施例16.病原体から植物を防御するための酵素を提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
また、BEMD系を用いて1以上の病原体から植物を防御する酵素を提示させても良い。たとえば、酵母およびカビ細胞壁は、たとえばβ−1,3−グルカナーゼ、β−1,4−グルカナーゼ、β−1,6−グルカナーゼ、キトシナーゼ、キチナーゼ、キトシナーゼ様タンパク質、およびリチカーゼ等の酵素により分解される。細菌細胞壁は、プロテイナーゼ、プロテアーゼ、ムタノリシン、スタホリシン、およびリゾチームから選択される酵素により分解される。これら細胞壁分解酵素の各々を根圏の病原性微生物の選択阻害のためにBEMD系上で発現させ、および植物生育環境へと添加しても良い。
また、BEMD系を用いて、たとえば所望される植物の昆虫および/または蠕虫の捕食を抑制することにより、昆虫または蠕虫の病原体から植物を防御する酵素またはタンパク質を提示させても良い。対象のそのようなタンパク質および酵素の例としては、エンドトキシン、Cry毒素、他の殺虫性タンパク質毒素、プロテアーゼ阻害物質、システインプロテアーゼ、Cry5Bタンパク質、Cry21Aタンパク質、キチナーゼ、プロテアーゼ阻害タンパク質、プロテアーゼ阻害ペプチド、トリプシンインヒビター、およびクワイプロテアーゼ阻害物質が挙げられる。
これらタンパク質またはペプチドのいずれかを実施例1に記述された方法と類似の方法を用いて、BEMD系に組み込んでも良い。酵素および、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現された際にエキソスポリウムへと当該酵素を向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を調製しても良い。次いで、融合構築物をBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現させ、当該Bacillus cereusファミリーのメンバーを、病原体から植物を防御するために、土壌、または他の植物生育環境へと添加する。
実施例17.植物防御のための抗真菌性酵素を発現するBEMD芽胞の使用、および、Sacchromycesへの有効性の提示
抗真菌性酵素のβ−1,3−グルカナーゼ(Bacillus subtilis由来)をコードする遺伝子を、BclAプロモーター(配列番号85)の制御下で、BclA標的化配列(配列番号60)に連結させ、合成した。当該遺伝子を、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入し、脳心臓滲出培養液中で形質転換されたBacillusを一晩培養して増殖させ、30℃で普通寒天プレート上に置き、3日間増殖させることにより、芽胞を形成させた。プレートから芽胞を洗い流し、PBSで3回洗浄した。Saccharomyces cerevisiae培養物を、YZ液体培地において37℃で一晩、増殖させた。次いで、一晩培養させたものを沈殿させ、PBSで洗浄し、Abs595=0.2でPBS中に再懸濁した。β−1,3−グルカナーゼを発現する1x10のBEMDを、Saccharomycesと共に、37℃で1時間、PBS中で振とうさせながらインキュベートした。Saccharomycesの対照試料は、未処置のままとした(BEMD芽胞無し)。3時間のインキュベートの後、Saccharomycesの希釈プレートを作製し、37℃で一晩インキュベートした。Saccharomycesの培養物を、翌日に計数し、殺傷パーセントを定量した。以下の表12に、β−1,3−グルカナーゼを発現するBEMD芽胞の殺傷活性の値を示す。BEMD発現酵素は、有意に多くのSaccharomyces細胞を殺傷した。これは、根圏、種子、または他の植物物質上の真菌微生物の殺傷にそのまま当てはめられる。ある種の真菌に特異的なペプチドを選択することにより、植物近傍の微生物群を有益なものに変えることができ、または、重要な病原体を選択的に標的とすることもできる。
Figure 2016520525
実施例18.病原体から植物を防御するための、植物免疫システム刺激ペプチドまたはタンパク質を提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
また、BEMD系を用いて、植物免疫システム増強ペプチドおよびタンパク質を提示しても良い。これらタンパク質は、植物免疫システムを刺激して植物病原体から植物自身を防御するよう、BEMD芽胞の外側に発現され、および、植物生育環境中に送達されても良い。例示的なタンパク質およびペプチドとしては、ハーピン、α−エラスチン、β−エラスチン、システミン、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ、エリシチン、ディフェンシン、クリプトゲイン、ならびに、フラジェリンタンパク質およびペプチドが挙げられる。これらタンパク質およびペプチドに植物を曝すことにより、植物において、多くの植物病原体に対する抵抗性が刺激される。
これらタンパク質またはペプチドのいずれかをBEMD系へと導入し、実施例1に記述される方法と類似の方法を用いてBEMD芽胞上に提示させても良い。酵素および、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現された際にエキソスポリウムへと当該酵素を向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を調製しても良い。次いで、融合構築物をBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現させ、当該Bacillus cereusファミリーのメンバーを、病原体から植物を防御するために、土壌、または他の植物生育環境へと添加する。
実施例19.植物の根系、または、植物の葉において、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを固定するための、根結合タンパク質もしくはペプチド、または葉結合タンパク質もしくはペプチドを提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
また、根および葉に結合するタンパク質ならびにペプチドをBEMD系に導入し、BEMD芽胞が植物の根系または葉に固定されるようにしても良い。BEMD芽胞上にそのような根、または葉に結合するリガンドを提示することにより、植物の根系、または根系の下部構造、または葉、または葉の下部構造に芽胞が向かい、他の提示されている生物学的分子および酵素が有効であるために最適な位置でBEMD芽胞が維持されることが可能となる。
たとえば、リカドヘシン(rhicadhesin)は、根毛に結合する根結合リガンドである。ゆえに、BEMD芽胞上にリカドヘシンを提示することにより、芽胞を根毛に向かわせることができる。植物の根または葉に選択的に結合することができる他のタンパク質としては、アドヘシン、フラジェリン、オンプチン(omptin)、レクチン、線毛タンパク質、カーラスタンパク質(curlus protein)、インチミン、インベーシン、アグルチニン、非線毛タンパク質(afimbrial protein)、TasAまたはYuaBが挙げられる。
そのような根または葉に結合するタンパク質およびペプチドを、実施例1に記述される方法と類似の方法を用いてBEMD系に導入しても良い。根もしくは葉結合タンパク質またはペプチド、および、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現された際にエキソスポリウムへと当該タンパク質またはペプチドを向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を調製しても良い。次いで、根または葉結合リガンドを含有する融合構築物をBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現させる。そのような融合構築物は、本明細書に記述される任意の有益な酵素(たとえば、植物ホルモンの合成に関与する酵素、栄養源を分解する酵素、または、病原体から植物を防御するプロテアーゼ等)を含有する1以上の追加の融合構築物と共に共発現されても良い。当該Bacillus cereusファミリーのメンバーを、土壌、または他の植物生育環境へと添加するか、または、植物の葉に適用する。根または葉結合リガンドは、Bacillus cereusファミリーのメンバーを植物の根系または植物の葉に向かわせ、そこに固定し、それによって、共発現された融合構築物が根系または葉系のすぐ近傍でその効果を発揮できるようにする。
実施例20.植物のストレス耐性を増強させるタンパク質または酵素を提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質、ペプチド、および酵素をBEMD系に導入し、根、葉、または植物生育環境への添加を介して標的植物への送達を行っても良い。ストレスを受けている間、植物はストレス関連化合物(アミノシクロプロパン−1−カルボン酸(ACC)、活性酸素種、その他等)を放出し、それにより、植物の生育が負の影響を受ける。BEMD系を用いて、そのようなストレス関連化合物を分解する酵素(たとえば、アミノシクロプロパン−1−カルボン酸デアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ、および、活性酸素種に作用する他の酵素等)を提示しても良い。そのような酵素により、これらストレス関連化合物の量が減少し、植物が生育を継続することが出来、さらには、ストレス条件下で力強く育つことができる。
BEMD芽胞上に提示させるために、これらタンパク質またはペプチドのいずれかを実施例1に記述される方法と類似の方法を用いてBEMD系に組み込んでもよい。酵素および、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現された際にエキソスポリウムへと当該酵素を向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を調製しても良い。次いで、融合構築物をBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現させ、当該Bacillus cereusファミリーのメンバーを、標的植物のストレス耐性を増強させるために、土壌、または別の植物生育環境へと添加、または、植物の葉に適用する。
実施例21.防御酵素のカタラーゼを発現するBEMD芽胞の調製
防御酵素のカタラーゼ(Bacillus cereus由来)をコードする遺伝子を、BetAプロモーター(配列番号86)の制御下で、BetA標的化配列(配列番号61)に連結させ、合成した。当該遺伝子を、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入した。脳心臓滲出培養液中で形質転換されたBacillusおよび野生型株を一晩培養して増殖させ、30℃で普通寒天プレート上に置き、3日間増殖させることにより、芽胞を形成させた。プレートから芽胞を洗い流し、PBSで3回洗浄した。3滴の過酸化水素を各芽胞のペレットに添加した。酵素のカタラーゼは、過酸化水素を水とOガスに転換する。対照の芽胞は泡立たないが、BEMD−カタラーゼ芽胞はすぐに発泡し、芽胞の表面上に酵素活性があることを示す。ストレスの間、植物により産生されるフリーラジカルに作用するよう、他の防御酵素を同様の方法で提示させ、植物に送達しても良い。
実施例22.環境ストレスから種子または植物を防御するタンパク質または酵素を提示する組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの使用
環境ストレスから植物を防御するタンパク質、ペプチド、および酵素をBEMD系に導入し、根、葉、または植物生育環境への添加を介して標的植物への送達を行っても良い。氷結されている間、植物は氷の影響によりダメージを受ける。BEMD系を用いて、そのような影響から植物を防御するペプチド、タンパク質または酵素を提示させても良い。たとえば、BEMD系を用いて、コリン脱水素酵素(霜から植物または種子を防御する防御産物を産生することにより作用する)を提示しても良い。また、これら酵素の基質(たとえば、コリンおよび/またはコリン誘導体)を植物生育環境に添加しても良い。そのような基質を添加することにより、BEMD発現酵素により植物環境中に産生された防御物質(ベタインおよび関連化学物質)の量を増やすことができる。ベタイン誘導体は、低温ストレスから種子を防御することが知られている。
これらタンパク質またはペプチドのいずれかを実施例1に記述される方法と類似の方法を用いてBEMD系に組み込んでもよい。酵素および、融合構築物がBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現された際にエキソスポリウムへと当該酵素を向かわせる標的化配列を含有する融合構築物を調製しても良い。次いで、融合構築物をBacillus cereusファミリーのメンバーにおいて発現させ、当該Bacillus cereusファミリーのメンバーを、環境ストレスおよび因子から植物を防御するために、土壌、または他の植物生育環境へと添加、または、植物の葉に適用する。
実施例23.増強された、または、別のプロモーターエレメントを用いることによる、BEMD系における融合構築物の発現増強
BEMD系は、本明細書に記述される標的化配列の1以上を用いた幅広いタンパク質、ペプチドおよび酵素を提示することができる。これら標的化配列の一部は、エキソスポリウムに対し高い親和性を有しているため融合タンパク質の発現に有益であるが、融合タンパク質の発現レベルは低いため、BEMD系上で用いることには制限がある。そのような融合タンパク質および配列に対しては、天然プロモーターの代わりに、別の高発現芽胞形成プロモーターを用いても良い。
たとえば、配列番号13(B.weihenstephensis KBAB4遺伝子3572のアミノ酸1〜39)により、Bacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムへのタンパク質の送達が非常に効率的となるN末端配列がもたらされる(以下の表13に示す)。本明細書に記述されるように、全ての遺伝子は、その完全形で合成される(プロモーター領域および融合タンパク質のコード領域を含む)。B. weihenstephensis KBAB4遺伝子3572に対する天然プロモーターエレメント(配列番号88)を用いて、β−ガラクトシダーゼ酵素(大腸菌由来)に融合された配列番号13の標的化配列を含有する融合タンパク質を発現した場合は、低レベルの融合タンパク質が発現されるため、芽胞表面上の酵素活性は低い。酵素活性は、10分間の溶液中の0.5M o−ニトロフェニルガラクトシドの転換により測定した。酵素転換は、ABS540で分光光度計を用いて測定した。B.weihenstephensis KBAB4遺伝子3572の天然型プロモーターエレメントを配列番号86の高発現プロモーター(B.anthracis BetA/BAS3290)、または、配列番号89の高発現プロモーター(B.weihenstephensis KBAB4 YVTN βプロペラタンパク質)と置き換えることにより、芽胞の酵素活性が劇的に増加した。他方、B.weihenstephensis KBAB4遺伝子3572の天然型プロモーターエレメントを、B.anthracis Sterne BAS1882の天然型プロモーター(配列番号87)と置き換えた場合には、芽胞の酵素活性は減少した。β−ガラクトシダーゼに融合された配列番号13の標的化配列の発現レベルは、BAS1882(配列番号87)のプロモーターにより誘導された場合には非常に低く(0.38X)、BetAプロモーター(配列番号86)またはYVTNタンパク質プロモーター(配列番号89)から誘導された場合には大きく改善された。
Figure 2016520525
実施例24.植物生育促進細菌株の単離および同定
最も健康で、最も耐性のあるジャガイモ(Solanum tuberosum)、黄色夏カボチャ(Cucurbita pepo)、トマト(Solanum lycopersicum)、および、pole bean(Phaseolus coccineus)植物の根圏から土壌試料を採取し、滅菌水で希釈して、普通寒天プレートに撒いた。高成長率を示し、継代および増殖することができた細菌単離株をさらなる実験に選択した。選択された株を、最小培地(KHPO 3g、NaHPO 6g、NHCl 1g、NaCl 0.50g、MgSO7HO 0.15g、CaCl2HO 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。1回の処置当たり10のレタス種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土に、1cmの深さで植えた(Columbia,MO)。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのHOに混合したものとともに、4cmのポットに接種した。10mlのHOは、細菌が3in(7.62cm)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。1週間後、植物の高さと葉の直径、ならびに、植物の全体的な健康を記録した。根圏単離物の最初のスクリーニングによって、4つの植物の根圏から、200を超える異なる種の細菌および真菌が得られた。一部の細菌種を表14に示す。同定された株は、その正規の細菌名で示されている。他の株は、不明 番号により示されている。対照に近い結果となった接種物(+/−2%)は、表に含めなかった。
Figure 2016520525
最初のレタスの試験において、植物全体の健康および植物の高さに最も大きな効果のあった細菌株を、次の同定に供した。細菌株は、Luria Bertani液体培地中、37℃で増殖させ、一晩培養したものを遠心でスピンダウンした。培地を棄て、残った細菌のペレットを、Qiagen Bacterial Chromosomal DNA Isolationキットを用いた染色体DNAの単離に供した。染色体DNAは、プライマーE338F 5’−ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT−3’(配列番号122)、E1099R A 5’−GGG TTG CGC TCG TTG C−3’ (配列番号123)、およびE1099R B 5’−GGG TTG CGC TCG TTA C−3’(配列番号124)を用いて、16S rRNAコード領域のPCR増幅に供した。PCR増幅物は、Promega PCR精製キットを用いて精製し、得られた増幅物を希釈し、DNA配列解析のためにUniversity of Missouri DNA Coreに送付した。DNA配列を、細菌単離物のNCBI BLASTデータベースと比較し、属種は、公知の株との直接比較により特定した。最も特定された種を表14に示す。多くの場合において、16S rRNA DNA配列からは、選択された細菌株の属を示すことが出来たのみであった。直接同定が利用できなかった場合、当分野に標準的な方法を用いた追加の生化学分析を行い、種および株レベルで識別を行い、それらを表15に示す。
Figure 2016520525
実施例25.追加の植物生育促進細菌株の単離および同定
Gas、Kansasに近い農場から土壌試料を集め、滅菌水で希釈し、普通寒天培地に撒いた。高成長率を示し、継代および増殖することができた細菌単離株をさらなる実験に選択した。選択された株を、最小培地(KHPO 3g、NaHPO 6g、NHCl 1g、NaCl 0.50g、MgSO7HO 0.15g、CaCl2H0 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。トウモロコシの種子を市販の種子ポリマー(水単独と混合したもの(トータルで1.6μl/種子)、または、選択細菌株(トータルで1.6μl/種子)を含有するもの)でコートした。コートされた種子は、(3インチ)7.62cm直径のポットに、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に1インチ(2.54cm)の深さで植えた。植物は18〜24℃(65〜75°F)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、50mlの水を3日毎に与えた。2週間後、植物の高さと葉の直径、ならびに、植物の全体的な健康を記録した。発芽アッセイおよび3日目の根の長さを測定するために、種子を上述のようにコートし、ペーパータオル毎に10個の種子で等しく撒いた。ペーパータオルは10mlの水で湿らせ、くるくると巻き、小さなプラスチック袋内に置き、30℃でインキュベートするか、または、発芽加熱マット上に27〜30℃(80〜85°F)で置いた。根の測定は、3日後に記録した。根圏単離物の最初のスクリーニングによって、根圏から100を超える異なる種の細菌および真菌が得られた。一部の細菌種を表16に示す。同定された株は、その正規の細菌名で示されている。
Figure 2016520525
植物の健康に最も大きな効果のあった細菌株を、表16に示す。細菌株は、Luria Bertani液体培地中、37℃で増殖させ、一晩培養したものを遠心でスピンダウンした。培地を棄て、残った細菌のペレットを、Qiagen Bacterial Chromosomal DNA Isolationキットを用いた染色体DNAの単離に供した。染色体DNAは、プライマーE338F 5’−ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT−3’(配列番号122)、E1099R A 5’−GGG TTG CGC TCG TTG C−3’ (配列番号123)、およびE1099R B 5’−GGG TTG CGC TCG TTA C−3’(配列番号124)を用いて、16S rRNAコード領域のPCR増幅に供した。PCR増幅物は、Promega PCR精製キットを用いて精製し、得られた増幅物を希釈し、DNA配列解析のためにUniversity of Missouri DNA Coreに送付した。DNA配列を、細菌単離物のNCBI BLASTデータベースと比較し、属種は、公知の株との直接比較により特定した。最も特定された種を表16に示す。多くの場合において、16S rRNA DNA配列からは、選択された細菌株の属を示すことが出来たのみであった。直接同定が利用できなかった場合、当分野に標準的な方法を用いた追加の生化学分析を行い、種および株レベルで識別を行い、識別された株を表17に示す。
Figure 2016520525
実施例26.アルファルファに対する、植物生育促進細菌株の検証
選択された株を、最小培地(KHPO 3g、NaHPO 6g、NHCl 1g、NaCl 0.50g、MgSO7HO 0.15g、CaCl2HO 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個のZebaコートされたアルファルファの種子は、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に0.6cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのHOに混合したものとともに接種した。10mlのHOは、細菌が3in(7.62cm)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。アルファルファを1週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表18に示す。
Figure 2016520525
実施例27.キュウリに対する植物生育促進細菌株の検証
選択された株を、最小培地(KHPO 3g、NaHPO 6g、NHCl 1g、NaCl 0.50g、MgSO7HO 0.15g、CaCl2HO 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個のキュウリの種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に1cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのHOに混合したものとともに接種した。10mlのHOは、細菌が3in(7.62cm)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。キュウリを2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表19に示す。
Figure 2016520525
実施例28.黄色カボチャ(yellow squash)に対する植物生育促進細菌株の検証
選択された株を、最小培地(KHPO 3g、NaHPO 6g、NHCl 1g、NaCl 0.50g、MgSO7HO 0.15g、CaCl2HO 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個の黄色カボチャの種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に1cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのHOに混合したものとともに接種した。10mlのHOは、細菌が3in(7.62cm)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。カボチャを2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さおよび最終的な葉の直径(2つの葉の長さによる)のデータを表20に示す。
Figure 2016520525
実施例29.ライグラスに対する植物生育促進細菌株の検証
選択された株を、最小培地(KHPO 3g、NaHPO 6g、NHCl 1g、NaCl 0.50g、MgSO7HO 0.15g、CaCl2HO 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。30個のライグラスの種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に0.3cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのHOに混合したものとともに接種した。10mlのHOは、細菌が3in(7.62cm)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。ライグラスを1.5週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表21に示す。
Figure 2016520525
実施例30.トウモロコシに対する植物生育促進細菌株の検証
選択された株を、最小培地(KHPO 3g、NaHPO 6g、NHCl 1g、NaCl 0.50g、MgSO7HO 0.15g、CaCl2HO 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個のトウモロコシ種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に2.5cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのHOに混合したものとともに接種した。10mlのHOは、細菌が3in(7.62cm)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。トウモロコシを2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表22に示す。
Figure 2016520525
実施例31.大豆に対する植物生育促進細菌株の検証
選択された株を、最小培地(KHPO 3g、NaHPO 6g、NHCl 1g、NaCl 0.50g、MgSO7HO 0.15g、CaCl2HO 0.013g、および、グルコース1g/L 乾重量)中で増殖させた。選択された株を一晩培養した(30℃)ものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。10個の大豆種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に2.5cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを10mlのHOに混合したものとともに接種した。2つの細菌株を検証する際、0.5μlの各再懸濁された細菌は、10mlのHOと混合された。10mlのHOは、細菌が3in(7.62cm)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜75°F(18〜24℃)の温度で、11時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。大豆を2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表23に示す。本発明の細菌株とBradyrhizobium sp.またはRhizobium sp.のメンバーと共に接種することにより、各接種単独と比較し、植物の生育が増加した。
Figure 2016520525
実施例32.植物生育促進の特性を有するBacillus cereusファミリーのメンバー
Bacillus mycoides株BT155、Bacillus mycoides株EE118、Bacillus mycoides株EE141、Bacillus mycoides株BT46−3、Bacillus cereusファミリーのメンバー株EE349、Bacillus thuringiensis株BT013A、および、Bacillus megaterium株EE281を、Luria Bertani液体培地中、37℃で増殖させ、一晩培養したものをスピンダウンし、培地を棄て、等量の滅菌水に再懸濁した。20個のトウモロコシ種子を、大きな残渣をふるいにかけて取り除いた表土(Columbia、MO)に2.5cmの深さで各処置に対して植えた。種子は、植え付け時に、水に再懸濁した細菌0.5μlを50mlのHOに混合したものとともに接種した。50mlのHOは、細菌が29in(442.5cm)の土壌に細菌が送達されるのに十分であり、ならびに、種子の適切な発芽のために土壌を満たすのに十分であった。植物は65〜72°Fの温度で、13時間の光照射/日とともに生育させ、5mlの水を3日毎に与えた。苗木を2週間育て、記載された条件下での発芽および植物の最初の伸長を分析した。同定された株は、その正規の細菌名で示され、最終的な高さのデータを表24に示す。
Figure 2016520525

全ての検証した植物生育促進細菌は、記述される条件下、2週間でトウモロコシの高さに有益な効果をもたらした。Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE128株は、この試験で最も高い効果を有しており、トウモロコシの高さにおいて14%を超えるブースト効果があった。
実施例33.BEMD発現宿主として、植物生育促進および他の有益な活性に関するスクリーニングのための、Bacillus cereusファミリーのメンバーの選択強化
有益な農業的効果をもたらすために本明細書に記述される標的化配列のいずれかを用いて、広範なタンパク質、ペプチド、酵素を提示するためにBEMD系を用いてもよい。追加の有益な効果は、内在的に有益な特性を有する発現宿主(たとえば、Bacillus cereusファミリーのメンバー)を選択することにより得ることができる。Bacillus cereusファミリーのメンバーの多くの株が、植物生育促進の効果を有している。さらに、多くのBacillus cereusファミリーのメンバー株が、直接的な殺真菌活性、殺虫活性、殺線虫活性、または他の防御的活性を介した防御効果を有している。BEMD系の発現宿主として、そのような株を用いることにより、最終芽胞産物は、農業における複数の有益な効果を有する。
表25において、融合タンパク質が様々なBacillus cereusファミリーのメンバーの株で発現された実験に関する結果を示す。すべての株が、配列番号1のアミノ酸1〜35、および、トウモロコシにおけるリン酸取り込み強化に有益な酵素であるBacillus subtilis由来のホスファターゼPhoA4を含有する融合タンパク質を発現している。当該遺伝子は合成され、pMK4ベクターにクローニングされ、および、以下の表25に示されるBacillus spp.の各々に導入された。クロラムフェニコール10μg/mlを含有する普通寒天プレート上で3日間、30℃でインキュベートすることにより、株は芽胞形成した。芽胞を集め、洗浄し、植え付けの際に、5mgポリリン酸/ポットと共に、7.62cmの直径のポット毎に、50mlの水に溶解した1x10CFU/mlの比率でトウモロコシに適用された。トウモロコシは2週間、シルトローム土壌中で生育された。植物は、T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下で、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下、1日当たり13時間光を当てられ、生育された。植物は、2週間の試験の間、3日毎に水を十分に与えられた。2週間の最後、各植物の高さを計測し、計測値は、対照のBacillus thuringiensisの芽胞に対して標準化された。配列番号1−ホスファターゼ融合タンパク質の発現により、選択された発現宿主株に関わらず、2週でトウモロコシの高さが増加した。表25に示されるように、植物生育促進Bacillus cereusファミリーのメンバーの使用により、さらにトウモロコシの高さが増加した。
Figure 2016520525
実施例34.Bacillus thuringiensisの表面上にβ−ガラクトシダーゼを発現するための、様々な標的化配列の使用
BclAのアミノ酸20〜35(配列番号1のアミノ酸20〜35)と高度な相同性を有する様々な標的化配列を、Bacillus cereusファミリーのメンバーの表面上に酵素、タンパク質、およびペプチドを提示するために用いても良い。いくつかの標的化配列を、Bacillus subtilisリパーゼに連結された標的化配列を含有する融合タンパク質を作製することにより比較した。融合構築物は、標的化配列に対し天然型であるプロモーターを用いて合成し、複製プラスミドpMK4にクローニングし、および、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入した。クロラムフェニコール10μg/mlを含有する普通寒天プレート上で3日間、30℃でインキュベートすることにより、株は芽胞形成した。芽胞を集め、洗浄し、1x10/mlの比率でPBS中に再懸濁した。各融合構築物の芽胞に対し、1x10個の芽胞を、400μlのdHOに懸濁した。反応物を、所望される反応温度(40℃)にまで、反応成分と共に加熱した。200μlのワーキング緩衝液を添加した(溶液A:溶液Bが9:1)。溶液Aは、50mMのTris(pH10)および13.6mMのデオキシコール酸であり、溶液Bは、イソプロパノールに溶解した3mg/mlのp−ニトロフェニルパルミチン酸である。反応物を40℃で10分間インキュベートし、氷上に置き、芽胞を取り除くために遠心し、420nmの吸光度を測定した。結果を以下の図26に示す。活性は、Bacillus subtilisリパーゼに融合された配列番号1のアミノ酸1〜35を含有する対照融合タンパク質に対して標準化された。
Figure 2016520525
リパーゼに連結されたいくつかの標的化配列は、芽胞表面上の酵素の発現レベルおよび活性の増加をもたらした。特に、配列番号60、62、および64(各々、より短い標的化配列を含有する)は、BEMD芽胞の表面上に融合物の発現増強をもたらした。検証された標的化配列を含有する融合タンパク質はすべて、リパーゼを表面に提示した。
実施例35.Bacillus thuringiensisの表面上にリパーゼを発現させるための様々なエキソスポリウム配列の使用、および、エキソスポリウム表面への融合タンパク質の局在化の証明
様々なエキソスポリウムタンパク質を、Bacillus cereusファミリーのメンバーの表面上に酵素、タンパク質およびペプチドを提示するために用いることができる。いくつかのエキソスポリウムタンパク質を、Bacillus subtilisリパーゼに連結されたエキソスポリウムタンパク質を含有する融合タンパク質を実施例34に記述されるように作製することにより比較した。融合構築物は、以下の表27に示されるエキソスポリウムタンパク質に対して天然型であるプロモーターを用いて合成され、複製プラスミドのpMK4にクローニングされ、および、Bacillus thuringiensis BT013Aへと導入された。様々なエキソスポリウムタンパク質‐Bacillus subtilis168リパーゼ融合物を提示する芽胞を、脳心臓滲出液体培地中で形質転換された細菌を、10μg/mlのクロラムフェニコールの選択圧と共に増殖させ、普通寒天プレート上に置き、および、30℃で3日間インキュベートすることにより作製した。3日後、芽胞をプレートから洗い流し、遠心により精製し、および、1x10CFU/mlでPBSに再懸濁した。
各融合構築物に対し1x10個の芽胞を、400μlのdHOに再懸濁した。反応物を、所望される反応温度(40℃)にまで、反応成分と共に加熱した。200μlのワーキング緩衝液を添加した(溶液A:溶液Bは9:1)。溶液Aは、50mMのTris(pH10)および13.6mMのデオキシコール酸であり、溶液Bは、イソプロパノールに溶解した3mg/mlのp−ニトロフェニルパルミチン酸である。反応物を40℃で10分間インキュベートし、氷上に置き、芽胞を取り除くために遠心し、420nmの吸光度を測定した。結果を以下の図27に示す。活性は、リパーゼに連結された配列番号72に対して標準化された。
Figure 2016520525
配列番号72および73のエキソスポリウムタンパク質の使用により、芽胞上の酵素活性は最も高くなった。エキソスポリウムタンパク質を含有する全ての融合タンパク質は、異なるレベルではあるが、活性なBacillus subtilis168リパーゼを表面に提示した。
さらに別のエキソスポリウムタンパク質が、蛍光レポーターであるmCherryを用いて、エキソスポリウムへ融合タンパク質を向かわせることができることが示された。mCherryレポーターに連結された配列番号74、83および73のエキソスポリウムタンパク質を含有した融合構築物が作製された。芽胞を1.5日間増殖させ、回収し、上述のように再懸濁した。7μlの蛍光芽胞を、Nikon E1000顕微鏡に置き、後期芽胞形成の間、画像化を行った。リングの中の円状の局在は、外側芽胞層の局在の指標であり、それが出現することは、エキソスポリウムタンパク質が出現したことを表す。蛍光顕微鏡の結果は図2に示す。図2A、2Bおよび2Cは、それぞれ配列番号74、83および73のエキソスポリウムタンパク質とmCherryレポーターを含有する融合タンパク質を発現している芽胞の蛍光顕微鏡画像である。3つの融合物すべてが、高レベルの蛍光とエキソスポリウムの局在を示し、このことから、エキソスポリウムの表面上に外来性タンパク質を発現させるための利用可能性が示された。
実施例36.Bacillus subtilis芽胞においてホスファターゼを発現させるための様々な標的化配列およびエキソスポリウムタンパク質の使用、ならびに、大豆におけるホスファターゼ発現芽胞の効果
Bacillus subtilis EE148ホスファターゼA4(PhoA4)を発現するBEMD芽胞は、様々な標的化配列および、PhoA4に連結されたその天然型プロモーターの制御下にあるエキソスポリウムタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子合成することにより作製した。合成された遺伝子をpMK4にクローニングし、Bacillus thuringiensis BT013Aに導入した。様々なエキソスポリウムタンパク質‐Bacillus subtilis EE148 PhoA4融合物を提示する芽胞は、脳心臓滲出液体培地中で形質転換された細菌を、10μg/mlのクロラムフェニコールの選択圧と共に増殖させ、普通寒天プレートに置き、3日間、30℃でインキュベートすることにより作製した。3日後、芽胞をプレートから洗い流し、遠心により精製し、PBS中に1x10CFU/mlで再懸濁した。
標準的なローム表土で満たした10cmの深さのポットに、2.54cmの深さで大豆を植えた。PhoA4発現BEMD芽胞は、50mlの水で1x10/mlの濃度まで希釈し、植え付けの際に各植物に適用された。水のみの対照もまた含まれた。ポリリン酸を、液体中0.5mg/ポットの比率でポットに添加した。植物は、T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下で、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下、1日当たり13時間光を当てられ、生育された。植物は、2週間の試験の間、3日毎に水を十分に与えられた。2週間の最後、各植物の高さを計測し、計測値は、対照の水のみの植物に対して標準化された。
結果を表28に示す。様々な標的化配列に連結されたPhoA4と、PhoA4と異なる融合パートナーを有するエキソスポリウムタンパク質を含有する融合タンパク質を発現しているBEMD芽胞の存在下で生育した大豆はすべて生育の増強を示したが、効果の程度は、用いられた標的化配列またはエキソスポリウムタンパク質によって変化した。
Figure 2016520525
実施例37.BEMD芽胞ならびに、種子処置、液体肥料および他の添加物の共適用
融合タンパク質を発現しているBEMD芽胞を、様々な種子処置との適合性に関して検証した。BEMD芽胞は、Bacillus subtilis EE148 PhoA4由来のホスファターゼ(PhoA4)またはPOLARISペプチドに連結された配列番号1のアミノ酸1〜35の標的化配列を含有する融合タンパク質を発現させた。合成された遺伝子をpMK4にクローニングし、Bacillus thuringiensis BT013Aに導入した。様々なエキソスポリウムタンパク質‐Bacillus subtilis EE148 PhoA4またはPOLARIS融合物を提示する芽胞は、脳心臓滲出液体培地中で形質転換された細菌を、10μg/mlのクロラムフェニコールの選択圧と共に増殖させ、普通寒天プレートに置き、3日間、30℃でインキュベートすることにより作製した。3日後、芽胞をプレートから洗い流し、遠心により精製し、PBS中に1x10CFU/mlで再懸濁した。
植物は、T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下で、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下、1日当たり13時間光を当てられ、生育された。植物は、2週間の試験の間、3日毎に水を十分に与えられた。2週間の最後、各植物の高さを計測し、計測値は、対照の水のみの植物に対して標準化された。結果を以下の表29に示す。水浸=50ml/ポットで土壌に適用された。ポリマー=ACCELERON種子コーティングポリマーのみ。BEMD芽胞は、水浸適用に対しては、1x10細胞/50mlで添加された。種子コーティング適用に対しては、BEMD芽胞は1.3x10細胞/種子で添加された。10−34−0および6−24−6は、標準的な市販の開始肥料組成物である。10−34−0は液体リン酸アンモニウムである。6−24−6は、オルト/ポリ組成での低塩液体リン酸肥料である。着色料=Becker Underwood赤種子コーティング着色剤。MACHO、APRON、およびCRUISERは、種子に用いられた市販の抗真菌剤である。MACHOは活性成分であるイミダクリプリドを含有し、APRONは活性成分であるメフェノキサムを含有し、CRUISERは、活性成分であるチアメトキサム、メフェノキサム、およびフルジオキソニルの混合物を含有している。芽胞は、多くの種子適用と適合性があり、トウモロコシにおいて、植物生育促進の活性を維持していることが判明した。
Figure 2016520525
BEMD芽胞は、検証した種子コーティング追加物すべてと適合性があることが判明した。BEMD PhA4芽胞を着色剤およびポリマー単独と組み合わせた場合、若干の活性減少があったものの、着色剤と他の抗真菌剤と組み合わせることにより、完全な活性が再び得られた。また、BEMD芽胞は液体肥料でも良く作用した。直接的な栄養補給を介して、開始肥料は植物の生育に寄与したものと思われる。BEMD芽胞は開始肥料の両方と連携したことから、過剰な栄養源の存在下でも、ホスファターゼ活性によって、植物の生育増強がもたらされることが示唆される。BEMD芽胞と抗真菌剤を組み合わせることにより、BEMD芽胞単独よりも植物の生育が大きく増加したことから、早期の生育期間中、若いトウモロコシが保護されたことが示唆される。
実施例38.トウモロコシに対するストレスによる生育阻害を減少させるための葉面添加としてのBEMD芽胞の使用
BEMD芽胞提示系を用いて、農場または温室の生育中の植物の、何らかのストレスを緩和することができる酵素を送達しても良い。これを行うために、土壌中の活性酸素種に対して選択的に作用する酵素を選択した。活性酸素種は、植物におけるストレスの重要なマーカーである。
キトシナーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、カタラーゼ、またはβ1,3−グルカナーゼ(Bacillus thuringiensis BT013A由来)に連結された配列番号1のアミノ酸1〜35の標的化配列を含有する融合タンパク質を発現するBEMD芽胞を作製した。合成された遺伝子をpMK4にクローニングし、Bacillus thuringiensis BT013Aに導入した。様々なタンパク質融合物を提示する芽胞は、脳心臓滲出液体培地中で形質転換された細菌を、10μg/mlのクロラムフェニコールの選択圧と共に増殖させ、普通寒天プレートに置き、3日間、30℃でインキュベートすることにより作製した。3日後、芽胞をプレートから洗い流し、遠心により精製し、PBS中に1x10CFU/mlで再懸濁した。
3週齢のトウモロコシ(V5ステージ)は、T5ランプ、54ワットを用いた最適な光の下で、15.5〜25.5℃の間に制御された温度条件下、1日当たり13時間光を当てられ、生育された。植物は、試験の間、3日毎に水を十分に与えられた。植物がV5に到達したとき、BEMD芽胞または陽性対照化学物質を、1x10BEMD芽胞/ml、または、当該化学物質に推奨される濃度のいずれかで、葉にスプレーした。トータルで1mlのスプレーを各植物に個々に適用した。植物の高さは、葉面スプレー適用の少し前に計測した。次いで、32.2℃まで加温し、水やりを週に1度に減らすことにより、トウモロコシにストレスを与えた。2週間の間、ストレス条件下に植物を置いた。2週間の最後、植物の高さを再度計測し、外観を記録した。ストレス条件下では、対照処置群において植物の生育は最小であった。水のみの対照と比較して、2週間にわたり植物の高さが増加することにより、ストレス条件下でも生育し続けていると記録された。結果を以下の表30に示す。
Figure 2016520525
いくつかのストレス除去酵素を、上述の表30に示されるように、BEMD系を用いてトウモロコシに適用した。対照芽胞は有意な効果が無かった(植物の高さが−1.6%の減少)。BEMDキトシナーゼ酵素は、その基質であるキトサンと組み合わせた場合に、ポジティブな効果が得られた。最も良く作用した2つの酵素は、BEMD β−1,3−グルカナーゼおよびBEMDスーパーオキシドジムスターゼであった。BEMD β−1,3−グルカナーゼは、主に抗真菌活性を有しているが、植物に対し直接な効果を与えることもできる。サリチル酸およびBTHは、葉面アッセイに対する陽性対照であり、陽性反応は両方に対して認められた。この葉面送達法は、季節な様々なタイミングで、植物にストレス除去酵素を送達するのに有用である。
実施例39.様々なシグマ−K含有プロモーターを使用した融合タンパク質の発現レベル
上述の実施例23に示されているように、標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片のの天然型プロモーターを置き換えることにより、Bacillus cereusファミリーの芽胞のエキソスポリウムで発現される融合タンパク質のレベルに大きな影響を与えることができる。たとえば、天然型であるBclAプロモーターをBclBプロモーターに置き換えることにより、Bacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞の表面上の融合タンパク質のレベルは大きく減少する。あるいは、天然型であるBclBプロモーターをBclAプロモーターと置き換えることにより、エキソスポリウム上の融合タンパク質のレベルは劇的に増加する。
その天然型芽胞形成プロモーターの制御下にある様々なエキソスポリウムタンパク質の相対プロモーター発現レベルは、Bergman et al.,2008のマイクロアレイデータから得た。相対発現レベルは、後期芽胞形成期(実験開始から300分、シグマKプロモーターが最も活性を有するとき)に測定された。シグマKプロモーターは、エキソスポリウム局在化遺伝子および関連タンパク質の発現にとって重要なプロモーターである。相対発現は、全ての所与の時間で、染色体の他の全ての遺伝子の平均と比較した、遺伝子の発現レベルの増加である。以下の表31において、Bacillus cereusファミリーのメンバーにおいて、シグマKにより誘導された様々な遺伝子の送達発現レベルを示す。
Figure 2016520525
上述を考慮すれば、本発明の複数の目的が達成され、および、他の有益な結果も得られたことがあきらかであろう。
上述の融合タンパク質、Bacillus cereusファミリーのメンバー、製剤、および方法には、本発明の主旨から逸脱することなく様々な改変が可能であり、上述の明細書に含まれ、および添付の図面に示されるすべての内容は、解説と解釈され、限定の意図は無いとみなされるべきである。

Claims (239)

  1. 植物生育刺激タンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、または、植物結合タンパク質もしくはペプチドを少なくとも1つ、および:
    (a)配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する標的化配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は少なくとも約54%である、前記標的化配列;
    (b)配列番号1のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
    (c)配列番号1のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
    (d)配列番号1を含有する標的化配列;
    (e)配列番号2と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (f)配列番号3のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
    (g)配列番号3のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
    (h)配列番号3を含有する標的化配列;
    (i)配列番号4と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (j)配列番号5のアミノ酸1〜38を含有する標的化配列;
    (k)配列番号5のアミノ酸23〜38を含有する標的化配列;
    (l)配列番号5を含有する標的化配列;
    (m)配列番号6と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (n)配列番号7のアミノ酸1〜28を含有する標的化配列;
    (o)配列番号7のアミノ酸13〜28を含有する標的化配列;
    (p)配列番号7を含有する標的化配列;
    (q)配列番号8と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (r)配列番号9のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (s)配列番号9のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (t)配列番号9を含有する標的化配列;
    (u)配列番号10と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (v)配列番号11のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (w)配列番号11のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (x)配列番号11を含有する標的化配列;
    (y)配列番号12と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (z)配列番号13のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (aa)配列番号13のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (ab)配列番号13を含有する標的化配列;
    (ac)配列番号14と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ad)配列番号15のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
    (ae)配列番号15のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
    (af)配列番号15を含有する標的化配列;
    (ag)配列番号16と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ah)配列番号17のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
    (ai)配列番号17のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
    (aj)配列番号17を含有する標的化配列;
    (ak)配列番号18と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (al)配列番号19のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (am)配列番号19のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (an)配列番号19を含有する標的化配列;
    (ao)配列番号20と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ap)配列番号21のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (aq)配列番号21のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (ar)配列番号21を含有する標的化配列;
    (as)配列番号22と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (at)配列番号23のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (au)配列番号23のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (av)配列番号23を含有する標的化配列;
    (aw)配列番号24と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ax)配列番号25のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (ay)配列番号25のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (az)配列番号25を含有する標的化配列;
    (ba)配列番号26と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bb)配列番号27のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
    (bc)配列番号27のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
    (bd)配列番号27を含有する標的化配列;
    (be)配列番号28と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bf)配列番号29のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (bg)配列番号29のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (bh)配列番号29を含有する標的化配列;
    (bi)配列番号30と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bj)配列番号31のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (bk)配列番号31のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (bl)配列番号31を含有する標的化配列;
    (bm)配列番号32と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bn)配列番号33のアミノ酸1〜15を含有する標的化配列;
    (bo)配列番号33を含有する標的化配列;
    (bp)配列番号34と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bq)配列番号35のアミノ酸1〜16を含有する標的化配列;
    (br)配列番号35を含有する標的化配列;
    (bs)配列番号36と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bt)配列番号43のアミノ酸1〜29を含有する標的化配列;
    (bu)配列番号43のアミノ酸14〜29を含有する標的化配列;
    (bv)配列番号43を含有する標的化配列;
    (bw)配列番号44と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bx)配列番号45のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
    (by)配列番号45のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
    (bz)配列番号45を含有する標的化配列;
    (ca)配列番号46と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cb)配列番号47のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
    (cc)配列番号47のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
    (cd)配列番号47を含有する標的化配列;
    (ce)配列番号48と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cf)配列番号49のアミノ酸1〜32を含有する標的化配列;
    (cg)配列番号49のアミノ酸17〜32を含有する標的化配列;
    (ch)配列番号49を含有する標的化配列;
    (ci)配列番号50と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cj)配列番号51のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (ck)配列番号51のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (cl)配列番号51を含有する標的化配列;
    (cm)配列番号52と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cn)配列番号53のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (co)配列番号53のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (cp)配列番号53を含有する標的化配列;
    (cq)配列番号54と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cr)配列番号55のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
    (cs)配列番号55のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
    (ct)配列番号55を含有する標的化配列;
    (cu)配列番号56と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cv)配列番号57のアミノ酸1〜130を含有する標的化配列;
    (cw)配列番号57のアミノ酸115〜130を含有する標的化配列;
    (cx)配列番号57を含有する標的化配列;
    (cy)配列番号58と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cz)配列番号59と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質断片;
    (da)配列番号60を含有する標的化配列;
    (db)配列番号61を含有する標的化配列;
    (dc)配列番号62を含有する標的化配列;
    (dd)配列番号63を含有する標的化配列;
    (de)配列番号64を含有する標的化配列;
    (df)配列番号65を含有する標的化配列;
    (dg)配列番号66を含有する標的化配列;
    (dh)配列番号67を含有する標的化配列;
    (di)配列番号68を含有する標的化配列;
    (dj)配列番号69を含有する標的化配列;
    (dk)配列番号70を含有する標的化配列;
    (dl)配列番号71と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dm)配列番号72と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dn)配列番号73と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (do)配列番号74と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dp)配列番号75と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dq)配列番号76と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dr)配列番号77と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ds)配列番号78と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dt)配列番号79と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (du)配列番号80と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dv)配列番号81と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dw)配列番号82と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dx)配列番号83と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dy)配列番号84と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dz)配列番号1のアミノ酸22〜31を含有する標的化配列;
    (ea)配列番号1のアミノ酸22〜33を含有する標的化配列;
    (eb)配列番号1のアミノ酸20〜31を含有する標的化配列;
    (ec)配列番号3のアミノ酸14〜23を含有する標的化配列;
    (ed)配列番号3のアミノ酸14〜25を含有する標的化配列;または、
    (ef)配列番号3のアミノ酸12〜23を含有する標的化配列、
    を含有する融合タンパク質であって、
    ここで、前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、ペプチドホルモン、非ホルモン性ペプチド、または植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有する、前記融合タンパク質。
  2. 病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ、および:
    (a)16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列からなる標的化配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は少なくとも約54%である、前記標的化配列;
    (b)配列番号1のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
    (c)配列番号1のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
    (d)配列番号1を含有する標的化配列;
    (e)配列番号60を含有する標的化配列;
    (f)配列番号3のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
    (g)配列番号3のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
    (h)配列番号3を含有する標的化配列;
    (i)配列番号4と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (j)配列番号5のアミノ酸1〜38を含有する標的化配列;
    (k)配列番号5のアミノ酸23〜38を含有する標的化配列;
    (l)配列番号5を含有する標的化配列;
    (m)配列番号6と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (n)配列番号7のアミノ酸1〜28を含有する標的化配列;
    (o)配列番号7のアミノ酸13〜28を含有する標的化配列;
    (p)配列番号7を含有する標的化配列;
    (q)配列番号8と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (r)配列番号9のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (s)配列番号9のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (t)配列番号9を含有する標的化配列;
    (u)配列番号10と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (v)配列番号11のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (w)配列番号11のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (x)配列番号11を含有する標的化配列;
    (y)配列番号12と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (z)配列番号13のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (aa)配列番号13のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (ab)配列番号13を含有する標的化配列;
    (ac)配列番号14と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ad)配列番号15のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
    (ae)配列番号15のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
    (af)配列番号15を含有する標的化配列;
    (ag)配列番号16と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ah)配列番号17のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
    (ai)配列番号17のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
    (aj)配列番号17を含有する標的化配列;
    (ak)配列番号18と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (al)配列番号19のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (am)配列番号19のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (an)配列番号19を含有する標的化配列;
    (ao)配列番号20と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ap)配列番号21のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (aq)配列番号21のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (ar)配列番号21を含有する標的化配列;
    (as)配列番号22と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (at)配列番号23のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (au)配列番号23のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (av)配列番号23を含有する標的化配列;
    (aw)配列番号24と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ax)配列番号25のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (ay)配列番号25のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (az)配列番号25を含有する標的化配列;
    (ba)配列番号26と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bb)配列番号27のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
    (bc)配列番号27のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
    (bd)配列番号27を含有する標的化配列;
    (be)配列番号28と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bf)配列番号29のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (bg)配列番号29のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (bh)配列番号29を含有する標的化配列;
    (bi)配列番号30と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bj)配列番号31のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (bk)配列番号31のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (bl)配列番号31を含有する標的化配列;
    (bm)配列番号32と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bn)配列番号33のアミノ酸1〜15を含有する標的化配列;
    (bo)配列番号33を含有する標的化配列;
    (bp)配列番号34と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bq)配列番号35のアミノ酸1〜16を含有する標的化配列;
    (br)配列番号35を含有する標的化配列;
    (bs)配列番号36と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bt)配列番号43のアミノ酸1〜29を含有する標的化配列;
    (bu)配列番号43のアミノ酸14〜29を含有する標的化配列;
    (bv)配列番号43を含有する標的化配列;
    (bw)配列番号44と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bx)配列番号45のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
    (by)配列番号45のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
    (bz)配列番号45を含有する標的化配列;
    (ca)配列番号46と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cb)配列番号47のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
    (cc)配列番号47のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
    (cd)配列番号47を含有する標的化配列;
    (ce)配列番号48と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cf)配列番号49のアミノ酸1〜32を含有する標的化配列;
    (cg)配列番号49のアミノ酸17〜32を含有する標的化配列;
    (ch)配列番号49を含有する標的化配列;
    (ci)配列番号50と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cj)配列番号51のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (ck)配列番号51のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (cl)配列番号51を含有する標的化配列;
    (cm)配列番号52と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cn)配列番号53のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (co)配列番号53のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (cp)配列番号53を含有する標的化配列;
    (cq)配列番号54と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cr)配列番号55のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
    (cs)配列番号55のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
    (ct)配列番号55を含有する標的化配列;
    (cu)配列番号56と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cv)配列番号57のアミノ酸1〜130を含有する標的化配列;
    (cw)配列番号57のアミノ酸115〜130を含有する標的化配列;
    (cx)配列番号57を含有する標的化配列;
    (cy)配列番号58と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cz)配列番号59と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質断片;
    (da)配列番号61を含有する標的化配列;
    (db)配列番号62を含有する標的化配列;
    (dc)配列番号63を含有する標的化配列;
    (dd)配列番号64を含有する標的化配列;
    (de)配列番号65を含有する標的化配列;
    (df)配列番号66を含有する標的化配列;
    (dg)配列番号67を含有する標的化配列;
    (dh)配列番号68を含有する標的化配列;
    (di)配列番号69を含有する標的化配列;
    (dj)配列番号70を含有する標的化配列;
    (dk)配列番号71と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dl)配列番号72と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dm)配列番号73と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dn)配列番号74と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (do)配列番号75と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dp)配列番号76と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dq)配列番号77と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dr)配列番号78と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ds)配列番号79と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dt)配列番号80と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (du)配列番号81と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dv)配列番号82と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dw)配列番号83と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dx)配列番号84と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dy)配列番号1のアミノ酸22〜31を含有する標的化配列;
    (dz)配列番号1のアミノ酸22〜33を含有する標的化配列;
    (ea)配列番号1のアミノ酸20〜31を含有する標的化配列;
    (eb)配列番号3のアミノ酸14〜23を含有する標的化配列;
    (ec)配列番号3のアミノ酸14〜25を含有する標的化配列;または、
    (ed)配列番号3のアミノ酸12〜23を含有する標的化配列、
    を含有する融合タンパク質。
  3. 病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ、および:
    (a)配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する標的化配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は少なくとも約54%である、前記標的化配列;
    (b)配列番号1のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
    (c)配列番号1のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
    (d)配列番号1を含有する標的化配列;
    (e)配列番号2と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (f)配列番号3のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
    (g)配列番号3のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
    (h)配列番号3を含有する標的化配列;
    (i)配列番号4と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (j)配列番号5のアミノ酸1〜38を含有する標的化配列;
    (k)配列番号5のアミノ酸23〜38を含有する標的化配列;
    (l)配列番号5を含有する標的化配列;
    (m)配列番号6と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (n)配列番号7のアミノ酸1〜28を含有する標的化配列;
    (o)配列番号7のアミノ酸13〜28を含有する標的化配列;
    (p)配列番号7を含有する標的化配列;
    (q)配列番号8と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (r)配列番号9のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (s)配列番号9のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (t)配列番号9を含有する標的化配列;
    (u)配列番号10と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (v)配列番号11のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (w)配列番号11のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (x)配列番号11を含有する標的化配列;
    (y)配列番号12と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (z)配列番号13のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (aa)配列番号13のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (ab)配列番号13を含有する標的化配列;
    (ac)配列番号14と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ad)配列番号15のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
    (ae)配列番号15のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
    (af)配列番号15を含有する標的化配列;
    (ag)配列番号16と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ah)配列番号17のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
    (ai)配列番号17のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
    (aj)配列番号17を含有する標的化配列;
    (ak)配列番号18と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (al)配列番号19のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (am)配列番号19のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (an)配列番号19を含有する標的化配列;
    (ao)配列番号20と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ap)配列番号21のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (aq)配列番号21のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (ar)配列番号21を含有する標的化配列;
    (as)配列番号22と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (at)配列番号23のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (au)配列番号23のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (av)配列番号23を含有する標的化配列;
    (aw)配列番号24と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ax)配列番号25のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (ay)配列番号25のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (az)配列番号25を含有する標的化配列;
    (ba)配列番号26と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bb)配列番号27のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
    (bc)配列番号27のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
    (bd)配列番号27を含有する標的化配列;
    (be)配列番号28と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bf)配列番号29のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (bg)配列番号29のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (bh)配列番号29を含有する標的化配列;
    (bi)配列番号30と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bj)配列番号31のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (bk)配列番号31のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (bl)配列番号31を含有する標的化配列;
    (bm)配列番号32と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bn)配列番号33のアミノ酸1〜15を含有する標的化配列;
    (bo)配列番号33を含有する標的化配列;
    (bp)配列番号34と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bq)配列番号35のアミノ酸1〜16を含有する標的化配列;
    (br)配列番号35を含有する標的化配列;
    (bs)配列番号36と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bt)配列番号43のアミノ酸1〜29を含有する標的化配列;
    (bu)配列番号43のアミノ酸14〜29を含有する標的化配列;
    (bv)配列番号43を含有する標的化配列;
    (bw)配列番号44と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bx)配列番号45のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
    (by)配列番号45のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
    (bz)配列番号45を含有する標的化配列;
    (ca)配列番号46と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cb)配列番号47のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
    (cc)配列番号47のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
    (cd)配列番号47を含有する標的化配列;
    (ce)配列番号48と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cf)配列番号49のアミノ酸1〜32を含有する標的化配列;
    (cg)配列番号49のアミノ酸17〜32を含有する標的化配列;
    (ch)配列番号49を含有する標的化配列;
    (ci)配列番号50と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cj)配列番号51のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (ck)配列番号51のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (cl)配列番号51を含有する標的化配列;
    (cm)配列番号52と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cn)配列番号53のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (co)配列番号53のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (cp)配列番号53を含有する標的化配列;
    (cq)配列番号54と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cr)配列番号55のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
    (cs)配列番号55のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
    (ct)配列番号55を含有する標的化配列;
    (cu)配列番号56と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cv)配列番号57のアミノ酸1〜130を含有する標的化配列;
    (cw)配列番号57のアミノ酸115〜130を含有する標的化配列;
    (cx)配列番号57を含有する標的化配列;
    (cy)配列番号58と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cz)配列番号59と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質断片;
    (da)配列番号60を含有する標的化配列;
    (db)配列番号61を含有する標的化配列;
    (dc)配列番号62を含有する標的化配列;
    (dd)配列番号63を含有する標的化配列;
    (de)配列番号64を含有する標的化配列;
    (df)配列番号65を含有する標的化配列;
    (dg)配列番号66を含有する標的化配列;
    (dh)配列番号67を含有する標的化配列;
    (di)配列番号68を含有する標的化配列;
    (dj)配列番号69を含有する標的化配列;
    (dk)配列番号70を含有する標的化配列;
    (dl)配列番号71と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dm)配列番号72と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dn)配列番号73と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (do)配列番号74と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dp)配列番号75と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dq)配列番号76と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dr)配列番号77と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ds)配列番号78と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dt)配列番号79と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (du)配列番号80と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dv)配列番号81と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dw)配列番号82と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dx)配列番号83と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dy)配列番号84と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dz)配列番号1のアミノ酸22〜31を含有する標的化配列;
    (ea)配列番号1のアミノ酸22〜33を含有する標的化配列;
    (eb)配列番号1のアミノ酸20〜31を含有する標的化配列;
    (ec)配列番号3のアミノ酸14〜23を含有する標的化配列;
    (ed)配列番号3のアミノ酸14〜25を含有する標的化配列;または、
    (ef)配列番号3のアミノ酸12〜23を含有する標的化配列、
    を含有する融合タンパク質であって、
    ここで、前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、ハーピン、αエラスチン、βエラスチン、システミン、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、エリシチン、ディフェンシン、クリプトゲイン、フラジェリンタンパク質、フラジェリンペプチド、バクテリオシン、リゾチーム、リゾチームペプチド、シデロフォア、非リボソーム活性ペプチド、コンアルブミン、アルブミン、ラクトフェリン、ラクトフェリンペプチド、またはTasAを含有し;ここで、前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、殺虫活性、殺蠕虫活性を有するか、または、昆虫もしくは蠕虫の捕食を抑制するか、またはそれらの組み合わせであり;または、ここで、前記病原体から植物を防御するタンパク質は、酵素を含有する、前記融合タンパク質。
  4. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  5. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  6. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約56%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  7. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約62%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  8. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約68%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  9. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  10. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  11. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  12. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約90%である、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  13. 前記標的化配列が、
    (a)16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約54%である、前記アミノ酸配列;
    (b)配列番号1のアミノ酸1〜35;
    (c)配列番号1のアミノ酸20〜35;
    (d)配列番号1;または、
    (e)配列番号60、
    からなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  14. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  15. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  16. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約56%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  17. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約62%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  18. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約68%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  19. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  20. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  21. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  22. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約90%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  23. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  24. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  25. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  26. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  27. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と100%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項1または3に記載の融合タンパク質。
  28. 配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質、または、配列番号59と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項2に記載の融合タンパク質。
  29. 配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質、または、配列番号59と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列からなるエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項2に記載の融合タンパク質。
  30. 配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質、または、配列番号59と少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列からなるエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項2に記載の融合タンパク質。
  31. 配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質、または、配列番号59と少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列からなるエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項2に記載の融合タンパク質。
  32. 配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と100%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質、または、配列番号59と少なくとも100%の同一性を有するアミノ酸配列からなるエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項2に記載の融合タンパク質。
  33. 対象のタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ、および:
    (a)配列番号71と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (b)配列番号75と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (c)配列番号80と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (d)配列番号81と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (e)配列番号82と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (f)配列番号83と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;または、
    (g)配列番号84と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    を含有する融合タンパク質。
  34. 配列番号71、75、80、81、82、83、または84と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質を含有する、請求項33に記載の融合タンパク質。
  35. 配列番号71、75、80、81、82、83、または84と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質を含有する、請求項33に記載の融合タンパク質。
  36. 配列番号71、75、80、81、82、83、または84と少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質を含有する、請求項33に記載の融合タンパク質。
  37. 配列番号71、75、80、81、82、83、または84と少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質を含有する、請求項33に記載の融合タンパク質。
  38. 配列番号71、75、80、81、82、83、または84と100%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質を含有する、請求項33に記載の融合タンパク質。
  39. 前記対象のタンパク質またはペプチドが、植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質もしくはペプチド、または、植物結合タンパク質もしくはペプチド、を含有する、請求項33〜38のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  40. 前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、ペプチドホルモン、非ホルモン性ペプチド、または、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素、または、細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素、を含有する、請求項39に記載の融合タンパク質。
  41. 標的化配列、前記エキソスポリウムタンパク質、または前記エキソスポリウムタンパク質断片が、そのカルボキシ末端にアミノ酸配列GXTを含有し、ここで、Xは、任意のアミノ酸である、請求項1〜12、および33〜40のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  42. 前記標的化配列、前記エキソスポリウムタンパク質、または前記エキソスポリウムタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸20に相当する標的化配列の位置で、アラニン残基を含有する、請求項1〜12、および33〜41のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  43. 前記融合タンパク質がさらに、前記標的化配列、前記エキソスポリウムタンパク質、または、前記エキソスポリウムタンパク質断片と、前記植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、前記病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、前記植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質もしくはペプチド、または、前記植物結合タンパク質もしくはペプチド、の間にアミノ酸リンカーを含有する、請求項1〜12、および33〜42のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  44. 前記リンカーが、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー、または、アラニン残基とグリシン残基の両方の混合物を含有するリンカー、を含有する、請求項43に記載の融合タンパク質。
  45. 前記リンカーが、プロテアーゼ認識部位を含有する、請求項43または44の融合タンパク質。
  46. 前記融合タンパク質が、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを含有し、ここで、前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、ペプチドホルモン、非ホルモン性ペプチド、または、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素、を含有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
  47. 前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、ペプチドホルモンを含有する、請求項1、4〜7、および39〜46のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  48. 前記ペプチドホルモンが、フィトスルホカイン、クラバータ3(CLV3)、システミン、ZmlGF、またはSCR/SP11を含有する、請求項47に記載の融合タンパク質。
  49. 前記フィトスルホカインが、フィトスルホカイン−αを含有する、請求項48に記載の融合タンパク質。
  50. 前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、非ホルモン性ペプチドを含有する、請求項1、4〜27、および39〜46のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  51. 前記非ホルモン性ペプチドが、RKN 16D10、Hg−Syv46、eNOD40ペプチド、メリチン、マストパラン、Mas7、RHPP、POLARIS、または、kunitzトリプシンインヒビター(KTI)を含有する、請求項50に記載の融合タンパク質。
  52. 前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有する、請求項1、4〜27、および39〜46のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  53. 前記植物生育刺激化合物が、根圏で細菌または真菌により産生される化合物を含有する、請求項52に記載の融合タンパク質。
  54. 前記根圏で細菌または真菌により産生される化合物が、2,3−ブタンジオールを含有する、請求項53に記載の融合タンパク質。
  55. 前記植物生育刺激化合物が、植物成長ホルモンを含有する、請求項52に記載の融合タンパク質。
  56. 前記植物成長ホルモンが、サイトカイニンもしくはサイトカイニン誘導体、エチレン、オーキシンもしくはオーキシン誘導体、ジベレリン酸もしくはジベレリン酸誘導体、アブシジン酸もしくはアブシジン酸誘導体、ジャスモン酸もしくはジャスモン酸誘導体を含有する、請求項55に記載の融合タンパク質。
  57. 前記植物成長ホルモンが、サイトカイニンもしくはサイトカイニン誘導体を含有し、および、前記サイトカイニンもしくはサイトカイニン誘導体が、キネチン、シス−ゼアチン、トランス−ゼアチン、6−ベンジルアミノプリン、ジヒドロキシゼアチン、N6−(D2−イソペンテニル)アデニン、リボシルゼアチン、N6−(D2−イソペンテニル)アデノシン、2−メチルチオ−シス−リボシルゼアチン、シス−リボシルゼアチン、トランス−リボシルゼアチン、2−メチルチオ−トランス−リボシルゼアチン、リボシルゼアチン−5−モノスホスフェート、N6−メチルアミノプリン、N6−ジメチルアミノプリン、2’−デオキシゼアチンリボシド、4−ヒドロキシ−3−メチル−トランス−2−ブテニルアミノプリン、オルト−トポリン、メタ−トポリン、ベンジルアデニン、オルト−メチルトポリン、メタ−メチルトポリン、または、それらの組み合わせを含有し;または、前記植物成長ホルモンが、オーキシンまたはオーキシン誘導体を含有し、および、前記オーキシンまたはオーキシン誘導体が、活性型オーキシン、不活性型オーキシン、結合オーキシン、天然型オーキシン、合成オーキシン、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項56に記載の融合タンパク質。
  58. 前記植物成長ホルモンが、オーキシンまたはオーキシン誘導体を含有し、および、前記オーキシンまたはオーキシン誘導体が、インドール−3−酢酸、インドール−3−ピルビン酸、インドール−3−アセトアルドキシム、インドール−3−アセトアミド、インドール−3−アセトニトリル、インドール−3−エタノール、インドール−3−ピルビン酸塩、インドール−3−アセトアルドキシム、インドール−3−酪酸、フェニル酢酸、4−クロロインドール−3−酢酸、グルコース結合オーキシン、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項56または57に記載の融合タンパク質。
  59. 前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドが、植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素を含有し、および、前記植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素が、アセトイン還元酵素、インドール−3−アセトアミド加水分解酵素、トリプトファンモノオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、αアセト乳酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ジアセチル還元酵素、ブタンジオール脱水素酵素、アミノトランスフェラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、アミンオキシダーゼ、インドール−3−ピルビン酸デカルボキシラーゼ、インドール−3−アセトアルデヒド脱水素酵素、トリプトファン側鎖オキシダーゼ、ニトリル加水分解酵素、ニトリラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、アデノシンホスフェートイソペンテニルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、アデノシンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、CYP735A、5’リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、ゼアチン シス−トランスイソメラーゼ、ゼアチン O−グルコシルトランスフェラーゼ、β−グルコシダーゼ、シス−ヒドロキシラーゼ、CKシス−ヒドロキシラーゼ、CK N−グルコシルトランスフェラーゼ、2,5−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ゼアチン還元酵素、ヒドロキシルアミン還元酵素、2−オキソグルタレートジオキシゲナーゼ、ジべレリン2B/3B加水分解酵素、ジベレリン3−オキシダーゼ、ジベレリン20−オキシダーゼ、キトシナーゼ、キチナーゼ、β−1,3−グルカナーゼ、β−1,4−グルカナーゼ、β−1,6−グルカナーゼ、アミノシクロプロパン−1−カルボン酸デアミナーゼ、または、ノッド因子の産生に関与する酵素を含有する、請求項52〜58のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  60. 前記植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素が、ノッド因子の産生に関与する酵素を含有し、前記ノッド因子の産生に関与する酵素が、nodA、nodB、またはnodIを含有し;または、前記植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素が、アミノトランスフェラーゼを含有し、および前記アミノトランスフェラーゼがトリプトファンアミノトランスフェラーゼを含有する、請求項59に記載の融合タンパク質。
  61. 前記植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素が、タンパク質、ペプチド、プロタンパク質、またはプレプロタンパク質を開裂して生物活性型ペプチドを生成するプロテアーゼまたはペプチダーゼを含有する、請求項59に記載の融合タンパク質。
  62. 前記プロテアーゼまたはペプチダーゼが、サブチリシン、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼを含有する、請求項61に記載の融合タンパク質。
  63. 前記生物活性型ペプチドが、RKN 16D10またはRHPPを含有する、請求項61または62に記載の融合タンパク質。
  64. 前記プロテアーゼまたはペプチダーゼが、タンパク質に富んだ食品中のタンパク質を開裂する、請求項61〜63のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  65. 前記タンパク質に富んだ食品が、大豆食品または酵母抽出物である、請求項64に記載の融合タンパク質。
  66. 前記細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素が、セルラーゼ、リパーゼ、リグニンオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシド加水分解酵素、ホスファターゼ、ニトロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵素、アミラーゼ、アンモニアオキシダーゼ、リグニナーゼ、グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ぺクチナーゼ、グルカナーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、キシラナーゼ、およびシデロフォアを含有する、請求項40に記載の融合タンパク質。
  67. 前記細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素が、セルラーゼを含有し、前記セルラーゼが、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ、またはβ−グルコシダーゼを含有する、請求項66に記載の融合タンパク質。
  68. 前記セルラーゼが、エンドセルラーゼを含有し、および前記エンドセルラーゼがエンドグルカナーゼを含有する、請求項67に記載の融合タンパク質。
  69. 前記セルラーゼがエンドセルラーゼを含有し、および、前記エンドセルラーゼがBacillus subtilisエンドグルカナーゼ、Bacillus thuringiensisエンドグルカナーゼ、Bacillus cereusエンドグルカナーゼ、または、Bacillus clausiiエンドグルカナーゼを含有する、請求項67または68に記載の融合タンパク質。
  70. 前記セルラーゼがエキソセルラーゼを含有し、および、前記エキソセルラーゼが、Trichoderma reeseiエキソセルラーゼを含有する、請求項67に記載の融合タンパク質。
  71. 前記セルラーゼが、β−グルコシダーゼを含有し、および、前記β−グルコシダーゼが、Bacillus subtilisβ−グルコシダーゼ、Bacillus thuringiensis β−グルコシダーゼ、Bacillus cereus β−グルコシダーゼ、または、Bacillus clausii β−グルコシダーゼを含有する、請求項67に記載の融合タンパク質。
  72. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がリパーゼを含有し、前記リパーゼが、Bacillus subtilisリパーゼ、Bacillus thuringiensisリパーゼ、Bacillus cereusリパーゼ、または、Bacillus clausiiリパーゼを含有する、請求項66に記載の融合タンパク質。
  73. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がリグニンオキシダーゼを含有し、前記リグニンオキシダーゼが、リグニンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グリオキサルオキシダーゼ、リグニナーゼ、およびマンガンペルオキシダーゼを含有する、請求項66に記載の融合タンパク質。
  74. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がプロテアーゼを含有し、前記プロテアーゼが、サブチリシン、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼを含有する、請求項66に記載の融合タンパク質。
  75. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がホスファターゼを含有し、および、前記ホスファターゼがリン酸モノエステル加水分解酵素、ホスホモノエステラーゼ、リン酸ジエステル加水分解酵素、ホスホジエステラーゼ、三リン酸モノエステル加水分解酵素、無水ホスホリル加水分解酵素、ピロホスファターゼ、フィターゼ、トリメタホスファターゼ、またはトリホスファターゼを含有する、請求項66に記載の融合タンパク質。
  76. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がホスホモノエステラーゼを含有し、および、前記ホスホモノエステラーゼが、PhoA4を含有し;または、前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がフィターゼを含有し、および、前記フィターゼが、Bacillus subtilis EE148フィターゼ、または、Bacillus thuringiensis BT013Aフィターゼを含有する、請求項75に記載の融合タンパク質。
  77. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がニトロゲナーゼを含有し、および、前記ニトロゲナーゼが、Nifファミリーのニトロゲナーゼを含有する、請求項66に記載の融合タンパク質。
  78. 前記Nifファミリーのニトロゲナーゼが、Paenibacillus massiliensis NifBDEHKNXVを含有する、請求項77に記載の融合タンパク質。
  79. 前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドが、植物免疫システム増強タンパク質またはペプチドを含有する、請求項2、13〜22、28〜32、39、および41〜45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  80. 前記植物免疫システム増強タンパク質またはペプチドは、ハーピン、α−エラスチン、β−エラスチン、システミン、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ、エリシチン、ディフェンシン、クリプトゲイン、フラジェリンタンパク質またはフラジェリンペプチドを含有する、請求項79に記載の融合タンパク質。
  81. 前記フラジェリンペプチドは、flg22を含有する、請求項3または80に記載の融合タンパク質。
  82. 前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドが、抗細菌活性、抗真菌活性、または、抗細菌活性と抗真菌活性の両方を有する、請求項2、3、13〜22、28〜32、39、および41〜45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  83. 前記タンパク質またはペプチドが、バクテリオシン、リゾチーム、リゾチームペプチド、シデロフォア、非リボソーム活性ペプチド、コンアルブミン、アルブミン、ラクトフェリン、ラクトフェリンペプチド、またはTasAを含有する、請求項82に記載の融合タンパク質。
  84. 前記リゾチームペプチドが、LysMを含有するか、または、前記ラクトフェリンペプチドが、LfcinBを含有する、請求項3または83に記載の融合タンパク質。
  85. 前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、殺虫活性、殺蠕虫活性を有するか、昆虫もしくは蠕虫の捕食を抑制するか、またはそれらの組み合わせである、請求項2、3、13〜22、28〜32、39、および41〜45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  86. 前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、殺虫性細菌毒素、エンドトキシン、Cry毒素、プロテアーゼインヒビタータンパク質もしくはペプチド、システインプロテアーゼ、またはキチナーゼを含有する、請求項85に記載の融合タンパク質。
  87. 前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、殺虫性細菌毒素を含有し、および、前記殺虫性細菌毒素は、VIP殺虫性毒素を含有し;ここで、前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、プロテアーゼインヒビタータンパク質またはペプチドを含有し、前記プロテアーゼインヒビタータンパク質またはペプチドは、トリプシンインヒビターまたはクワイプロテアーゼインヒビターを含有し;または、前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、Cry毒素を含有し、および前記Cry毒素は、Bacillus thuringiensis由来のCry毒素を含有する、請求項86に記載の融合タンパク質。
  88. 前記Cry毒素は、Bacillus thuringiensis由来のCry毒素を含有し、および、前記Cry毒素は、含有し前記Bacillus thuringiensis由来のCry毒素は、Cry5Bタンパク質またはCry21Aタンパク質を含有する、請求項87に記載の融合タンパク質。
  89. 前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、酵素を含有する、請求項2、3、13〜22、28〜32、39、および41〜45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  90. 前記酵素は、プロテアーゼまたはラクトナーゼを含有する、請求項3または89に記載の融合タンパク質。
  91. 前記プロテアーゼまたはラクトナーゼは、細菌性シグナル伝達分子に特異的である、請求項90に記載の融合タンパク質。
  92. 前記細菌性シグナル伝達分子は、細菌性ラクトンホモセリンシグナル伝達分子を含有する、請求項91に記載の融合タンパク質。
  93. 前記酵素はラクトナーゼを含有し、前記ラクトナーゼは、1,4−ラクトナーゼ、2−ピロン−4,6−ジカルボキシレートラクトナーゼ、3−オキソアジペートエノールラクトナーゼ、アクチノマイシンラクトナーゼ、デオキシリモネートA環−ラクトナーゼ、グルコノラクトナーゼL−ラムノノ−1、4−ラクトナーゼ、リモニン−D環−ラクトナーゼ、ステロイド−ラクトナーゼ、トリアセテート−ラクトナーゼ、または、キシロノ−1,4−ラクトナーゼを含有する、請求項90〜92のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  94. 前記酵素は、細菌または真菌の細胞成分に特異的である、請求項89に記載の融合タンパク質。
  95. 前記酵素が、β−1,3−グルカナーゼ、β−1,4−グルカナーゼ、β−1,6−グルカナーゼ、キトシナーゼ、キチナーゼ、キトシナーゼ様酵素、リチカーゼ、ペプチダーゼ、プロテイナーゼ、プロテアーゼ、ムタノリシン、スタホリシン、またはリゾチームを含有する、請求項94に記載の融合タンパク質。
  96. 前記プロテアーゼが、アルカリプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、または中性プロテアーゼを含有する、請求項95に記載の融合タンパク質。
  97. 前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、細菌性病原体、真菌性病原体、蠕虫病原体、または昆虫病原体から植物を防御する、請求項2、3、13〜22、28〜23、29、41〜45、および79〜96のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  98. 前記細菌性病原体は、αクラスプロテオバクテリア、βクラスプロテオバクテリア、γクラスプロテオバクテリア、または、それらの組み合わせを含有するか;または、前記細菌性病原体は、Agrobacterium tumefaciens、Pantoea stewartii、Erwinia carotovora、Ralstonia solanacearum、Pseudomonas syringae、Pseudomonas aeruginosa、Xanthomonas campestris、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項97に記載の融合タンパク質。
  99. 前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、蠕虫または昆虫の病原体による捕食から植物を防御する、請求項97に記載の融合タンパク質。
  100. 前記蠕虫または昆虫の病原体は、ヨトウムシ(army worm)、タマナヤガ、European corn borer、ツマジロクサヨトウ、ヨトウムシ(cutworm)、マメコガネ、lesser cornstalk borer、maize billbug、seed corn maggot、webworm、southern cornstalk borer、southern corn rootworm、southern potato wireworm、stalk borer、sugarcane beetle、コガネムシの幼虫、cabbage looper、ワタミハナゾウムシ、yellow striped armyworm、cereal leaf beetle、ヒメコガネナガカメムシ、アブラムシ、ビートアワヨトウ、インゲンテントウ、soybean looper、soybean stem borer、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項97または99に記載の融合タンパク質。
  101. 前記融合タンパク質は、植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
  102. 前記植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドは、ストレス関連化合物を分解する酵素を含有する、請求項1、4〜27、39および41〜45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  103. 前記ストレス関連化合物には、アミノシクロプロパン−1−カルボン酸(ACC)、活性酸素種、一酸化窒素、オキシリピン、フェノール類、またはそれらの組み合わせが含まれる、請求項102に記載の融合タンパク質。
  104. 前記ストレス関連化合物を分解する酵素には、スーパーオキシドジスムターゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ、アミノシクロプロパン−1−カルボン酸デアミナーゼ、ペルオキシダーゼ、抗酸化酵素、または、抗酸化ペプチドが含まれる、請求項102または103に記載の融合タンパク質。
  105. 前記植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドには、環境ストレスから植物を防御するタンパク質またはペプチドが含まれる、請求項1、4〜27、39および41〜45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  106. 前記環境ストレスには、干ばつ、洪水、高温、凍結、塩、重金属、低pH、高pH、またはそれらの組み合わせが含まれる、請求項105に記載の融合タンパク質。
  107. 前記環境ストレスから植物を防御するタンパク質またはペプチドには、氷核形成タンパク質、プロリナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、イソコリスミ酸シンターゼ、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ、またはコリン脱水素酵素が含まれる、請求項105または106に記載の融合タンパク質。
  108. 前記融合タンパク質は、植物結合タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ含有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
  109. 前記植物結合タンパク質またはペプチドには、アドヘシン、フラジェリン、オムプチン、レクチン、エクスパンシン、バイオフィルム構造タンパク質、線毛タンパク質、カーラスタンパク質、インチミン、インベーシン、アグルチニン、および、非線毛タンパク質が含まれる、請求項1、4〜27、39および41〜45のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
  110. 前記植物結合タンパク質はアドヘシンを含有し、前記アドヘシンはリカドヘシン(rhicadhesin)を含有し;または、前記植物結合タンパク質はバイオフィルム構造タンパク質を含有し、および前記バイオフィルム構造タンパク質はTasAまたはYuaBを含有する、請求項109に記載の融合タンパク質。
  111. 請求項1〜110のいずれか1項に記載の融合タンパク質を発現する組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  112. 請求項1〜107のいずれか1項に記載の、植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、または、植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質もしくはペプチドを含有する融合タンパク質を少なくとも1つ、および、請求項1、4〜27、39、41〜45、および108〜110のいずれか1項に記載の植物結合タンパク質またはペプチドを含有する融合タンパク質を少なくとも1つ、を共発現する、組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  113. 前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーには、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Bacillus mycoides、Bacillus pseudomycoides、Bacillus samanii、Bacillus gaemokensis、Bacillus weihenstephensi、またはそれらの組み合わせが含まれる、請求項111または112に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  114. 前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーには、Bacillus thuringiensis、または、Bacillus mycoidesが含まれる、請求項111〜113のいずれかに記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  115. 前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーには、植物生育促進細菌株が含まれる、請求項111〜114のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  116. 前記植物生育促進細菌株は、殺虫性毒素を産生する、殺真菌性化合物を産生する、殺線虫性化合物を産生する、殺菌性化合物を産生する、1以上の抗生物質に対して抵抗性である、1以上の遊離複製プラスミドを含有する、植物の根に結合する、植物の根にコロニー形成する、バイオフィルムを形成する、栄養素を可溶化する、有機酸を分泌する、またはそれらの組み合わせである、請求項115に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  117. 前記殺虫性毒素にはCry毒素が含まれ;前記殺真菌性化合物には、β−1,3−グルカナーゼ、キトシナーゼ、リチカーゼ、またはそれらの組み合わせが含まれ;または、前記殺線虫性化合物にはCry毒素が含まれる、請求項116に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  118. 前記植物生育促進細菌株には、Bacillus mycoides BT155、Bacillus mycoides EE118、Bacillus mycoides EE141、Bacillus mycoides BT46−3、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE128、Bacillus thuringiensis BT013A、または、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE349が含まれる、請求項115〜117のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  119. 前記植物生育促進細菌株には、Bacillus mycoides BT155、Bacillus mycoides EE141、または、Bacillus thuringiensis BT013Aが含まれる、請求項118に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  120. 前記融合タンパク質は、配列番号60の標的化配列を含有する、請求項119に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  121. 前記非ホルモン性ペプチドは、kunitzトリプシンインヒビター(KTI)を含有し;前記植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素は、キトシナーゼを含有し;前記植物結合タンパク質またはペプチドは、TasAを含有し;前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、TasAを含有し;または、前記細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素は、ホスファターゼまたはエンドグルカナーゼを含有する、請求項120に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  122. 前記ホスファターゼは、PhoAまたはフィターゼを含有する、請求項121に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  123. 前記融合タンパク質は、前記融合タンパク質の標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片に対して天然型である芽胞形成プロモーターの制御下で発現される、請求項111〜122のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  124. 前記融合タンパク質は、高発現芽胞形成プロモーターの制御下で発現される、請求項111〜123のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  125. 前記高発現芽胞形成プロモーターには、シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列が含まれる、請求項124に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  126. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも80%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項123〜125のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  127. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項126に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  128. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも95%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項126に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  129. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも98%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項126に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  130. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項126に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  131. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と100%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項126に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  132. 前記シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列(複数含む)は、配列番号85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、または103の相当するヌクレオチドと100%の同一性を有する、請求項125〜130のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー。
  133. 請求項111〜132のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーおよび農学的に受容可能な担体を含有する製剤。
  134. 前記農学的に受容可能な担体には、分散剤、界面活性剤、添加剤、水、増粘剤、凝固防止剤、残基分解物、たい肥化剤、粒状塗布物、珪藻土、油、着色剤、安定化剤、防腐剤、ポリマー類、コーティング、およびそれらの組み合わせが含まれる、請求項133に記載の製剤。
  135. 前記農学的に受容可能な担体には、添加剤が含まれ、および、前記添加剤には、油、ゴム、樹脂、粘土、ポリオキシエチレングリコール、テルペン、粘着性有機物、脂肪酸エステル、硫酸化アルコール、スルホン酸アルキル、硫酸化石油、アルコール硫酸、ナトリウムアルキルブタンジアメート(sodium alkyl butane diamate)、ナトリウムチオブタンジオエートのポリエステル、ベンゼンアセトニトリル誘導体、タンパク質性物質または、それらの組み合わせが含まれ;前記農学的に受容可能な担体には、増粘剤が含まれ、および前記増粘剤には、ポリエチレングリコールの長鎖スルホン酸アルキル、オレイン酸ポリオキシエチレン、またはそれらの組み合わせが含まれ;前記農学的に受容可能な担体には、界面活性剤が含まれ、および前記界面活性剤には、重油、重油蒸留物、ポリオール脂肪酸エステル、ポリエトキシル化脂肪酸エステル、アリールアルキルポリオキシエチレングリコール、アルキル酢酸アミン、アルキルスルホン酸アリール、多価アルコール、リン酸アルキル、またはそれらの組み合わせが含まれ;または、前記農学的に受容可能な担体には、凝固防止剤が含まれ、および前記凝固防止剤には、ナトリウム塩、炭酸カルシウム、珪藻土、またはそれらの組み合わせが含まれる、請求項134に記載の製剤。
  136. 添加剤が、タンパク質性物質を含有し、および、前記タンパク質性物質が、乳製品、小麦粉、大豆ミール、血液、アルブミン、ゼラチン、またはそれらの組み合わせを含有し;または、前記凝固防止剤が、ナトリウム塩を含有し、および、前記ナトリウム塩が、モノメチルスルホン酸ナフタレンのナトリウム塩、ジメチルスルホン酸ナフタレンのナトリウム塩、亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項135に記載の製剤。
  137. 前記農学的に受容可能な担体には、バーミキュライト、木炭、製糖工場の炭酸化プレス泥、もみ殻、カルボキシメチルセルロース、泥炭、パーライト、細砂、炭酸カルシウム、粉末、ミョウバン、デンプン、滑石、ポリビニルピロリドン、またはそれらの組み合わせが含まれる、請求項133〜136のいずれか1項に記載の製剤。
  138. 前記製剤には、種子コーティング製剤、植物もしくは植物生育環境への適用のための液体製剤、または、植物もしくは植物生育環境への適用のための固形製剤が含まれる、請求項133〜137のいずれか1項に記載の製剤。
  139. 前記種子コーティング製剤には、種子への適用のための水性溶液もしくは油性溶液、または、種子への適用のための粉末製剤もしくは顆粒製剤が含まれる、請求項138に記載の製剤。
  140. 前記種子または植物生育環境への適用のための液体製剤には、濃縮製剤またはすぐに使える(ready−to−use)製剤が含まれる、請求項138に記載の製剤。
  141. 前記種子または植物生育環境への適用のための固形製剤には、顆粒剤または粉末剤が含まれる、請求項138に記載の製剤。
  142. 前記製剤にはさらに、肥料、微量栄養素肥料物質、殺虫剤、除草剤、植物生育改善物質、防かび剤、殺虫剤、軟体動物駆除剤、殺藻剤、細菌接種剤、真菌接種剤、またはそれらの組み合わせが含まれる、請求項133〜141のいずれか1項に記載の製剤。
  143. 前記製剤がさらに肥料を含有し、および、前記肥料が、液体肥料を含有し;前記製剤がさらに微量栄養素肥料物質を含有し、および、前記微量栄養素肥料物質がホウ酸、ホウ酸塩、ホウ素フリット、硫酸銅、銅フリット、銅キレート、四ホウ酸ナトリウム十水和物、硫酸鉄、酸化鉄、硫酸鉄アンモニウム、鉄フリット、鉄キレート、硫酸マンガン、酸化マンガン、マンガンキレート、塩化マンガン、マンガンフリット、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸、硫酸亜鉛、酸化亜鉛、炭酸亜鉛、亜鉛フリット、リン酸亜鉛、亜鉛キレート、もしくはそれらの組み合わせを含有し;前記製剤がさらに殺虫剤を含有し、および前記殺虫剤が有機リン酸塩、カルバミン酸塩、ピレスロイド、ダニ駆除剤、フタル酸アルキル、ホウ酸、ホウ酸塩、フッ化物、硫黄、ハロ芳香族置換尿素、炭化水素エステル、生物ベースの殺虫剤、もしくはそれらの組み合わせを含有し;前記製剤がさらに除草剤を含有し、および、前記除草剤がクロロフェノキシ化合物、ニトロフェノール化合物、ニトロクレゾール化合物、ジピリジル化合物、アセトアミド、脂肪酸、アニリド、ベンズアミド、安息香酸、安息香酸誘導体、アニス酸、アニス酸誘導体、ベンゾニトリル、ベンゾチアジアジノン二酸化物、チオカルバミド酸塩、カルバミン酸塩、カルバニレート、クロロピリジニル、シクロヘキセノン誘導体、ジニトロアミノベンゼン誘導体、フルオロジニトロトルイジン化合物、イソキサゾリジノン、ニコチン酸、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン誘導体、オキサジアゾリノン、リン酸塩、フタル酸塩、ピコリン酸化合物、トリアジン、トリアゾール、ウラシル、尿素誘導体、エンドサル、塩素酸ナトリウム、もしくはそれらの組み合わせを含有し;前記製剤がさらに防かび剤を含有し、および、前記防かび剤が、置換ベンゼン、チオカルバマート、エチレンビスジチオカルバマート、チオフタリドアミド、銅化合物、有機水銀化合物、有機スズ化合物、カドミウム化合物、アニラジン、ベノミル、シクロへキサミド、ドジン、エトリジアゾール、イプロジオン、メトラキシル、チアミメホン、トリホリン、もしくはそれらの組み合わせを含有し;前記製剤がさらに真菌接種剤を含有し、および、前記真菌接種剤は、Glomeraceae科の真菌接種剤、Claroidoglomeraceae科の真菌接種剤、Gigasporaceae科の真菌接種剤、Acaulosporaceae科の真菌接種剤、Sacculosporaceae科の真菌接種剤、Entrophosporaceae科の真菌接種剤、Pacidsporaceae科の真菌接種剤、Diversisporaceae科の真菌接種剤、Paraglomeraceae科の真菌接種剤、Archaeosporaceae科の真菌接種剤、Geosiphonaceae科の真菌接種剤、Ambisporaceae科の真菌接種剤、Scutellosporaceae科の真菌接種剤、Dentiscultataceae科の真菌接種剤、Racocetraceae科の真菌接種剤、phylum Basidiomycota科の真菌接種剤、phylum Ascomycota科の真菌接種剤、phylum Zygomycota科の真菌接種剤、もしくはそれらの組み合わせを含有し;または、前記製剤はさらに、細菌接種剤を含有し、および、前記細菌接種剤は、Rhizobium属の細菌接種剤、Bradyrhizobium属の細菌接種剤、Mesorhizobium属の細菌接種剤、Azorhizobium属の細菌接種剤、Allorhizobium属の細菌接種剤、Sinorhizobium属の細菌接種剤、Kluyvera属の細菌接種剤、Azotobacter属の細菌接種剤、Pseudomonas属の細菌接種剤、Azospirillium属の細菌接種剤、Bacillus属の細菌接種剤、Streptomyces属の細菌接種剤、Paenibacillus属の細菌接種剤、Paracoccus属の細菌接種剤、Enterobacter属の細菌接種剤、Alcaligenes属の細菌接種剤、Mycobacterium属の細菌接種剤、Trichoderma属の細菌接種剤、Gliocladium属の細菌接種剤、Glomus属の細菌接種剤、Klebsiella属の細菌接種剤、もしくはそれらの組み合わせを含有する、請求項142に記載の製剤。
  144. 前記肥料が、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、重硫酸アンモニウム、ポリ硫化アンモニウム、チオ硫化アンモニウム、アンモニア水、無水アンモニア、ポリリン酸アンモニウム、硫酸アルミニウム、硝酸カルシウム、カルシウム硝酸アンモニウム、硫酸カルシウム、か焼マグネサイト、方解石質石灰岩、酸化カルシウム、硝酸カルシウム、ドロマイト質石灰石、消石灰、炭酸カルシウム、リン酸2アンモニウム、リン酸1アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸カリウム、塩化カリウム、硫酸カリウムマグネシウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム、苦灰質石灰岩、マグネシア、尿素、尿素−ホルムアルデヒド、尿素硝酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、ポリマー被覆尿素、イソブチリデンジウレア、KSO−2MgSO、カイナイト、シルビナイト、キーゼル石、Epsom塩、元素状硫黄、泥灰土、粉末牡蠣、魚粉、油かす、魚肥料、血粉、リン鉱石、過リン酸肥料、スラグ、骨粉、木灰、肥料、バットグアノ、ピートモス、堆肥、生砂、綿実粉、羽毛粉、蟹粉、魚乳濁液、フミン酸、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項142または143に記載の製剤。
  145. 前記細菌接種剤が植物生育促進細菌株を含有する、請求項142に記載の製剤。
  146. 前記植物生育促進細菌株が、殺虫性毒素を産生する、殺真菌性化合物を産生する、殺線虫性化合物を産生する、殺菌性化合物を産生する、1以上の抗生物質に対して抵抗性である、1以上の遊離複製プラスミドを含有する、植物の根に結合する、植物の根にコロニー形成する、バイオフィルムを形成する、栄養素を可溶化する、有機酸を分泌する、またはそれらの組み合わせである、請求項145に記載の製剤。
  147. 前記殺虫性毒素には、Cry毒素が含まれ;前記殺真菌性化合物には、β−1,3−グルカナーゼ、キトシナーゼ、リチカーゼ、またはそれらの組み合わせが含まれ;または、前記殺線虫性化合物にはCry毒素が含まれる、請求項146に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの製剤。
  148. 前記植物生育促進細菌株が、Bacillus aryabhattai CAP53、Bacillus aryabhattai CAP56、Bacillus flexus BT054、Paracoccus kondratievae NC35、Bacillus mycoides BT155、Enterobacter cloacae CAP12、Bacillus nealsonii BOBA57、Bacillus mycoides EE118、Bacillus subtilis EE148、Alcaligenes faecalis EE107、Bacillus mycoides EE141、Bacillus mycoides BT46−3、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE128、Bacillus thuringiensis BT013A、Paenibacillus massiliensis BT23、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE349、Bacillus subtilis EE218、Bacillus megaterium EE281、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項145〜147のいずれか1項に記載の製剤。
  149. 前記植物生育促進細菌株が、Paracoccus kondratievae NC35、Bacillus aryabhattai CAP53、または、Bacillus megaterium EE281を含有し、および、前記製剤はさらに、請求項119〜122のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する、請求項148に記載の製剤。
  150. 請求項111〜132のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または、請求項133〜149のいずれか1項に記載の製剤を、植物生育環境へと導入すること;または、
    請求項111〜132のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または、請求項133〜149のいずれか1項に記載の製剤を、植物、植物種子、または、植物もしくは植物種子の周辺域へと適用すること;
    を含む植物の生育を刺激する方法であって、
    ここで、前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている、前記方法。
  151. 融合タンパク質を発現している組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを植物生育環境へと導入すること、または、融合タンパク質を発現している組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域へと適用することを含む植物の生育を刺激する方法であって、
    ここで、前記融合タンパク質は、植物生育刺激タンパク質またはペプチドを少なくとも1つ、および:
    (a)配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する標的化配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は少なくとも約54%である、前記標的化配列;
    (b)配列番号1のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
    (c)配列番号1のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
    (d)配列番号1を含有する標的化配列;
    (e)配列番号2と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (f)配列番号3のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
    (g)配列番号3のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
    (h)配列番号3を含有する標的化配列;
    (i)配列番号4と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (j)配列番号5のアミノ酸1〜38を含有する標的化配列;
    (k)配列番号5のアミノ酸23〜38を含有する標的化配列;
    (l)配列番号5を含有する標的化配列;
    (m)配列番号6と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (n)配列番号7のアミノ酸1〜28を含有する標的化配列;
    (o)配列番号7のアミノ酸13〜28を含有する標的化配列;
    (p)配列番号7を含有する標的化配列;
    (q)配列番号8と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (r)配列番号9のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (s)配列番号9のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (t)配列番号9を含有する標的化配列;
    (u)配列番号10と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (v)配列番号11のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (w)配列番号11のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (x)配列番号11を含有する標的化配列;
    (y)配列番号12と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (z)配列番号13のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (aa)配列番号13のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (ab)配列番号13を含有する標的化配列;
    (ac)配列番号14と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ad)配列番号15のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
    (ae)配列番号15のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
    (af)配列番号15を含有する標的化配列;
    (ag)配列番号16と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ah)配列番号17のアミノ酸1〜27を含有する標的化配列;
    (ai)配列番号17のアミノ酸12〜27を含有する標的化配列;
    (aj)配列番号17を含有する標的化配列;
    (ak)配列番号18と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (al)配列番号19のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (am)配列番号19のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (an)配列番号19を含有する標的化配列;
    (ao)配列番号20と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ap)配列番号21のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (aq)配列番号21のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (ar)配列番号21を含有する標的化配列;
    (as)配列番号22と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (at)配列番号23のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (au)配列番号23のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (av)配列番号23を含有する標的化配列;
    (aw)配列番号24と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ax)配列番号25のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (ay)配列番号25のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (az)配列番号25を含有する標的化配列;
    (ba)配列番号26と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bb)配列番号27のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
    (bc)配列番号27のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
    (bd)配列番号27を含有する標的化配列;
    (be)配列番号28と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bf)配列番号29のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (bg)配列番号29のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (bh)配列番号29を含有する標的化配列;
    (bi)配列番号30と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bj)配列番号31のアミノ酸1〜24を含有する標的化配列;
    (bk)配列番号31のアミノ酸9〜24を含有する標的化配列;
    (bl)配列番号31を含有する標的化配列;
    (bm)配列番号32と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bn)配列番号33のアミノ酸1〜15を含有する標的化配列;
    (bo)配列番号33を含有する標的化配列;
    (bp)配列番号34と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bq)配列番号35のアミノ酸1〜16を含有する標的化配列;
    (br)配列番号35を含有する標的化配列;
    (bs)配列番号36と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bt)配列番号43のアミノ酸1〜29を含有する標的化配列;
    (bu)配列番号43のアミノ酸14〜29を含有する標的化配列;
    (bv)配列番号43を含有する標的化配列;
    (bw)配列番号44と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (bx)配列番号45のアミノ酸1〜35を含有する標的化配列;
    (by)配列番号45のアミノ酸20〜35を含有する標的化配列;
    (bz)配列番号45を含有する標的化配列;
    (ca)配列番号46と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cb)配列番号47のアミノ酸1〜43を含有する標的化配列;
    (cc)配列番号47のアミノ酸28〜43を含有する標的化配列;
    (cd)配列番号47を含有する標的化配列;
    (ce)配列番号48と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cf)配列番号49のアミノ酸1〜32を含有する標的化配列;
    (cg)配列番号49のアミノ酸17〜32を含有する標的化配列;
    (ch)配列番号49を含有する標的化配列;
    (ci)配列番号50と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cj)配列番号51のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (ck)配列番号51のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (cl)配列番号51を含有する標的化配列;
    (cm)配列番号52と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cn)配列番号53のアミノ酸1〜33を含有する標的化配列;
    (co)配列番号53のアミノ酸18〜33を含有する標的化配列;
    (cp)配列番号53を含有する標的化配列;
    (cq)配列番号54と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cr)配列番号55のアミノ酸1〜30を含有する標的化配列;
    (cs)配列番号55のアミノ酸15〜30を含有する標的化配列;
    (ct)配列番号55を含有する標的化配列;
    (cu)配列番号56と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cv)配列番号57のアミノ酸1〜130を含有する標的化配列;
    (cw)配列番号57のアミノ酸115〜130を含有する標的化配列;
    (cx)配列番号57を含有する標的化配列;
    (cy)配列番号58と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (cz)配列番号59と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質断片;
    (da)配列番号60を含有する標的化配列;
    (db)配列番号61を含有する標的化配列;
    (dc)配列番号62を含有する標的化配列;
    (dd)配列番号63を含有する標的化配列;
    (de)配列番号64を含有する標的化配列;
    (df)配列番号65を含有する標的化配列;
    (dg)配列番号66を含有する標的化配列;
    (dh)配列番号67を含有する標的化配列;
    (di)配列番号68を含有する標的化配列;
    (dj)配列番号69を含有する標的化配列;
    (dk)配列番号70を含有する標的化配列;
    (dl)配列番号71と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dm)配列番号72と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dn)配列番号73と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (do)配列番号74と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dp)配列番号75と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dq)配列番号76と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dr)配列番号77と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (ds)配列番号78と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dt)配列番号79と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (du)配列番号80と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dv)配列番号81と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dw)配列番号82と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dx)配列番号83と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dy)配列番号84と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質;
    (dz)配列番号1のアミノ酸22〜31を含有する標的化配列;
    (ea)配列番号1のアミノ酸22〜33を含有する標的化配列;
    (eb)配列番号1のアミノ酸20〜31を含有する標的化配列;
    (ec)配列番号3のアミノ酸14〜23を含有する標的化配列;
    (ed)配列番号3のアミノ酸14〜25を含有する標的化配列;または、
    (ef)配列番号3のアミノ酸12〜23を含有する標的化配列、
    を含有し、および、ここで、前記植物生育刺激タンパク質またはペプチドは、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている、前記方法。
  152. 前記標的化配列は、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、前記アミノ酸25〜35との同一性は少なくとも約63%である、請求項151に記載の方法。
  153. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項151に記載の方法。
  154. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約56%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である、請求項151に記載の方法。
  155. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約62%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項151に記載の方法。
  156. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約68%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項151に記載の方法。
  157. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項151に記載の方法。
  158. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項151に記載の方法。
  159. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項151に記載の方法。
  160. 前記標的化配列が、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約90%である、請求項151に記載の方法。
  161. 前記標的化配列が、
    (a)16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約43%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約54%である、前記アミノ酸配列;
    (b)配列番号1のアミノ酸1〜35;
    (c)配列番号1のアミノ酸20〜35;
    (d)配列番号1;または、
    (e)配列番号60、
    からなる、請求項151に記載の方法。
  162. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である、請求項151に記載の方法。
  163. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約50%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項151に記載の方法。
  164. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約56%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約63%である、請求項151に記載の方法。
  165. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約62%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項151に記載の方法。
  166. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約68%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項151に記載の方法。
  167. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約72%である、請求項151に記載の方法。
  168. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約75%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、配列番号1のアミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項151に記載の方法。
  169. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約81%である、請求項151に記載の方法。
  170. 前記標的化配列が、16アミノ酸からなり、および、配列番号1のアミノ酸20〜35と少なくとも約81%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ここで、アミノ酸25〜35との同一性は、少なくとも約90%である、請求項151に記載の方法。
  171. 前記融合タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項151に記載の方法。
  172. 前記融合タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項151に記載の方法。
  173. 前記融合タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項151に記載の方法。
  174. 前記融合タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項151に記載の方法。
  175. 前記融合タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、または、84と100%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するエキソスポリウムタンパク質またはエキソスポリウムタンパク質断片を含有する、請求項151に記載の方法。
  176. 標的化配列、前記エキソスポリウムタンパク質、または前記エキソスポリウムタンパク質断片が、そのカルボキシ末端にアミノ酸配列GXTを含有し、ここで、Xは、任意のアミノ酸である、請求項151〜160、および171〜175のいずれか1項に記載の方法。
  177. 前記標的化配列、前記エキソスポリウムタンパク質、または前記エキソスポリウムタンパク質断片が、配列番号1のアミノ酸20に相当する標的化配列の位置で、アラニン残基を含有する、請求項151〜160、および171〜176のいずれか1項に記載の方法。
  178. 前記融合タンパク質がさらに、前記標的化配列、前記エキソスポリウムタンパク質、または、前記エキソスポリウムタンパク質断片と、前記植物生育刺激タンパク質もしくはペプチド、前記病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、前記植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質もしくはペプチド、または、前記植物結合タンパク質もしくはペプチド、の間にアミノ酸リンカーを含有する、請求項151〜160、および171〜177のいずれか1項に記載の方法。
  179. 前記リンカーが、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー、または、アラニン残基とグリシン残基の両方の混合物を含有するリンカー、を含有する、請求項178に記載の方法。
  180. 前記リンカーが、プロテアーゼ認識部位を含有する、請求項178または179のいずれかに記載の方法。
  181. 前記植物生育刺激タンパク質が、酵素を含有する、請求項151〜180のいずれか1項に記載の方法。
  182. 前記酵素が、細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素を含有する、請求項181に記載の方法。
  183. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素が、セルラーゼ、リパーゼ、リグニンオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシド加水分解酵素、ホスファターゼ、ニトロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵素、アミラーゼ、アンモニアオキシダーゼ、リグニナーゼ、グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ぺクチナーゼ、グルカナーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、キシラナーゼ、およびシデロフォアを含有する、請求項182に記載の方法。
  184. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素が、セルラーゼを含有し、前記セルラーゼが、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ、またはβ−グルコシダーゼを含有する、請求項183に記載の方法。
  185. 前記セルラーゼが、エンドセルラーゼを含有し、および前記エンドセルラーゼがエンドグルカナーゼを含有する、請求項184に記載の方法。
  186. 前記セルラーゼがエンドセルラーゼを含有し、および、前記エンドセルラーゼがBacillus subtilisエンドグルカナーゼ、Bacillus thuringiensisエンドグルカナーゼ、Bacillus cereusエンドグルカナーゼ、または、Bacillus clausiiエンドグルカナーゼを含有する、請求項184または185に記載の方法。
  187. 前記セルラーゼがエキソセルラーゼを含有し、および、前記エキソセルラーゼが、Trichoderma reeseiエキソセルラーゼを含有する、請求項184に記載の方法。
  188. 前記セルラーゼが、β−グルコシダーゼを含有し、および、前記β−グルコシダーゼが、Bacillus subtilisβ−グルコシダーゼ、Bacillus thuringiensis β−グルコシダーゼ、Bacillus cereus β−グルコシダーゼ、または、Bacillus clausii β−グルコシダーゼを含有する、請求項184に記載の方法。
  189. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がリパーゼを含有し、前記リパーゼが、Bacillus subtilisリパーゼ、Bacillus thuringiensisリパーゼ、Bacillus cereusリパーゼ、または、Bacillus clausiiリパーゼを含有する、請求項183に記載の方法。
  190. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がリグニンオキシダーゼを含有し、前記リグニンオキシダーゼが、リグニンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グリオキサルオキシダーゼ、リグニナーゼ、およびマンガンペルオキシダーゼを含有する、請求項183に記載の方法。
  191. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がプロテアーゼを含有し、前記プロテアーゼが、サブチリシン、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼを含有する、請求項183に記載の方法。
  192. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がホスファターゼを含有し、および、前記ホスファターゼがリン酸モノエステル加水分解酵素、ホスホモノエステラーゼ、リン酸ジエステル加水分解酵素、ホスホジエステラーゼ、三リン酸モノエステル加水分解酵素、無水ホスホリル加水分解酵素、ピロホスファターゼ、フィターゼ、トリメタホスファターゼ、またはトリホスファターゼを含有する、請求項183に記載の方法。
  193. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がホスホモノエステラーゼを含有し、および、前記ホスホモノエステラーゼが、PhoA4を含有し;または、前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がフィターゼを含有し、および、前記フィターゼが、Bacillus subtilis EE148フィターゼ、または、Bacillus thuringiensis BT013Aフィターゼを含有する、請求項192に記載の方法。
  194. 前記細菌、真菌、もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素がニトロゲナーゼを含有し、および、前記ニトロゲナーゼが、Nifファミリーのニトロゲナーゼを含有する、請求項183に記載の方法。
  195. 前記Nifファミリーのニトロゲナーゼが、Paenibacillus massiliensis NifBDEHKNXVを含有する、請求項194に記載の方法。
  196. 前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する植物生育環境中で生育された植物は、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有しない前記植物生育環境と同一の環境中での植物の生育と比較し、生育の増強を示す、請求項150〜195のいずれか1項に記載の植物生育を刺激する方法。
  197. 前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、植物生育促進細菌株を含有する、請求項151〜196のいずれか1項に記載の方法。
  198. 前記植物生育促進細菌株は、殺虫性毒素を産生する、殺真菌性化合物を産生する、殺線虫性化合物を産生する、殺菌性化合物を産生する、1以上の抗生物質に対して抵抗性である、1以上の遊離複製プラスミドを含有する、植物の根に結合する、植物の根にコロニー形成する、バイオフィルムを形成する、栄養素を可溶化する、有機酸を分泌する、またはそれらの組み合わせである、請求項197に記載の方法。
  199. 前記殺虫性毒素には、Cry毒素が含まれ;前記殺真菌性化合物には、β−1,3−グルカナーゼ、キトシナーゼ、リチカーゼ、またはそれらの組み合わせが含まれ;または、前記殺線虫性化合物にはCry毒素が含まれる、請求項198に記載の方法。
  200. 前記植物生育促進細菌株には、Bacillus mycoides BT155、Bacillus mycoides EE118、Bacillus mycoides EE141、Bacillus mycoides BT46−3、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE128、Bacillus thuringiensis BT013A、または、Bacillus cereusファミリーのメンバーであるEE349が含まれる、請求項197〜199のいずれか1項に記載の方法。
  201. 前記植物生育促進細菌株には、Bacillus mycoides BT155、Bacillus mycoides EE141、または、Bacillus thuringiensis BT013Aが含まれる、請求項200に記載の方法。
  202. 前記融合タンパク質は、配列番号60の標的化配列を含有する、請求項201に記載の方法。
  203. 前記非ホルモン性ペプチドは、kunitzトリプシンインヒビター(KTI)を含有し;前記植物生育刺激化合物の産生または活性化に関与する酵素は、キトシナーゼを含有し;前記植物結合タンパク質またはペプチドは、TasAを含有し;前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドは、TasAを含有し;または、前記細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解または改変する酵素は、ホスファターゼまたはエンドグルカナーゼを含有する、請求項202に記載の方法。
  204. 前記ホスファターゼは、PhoAまたはフィターゼを含有する、請求項203に記載の方法。
  205. 前記融合タンパク質は、前記融合タンパク質の標的化配列、エキソスポリウムタンパク質、またはエキソスポリウムタンパク質断片に対して天然型である芽胞形成プロモーターの制御下で発現される、請求項151〜204のいずれか1項に記載の方法。
  206. 前記融合タンパク質は、高発現芽胞形成プロモーターの制御下で発現される、請求項151〜205のいずれか1項に記載の方法。
  207. 前記高発現芽胞形成プロモーターには、シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列が含まれる、請求項206に記載の方法。
  208. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも80%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項205〜207のいずれか1項に記載の方法。
  209. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項208に記載の方法。
  210. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも95%の同一性を有する核酸配列を含有する、請請求項208に記載の方法。
  211. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも98%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項208に記載の方法。
  212. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と少なくとも99%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項208に記載の方法。
  213. 前記芽胞形成プロモーターは、配列番号85〜103のいずれか1つの核酸配列と100%の同一性を有する核酸配列を含有する、請求項208に記載の方法。
  214. 前記シグマ−K芽胞形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列(複数含む)は、配列番号85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、または103の相当するヌクレオチドと100%の同一性を有する、請求項208〜212のいずれか1項に記載の方法。
  215. 請求項111〜132のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または、請求項133〜149のいずれか1項に記載の製剤を、植物生育環境へと導入すること;または、
    請求項11〜132のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または、請求項133〜149のいずれか1項に記載の製剤を、植物、植物種子、または、植物もしくは植物種子の周辺域へと適用すること;
    を含む、病原体から植物を防御する方法、または、植物におけるストレス耐性を増強させる方法であって、
    ここで、前記病原体から植物を防御するタンパク質もしくはペプチド、または、前記植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質もしくはペプチドは、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている、前記方法。
  216. 病原体から植物を防御するための方法を含有する方法であって、前記病原体から植物を防御するタンパク質またはペプチドが、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている方法を含む、請求項215に記載の方法。
  217. 前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する植物生育環境中で生育された植物は、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有しない同一の植物生育環境中で育った植物と比較し、病原体に感染しにくい、請求項216に記載の病原体から植物を防御する方法。
  218. 植物におけるストレス耐性を増強させる方法を含有する方法であって、前記植物におけるストレス耐性を増強させるタンパク質またはペプチドが、組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている方法を含む、請求項215に記載の方法。
  219. 前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する植物生育環境中で生育された植物は、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有しない同一の植物生育環境中で育った植物と比較し、ストレスの影響を受けにくい、請求項218に記載の植物におけるストレス耐性を増強させる方法。
  220. 請求項111〜132のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または、請求項133〜149のいずれか1項に記載の製剤を、植物生育環境へと導入すること;または、
    請求項111〜132のいずれか1項に記載の組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または、請求項133〜149のいずれか1項に記載の製剤を、植物、植物種子、または、植物もしくは植物種子の周辺域へと適用すること;
    を含む、植物に組換えBacillus cereusファミリーのメンバーの芽胞を固定する方法であって、
    ここで、前記植物結合タンパク質またはペプチドは、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている、前記方法。
  221. 前記植物結合タンパク質またはペプチドは、植物に前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを選択的に向かわせ、および維持する、請求項220に記載の方法。
  222. 前記植物結合タンパク質またはペプチドは、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを植物の根、根の下部構造、植物の空中部分、または植物の空中部分の下部構造に選択的に向かわせ、および、維持する、請求項221に記載の方法。
  223. 植物生育環境へ導入する前に、または、植物、植物種子、または植物もしくは植物種子の周辺域に適用する前に、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを不活性化することをさらに含む、請求項150〜222のいずれか1項に記載の方法。
  224. 前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーは、加熱処置;ガンマ線照射;x線照射;UV−A照射;UV−B照射;グルタルアルデヒド(gluteraldehyde)、ホルムアルデヒド、過酸化水素、酢酸、漂白、またはそれらの組み合わせを用いた処置、または、それらの組み合わせにより不活性化される、請求項223に記載の方法。
  225. 前記植物生育環境は、土壌、水、水性溶液、砂、砂利、多糖、マルチ、堆肥、ピートモス、わら、丸太、粘土、大豆ミール、酵母抽出物、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項150〜224のいずれか1項に記載の方法。
  226. 前記植物生育環境は、酵素に対する基質が補充される、請求項150〜225のいずれか1項に記載の方法。
  227. 前記基質は、トリプトファン、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、インドール、トリメタホスフェート、フェロドキシン、アセトイン、ジアセチル、ピルビン酸、アセト乳酸、ペクチン、セルロース、メチルセルロース、デンプン、キチン、ペクチン、タンパク質食品、セルロース誘導体、リン酸、アセトイン、キトサン、インドール−3−酢酸の不活性型誘導体、ジベレリン酸の不活性型誘導体、キシラン、アラビノキシラン、脂肪、ワックス、油、フィチン酸、リグニン、フミン酸、コリン、コリン誘導体、プロリン、ポリプロリン、プロリン富化タンパク質、プロリン富化食、フェニルアラニン、またはコリスミ酸、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項226に記載の方法。
  228. 前記アデノシン三リン酸は、アデノシン−3−リン酸を含有する、請求項227に記載の方法。
  229. 植え付けの前に、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバー、または、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する製剤を用いて種子をコーティングすることを含有する、請求項150〜228のいずれか1項に記載の方法。
  230. 植物の空中部分に前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーまたは製剤を適用することを含む、請求項150〜229のいずれか1項に記載の方法。
  231. 前記植物生育環境に前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを導入することには、前記環境に前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーを含有する液体製剤または固形製剤を適用することを含む、請求項150〜230のいずれか1項に記載の方法。
  232. 前記植物生育環境は、土壌、堆肥、ピートモス、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項230に記載の方法。
  233. 前記方法は、前記植物生育環境に種子、苗、挿し木、球根または植物を植え付ける前、植え付けと同時、または植え付けの後に、前記植物生育環境へ前記製剤を適用することを含む、請求項231または232に記載の方法。
  234. 植物生育環境中に少なくとも1つの農薬を導入すること、または、植物もしくは種子に少なくとも1つの農薬を適用することをさらに含有する、請求項150〜233のいずれか1項に記載の方法。
  235. 前記農薬は、肥料、微量栄養素肥料物質、殺虫剤、除草剤、防かび剤、軟体動物駆除剤、殺藻剤、植物生育改善物質、細菌接種剤、真菌接種剤、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項234に記載の方法。
  236. 前記農薬が、肥料を含有し、および、前記肥料が、液体肥料を含有し;前記農薬が微量栄養素肥料物質を含有し、および、前記微量栄養素肥料物質がホウ酸、ホウ酸塩、ホウ素フリット、硫酸銅、銅フリット、銅キレート、四ホウ酸ナトリウム十水和物、硫酸鉄、酸化鉄、硫酸鉄アンモニウム、鉄フリット、鉄キレート、硫酸マンガン、酸化マンガン、マンガンキレート、塩化マンガン、マンガンフリット、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸、硫酸亜鉛、酸化亜鉛、炭酸亜鉛、亜鉛フリット、リン酸亜鉛、亜鉛キレート、もしくはそれらの組み合わせを含有し;前記農薬が殺虫剤を含有し、および前記殺虫剤が有機リン酸塩、カルバミン酸塩、ピレスロイド、ダニ駆除剤、フタル酸アルキル、ホウ酸、ホウ酸塩、フッ化物、硫黄、ハロ芳香族置換尿素、炭化水素エステル、生物ベースの殺虫剤、もしくはそれらの組み合わせを含有し;前記農薬が除草剤を含有し、および、前記除草剤がクロロフェノキシ化合物、ニトロフェノール化合物、ニトロクレゾール化合物、ジピリジル化合物、アセトアミド、脂肪酸、アニリド、ベンズアミド、安息香酸、安息香酸誘導体、アニス酸、アニス酸誘導体、ベンゾニトリル、ベンゾチアジアジノン二酸化物、チオカルバミド酸塩、カルバミン酸塩、カルバニレート、クロロピリジニル、シクロヘキセノン誘導体、ジニトロアミノベンゼン誘導体、フルオロジニトロトルイジン化合物、イソキサゾリジノン、ニコチン酸、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン誘導体、オキサジアゾリノン、リン酸塩、フタル酸塩、ピコリン酸化合物、トリアジン、トリアゾール、ウラシル、尿素誘導体、エンドサル、塩素酸ナトリウム、もしくはそれらの組み合わせを含有し;前記農薬が防かび剤を含有し、および、前記防かび剤が、置換ベンゼン、チオカルバマート、エチレンビスジチオカルバマート、チオフタリドアミド、銅化合物、有機水銀化合物、有機スズ化合物、カドミウム化合物、アニラジン、ベノミル、シクロへキサミド、ドジン、エトリジアゾール、イプロジオン、メトラキシル、チアミメホン、トリホリン、もしくはそれらの組み合わせを含有し;前記農薬が真菌接種剤を含有し、および、前記真菌接種剤は、Glomeraceae科の真菌接種剤、Claroidoglomeraceae科の真菌接種剤、Gigasporaceae科の真菌接種剤、Acaulosporaceae科の真菌接種剤、Sacculosporaceae科の真菌接種剤、Entrophosporaceae科の真菌接種剤、Pacidsporaceae科の真菌接種剤、Diversisporaceae科の真菌接種剤、Paraglomeraceae科の真菌接種剤、Archaeosporaceae科の真菌接種剤、Geosiphonaceae科の真菌接種剤、Ambisporaceae科の真菌接種剤、Scutellosporaceae科の真菌接種剤、Dentiscultataceae科の真菌接種剤、Racocetraceae科の真菌接種剤、phylum Basidiomycota科の真菌接種剤、phylum Ascomycota科の真菌接種剤、phylum Zygomycota科の真菌接種剤、もしくはそれらの組み合わせを含有し;または、前記農薬は細菌接種剤を含有し、および、前記細菌接種剤は、Rhizobium属の細菌接種剤、Bradyrhizobium属の細菌接種剤、Mesorhizobium属の細菌接種剤、Azorhizobium属の細菌接種剤、Allorhizobium属の細菌接種剤、Sinorhizobium属の細菌接種剤、Kluyvera属の細菌接種剤、Azotobacter属の細菌接種剤、Pseudomonas属の細菌接種剤、Azospirillium属の細菌接種剤、Bacillus属の細菌接種剤、Streptomyces属の細菌接種剤、Paenibacillus属の細菌接種剤、Paracoccus属の細菌接種剤、Enterobacter属の細菌接種剤、Alcaligenes属の細菌接種剤、Mycobacterium属の細菌接種剤、Trichoderma属の細菌接種剤、Gliocladium属の細菌接種剤、Glomus属の細菌接種剤、Klebsiella属の細菌接種剤、もしくはそれらの組み合わせを含有する、請求項235に記載の方法。
  237. 前記肥料が、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、重硫酸アンモニウム、ポリ硫化アンモニウム、チオ硫化アンモニウム、アンモニア水、無水アンモニア、ポリリン酸アンモニウム、硫酸アルミニウム、硝酸カルシウム、カルシウム硝酸アンモニウム、硫酸カルシウム、か焼マグネサイト、方解石質石灰岩、酸化カルシウム、硝酸カルシウム、ドロマイト質石灰石、消石灰、炭酸カルシウム、リン酸2アンモニウム、リン酸1アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸カリウム、塩化カリウム、硫酸カリウムマグネシウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム、苦灰質石灰岩、マグネシア、尿素、尿素−ホルムアルデヒド、尿素硝酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、ポリマー被覆尿素、イソブチリデンジウレア、KSO−2MgSO、カイナイト、シルビナイト、キーゼル石、Epsom塩、元素状硫黄、泥灰土、粉末牡蠣、魚粉、油かす、魚肥料、血粉、リン鉱石、過リン酸肥料、スラグ、骨粉、木灰、肥料、バットグアノ、ピートモス、堆肥、生砂、綿実粉、羽毛粉、蟹粉、魚乳濁液、フミン酸、またはそれらの組み合わせを含有する、請求項235または236に記載の方法。
  238. 前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーが、請求項1、4〜27、39、41〜45、および108〜110のいずれか1項に記載の植物結合タンパク質またはペプチドを少なくとも1つを含有する融合タンパク質を少なくとも1つ発現し、および、前記植物結合タンパク質またはペプチドが、前記組換えBacillus cereusファミリーのメンバーのエキソスポリウムに物理的に付加されている、請求項150〜136のいずれか1項に記載の方法。
  239. 前記植物が双子葉植物、単子葉植物、または裸子植物である、請求項150〜238のいずれか1項に記載の方法。
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