盐生植物是能够在高盐环境中存活、生长和发育的特殊植物，仅占植物种类的2%左右^[1-4]。盐生植物在高盐(约200 mmol/L氯化钠或更高)和干旱条件下能够正常存活、生长和发育，可见它们具有独特的分子响应机制、生理结构和内生菌群落，能够对抗盐碱胁迫^[5-7]。由于全球气候变化和农业用水量增加，咸海面积急剧减少，形成裸露带，引发一系列生态和环境问题^[8-11]。然而在咸海裸露带具有多种盐生植物分布，那么其共生微生物对植物生长、病原体抗性和逆境适应性可能具有重要作用，在农业生产应用方面也具有重要的意义。

内生菌是一类微生物，它们在健康植物生命周期中的某个阶段生活在其体内，通常包括细菌和真菌。内生菌与宿主植物建立了互惠互利的共生关系，这种关系可以促进寄主植物的生长，提高其抗逆性，也可能是盐生植物抗盐碱胁迫的一个重要因素。内生菌在几乎所有植物体内均存在，并且会因植物种类、基因型和生长环境的不同而有所差异，因此内生菌是一类非常广泛的微生物资源^[12-15]。前期的研究发现，在位于乌兹别克斯坦咸海岸边不同暴露时期土壤带的土壤真菌和植物内生真菌种群结构具有时空差异，并且与植物种类丰富度和特定矿物组成相关^[16]。钮旭光等通过传统的分离培养方法对盐生植物翅碱蓬的内生真菌多样性进行了调查，发现其内生真菌的分布表现出一定的组织特异性和高度的宿主特异性，而且其分布模式也受到生境条件的影响^[17]。刘晓静等在对干旱荒漠区盐生植物盐爪爪内生真菌群落组成进行研究时发现其内生真菌群落多样性较为丰富，同时也表现出对宿主不同组织具有选择偏好性^[18]。唐琦勇等则采用高通量测序方法对新疆北部的盐角草内生菌进行测序，结果显示该区域盐角草内生真菌涉及6个门，其中子囊菌门(Ascomycota)占绝对优势^[19]。这些研究为今后微生物资源的挖掘和利用奠定了基础。

假木贼属植物是藜科中的原始类群之一，世界上约有30种。它们生长在地中海至中亚和欧洲干旱地区，是沙漠植被的代表性群体之一。这些小灌木具有强大的根系，能够在超级干燥的环境中生存，对盐碱土和其他不良环境具有高度的适应性，是绿洲强大的自然生态屏障，具有重要的生态价值和经济价值^[20]。然而，目前关于假木贼属植物内生菌多样性、群落结构、潜在功能和生产应用的研究相对较少。因此，本研究旨在通过高通量测序了解两种盐生植物内生真菌的多样性。本研究报道咸海盆地裸露带上毛足假木贼和展枝假木贼内生真菌的群落组成，并提供新的见解，以期为今后挖掘盐生植物内生菌资源提供基础。

1 材料与方法 1.1 样品采集与预处理

我们于2018年8月在乌兹别克斯坦西咸海岸边裸露带(44°29′50.42′′N, 58°12′43.80′′E)采集到两种假木贼植物(毛足假木贼和展枝假木贼)，每种植物各采集了3个生物学重复样品(图 1)。样品采集后置于无菌袋中，并在一周内放置于冰盒中运回实验室进行表面消毒处理^[21]。消毒后，植物样品被剪成小段并在超净工作台中吹干。随后，植物样品在消毒灭菌后的状态下被打碎并密封于无菌离心管中，最终存储于−20 ℃备用。

1.2 主要试剂和仪器

FastDNA SPIN Kit for Soil，MP Biomedicals公司；T100 Thermal Cycler；Bio-Rad公司；5 Prime Hot Master Mix，QuantaBio公司。HiSeq PE250，Illumina公司。

1.3 总DNA提取、PCR扩增和基因克隆文库的构建

将冻存的植物样品送至广东美格基因科技有限公司进行总DNA提取、PCR扩增、基因克隆文库构建和测序。根据说明书的方案，使用FastDNA SPIN Kit for Soil提取样品总DNA。利用靶向特异性引物ITS1F (5′-GGAAGTAAAAG TCGTAACAAGG-3′)和ITS1R (5′-GCTGCGTTC TTCATCGATGC-3′)扩增真菌的ITS1基因序列^[16]。PCR反应体系：MO BIO PCR H₂O 22 μL，5 Prime Hot Master Mix 25 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，基因组DNA (78 ng/μL) 1 μL。PCR反应条件：94 ℃ 6 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。所有样品检测合格后，使用HiSeq PE250平台进行高通量测序。

1.4 序列处理与分析

首先使用QIIME2平台的cutadapt插件去除原始数据中的引物^[22]。然后，利用QIIME2平台的DADA2插件对所有reads进行合并、去噪、过滤嵌合体、去冗余、预测生物序列等操作，获得特征表和代表性序列^[23]。每个扩增子序列变异(amplicon sequence variant, ASV)定义为序列相似性为100%的reads簇。每个ASV都使用QIIME feature-classifier插件基于Unite数据库进行物种注释。然后，使用QIIME2 (V2020.8)过滤未得到有效注释的ASVs^[24]。将无单体(singleton)的特征表按所有样品中数据量最小的reads数进行抽平，以用于多样性的计算和比较。采用单因素方差分析和t检验来比较两种盐生植物内生真菌的多样性。稀释曲线、箱线图以及物种组成图的绘制使用R包“Phyloseq”完成。Venn图的绘制使用R包“VennDiagram”完成。采用主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)方法评价两种盐生植物内生真菌群落结构之间的关系。此外，利用LEfSe (linear discriminant analysis effect size)寻找两种盐生植物在丰度上存在显著差异的生物标志物(biomarkers)。系统发育树的构建选择相对丰度前100的真菌ASVs代表性序列，在QIIME2平台上使用align-to-tree-mafft-fasttree流程构建完成，并使用interactive tree of life (iTOL)进行进化树的美化与展示。最后，使用PICRUSt2 (phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)来预测内生真菌的潜在功能。基于PICRUSt2的内生真菌功能预测和可视化采用Microeco bioinformatics cloud (https://www.bioincloud.tech/)和STAMP软件(statistical analysis of taxonomic and functional profiles, V2.1.3)完成。基于FUNGuild (http://www.funguild.org/)对内生真菌按功能类别进行分类注释，并使用BioLadder在线分析平台完成可视化绘图。本研究所获得的完整内生真菌序列已经上传至NCBI的SRA数据库中，登录号为SAMN17935013−SAMN17935018。

2 结果与分析 2.1 微生物群落的丰富度和多样性

本研究采用DADA2进行reads质量过滤、去噪等，并使用QIIME2去除无效注释的reads。最终从两种盐生植物中获得了97 201条高质量reads，各样本中的reads数量在4 804−34 950之间(表 1)。Rarefaction曲线结合测序深度估算(coverage)表明，测序深度已经足够大，可以获得样品中大部分真菌的多样性特征(图 2)。

在所有克隆文库中共检测到166个真菌ASVs。使用Venn图展示了两个样本中共有和独有的ASVs数目，以直观地表现各样本的ASVs组成情况。从图 3可以看出，两种盐生植物内生真菌群落组成中共有的ASVs数为9个，AT (Anabasis truncate)和AE (Anabasis eriopoda)独有的ASVs数分别为133个和24个。此外，与AT相关的内生真菌的丰富度和多样性均高于AE，但差异不显著(图 4)。

α多样性分析结合一系列统计分析和检验可以反映环境中微生物群落的物种丰富度和多样性。从图 3可以看出，AT中内生真菌的丰富度和多样性均高于AE，且AT和AE中的丰富度(observed_ASVs)存在显著性差异(P < 0.05)。然而，香农多样性指数(Shannon)和辛普森多样性指数(Simpson)在AT和AE之间无显著性差异。因此，为了更好地了解两种盐生植物内生真菌的多样性方面的差异，未来的研究需要采集更多的生物学重复样品。

2.2 两种盐生植物内生真菌群落组成

利用高通量测序技术分析了两种不同盐生植物内生真菌的群落组成，共鉴定出166个内生真菌ASVs，分类归属于4门13纲25目37科49属(图 5)。在两种植物中，Ascomycota是优势类群，而在AT中，Basidiomycota类群的相对丰度更高。Dothideomycetes是优势类群，其相对丰度在AE和AT中都比较高。Pleosporales和Botryosphaeriales在两种植物中都是优势目，而Capnodiales在样品AE2中具有较高的丰度。Pleosporaceae和Botryosphaeriaceae的相对丰度在两种植物中都比较高，而Didymosphaeriaceae在AT中分布更广，Mycosphaerellaceae在样品AE2中相对丰度较高。比较两种盐生植物内生真菌属的群落组成可以发现，Neocamarosporium、Botryosphaeria和Alternaria在两种植物中都处于优势属的地位，而Laburnicola仅在AT中有较高的丰度。此外，从纲、目、科和属等分类水平的物种组成图中可以看出，AT中的内生真菌多样性要高于AE。尤其值得注意的是，Dothideomycetes类群在两种植物内的相对丰度占到了94%‒99%。

2.3 两种盐生植物内生真菌群落组成差异分析

两种盐生植物的内生真菌群落组成存在显著差异。LEfSe分析显示(图 6)，某些内生真菌类群的丰度在两种盐生植物中存在显著差异。共发现16个生物标志物，其中15个在AT中丰度显著富集，1个在AE中丰度显著富集。AT中富集的生物标志物主要包括2个门的真菌类群，如Didymosphaeriaceae、Laburnicola、Chaetothyriales、Eurotiomycetes、Mrakiaceae、Cystofilobasidiales、Udeniomyces、Kalmusia等，而在AE中仅有Dothideomycetes类群富集。

通过非加权UniFrac距离进行的β多样性分析表明，不同样品的内生真菌群落组成差异较大。PCoA分析结果显示(图 7)不同样品之间的内生真菌群落组成差异较大，其中PCoA1和PCoA2分别解释了46.2%和24.15%的变异，PCoA1能解释两种盐生植物内生真菌群落组成变化的主要成分。虽然属于同一种盐生植物的样品基本聚集在一起，但其他样品在两种不同的盐生植物之间存在较强的分离，表明两种盐生植物内生真菌的群落组成存在较大的差异。图 7还进一步显示了一些富集于AT或AE中的ASVs (amplicon sequence variant)，如ASV16 (s_Mycosphaerella_tassiana)、ASV66 (g_Botryosphaeria)和ASV141 (s_Alternaria alternata)在AT中富集，而ASV72和ASV150在AE中富集。

2.4 两种盐生植物内生真菌的系统发育学分析

本研究选择了两种盐生植物内生真菌丰度前100的代表性序列构建系统发育树。门水平分析发现这些高丰度内生真菌仅属于2个门Ascomycota和Basidiomycete，多样性较低。然而在目和科等分类水平上分析则发现这两种盐生植物的内生真菌多样性较高，丰度前100的ASVs属于2门8纲15目24科27属。其中，Ascomycota有74个ASVs，Basidiomycete有26个ASVs。系统发育树还展示了特定类群的定向富集，即Botryosphaeria在AT中的丰度较高，而Neocamarosporium的丰度在AE中更高。此外，系统发育树显示，与这两种盐生植物相关的内生真菌ASVs中包含一些未分类的潜在新类群(图 8)。

2.5 内生真菌的功能预测

本研究使用了PICRUSt2算法预测了内生真菌的宏基因组功能，发现了68个与MetaCycle通路相关的通路，包括辛烷氧化、有氧呼吸Ⅰ (细胞色素c)、有氧呼吸Ⅱ (细胞色素c) (酵母)、乙醛酸循环、GDP-甘露糖生物合成等。利用STAMP软件对预测结果进行差异比较发现，2种盐生植物中存在61个预测的内生真菌MetaCycle通路的显著性差异(图 9A)。其中，在AT中有22个MetaCycle通路的丰度较高，包括l-tryptophan degradation to 2-amino-3-carboxymuconate semialdehyde、stearate biosynthesis Ⅲ (fungi)、sucrose degradation Ⅲ (sucrose invertase)、NAD/NADP-NADH/NADPH cytosolic interconversion (yeast)等；在AE中有39个MetaCycle通路的丰度较高，包括l-tyrosine degradation I、adenosine ribonucleotides de novo biosynthesis、d-galactose degradation V (Leloir pathway)、phosphopantothenate biosynthesis I等。预测结果还检测到了内生真菌中较高丰度的尿素循环代谢通路的基因丰度，这表明内生真菌在植物氮源吸收等方面具有重要作用(图 9B)。然而，内生真菌的潜在代谢潜能需要进一步通过纯培养或宏基因组研究进行验证，这可能为内生菌与宿主植物之间的互利共生机制提供了新的见解。

此外，本研究还使用了FUNGuild对内生真菌的功能进行预测，并发现了pathotroph、saprotroph和symbiotroph这3种营养模式的存在(图 9C)。对内生真菌群落的物种信息进行注释发现，2种不同盐生假木贼属植物内生真菌群落中不同类型的病原菌、共生菌和腐生菌的丰度差异较大。在AE2样品中，animal pathogen、undefined saprotroph-wood saprotroph、dung saprotroph-ectomycorrhizal-litter saprotroph-undefined saprotroph、plant pathogen、animal pathogen-endophyte-lichen parasite-plant pathogen-wood saprotroph以及leaf saprotroph等营养类型的真菌丰度相对较高；而在AT样品组中，fungal parasite-undefined saprotroph、plant pathogen-wood saprotroph等其他营养类型的真菌丰度相对更高。

3 讨论与结论

本研究利用Illumina高通量测序技术，研究了生长于乌兹别克斯坦西咸海裸露带上的毛足假木贼和展枝假木贼两种盐生植物内生真菌的多样性。研究结果显示，这两种盐生植物的内生真菌在ASVs水平上具有不同的丰富度和多样性。本研究获得的166个ASVs归属于4门13纲25目37科49属，其中Neocamarosporium、Botryosphaeria和Alternaria及其上级分类群在AE和AT中占比较高，属于优势类群。群落组成分析结果还表明，同种假木贼的3个生物学重复存在一定差异，特别是在目、科、属等分类水平上，这可能是本研究想要探讨的咸海裸露带两种盐生假木贼内生真菌的多样性和潜在生态功能，未考虑植物的不同生态位对内生菌群落结构的影响。影响盐生植物内生菌多样性和群落组成的因素包括不同的植物、生长状态、生态位和土壤环境因素等。本研究结果发现，两种不同盐生假木贼的内生真菌组成在科、属等分类水平上差异较大，可能是由不同植物所导致的内生菌差异。

张志东等利用不同的扩增引物对盐角草内生真菌群落进行了高通量测序分析，发现共获得102个OTU，隶属于真菌界的8个门，其中Ascomycota丰度最高，成为绝对优势^[25]。李海林等从黄河三角洲滨海湿地的1 350个芦苇组织切片中分离到318株内生真菌，并进行测序及系统进化分析，结果表明Ascomycota为绝对优势菌群，在各组织和部位中均有分布，且受不同盐度和不同组织部位的影响不显著^[26]。丁小维^[27]采用不同盐度的培养基分离盐蒿内生耐盐真菌并研究其多样性，共获得1 215株内生耐盐真菌，鉴定结果也显示Ascomycota为绝对优势菌群。Li等^[28]从10种沙漠盐生植物中分离出36株内生真菌，发现不同植物种类和寄生植物组织部位对内生真菌群落组成有显著影响，表现出一定的寄主和组织偏好性。Khalmuratova等^[29]从生长于盐沼泽上的5种盐生植物中分离出了160株内生真菌，主要隶属于Ascomycota、Basidiomycota和Zygomycota，其中芦苇中可培养内生真菌的多样性最高。综上所述，Ascomycota是盐生植物内生真菌的主要优势类群之一。

本研究使用LEfSe分析方法发现了两种不同盐生植物中存在丰度差异的内生真菌biomarkers，结果表明子囊菌是盐生植物的主要内生真菌；对PCoA分析结果的探究显示，不同盐生植物内生真菌的群落结果存在差异。为进一步研究造成这种差异的原因，后续会进行全面采样，包括记录植物的年龄、生长状态以及土壤的物理和化学性质，以进行测序验证。本研究对丰度前100的ASVs进行了系统发育分析，发现两种盐生植物的内生真菌在目和科分类水平上有较高的多样性，并且还存在大量未分类的内生真菌类群。因此未来的研究需要探索纯培养方法，以分离潜在的新内生真菌类群，并研究内生真菌在促进植物生长和抗胁迫等方面的潜在功能。

本研究使用PICRUSt2预测了两种盐生植物内生真菌MetaCycle通路的丰度，共检测到68个相关代谢通路，差异丰度分析表明61个通路在两种盐生植物中存在显著性差异。内生真菌的MetaCycle通路丰度预测结果表明两种盐生植物内生真菌的代谢具有多样性的特点，与基础代谢相关的功能通路丰度较高，如l-tyrosine and l-leucine degradation I、trehalose degradation V、d-galactose degradation V等，表明植物可以为内生真菌提供充足且优质的底物供其正常生存代谢。此外，较高丰度的尿素循环(urea cycle)功能通路表明内生真菌在介导植物氮源吸收等方面可以发挥重要作用。FUNGuild的功能分组预测结果表明两种盐生植物内生真菌的营养方式多样，且营养模式差异较大，包括pathotroph、saprotroph和symbiotroph三种营养模式。其中，pathotroph型真菌可能导致植物病害，而saprotroph型真菌可能在植物碎屑以及正常凋零和死亡的植物器官及细胞降解过程中发挥作用，symbiotroph型真菌可能与宿主植物存在较多的代谢互动，为对方提供所需营养物质。本研究还发现不同植物的内生真菌多样性及微生物群落组成具有差异效应，但它们的潜在生态功能具有类似的结果。