CAPÍTULO 9 ASCOMICETOS (DIVISIÓN ASCOMYCOTA) Se estima que hay más de 65,000 especies descritas de ascomicetos, las cuales conforman la división Ascomycota dentro del reino Fungi. Son por ello el grupo más abundante de hongos y se les considera cercanamente emparentadas con los basidiomicetos, el otro grupo de organismos fúngicos avanzados, junto a los cuales forma el subreino Dikarya. Generalidades1, 2 Estos hongos poseen micelios compartamentalizados (hifas septadas), un estado dicariótico en algún momento de su ciclo de vida (de ahí el nombre del subreino al que pertenecen), falsos tejidos (plecténquima), que están asociados a la producción de esporas sexuales y complejos sistemas de dispersión y producción de esporas asexuales (conidias). Los septos del micelio poseen poros simples y cuerpos de Woronin, los cuales constituyen una de las características más propias de este grupo. Su característica más distintiva, sin embargo, es el asco, lugar de producción de las ascosporas, las cuales son generadas luego de la cariogamia y de la meiosis. Las ascosporas pueden ser de una a varios miles por individuo, pero regularmente son ocho en cada asco. Los ascomicetos ocupan una gran cantidad de hábitats y poseen muchos nichos ecológicos, pues los hay fitoparásitos, formadores de líquenes y micorrizas, endófitos, saprótrofos, coprófilos, micoparásitos, acuáticos e incluso algunos son hipógeos durante toda su vida. Los ascomicetos poseen dos fases reproductivas en su ciclo de vida (Figura 9.1), una sexual y una asexual, siendo la primera caracterizada por la presencia de ascos y ascosporas, mientras que la segunda se caracteriza por la producción de esporas asexuales en diferentes momentos en el mismo micelio. Dado que en muchas especies sólo se ha encontrado la fase asexual, ha sido costumbre ubicar tales anamorfos en el grupo de los Deuteromicetos u Hongos Imperfectos, grupo artificial que carece de jerarquía taxonómica. Estos estados asexuales de los ascomicetos son muy numerosos, a veces más comunes que los teleomorfos y pueden ser de una gran importancia para la humanidad, tanto por sus propiedades potencialmente beneficiosas como por ser agentes contaminantes y patógenos. Es pertinente aquí mencionar algunos términos relacionadaos con los anamorfos o estados asexuales u hongos mitospóricos, pues siguen siendo usados cotidianamente en micología: celomicetos son los deuteromicetos que producen conidias en picnidios o acérvulos, hifomicetos son los que no producen conidiomas, es decir, sus conidias son generadas libres en el micelio. Entre éstos los hongos moniliáceos son de hifas y conidias hialinas o de colores pálidos, las dematiáceas son las especies oscuramente pigmentadas y las estilbáceas son las que producen sinemas. Cuando un hongo no produce conidias, se dice que es Mycelia Sterilia (micelio estéril). Algunas características notables están presentes de manera distintiva en los ascomicetos y debe nombrárseles. Su cuerpo puede ser unicelular en las levaduras, micelial en la mayoría de especies o aun dimórfico. Cuando los micelios no son claramente distinguibles de los basidiomicetos, las características ultraestructurales pueden servir para diferenciarlos. La más notable presencia intracelular corresponde a los cuerpos de Woronin (CW), microcuerpos de doble membrana al parecer derivados del peroxisoma y que sirven para obstruir el poro septal e impedir la pérdida del citoplasma cuando ha habido una lesión en la hifa, como por ejemplo una ruptura. La posición del CW en hifas no septadas es el ápice de ellas, pero cuando se forma el septo la mayoría de ellos son transportados a la cercanía del poro septal, donde permanecen indefinidamente. En cuanto a la pared celular también hay importantes hechos distintivos en los ascomicetos. En las levaduras, por ejemplo, los mananos y los glucanos son los principales componentes de la pared, mientras que en los hongos filamentosos la quitina es el principal constituyente. Es notable la presencia de un organelo casi exclusivo de los ascomicetos liquenizados, al cual se denomina cuerpo concéntrico, cuyo origen y función son desconocidos. Figura 9.1. Ciclo de vida de un ascomiceto. A) La fase asexual se basa en la producción de esporas llamadas conidias, B) hifas haploides que producen más conidias. C) Ascogonio, estructura reproductiva femenina que emite un tricogino que busca el anteridio, D) anteridio, estructura reproductiva masculina, E) fusión de citoplasmas y el anteridio arroja sus núcleos en el ascogonio, F) desarrollo de hifas dicarióticas en el ascogonio que dan lugar a los ascos, G) gancho (crozier), que conforma la célula madre del asco en la cual se da la cariogamia, H) meiosis dentro del asco en proceso de crecimiento que produce 4 células haploides, las cuales experimentan mitosis y generan 8 ascosporas dentro del asco maduro (I). Las esporas son liberadas (J), para luego germinar formando hifas (B).§ Los septos del micelio de los ascomicetos están intercomunicados por los poros septales, a través de los cuales se continúa el citoplasma y la membrana plasmática, llegando incluso a darse la migración de núcleos. Por esto es posible que haya especies con septos multinucleados. Otras características notables al nivel celular son los apresorios, haustorios e hifopodios, los cuales están relacionados con la habilidad de fijarse o penetrar sustratos especializados. También relacionado con estas estructuras están las trampas, anillos y estructuras pegajosas que producen los micelios de algunos ascomicetos como Arthrobotrys, que se emplean mayoritariamente para atrapar presas, especialmente nematodos. Las hifas de estos hongos forman unas asociaciones organizadas que aparentan ser tejidos, a las cuales se les denomina en conjunto plecténquima. Dicho plecténquima puede tener dos variantes, algunas veces difícilmente distinguibles, a las cuales se les llama prosénquima y pseudoparénquima. Estos son falsos tejidos ya que se originan de diferentes hifas que sólo secundariamente se asocian, por lo que no tienen un origen común. Ellos están casi siempre relacionados con la actividad reproductiva o con la elaboración de estructuras resistentes a condiciones adversas. En términos antropocéntricos, los ascomicetos son muy importantes pues numerosas especies afectan el quehacer humano, y esto aplica tanto a la fase asexual (anamorfo), como a la sexual (teleomorfo). Por ejemplo, muchas especies vegetales útiles son atacadas por grupos como Ophiostoma, Cryphonectria y Fusarium, mientras que los mismos humanos somos víctimas de infecciones fúngicas de especies de Sporothrix y Pneumocystis, entre otros. Ahora bien, no todas las especies son perjudiciales, ya que las levaduras son ampliamente usadas con fines alimenticios y especies de Beauveria y Metarrhizium pueden llegar a ser controladores biológicos útiles. Muchas especies tienen potencial como productoras de compuestos fisiológicamente activos que pueden ser útiles en medicina humana, pues muchos ascomicetos sintetizan alcaloides y proteínas que alteran el metabolismo. Algunos de esos compuestos pueden generar enfermedades o incluso ser mortales tanto en animales como en humanos, pero también pueden ser medicinales o útiles en investigación básica. Reproducción1, 2 La reproducción asexual en los ascomicetos es quizá su principal forma de propagación en la naturaleza. Normalmente la formación de clamidosporas, el desarrollo de conidias, la fragmentación y la fisión, son los métodos de reproducción asexual en estos hongos. Las clamidosporas se formar por formación y engrosamiento de septos que dan lugar a una célula melanizada y más grande que el resto de la hifa en la que se forma. Cuando la hifa parental se desintegra las clamidosporas son liberadas, en un tipo de desarrollo tálico, como se explica para las conidias. Por su parte, las conidias representan el método más común de reproducción asexual y pueden ser muy variables en forma y tamaño (Figura 9.2). Se originan de una hifa especializada denominada conodióforo, la cual puede ser individual y estar dispersa en el micelio o agruparse formando complejas estructuras reproductivas. Los ascomicetos pueden reproducirse mediante conidias de manera asexual durante mucho tiempo, lo que a menudo llevó a los micólogos a considerar que se trataba de especies de reproducción asexual. Sólo cuando se pudo germinar ascosporas en el laboratorio y se vio que producían estados miceliales con conidias, se logró establecer la verdadera naturaleza de muchas especies consideradas asexuales, que en realidad resultaron ser sólo el anamorfo de un taxón específico. Las conidias pueden originarse directamente de las hifas somáticas o de células conidiógenas especiales situadas en los conidióforos más complejos y según el modo de desarrollo se denominan tálicas o blásticas (Figura 9.2I-K). El tipo de desarrollo tálico implica la cesación del crecimiento de la hifa fértil o célula conidiógena, tras lo cual se desarrollan septos que separan las células conidiales iniciales del resto de su parental. La hifa parental experimenta desarticulación y libera así las conidias, que en este caso generalmente reciben nombres especializados como oidios o artrosporas. En el desarrollo blástico la conida resulta de la formación de nuevas células que se originan de la célula conidiógena y la célula inicial puede agrandarse considerablemente antes de ser separada de aquella por un septo. La manera en que se forma la pared de las conidias ha sido también usada para clasificarlas en exógenas y endógenas, para lo que se usan los prefijos holo y entero, respectivamente. La formación exógena de la pared de la conidia implica que la pared de la célula parental se extienda en ella, derivando toda su pared de su célula madre. Esto sucede en ambos tipos de desarrollo conidial, por lo que hay conidias holotálicas y holoblásticas. El desarrollo endógeno implica que al menos la capa externa de la pared de la conidia sea nueva, es decir, no provenga de su parental (incluso puede ser completamente sintetizada de novo), por lo que también hay conidias enterotálicas y enteroblásticas. Figura 9.2. Conidias. Formas de las conidias maduras: A) Ameroconidia, B) didimoconidia, C y D) helicoconidias, E) estauroconidia, F) dictioconidia, G) fragmoconidia, H) escoleconidia. Tipos de desarrollo conidial: I) desarrollo de conidias blásticas, J) blastoconidias, K) desarrollo tálico de conidias, L) taloconidias. Arreglo conidial: M) arreglo simpodial, N) arreglo anelídico (se notan los anillos en la célula conidiógena).§ Figura 9.3. Estructuras reproductivas asexuales en ascomicetos que no producen esporocarpos. A) Sinema, B) esporodoquio.§ Figura 9.4. Estructuras reproductivas asexuales en ascomicetos que sí producen esporocarpos. A) Esquema y foto de un acérvulo, B) esquema y foto de un picnidio. Ambas estructuras son comunes en especies fitopatógenas.§ Si bien las conidias pueden ser originadas en conidióforos individuales, a menudo éstos se encuentran agrupados en varias presentaciones (Figuras 9.3 y 9.4). El esporodoquio y el sinema son agrupaciones de conidióforos en hongos que no forman un esporocarpo, es decir, aquellos hongos que carecen de un cuerpo dentro del cual se agrupan los conidióforos. Los deuteromicetos (hongos asexuales), que carecen de esporocarpos se han denominado tradicionalmente hifomicetos. El esporodoquio es una masa de aspecto polvoso en la que los conidióforos están estrechamente amontonados sobre su sustrato. En el sinema los conidióforos son alargados y forman una estructura erecta, en fascículo, a manera de cerdas de un pincel. Por el contrario, cuando las fases asexuales sí producen un esporocarpo, los conidióforos se guardan en un picnidio o en un acérvulo (Figura 9.4, a estos hongos se les denomina celomicetos). El picnidio parece un peritecio, ya que es un esporocarpo cerrado que contiene en su interior las conidias. Pueden estar completamente cerrados o poseer un poro superior y se les encuentra inmersos en la superficie del hospedero o sobre su sustrato. Están a menudo presentes en especies saprófitas o fitoparásitas, como en Septoria. El acérvulo es una masa aplanada, abierta, que emerge del interior de su hospedero, el cual es generalmente una planta. Las antracnosis producidas por Colletotrichum en cítricos y bananos, por ejemplo, son típicos ejemplos de acérvulos. Figura 9.5. Ascomicetos levaduriformes. A) Microscopía electrónica de barrido de la levadura de la fisión (Schizosaccharomyces pombe), foto de DO Morgan. B) Microscopía Nomarski de levaduras de la fermentación (Saccharomyces cerevisiae), foto de Masur.§ La fragmentación es quizá el método más sencillo de propagación asexual entre los hongos, pues implica que un trozo del micelio, a veces constituido sólo por unas pocas hifas, se separe del cuerpo original y continúen su crecimiento independientemente. El nuevo individuo así originado, es un organismo genéticamente idéntico a su parental. Otro ejemplo de reproducción asexual se da en las levaduras, ascomicetos unicelulares que frecuentemente producen células hijas mediante los procesos de fisión y yemación. La fisión es la división de la célula madre en dos hijas que terminan separadas por una pared que se forma entre los núcleos hijos luego de la mitosis, siendo ambas células hijas del mismo tamaño. El otro proceso reproductivo asexual conocido es la yemación, que podría imaginarse como una fisión desigual, en la que una célula nueva se origina a partir de una evaginación de la célula madre en un área pequeña, a lo cual sigue la expansión del citoplasma evaginado y su eventual separación de la célula progenitora. La fisión es típica de las levaduras Schizosaccharomycetales (justamente llamadas levaduras de la fisión) y la yemación lo es de las levaduras Saccharomycetales (levaduras de la fermentación) (Figura 9.5). Aunque similares en forma por ser unicelulares, estos organismos levaduriformes son considerados ascomicetos no muy cercanamente emparentados, de hecho puestos en sus propias subdivisiones, como se verá en la sección de clasificación. Un último notable ejemplo de órganos reproductivos asexuales se da en los ascomicetos liquenizados, en los que un grupo de células del fotobionte (alga), se rodean de hifas del hongo (micobionte), formando el soredio (Figura 9.6). Esta estructura se origina en regiones especializadas del líquen que luego se desprenden permitiendo la dispersión del propágulo que dará origen a un nuevo individuo. Figura 9.6. Estructuras reproductivas asexuales en ascomicetos liquenizados. Se muestra un grupo de soredios y su representación esquemática en Ramalina. Con información de www. biologie.uni-hamburg.de.§ Pasando a la reproducción sexual de los ascomicetos, lo primero que debe decirse es que implica que dos núcleos compatibles sean reunidos en una misma célula. Si la fuente de los núcleos son gametangios morfológicamente similares, la cariogamia sucede rápidamente y la fase dicariótica es de corta duración. La plasmogamia previa origina una célula de fusión, la cual se desarrollará formando el asco que es variable en forma según la especie (Figura 9.7A, B). Ahora bien, es posible que las fuentes de los núcleos sean gametangios morfológicamente diferenciados, a los cuales se les denomina anteridio y ascogonio. Los ascos se producen como sobrecrecimientos del ascogonio, el cual recibe el núcleo del anteridio debido a una estructura especializada llamada tricogino. En este caso la fase dicariótica puede persistir bastante tiempo antes de la cariogamia y es lo que comúnmente sucede en los ascomicetos. También se ha documentado un proceso sexual entre los ascomicetos llamado espermatización, en el cual una célula masculina se suelta de su micelio y se adhiere al órgano receptor femenino, que puede o no ser un tricogino. Posteriormente el núcleo masculino es liberado en su interior y migra hacia el ascogonio a través de los poros septales. Un último método de reproducción sexual ha sido también detectado, el cual es más raro que los anteriores y se le ha denominado somatogamia. En este proceso hifas somáticas no especializadas pertenecientes a micelios compatibles se fusionan y los núcleos migran a través de los septos hacia el ascogonio. Los ascomicetos poseen una genética compleja cuyo estudio en detalle escapa a los objetivos de un libro introductorio como éste. Parte de dicha genética se ha revisado en el apartado de reproducción fúngica del capítulo 1. Debe mencionarse que la capacidad de fusión de las células, bien sea en procesos sexuales o asexuales, es uno de los aspectos más afectados por la genética del hongo y se ha descubierto que existe un grupo de genes especializados que la controlan, a los cuales se les llama genes del tipo apareante. Se sabe que hay especies en las que hifas genéticamente similares no pueden fusionarse (incompatibilidad homogénica), mientras en otras especies sí lo hacen (incompatibilidad heterogénica), temas que han sido extensivamente estudiados en los géneros Neurospora y Saccharomyces. Un fenómeno genético también muy interesante y poco entendido es el ciclo parasexual, el cual permite la recombinación en un micelio de un ascomiceto sin que haya habido reproducción sexual. Este ciclo sólo ha sido observado en el laboratorio pero plantea la existencia de alternativas fascinantes con las que cuentan los diversos y adaptables ascomicetos. Figura 9.7. Representación esquemática de las estructuras sexuales de los ascomicetos. A) Asco en forma de cachiporra, B) asco circular. Ambos dibujados con ascosporas en su interior. Estos ascos puedes estar solitarios o agrupados, en cuyo caso lo hacen casi siempre en uno de los siguientes tipos: C) Apotecio, ascocarpo abierto que expone los ascos al ambiente, D) cleistotecio, ascocarpo cerrado, de forma esférica, E) peritecio, ascocarpo casi completamente cerrado ya que sólo posee una abertura de salida denominada ostiolo.§ Los micelios heterocariotas pueden experimentar el fenómeno de la parasexualidad o ciclo parasexual. Se trata de una secuencia de fenómenos celulares en un micelio heterocariota en el que los núcelos se diploidizan y luego se reestablece la condición haploide (haploidización). Una serie de divisiones mitóticas irregulares de los núcleos diploides es la que lleva a la restauración del estado haploide, lo cual está frecuentemente acompañado de fallas en la separación de las cromátidas que producen núcleos hijos con números cromosómicos desiguales (aneuploidías, ej: 2n + 1 ó 2n - 1). Subsecuentes mitosis atípicas pueden conllevar a la recuperación del estado haploide en tasas tan bajas como uno entre 1,000 núcleos. La ventaja de este fenómeno parasexual radica en que es posible que exista recombinación genética en algunas de estas mitosis (Figura 9.8), lo que puede suceder en uno de cada diez núcleos haploides obtenidos en el ciclo parasexual. Este 10% de recombinación genética parece muy bajo al compararlo con la meiosis, en la que prácticamente el 100% de los núcleos producidos son recombinantes, pero debe pensarse que en términos biológicos es mejor tener algo de recombinación que carecer completamente de ella. Figura 9.8. Esquema que representa la ventaja del intercruzamiento mitótico en el ciclo parasexual. A) Se representan sólo dos cromosomas homólogos con los posibles cambios durante el proceso de haploidización en un núcleo heterocigoto para dos genes, B) intercruzamiento durante la replicación del cromosoma (en el estado de cuatro hebras), C) núcleos genéticamente diferentes luego de la segregación cromosómica.§ Otros aspectos muy importantes de la biología reproductiva de los ascomicetos, son la formación de las ascosporas (ascosporogénesis) y la producción del ascocarpo (ascocarpogénesis). La formación de la ascospora implica la delimitación de una porción del citoplasma, que generalmente contiene un núcleo, por parte de dos membranas celulares muy unidas entre sí. También implica la formación de una pared celular de la ascospora que se origina mediante el depósito de sus materiales precursores en el espacio entre las dos membranas mencionadas. Todo esto sucede en el interior del asco, donde generalmente se producen ocho ascosporas cuyas formas, al igual que las del asco, son muy variadas. La estructura del asco es de gran importancia para la clasificación de estos hongos, ya que tanto el número de capas de su pared como la presencia o no de una abertura con tapa para la descarga de las ascosporas, son usados frecuentemente para describir los ascomicetos. Si la pared del saco no se separa en dos capas en el momento de la descarga, se habla de ascos unitunicados, mientras que la presencia de dos capas separables los convierte en bitunicados. La condición bitunicada se detecta al aplicar yodo, pues los hongos con esta característica se tornan de color azul con compuestos yodados. De otra parte, la presencia de una tapa que se mueve al liberar las ascosporas es típica de hongos operculados, mientras los que no la poseen son inoperculados. Ahora bien, la mayoría de los ascomicetos poseen sus ascos en agrupaciones densas que se denominan ascocarpos o cuerpos fructíferos (Figuras 9.7C-E, 9.9). Estos pueden ser pueden ser cleistotecios, peritecios, apotecios y pseudotecios o pueden estar completamente ausentes en unas pocas especies que poseen sus ascos desnudos. Se conoce la existencia de formas intermedias de difícil clasificación, si bien la presencia del ascocarpo es útil para la determinación taxonómica del hongo. Figura 9.9. Carpóforos o cuerpos fructíferos en ascomicetos. A) Apotecio en el discomiceto Cookeina, B) peritecio en el pirenomiceto Sordaria y C) ascostroma en el loculoascomiceto Venturia (Fotos B y C de T Volk).§ Clasificación3, 4 Ha sido una tradición bien arraigada agrupar a los ascomicetos bajo nombres informales que, aunque carecen de rango nomenclatural, son útiles para estudiar especies con características similares. Entre ellos se puede mencionar a los discomicetos, plectomicetos, loculoascomicetos y pirenomicetos, términos que seguirán siendo usados cotidianamente por los micólogos pero que no corresponden con la clasificación actual de los ascomicetos, ya que éstos experimentaron un rearreglo taxonómico reciente junto a los otros grupos del reino Fungi. El término Ascomycota, actualmente usado para referirse a la presente subdivisión de hongos, tiene sus orígenes en fecha tan temprana como 19575, si bien se le considera sinónimo del taxón llamado Ascomycetes, usado ya para 1857. La actual clasificación de los ascomicetos acepta tres subdivisiones3: Pezizomycotina (60 órdenes), Saccharomycotina (1 orden) y Taphrinomycotina (4 órdenes) (Tabla 9.1), de las cuales se revisa a continuación algunos grupos. Ascomicetos I. Subdivisión Pezizomycotina Este es el grupo donde se encuentra la inmensa mayoría de las especies de ascomicetos, al cual se denomina en conjunto ascomicetos filamentosos. Su género tipo, Peziza, es también el tipo básico de la división Ascomycota. Estos hongos desarrollan órganos sexuales funcionales, si bien muchas especies han degenerado el gametangio masculino. Típicamente presentan ascogonio, hifas ascógenas y gancho (crozier) dentro de un ascocarpo (Figura 9.1), aunque hay especies con ascocarpos vagamente distinguibles o definitivamente ausentes. Esta subdivisión se divide en diez clases y de cada una de ellas se describe a continuación al menos un orden. Clase Arthoniomycetes: Orden Arthoniales Este grupo se ubica entre los ascomicetos filamentosos con ascostromas, tradicionalmente conocidos como loculoascomicetos, si bien hay quien ponga dudas en esta cercana relación taxonómica6. Son hongos que producen un estroma en el que se desarrollan unas cavidades llamadas lóculos, dentro de las cuales se originan los ascos que son generalmente bitunicados. Los loculoascomicetos poseen especies formadoras de líquenes, productoras de toxinas y notables fitopatógenos. En cuanto a los artoniales en particular, puede reconocerse su papel como formadores de líquenes crustosos en la corteza de los árboles, sus fotosimbiontes son algas trentepolioides, forman apotecios y presentan especies saprótrofas y parásitas. Arthonia (Figura 9.10B) y Opegrapha poseen unas 700 especies de las 1,200 del orden. Figura 9.10. Estructras reproductivas de ascomicetos miceliales. A) Hongo del orden erisifales (Cystotheca), mostrando un ascoma con un asco en el que hay 8 ascosporas, foto de J Rodríguez. B) Ascosporas en Arthonia radiata, foto de P Cannon.§ Clase Dothideomycetes: Orden Myriangiales Es otro grupo de loculoascomicetos con ascostromas de crecimiento indeterminado2. Los lóculos carecen de ostiolo y en ellos se desarrolla un solo asco, el cual experimenta dehiscencia. Las especies tropicales y subtropicales de la familia Myriangiaceae tienen miembros asociadas con plantas, insectos y resinas. Los ascos quedan expuestos al ambiente luego que el estroma se gelatinice y expulsan de manera forzada las ascosporas. Myriangium bambusae es un patógeno notable en bambú cultivado. En la familia Elsinoaceae hay también especies tropicales fitopatógenas importantes, como Elsinoë fawcettii (patógena en cítricos) y E. ampelina y E. veneta, que causan variadas antracnosis. El otro grupo importante de este orden está constituido por la familia Piedraiaceae, en la que Piedraia hortae se destaca por ser un importante patógeno tropical que afecta la piel de humanos y animales, desarrollando la enfermedad conocida como piedra negra. Algunos autores han cuestionado la presencia de este grupo entre los loculoascomicetos por poseer ascos globosos de pared delgada con paredes evanescentes y lóculos con ostiolo. Clase Dothideomycetes: Orden Pleosporales Estos hongos poseen ascostromas variables, que pueden ser con muchos lóculos o casi como un cleistotecio. En el ascocarpo existen las pseudoparáfisis, denominadas así porque crecen en la parte superior y crecen hacia abajo, donde se fusionan en la base. Los ascos son basales y crecen hacia arriba produciendo ascosporas variables en forma y oscuras o hialinas. Sus anamorfos son hifomicetos o celomicetos, comúnmente aislados en cursos básicos de micología. Entre ellos hay fitopatógenos, saprótrofos y formadores de líquenes, así como también se ha registrado la existencia de especies acuáticas. Cochliobolus y Pyrenophora son fitopatógenos importantes en cereales y pastos, así como Venturia lo es en el manzano2, 7. Varias especies del orden, por ejemplo entre las pleorporáceas, son importantes modelos en estudios genéticos y moleculares8. Las conexiones entre el teleomorfo y su anamorfo están bien documentadas (Tabla 9.1), y en algunos casos las formas conidiales poseen un solo tipo apareante, lo que se interpreta como especies verdaderamente asexuales. Un grupo grande y problemático taxonómicamente es el género Leptosphaeria, en el que hay importantes parásitos de plantas cultivadas y silvestres. Además de los anamorfos de la tabla 9.1, hay notables ejemplos como Coniothyrium, Phoma, Septonema, Septoria y Sporidesmium. Clase Eurotiomycetes: Orden Eurotiales Se caracterizan por tener ascos libres sobre el micelio o dentro de ascocarpos, reproducción sexual entre un tricogino y una hifa no diferenciada, ascos evanescentes ovoideos o redondeados, ascosporas unicelulares y presencia de conidias usualmente en fiálides. Un notable grupo de eurotiales son de muy amplia distribución mundial y poseen coberturas variadas sobre sus ascos que incluyen pseudoparénquima, estromas y cleistotecios modificados2. Se trata de la familia Trichocomaceae en la que hay anamorfos fialídicos como Aspergillus, Penicillium (Figura 9.11) y Paecilomyces. Las especies de esta familia ocupan diferentes nichos, pues las hay descomponedoras de alimentos, incluso de algunos guardados en el refrigerador, así como otras ayudan en la fabricación de productos alimenticios. Se sabe de especies termofílicas, así como también las hay productoras de micotoxinas, mientras que otras sirven en la producción de antibióticos. Es muy común en Asia el uso de Aspergillus y Monascus en la elaboración de alimentos fermentados como soya y arroz. El papel alimentiio de Penicillium se da, contrastantemente, en Occidente, donde se usa en la elaboración de variados y costosos quesos, aunque también se usa junto a Aspergillus en el proceso de curado del jamón y salami. Es justamente de especies de Penicillium de donde se extrajo el antibiótico más conocido, la penicilina9, y posteriormente la griseofulvina, la cual es útil para combatir afecciones fúngicas de la piel. De igual manera se encontró una serie de compuestos fisiológicamente activos entre los hongos tricocomáceos, las aflatoxinas y ocratoxinas (Figura 1.3), cuyos efectos pueden ser desastrosos para hígado y riñón en vertebrados. Aunque este tema es muy interesante desde el punto de vista de la investigación científica, la razón por la cual un microorganismo produce una toxina que afecta los órganos de un macroorganismo con el que aparentemente no interacciona, sigue siendo un misterio. Figura 9.11. Eurotiales. A) Esquema y foto de la parte reproductiva de Aspergillus, a) hifa somática, b) vesícula, c) fiálide, d) conidias. B) Esquema y foto de la parte reproductiva de Penicillium, e) esterigma, f) métula. Con información de http://website.nbm-mnb.ca/.§ En la actualidad, sin embargo, quizá el mayor problema de las especies patógenas de eurotiales se centra en Aspergillus, ya que A. fumigatus, A. flavus y A. niger han mostrado ser los agentes causales de un grupo de enfermedades colectivamente denominadas aspergilosis10. La inhalación de las conidias de estas especies puede producir reacciones alérgicas y sus hifas pueden crecer en espacios aéreos dentro del cuerpo o aún dentro de los tejidos. Esto a menudo sucede en el pulmón, de donde puede pasar a otros órganos, especialmente en pacientes inmunosuprimidos, como los que desarrollan el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (S.I.D.A.), en los cuales suele ser fatal. Si bien Penicillium puede causar enfermedades fatales también, su mayor impacto económico para la humanidad radica en que algunas especies son muy dañinas para varios productos vegetales almacenados como manzanas, cítricos e incluso material guardado en silos, donde forma característicos mohos que infectan el material y lo hacen no apto para consumo humano. Clase Eurotiomycetes: Orden Pyrenulales La organización de este grupo es reciente y obedece a la reestructuración del antiguo orden Melanommatales, donde comúnmente eran tratadas en cercana asociación las familias Massariaceae y Pyrenulaceae2, 11. Estos hongos son saprófitos o parásitos de la madera, corteza, raíces y frutos. Es muy común hallar hongos liquenizados del tipo crustoso o cortícola en ambientes tropicales, entre las especies de este grupo, como en Pyrenula. Se conoce poco de los anamorfos de este orden, si bien se sabe que algunos son celomicetos (deuteromicetos con picnidios o acérvulos). Clase Laboulbeniomycetes: Orden Laboulbeniales Son ascomicetos cuya clasificación ha sido siempre conflictiva. Es un grupo interesante que contiene especies que carecen de micelio. Los talos se originan de las ascosporas y pueden ser hialinos a pigmentados, con ascos evanescentes, ascosporas de dos células con un extremo modificado para la adhesión y comúnmente asociados a artrópodos. Se trata de parásitos obligados de insectos (Figura 9.12), ácaros y otros invertebrados, con los que desarrollan relaciones muy específicas. Figura 9.12. Escarabajo parasitado por hongos laboulbeniales. Muchas de estas infecciones causan poco daño al hospedero, por lo que éste puede vivir gran parte de su vida con los hongos en su exoesqueleto. Foto de MW Kozlowski.§ De este grupo fue separada la familia Pyxidiophoraceae, que ahora conforma su propio orden dentro de los ascomicetos. Es notable que en los labulbeniales no se desarrollan conidias comparables con las de la mayoría de los ascomicetos. Las especies de este grupo no son raras, si bien no son frecuentemente recolectadas pues se necesita una gran cantidad de insectos para poder observarlos de forma adecuada. Se sabe que en algunos hospederos hay diferencias en el lugar de adhesión según se trate de un macho o una hembra, como en los escarabajos, pero debe anotarse que es necesario realizar estudios poblacionales de largo plazo antes de sacar conclusiones sobre la historia natural de estos hongos y sus insectos 12. Otro curioso hospedero es la hormiga legionaria (Eciton), en cuyos nidos se han detectado estos hongos. La biología de los labulbeniales es estudiada por su posible rol como controladores de artrópodos, habiéndose descubierto que en el género Laboulbenia hay especies dioicas, con anteridio en unos individuos y carpogonio en otros, en el cual se desarrolla el tricogino. Clase Lecanoromycetes: Orden Lecanorales Casi todas las especies de este grupo son formadoras de líquenes o tienen diversas asociaciones con ellos. Es un grupo grande y heterogéneo de discomicetos que forma grandes y conspicuos líquenes así como algunos con talos microscópicos. Los hongos liquenizados han sido frecuentemente estudiados con respecto a su capacidad de servir como indicadores de calidad de hábitat, especialmente en ambientes modificados por el ser humano. En efecto, algunas especies en Hypogymnia (Figura 9.13), Lobaria y Usnea han mostrado ser muy sensibles a la polución ambiental y son buenas indicadoras del nivel de contaminación de un ambiente dado. Figura 9.13. Ascomiceto liquenizado del orden lecanorales (Hypogymnia). Las especies de este género son sensibles a la contaminación y pueden ser polvosas en su superficie. Foto cortesía de Kvistlav.§ De este grupo fue separado el actual orden Lichinales, basándose en la ontogenia de los ascocarpos. Los liquinales tienen como simbiontes fotosintéticos a cianobacterias y son comúnmente gelatinosos. La biología de los hongos liquenizados se aborda con mayor detalle en el capítulo 11, que está dedicado a las interacciones ecológicas de los hongos. Clase Lecanoromycetes: Orden Ostropales La clasificación actual presenta a este orden como la compilación de taxones anteriormente situados en Gomphillales, Graphidales, Gyalectales y Trichotheliales. Se trata de discomicetos con ascocarpos elongados que se abren por una hendidura, de tipo apotecioide o peritecioide. Los ascos son cilíndricos con paredes laterales delgadas, en algunas especies característicamente engrosados en el ápice donde hay un poro por el que se descargan las ascosporas. Éstas son asimétricas, con el extremo superior más ancho, septadas o muriformes con septos amiloides engrosados, la forma puede ser sigmoide o filiforme. Son comunes en ambientes de zonas templadas, donde hay especies formadoras de líquenes (Graphis), pero también hay saprótrofos de ambientes y sustratos xéricos como cortezas y madera expuesta al viento (Stictis), así como parásitos biótrofos (Skitta) o incluso necrótrofos (Bryodiscus). Clase Leotiomycetes: Orden Erysiphales Se trata de un grupo de especies que son biótrofas obligadas, conocidas en conjunto como mildeos polvosos2. El nombre vulgar se deriva de la apariencia polvosa que adquieren las plantas infectadas por ellos, que es consecuencia de la gran cantidad de conidias producidas por el hongo. Se estima que más de 40,000 plantas son atacadas por estos microorganismos, entre las que se puede citar cereales, cucurbitáceas, manzanas, especies ornamentales y uvas13. Uncinula necator es un importante patógeno de la vid, Sphaeroteca pannosa ataca las rosas, Podosphaera leucotricha las manzanas, Erysiphe cichoracearum las cucúrbitas y Blumeria graminis es importante como patógeno de cereales (Figura 9.14). Es pertinente mencionar que algunas especies son extremadamente generalistas en cuanto a los hospederos que atacan, como Erysiphe polygoni que afecta más de 350 especies de plantas, mientras que algunas son muy específicas, como las formas especiales de Blumeria graminis, algunas de las cuales forman sistemas específicos con su hospedero (patosistemas), que son sujeto de mucha investigación en la actualidad. También es notable que hay especies cuyas infecciones causan poco daño al hospedero, como sucede con el género Microsphaera. El micelio es producido casi exclusivamente en la superficie de su hospedero, principalmente sobre las hojas. Las hifas son de pared delgada, septadas, pueden ser ramificadas y se adhieren al sustrato mediante apresorios que pueden desarrollar haustorios, que son las únicas estructuras que realmente penetran las células vegetales. La reproducción asexual se da por conidióforos superficiales erectos y no ramificados, que producen muchas conidias en cadena. Se sabe de la producción de clamidosporas en este grupo. De la reproducción sexual se sabe poco, habiéndose detectado especies homotálicas y heterotálicas. Las ascosporas de estos hongos se producen en ascocarpos diminutos, cerrados, a manera de cleistotecios, pero con la disposición de los ascos en la base, como en los peritecios. Es raro tener disponibilidad de ascocarpos por lo que la identificación debe basarse en estructuras somáticas y conidias. Figura 9.14. Apariencia polvosa de Blumeria graminis sobre la hoja de la cebada (Hordeum vulgare). Fuente: Clemson University - USDA Cooperative Extension Slide Series, Bugwood.org.§ Figura 9.15. Nematodo atrapado en el micelio de Arthrobotrys, un anamorfo en la familia Orbiliaceae. Fuente de la foto http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Ecology/antagoni.htm.§ Clase Orbiliomycetes: Orden Orbiliales Grupo de hongos ascomicetos comunes en ambientes templados aunque también hay especies tropicales. Con unas 300 especies, este grupo es ampliamente conocido por poseer adaptaciones para atrapar y digerir nematodos (Figura 9.15), lo cual es evidente en los anamorfos de Orbilia14. Poseen apotecios convexos, brillantes o traslúcidos, con ascosporas hialinas de forma ovalada o elipsoidea y muy pequeñas. No poseen estromas, sus anamorfos son hifomicetos y entre las estrategias usadas para capturar nematodos están los anillos (con capacidad de constricción o no), redes y elementos adhesivos. Se cree que esta conducta es consecuencia de adaptación a ambientes acuáticos y pobres en nitrógeno. Han recibido creciente atención porque se les quiere usar como biocontroladores de nematodos fitopatógenos. Clase Pezizomycetes: Orden Pezizales Las especies de este orden representan los típicos discomicetos operculados, es decir, ascomicetos cuyos ascocarpos están en forma de apotecios y sus ascos poseen un opérculo por el que se da la dispersión forzada de las ascosporas2. Además de las especies operculadas hay algunas hipógeas, es decir, que crecen bajo la tierra, que no dispersan sus ascosporas forzadamente sino que lo hacen por micofagia. Muchas especies de pezizales son saprótrofas y las hay también formadoras de ectomicorrizas. Figura 9.16. Corte transversal del esporocarpo de la valiosa especie Tuber melanosporum. Es conocida como trufa negra o de Périgord. Foto cortesía de autor anónimo (moi-même), a través de Wikimedia Commons.§ Es un grupo grande, en el que se ha requerido el uso de datos de ultraestructura y la citología para poder delimitar los taxones al nivel de familias y subórdenes15. En el género Peziza los apotecios son en forma de copa o de disco, con o sin tallo y coloreados a oscuros, así mismo son lisos o de variadas texturas. Sus opérculos están en el ápice del asco y sus ascosporas son uninucleadas y de pared delgada. Habitan sobre el suelo, boñiga o madera en descomposición. A los pezizales pertenecen también las trufas (Tuber, figura 9.16), hongos valiosos en culinaria cuyo ascocarpo es hipógeo y sólo libera sus ascosporas cuando se descompone o es comido por animales. Estos hongos forman micorrizas y para detectar su ascocarpo se usan cerdos o perros entrenados, siendo la especie más valiosa T. melanosporum. El género Cookeina (Figura 9.9A) y sus parientes cercanos poseen apotecios de colores brillantes y son comunes en los trópicos. Algunos grupos de pezizales muestran curiosas características, como Sarcosoma, que posee ascocarpos gelatinosos de gran tamaño (hasta 7 cm de altura), mientras que en Thelebolus hay una gran variación en el número de ascosporas por asco: desde 8 hasta 1024. Hay Pezizales comúnmente asociados a las heces de herbívoros, ya que pasan por su tracto digestivo antes de germinar, como por ejemplo en los géneros Ascobolus, Saccobolus y Coprotus. Las morchelas o colmenillas son también de este grupo (género Morchella). Ellas son comestibles y se caracterizan por un ascocarpo grande, de hasta 14 cm de longitud, con tallo y un píleo esponjoso en el que se producen ascosporas multinucleadas. Algunas pueden producir problemas gastrointestinales si se comen crudas o con alcohol. Verpa es otro género comestible importante que puede tener especies tóxicas, pero probablemente las más peligrosas entre las especies de Pezizales son las del género Gyromitra, que pueden ser mortales debido a que poseen un compuesto tóxico y cancerígeno denominado giromitrina. Clase Sordariomycetes: Orden Diaporthales Los diaportales producen peritecios en medio de un estroma formado por sus hifas y por el sustrato en el que crecen, así como también los pueden producir directamente de hifas sobre el sustrato. Las ascosporas pueden ser hialinas hasta color marrón y con uno o más septos. Las paráfisis son delicuescentes en la madurez y hay perífisis en el ostiolo. Existen varios tipos de anamorfos celomicetosos y muchas especies son importantes patógenos y saprótrofos. Varios taxones son complicados y la última palabra no ha sido dicha en este grupo, cabe mencionar a Diaporthe (Figura 9.17), Gnomonia, Magnaporthe y Cryphonectria como importantes fitopatógenos. Figura 9.17. Tallo y vaina de la soya en los que se muestra el efecto de Phomopsis sojae, el anamorfo de Diaporthe phaseolorum var. sojae. http://www.agrolink.com.br/culturas/soja/ podridao-seca_1763.html.§ Diaporthe es un importante género en el que hay numerosas especies fitopatógenas, como por ejemplo D. citri, D. vexans Y D. phaseolorum. Esta última especie produce peritecios inmersos en el estroma con un largo cuello que sobresale y puede constituir un complejo de especies, ya que numerosos anamorfos en Phomopsis han sido descritos16, si bien este hongo mitospórico es a menudo aislado como hongo endófito. El hongo aparece durante la estación de crecimiento del hospedero y produce conidiomas loculados en el estroma, para desarrollar peritecios cuando el hospedero ha muerto, dentro de los cuales hay una alta presión interna que permite una dispersión forzada de las ascosporas. Las pérdidas en los cultivos pueden ser totales ya que se rata de un patógeno muy agresivo, su control actual se basa en el uso de variedades vegetales resistentes. Otros diaportales notables son Magnaporthe grisea, cuyo anamorfo, Pyricularia oryzae, causa el quemado del arroz, una de las enfermedades agronómicas más importantes del planeta. Por su parte Gaeumannomyces graminis es un agente muy destructivo en cereales cultivados y Cryphonectria parasitica es el causante del chancro del castaño (Castanea spp.), que casi lleva a la desaparición de varias de sus especies. Clase Sordariomycetes: Orden Hypocreales Este grupo posee peritecios, ascos ovoides a cilíndricos, ascosporas de una a varias células, forzadamente descargadas y conidias enteroblásticas en conidióforos fialídicos. Sus interacciones incluyen endofitismo, parasitismo en plantas y animales, e incluso pueden ser saprótrofos. Son un grupo muy notable por su capacidad de producir metabolitos secundarios activos en vertebrados 17. Al interior del grupo se reconocen tres linajes que razonablemente pueden ser tratados como familias, Hypocreaceae, Nectriaceae y Clavicipitaceae, esta última a veces separada en su propio orden por algunos autores. Entre los hongos hipocreáceos están Hypocrea, Hypomyces y Sphaerostilbella. Hypocrea es común en madera y hojas en descomposición, posee ascosporas de dos células en una sola serie, las cuales se parten por el septo y sus especies poseen anamorfos en Trichoderma y Gliocladium. Por su parte, Hypomyces posee ascosporas de una o dos células y comúnmente es parásito en hongos suculentos como los champiñones. Los hongos clavicipitáceos son morfológicamente diferentes y muchos autores discuten si están más cercanamente emparentados con los xilariales. En esta familia hay notables anamorfos en Acremonium, Gibellula e Hirsutella. Géneros importantes son Claviceps, parásito en gramíneas y productor de peligrosas toxinas que causan el ergotismo, Cordyceps, patógeno en insectos y en basidiomicetos y Epichloë y Balansia, que son endófitos comunes en pastos. La familia Nectriaceae incluye géneros como Gibberella, Neocosmospora y Nectria (Figura 9.18), entre los que se encuentran especies útiles en el laboratorio por su facilidad de crecimiento y esporulación. El característico desarrollo de las paráfisis de Nectria en el centro del ascocarpo (centrum), ha llevado a que se le considere un modelo de comparación para clasificar el desarrollo de otros hongos. El género Nectria posee especies saprófitas y también parásitas, siendo una de las más importantes la que corresponde en su fase asexual a Fusarium solani, que en realidad es un complejo de especies de gran importancia económica por poseer miembros fitopatógenos. Algunos autores plantean que Nectria no es un grupo monofilético. En su ciclo de vida la fase asexual produce esporodoquios mientras que su ascocarpo sexual corresponde a un peritecio. Figura 9.18. Ascocarpos de Nectria. En este género hay unas 80 especies saprótrofas y parásitas (algunas de importancia económica), con característicos peritecios que emergen de su sustrato. Con información de http://mycoweb.narod.ru.§ Figura 9.19. Hifas de Ophiostoma creciendo entre las células del xilema (traqueidas areoladas), de una especie de pino comercial. Estos hongos producen alteraciones en la textura y el color de la madera. Foto cortesía del U.S.D.A. Forest Service, Ogden Archive.§ Clase Sordariomycetes: Orden Ophiostomatales Se trata de ascomicetos con peritecios o raramente cleistotecios, con ascos evanescentes globosos u ovoideos, que carecen de paráfisis y perífisis. Otras características del grupo son la presencia de anamorfos en Sporothrix y Leptographium, así como la asociación con escarabajos de la corteza que pueden dispersarlos en estructuras especiales de su exoesqueleto denominadas micangios. Hay especies que parasitan la madera (Figura 9.19) y la tiñen de azul, hecho que ha sido aprovechado para elaborar curiosas artesanías. También se sabe de especies fitopatógenas entre las que destacan Ophiostoma ulmi, O. novo-ulmi y Leptographium wagnerii. Ophiostoma ha presentado problemas taxonómicos por su similitud con el género Ceratocystis, del cual se distingue por poseer ramnosa y celulosa en la pared celular, ser resistente a la ciclohexamida y poseer anamorfos no fialídicos. La estrecha relación entre los hongos y sus escarabajos vectores18, ha sido un recurrente modelo para el estudio de las simbiosis, tema de gran actualidad. Clase Sordariomycetes: Orden Xylariales Se trata de un diverso grupo de hongos de ambientes tanto tropicales como templados. Tradicionalmente reconocidos como pirenomicetos, los xilariales poseen peritecios oscuros, acartonados, carbonáceos (Figura 9.20) o de apariencia leñosa, aunque puede haber especies con cleistotecios, a veces embebidos en el estroma. Los ascos son cilíndricos o subglobosos, usualmente con un anillo apical y con la particularidad de madurar a diferente velocidad dentro de un mismo ascocarpo, por lo que se pueden encontrar ascosporas de muy disímil edad en su cuerpo fructífero. Las ascosporas son de una o varias celdas, hialinas u oscuras y con poros o suturas de germinación. Las paráfisis son abundantes y su crecimiento activo parece ayudar a expandir el ascocarpo, creando una cavidad central. Las paráfisis pueden ser lisadas por los ascos en desarrollo y se sabe que en las especies con peritecios hay también perífisis. Sus estados asexuales muestran una característica conidiogénesis holoblástica. Figura 9.20. Especie de hongo xilarial saprófito en un bosque montano en los Andes colombianos. Muchas especies de este grupo son descomponedoras de la madera, por lo que desempeñan un importante rol en el ciclaje de nutrientes.§ Se considera que el nicho preferido de los xilariales es la descomposición de la madera y demás materiales orgánicos, pero se reconocen varias especies que son patógenas importantes en los géneros Hypoxylon, Rosellinia, Kretzschmaria y Biscogniauxia. Los perfiles químicos han sido reconocidos como de gran importancia para la clasificación de estos hongos. El género tipo, Xylaria, se caracteriza por especies saprótrofas o parásitos débiles en plantas leñosas que poseen estromas elongados y erectos. Ascomicetos II. Subdivisión Saccharomycotina Este es el grupo de especies que ha sido tradicionalmente conocido como levaduras, las cuales se caracterizan por poseer una forma de crecimiento similar, en este caso unicelular. El término levadura no es taxonómico sino que se ha aplicado a cualquier hongo que tenga etapas de crecimiento unicelulares, fenómeno que ha sido documentado en cigomicetos, basidiomicetos y ascomicetos, si bien el término levadura se asocia por antonomasia a los sacaromicetos2. Algunas especies pueden presentar ambos tipos de crecimiento (unicelular y micelial), por lo que se les denomina dimórficas. La diagnosis de la subdivisión y de su única clase, Saccharomycetes, corresponde a la de su también único orden Saccharomycetales, que se presenta a continuación. Orden Saccharomycetales Los sacaromicetales se caracterizan porque no poseen ni hifas ascógenas ni ascocarpos y sus ascos son de pared delgada que se desintegran o rompen para liberar las esporas. En este grupo el crecimiento se da en forma unicelular, a menudo acompañadas de pseudohifas o incluso hifas verdaderas. A pesar de su unicelularidad dominante, hay poca duda que se trata de un grupo monofilético hermano de los ascomicetos filamentosos19. Es muy común la reproducción asexual por fragmentación y yemación (Figura 9.21), así como también se da mediante conidias. Figura 9.21. Levadura de la fermentación. A) Fotografía electrónica de barrido de Saccharomyces cerevisae. B) Esquema mostrando las características intracelulares de S. cerevisae: a) mitocondrias, b) vacuola joven, c) vacuola con gránulos, d) yema, e) núcleo, f) dictiosoma, g) tonoplasto, h) gránulo lipídico, i) cicatriz de una yema, j) pared, K) gránulo de almacenamiento, l) vesículas. Foto cortesía del Dartmouth Microscope Facility, Dartmouth College.§ Las células que funcionan como gametangios se fusionan y sus núcleos dan origen a una célula diploide inmediatamente, ya que tras la plasmogamia sigue rápidamente la cariogamia. Por ello no hay etapa dicariótica en las levaduras, aunque el estado diploide puede durar algún tiempo mientras las células se dividen por yemación. El cigoto se puede originar partenogenéticamente o por la fusión de dos células y da origen bien sea a un asco o a un ascóforo, en el cual se desarrolla el asco. A nivel celular algunas características notables de este grupo son la presencia de una pared celular formada por capas en las que son comunes los mananos, los -1,3- y -1,6glucanos y la quitina. El plasmalema muestra numerosas invaginaciones y el citoplasma presenta mitocondrias de varias formas, ribosomas, vesículas de almacenamiento con lípidos o catalasa y glicógeno. En el núcleo posee un conspicuo nucléolo en forma de copa y también hay nucleoplasma. Poseen una gran vacuola visible incluso con microscopía de luz, que tiene enzimas hidrolíticas como proteasas, ribonucleasa y esterasa, por lo que funciona como un lisosoma, pero también actúa como sitio de almacenamiento de aminoácidos y potasio. En las levaduras la meiosis y la mitosis se dan dentro de la envoltura nuclear. Estos hongos son comunes en el néctar y exudados vegetales, así como en la superficie de los frutos y en general en cualquier sustrato rico en azúcares. Se han aislado también como endófitos de algunas especies de plantas dicotiledóneas como solanáceas del género Brugmansia (Figura 9.22A) y muchas especies son prósperas en ambientes con poca disponibilidad de agua. Su importancia para la humanidad es inmensa, pues se usan en panadería, cervecería, destilación y producción de etanol, también se usan como suplemento alimenticio y en la elaboración de riboflavina y ácido cítrico; son patógenos importantes de humanos y plantas y pueden arruinar varios tipos de alimentos, también han sido uno de los grupos modelos más importantes en investigación científica. Figura 9.22. Levaduras. A) Células de una levadura endófita obtenida de hojas de Brugmansia sp., vistas al microscopio de luz luego de someterlas a tinción Gram. B) Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae: a) cigoto, b) cigoto en yemación, c) colonia diploide que crece por mitosis, d) formación del asco y las ascosporas por meiosis, e) germinación de esporas que son de dos tipos a y , las cuales se fusionan formando el cigoto y reinician el ciclo.§ El ciclo de vida de las levaduras ha sido estudiado en gran medida (Figura 9.22B) y es justamente este modelo el que ha servido para establecer la secuencia de acontecimientos en el típico ciclo vital de una célula eucariota. La replicación del material genético se denomina fase S, de síntesis, y la división del núcleo se llama fase M, de mitosis. Estas dos etapas de alta actividad nuclear están separadas por dos lapsos de menor actividad aparente que son denominados fases G1 y G2, cuyos nombres se basan en la palabra inglesa gap (brecha, intervalo), haciendo referencia a periodos en los que se detiene la actividad mitótica y la célula aprenta estar en reposo. Así las cosas, la secuencia correcta del ciclo celular es: G1 – S – G2 – M. Estas fases conforman el ciclo de vida que involucra la sexualidad, la cual se da por un proceso de plasmogamia seguido de cariogamia que origina un cigoto diploide, el cual es considerado el mismo asco joven. Debe recalcarse que no hay fase dicariótica en las levaduras y lo común es que se produzcan cuatro ascosporas en cada asco, pero hay especies con cientos de ellas. Las ascosporas son generalmente unicelulares, lisas y sin pigmentación oscura, globosas u ovoideas, aunque las hay bicelulares, rugosas, pigmentadas y en forma de sombrero. La reproducción asexual incluye yemación holoblástica, formación de conidias y desarrollo de artrosporas. La yemación está relacionada con la formación del huso e involucra actividad enzimática que adelgaza la pared en un sector en forma de anillo. Por allí empuja el material citoplasmático y tras la mitosis se forma una placa de abscisión quitinosa que separa las dos células. Luego se deposita una capa de pared celular a cada lado de la placa y se concluye la separación de las células, que deja una cicatriz tanto en la célula madre como en la hija. Es posible que se forme una pequeña cadena de yemas en una célula madre, a lo cual se denomina falso micelio (pseudomicelio). El sitio de formación de las yemas ha sido usado con fines taxonómicos. La reproducción asexual ha sido el único medio de reproducción conocido en algunos grupos de levaduras, como por ejemplo en Candida. Ascomicetos III. Subdivisión Taphrinomycotina Aquí se incluye a los ascomicetos anteriormente denominados arquiascomicetos. Es un diverso grupo de especies saprótrofas y parásitas cuyas relaciones de parentesco han sido tradicionalmente confusas, en él se encuentra géneros como Taphrina, Protomyces, Saitoella, Neolecta, Pneumocystis y Schizosaccharomyces, entre otros. Orden Pneumocystidales Neumocistis es un microorganismo comúnmente asociado a neumonías virulentas que afectan al ser humano y a vertebrados como ratas, caballos, cerdos y conejos. Puede ser letal en pacientes con inmunodeficiencias y ha sido particualrmente notable en personas que desarrollan el S.I.D.A. El agente causal fue identificado inicialmente como un protozoo, pero posteriormente se identificó su naturaleza fúngica20 y se le asignó el nombre de Pneumocystis carinii, que resultó ser incorrecto ya que la especie que infecta a los humanos es P. jirovecii (Figura 9.23), nombre dado en honor al parasitólogo checo Otto Jirovec. Su cultivo en el laboratorio es muy difícil, carece de ergosterol y la secuencia 18S del ARNr de P. jirovecii aislado del ser humano difiere en un 5% de P. carinii aislado de las ratas, lo que se considera suficiente como para considerarlas especies diferentes (es similar al nivel de divergencia con otros organismos como Taphrina deformans). El microorganismo se une a las células epiteliales del alvéolo del pulmón y puede diseminarse a otros órganos. Se cree que el medio de diseminación y contagio es por el aire y parece haber especificidad de hospedero. En el humano las células somáticas haploides son uninucleadas y se ubican dentro del alvéolo, donde se dividen por fisión aumentando el número de individuos. Eventualmente se fusionan en pares y la cariogamia se da de forma inmediata. Esta célula diploide posee una pared de dos capas y se convierte en un asco en el que el núcleo experimenta meiosis y luego mitosis para generar 8 núcleos. Éstos maduran en ascosporas que son liberadas cuando la pared del asco se rompe. Figura 9.23. Quistes de Pneumocystis jirovecii obtenidos de un lavado broncoalveolar. Foto de RK Brynes, Public Health Image Library, Department of Health and Human Services, U.S.A.§ Orden Schizosaccharomycetales A este grupo pertenece el género Schizosaccharomyces, cuyas especies son concocidas como las levaduras de fisión, las cuales constituyen un importante grupo modelo de estudios en biología de la célula, genética y ciclo celular21. El potencial biotecnológico de este grupo es bien reconocido, pues especies como S. pombe (Figuras 9.5A y 9.24) y S. octosporus son útiles en la producción de citrulina y proteínas, así como también son degradadoras de residuos de la industria de la cerveza. De hecho, S. pombe fue aislada por primera vez de una cerveza en África. El grupo es además muy útil para la docencia e investigación básica en aspectos como la formación de las ascosporas. Sus células son globosas o cilíndricas en forma de barra, pero también pueden producir hifas septadas y producir artrosporas. Se distinguen bien de los sacaromicetales por su método de división celular y por la composición de su pared celular, pues poseen menos quitina y presentan polisacáridos estructurales únicos. Se les denomina levaduras de fisión porque luego de la mitosis la célula se alarga y se produce una pared entre los núcleos hijos hasta que se separan completamente las dos células resultantes. Las células somáticas son alargadas, uninucleadas y haploides. Se dividen transversalmente y las descendientes repiten el mismo ciclo indefinidamente, con la particularidad que cualquier célula puede funcionar como un gametangio. En S. pombe se han hecho numerosos estudios sobre la biología celular y se sabe que en ella el crecimiento está restringido a los polos, por lo que se trata de células con una fuerte polaridad estrictamente regulada espaciotemporalmente, en la que elementos como el citoesqueleto son esenciales. En la reproducción sexual dos células entran en contacto y sus paredes se disuelven formando un canal al cual migran los núcleos. Ellos se fusionan y el canal se amplia por el flujo del citoplasma, siendo posible que se realice la meiosis rápidamente después de la cariogamia. Se trata de un cigoto que se convierte en un asco tras la sucesión de tres divisiones que arrojan ocho núcleos hijos que se convertirán en ascosporas. Luego ellas son liberadas por la descomposición del asco y se tornan en células somáticas haploides que se dividen transversalmente, como se mencionó. Figura 9.24. Schizosaccharomyces pombe. A) Ciclo celular: M=mitosis, S=síntesis de ADN. La formación del septo se da en G1 y la separación de las células hijas en S. B) El ciclo de vida de S. pombe tiene un componente asexual notable (división mitótica), que puede darse en células haploides (e) o diploides (f). Su fase sexual a menudo es estimulada por deficiencias nutricionales de nitrógeno y se inicia con un cigoto (a), para continuar con un asco en el que se verifica la meiosis que origina las ascosporas (b), que luego son liberadas (c). Éstas germinan y producen células haploides (d). C) Foto de células de S. pombe teñidas con técnica DAPI para mostrar los núcleos (fotografía de SL Forsburg). Con información de http://www1.bio.ku.dk/ english/research/fg/cellecyklus_geno omintegritet/dokument/rewebfig1.jpg/.§ Orden Taphrinales En este orden no hay hifas ascógenas ni ascocarpos y los ascos son homologados con los esporangios. La presencia de quitina no ha sido plenamente confirmada en estos hongos y sus estados de ploidía son variables. Taphrina y sus parientes cercanos tienen estados miceliales que parasitan angiospermas, causando diversas lesiones como engrosamientos y agallas (Figura 9.25). El durazno y la almendra son especies de importancia económica que son afectadas por varias especies de tafrina, en las cuales se produce una deformación notable de las hojas. Otras especies como el roble, la cereza y la ciruela son también afectadas por varias tafrinas. Las especies de este orden son dimórficas, pero el estado micelial no ha podido ser cultivado en el laboratorio. El micelio es la fase infectiva y sus compartimentos poseen septos con poros simples muy parecidos a los ascomicetos filamentosos. Dicho micelio es dicariótico, multinucleado o diploide, crece intercelularmente y puede formar células ascógenas, bien sea intercalares o terminales, en las que se desarrollan ascosporas. Estas esporas pueden experimentar yemación y eventualmente germinan produciendo un micelio dicariótico, en el que se lleva a cabo la cariogamia en una célula ascógena, estableciendo así el estado diploide. Esa célula diploide forma el asco en donde se produce la meiosis que origina cuatro células haploides que derivarán en ascosporas. Al ser liberadas, estas esporas germinan reiniciando el ciclo de vida22. Además de Taphrina, en este orden existen los géneros Burenia, Protomyces, Protomycopsis, Taphridium y Volkartia. Varias de sus especies son parásitas en las familias Apiaceae y Asteraceae pero en plantas de escasa importancia económica, por lo que han sido poco estudiadas. Saitoella es un género con dos especies cuya posición es aún considerada incierta por algunos autores dentro de la subdivisión tafrinomicotina, si bien se considera que es un ascomiceto de temprana divergencia del resto de especies. Figura 9.25. Deformación de los tejidos vegetales (agallas), debido a la infección por Taphrina en el vástago del aliso (Alnus). El tejido deforme es de origen vegetal pero se produce por acción del hongo invasor. Foto cortesía de R Griffith.§ Tabla 9.1. Clasificación de los ascomicetos. Algunos ejemplos de géneros que representan taxones anamorfos van entre paréntesis al lado de su teleomorfo. Reino FUNGI: División Ascomycota Subdivisión Pezizomycotina Clase Arthoniomycetes Orden Arthoniales Géneros: Arthonia Chiodecton Chrysothrix Dirina Lecanactis Opegrapha Roccella Clase Dothideomycetes Orden Botryosphaeriales Géneros: Botryosphaeria Guignardia Orden Capnodiales Géneros: Capnodium Mycosphaerella Scorias Orden Dothideales Géneros: Dothidea Leptosphaerulina (Pithomyces) Mycosphaerella Stylodothis Sydowia Orden Hysteriales Géneros: Hysterium Hysteropatella Orden Jahnulales Géneros: Aliquandostipite Jahnula Patescospora Orden Myriangiales Géneros: Butleria Elsinoë Myriangium Orden Patellariales Géneros: Banhegyia Patellaria Orden Pleosporales Géneros: Cochliobolus (Bipolaris, Curvularia) Lewia (Alternaria) Lophiostoma Montagnula Phaeosphaeria Pleospora (Stemphylium) Pyrenophora (Drechslera) Setosphaera (Exserohilum) Sporormiella Tubeufia Venturia Clase Eurotiomycetes Orden Chaetothyriales Géneros: Capronia Ceramothyrium Chaetothyrium Orden Coryneliales Géneros: Caliciopsis Corynelia Orden Eurotiales Géneros: Byssochlamys Cephalotheca Cryptendoxyla Elaphomyces Emericella Eurotium Hemicarpenteles Monascus Neosartorya Talaromyces Trichocoma Orden Mycocaliciales Géneros: Chaenothecopsis Mycocalicium Sphinctrina Stenocybe Orden Onygenales Géneros: Arthroderma Gymnoascus Onygena Orden Pyrenulales Géneros: Pleurotrema Pyrenula Pyrgillus Orden Verrucariales Géneros: Agonimia Dermatocarpon Polyblastia Verrucaria Clase Laboulbeniomycetes Orden Laboulbeniales Géneros: Ceratomyces Euceratomyces Fanniomyces Herpomyces Laboulbenia Mycorhynchidium Rickia Orden Pyxidiophorales Géneros: Mycorhynchidium Pyxidiophora Clase Lecanoromycetes Orden Acarosporales Géneros: Acarospora Pleopsidium Sarcogyne Orden Agyriales Géneros: Agyrium Placopsis Trapeliopsis Orden Baeomycetales Géneros: Ainoa Baeomyces Phyllobaeis Orden Candelariales Géneros: Candelaria Candelariella Orden Lecanorales Géneros: Cetraria Cladonia Lecanora Lobaria Parmelia Peltigera Physcia Ramalina Sticta Usnea Orden Ostropales Géneros: Bryodiscus Gomphillus Graphis Gyalecta Odontotrema Ostropa Porina Skytta Stictis Thelotrema Orden Peltigerales Géneros: Coccocarpia Collema Nephroma Pannaria Peltigera Orden Pertusariales Géneros: Coccotrema Icmadophila Ochrolechnia Pertusaria Orden Teloschistales Géneros: Caloplaca Teloschistes Xanthoria Orden Umbilicariales Géneros: Lasallia Umbilicaria Clase Leotiomycetes Orden Cyttariales Géneros: Cyttaria Orden Erysiphales Géneros: Blumeria Cystotheca Erysiphe Leveillula Microsphaera, Phyllactinia Pleochaeta Podosphaera Sphaeroteca Uncinuliella (Oidiopsis, Oidium, Ovulariopsis, Streptopodium) Uncinulla Orden Helotiales Géneros: Ascocoryne Hymenoscyphus Mitrula Orden Rhytismatales Géneros: Cudonia Lophodermiun Rhytisma Orden Thelebolales Géneros: Ascozonus Coprotus Thelebolus Clase Lichinomycetes Orden Lichinales Géneros: Edwardiella Heppia Lichina Peltula Thyrea Clase Orbiliomycetes Orden Orbiliales Géneros : Hyalorbilia Orbilia (Arthrobotrys, Helicoon) Clase Pezizomycetes Orden Pezizales Géneros: Anthracobia Ascobolus Ascodesmis Byssonectria Caloscypha (Geniculodendron) Cheilymenia Chorioactis Cookeina Coprotus Elaphomyces Eleutherascus Galiella Genea Glaziella Gyromitra Helvella Lasiobolus Morchella (Constantinella) Peziza (Chromelosporium, Oedocephalum) Phillipsia Pyronema Rhizina Saccobolus Sarcoscypha Sarcosoma Scutellinia Terfezia Thelebolus Tuber Urnula Verpa Wilcoxina Wynnea Wynnella Clase Sordariomycetes Orden Boliniales Géneros: Apiocamarops Camarops Orden Calosphaeriales Géneros: Calosphaeria Pleurostoma Togniniella Orden Chaetosphaeriales Géneros: Chaetosphaeria Melanochaeta Striatosphaeria Zignoëlla Orden Coniochaetales Géneros: Coniochaeta Coniochaetidium Orden Coronophorales Géneros: Bertia Chaetosphaerella Nitschkia Scortechinia Orden Diaporthales Géneros: Diaporthe (Phomopsis) Cryphonectria Gnomia Magnaporthe Valsa Orden Hypocreales Géneros: Balansia Claviceps Cordyceps Epichloë Hypocrea (Trichoderma, Gliocladium) Hypomyces Niesslia Sphaerostilbella Orden Lulworthiales Géneros: Lindra Lulworthia Orden Melanosporales Géneros: Melanospora (Phialophora, Gonatobotrys) Orden Meliolales Géneros: Asteridiella Endomeliola Meliola Orden Microascales Géneros: Halosphaeria Lignicola Nimbospora Microascus Petriella Orden Ophiostomatales Géneros: Ceratocystis (Ambrosiella, Raffaelea) Fragosphaeria Kathistes Ophiostoma (Graphium, Leptographium, Sporothrix) Subbaromyces Orden Phyllachorales Géneros: Phyllachora Polystigma Orden Sordariales Géneros: Chaetomium Lasiosphaeria Neurospora Podospora Sordaria Orden Trichosphaeriales Género: Trichosphaeria Orden Xylariales Géneros: Anthostomella Biscogniauxia Camillea Daldinia Diatrype Graphostroma Hypoxylon Xylaria Pezizomycotina incertae sedis Género: Cenococcum Orden Lahmiales Género: Lahmia Orden Medeolariales Género: Medeolaria Orden Triblidiales Géneros: Huangshania Pseudographis Triblidium Subdivisión Saccharomycotina Clase Saccharomycetes Orden Saccharomycetales Géneros: Ashbya Candida Cephaloascus Debaromyces Dekkera Dipodascopsis Dipodascus Eremothecium Hanseniaspora Holleya Kluyveromyces Lipomyces Metschnikowia Nadsonia Nematospora Pichia Saccharomyces Saccharomycodes Torulaspora Wickerhamia Zygosaccharomyces Subdivisión Taphrinomycotina Clase Neolectomycetes Orden Neolectales Género: Neolecta Clase Pneumocystidomycetes Orden Pneumocystidales Género: Pneumocystis Clase Schizosaccharomycetes Orden Schizosaccharomycetales Géneros: Hasegawaea Schizosaccharomyces Clase Taphrinomycetes Orden Taphrinales Géneros: Burenia Protomyces Protomycopsis Taphridium Taphrina Volkartia Taphrinomycotina incertae sedis Género: Saitoella Bibliografía 1. Deacon JW. 2006. Fungal biology, 4 ed. Blackwell Publishing, Malden, E.U.A. 2. Alexopoulos CJ, Mims CW & Blackwell M. 1996. Introductory mycology (4 ed.). John Wiley & sons, Inc., Nueva York, NY, E.U.A. 3. Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF, Blackwell M, Cannon PF, Eriksson OE, Huhndorf S, James T, Kirk PM, Lücking R, Lumbsch T, Lutzoni F, Matheny PB, Mclaughlin DJ, Powell MJ, Redhead S, Schoch CL, Spatafora JW, Stalpers JA, Vilgalys R, Aime MC, Aptroot A, Bauer R, Begerow D, Benny GL, Castlebury LA, Crous PW, Dai YC, Gams W, Geiser DM, Griffith GW, Gueidan C, Hawksworth DL, Hestmark G, Hosaka K, Humber RA, Hyde K, Ironside JE, Kõljalg U, Kurtzman CP, Larsson KH, Lichtwardt R, Longcore J, Miądlikowska J, Miller A, Moncalvo JM, Mozley-Standridge S, Oberwinkler F, Parmasto E, Reeb V, Rogers JD, Roux C, Ryvarden L, Sampaio JP, Schüßler A, Sugiyama J, Thorn RG, Tibell L, Untereiner WA, Walker C, Wang Z, Weir A, Weiß M, White MM, Winka K, Yao YJ & Zhang N. 2007. A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycological Research 111: 509-547. 4. Schoch CL, Sung G, López-Giráldez F, Townsend JP, Miadlikowska J, Hofstetter V, Robbertse B, Matheny PB, Kauff F, Wang Z, Gueidan C, Andrie RM, Trippe K, Ciufetti LM, Wynns A, Fraker E, Hodkinson BP, Bonito G, Groenewald JZ, Arzanlou M, De Hoog GS, Croups PW, Hewitt D, Pfister DH, Peterson K, Ryzenhout M, Wingfield MJ, Aptroot A, Suh SO, Blackwell M, Hillis DM, Griffith GW, Castlebury LA, Rossman AY, Lumbsch HT, Lücking R, Büdel B, Rauhut A, Diederich P, Ertz D, Geiser DM, Hosaka K, Inderbitzin P, Kohlmeyer J, Volkmann-Kohlmeyer B, Mostert L, O’Donnell K, Sipman H, Rogers JD, Shoemaker RA, Sugiyama J, Summerbell RC, Untereiner W, Johnton PR, Stenroos S, Zuccaro A, Dyer PS, Crittenden PD, Cole MS, Hansen K, Trappe JM, Yahr R, Lutzoni F & Spatafora JW. 2009. The Ascomycota tree of life: A phylum-wide phylogeny clarifies the 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. origin and evolution of fundamental reproductive and ecological traits. Systematic Biology advance access published jun 4, 2009. DOI: 10.1093/sysbio/syp020. Bold HC. 1957. The morphology of plants. Harper Row, Nueva York, E.U.A. Henssen A & Thor G. 1994. Developmental morphology of the Zwischengruppe between Ascohymeniales and Ascoloculariales, pp. 43-56 En: Hawksworth DL (Ed.). Ascomycete systematics. Problems and perspectives in the nineties. Plenum, Nueva York, E.U.A. Agrios GN. 2005. Plant pathology (5 ed.). Elsevier Academic Press, Burlington, MA, E.U.A. Turgeon BG, Christiansen SK & Yoder OC. 1993. Mating type genes in Ascomycete and their imperfect relatives, pp. 199-215 En: Reynolds DR & Taylor JW. The fungal holomorph. Commonwealth Agricultural Bureaux International, Wallingford, Reino Unido. Fleming A. 1929. On the antibacterial action of cultures of a Penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. Br. J. Exp. Path. 10: 226-236. Kwon-Chung KJ & Bennett JE. 1992. Medical mycology. Lea and Febiger, Philadelphia, PA, E.U.A. Eriksson OE & Hawksworth DL. 1992. Notes on Ascomycete systematics-Nos 1294-1417. Sys. Ascomycet. 11: 49-80. De Kesel A. 1995. Population dynamics of Laboulbenia clivinalis Thaxter (Ascomycetes, Laboulbeniales) and sex-related thallus distribution on its host Clivina fossor (Linnaeus, 1758) (Coleoptera, Carabidae). Bull. Ann. Soc. R. Belge Entomol. 131: 335-348. Hirata K. 1986. Host range and geographical distribution of the powdery mildew fungi, 2 ed. Japan Science Society, Tokyo, Japón. Pfister DH. 1994. Orbilia fimicola, a nematophagous discomycete and its Arthrobotrys anamorph. Mycologia 86(3): 451-453. Kimbrough JW. 1994. Septal ultrastructure and Ascomycete systematics, pp. 127-141 En: Hawksworth DL (Ed.). Ascomycete systematics. Problems and perspectives in the nineties. Plenum, Nueva York, E.U.A. Uecker FA. 1988. A world list of Phomopsis names with notes on nomenclature, morphology, and biology. Mycol. Mem. 13: 1-231. Mantle PG. 1994. Secondary metabolites of some non-lichenized Ascomycetes, pp. 145154 En: Hawksworth DL (Ed.). Ascomycete systematics. Problems and perspectives in the nineties. Plenum, Nueva York, E.U.A. Harrington TC. 2005. Ecology and evolution of mycophagous bark beetles and their fungal partners, pp. 257-291 En:, Vega FE & Blackwell M (Eds.). Ecological and Evolutionary Advances in Insect-Fungal Associations. Oxford University Press. Berbee ML & Taylor JW. 1993. Detecting morphological convergence in true fungi, using 18S rRNA gene-sequence data. BioSystems 28: 117-125. Edman JC, Kovacs JA, Mansur H, Santi DV, Elwood HJ & Sogin ML. 1988. Ribosomal RNA sequence shows Pneumocystis carinii to be a member of the fungi. Nature 334: 519-522. Forsburg SL & Nurse P. 1991. Cell cycle regulation in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Ann. Rev. Cell. Biol. 7: 227-256. Kramer CL. 1987. The Taphrinales, pp. 151-166 En: De Hoog GS, Smith MT & Weijman ACM (Eds.). The expanding realm of yeast-like fungi. Elsevier, Amsterdam, Holanda.