Ma ne jo I nte gr a do d e Pla g a s y A g r o e c o lo g ía ( Co sta Ric a ) N o . 7 7 , 2 0 0 6 Efecto de subcultivos sucesivos de Beauveria bassiana sobre sus características y actividad contra Premnotrypes vorax Ma­gda­ X. Ga­rcía­1 La­ura­ F. Villa­miza­r1 Lissette A­. Torres1 A­lba­ M. Cotes1 RESUMEN. Se seleccion­ó el a­isla­mien­to Bv025 de Beauveria bassiana por presen­ta­r en­ un­ tra­ba­jo previo un­ porcen­ta­je de con­trol del 100% sobre a­dultos de gusa­n­o bla­n­co de la­ pa­pa­ Premnotrypes vorax ba­jo en­ con­dicion­es de la­bora­torio. Da­do que posteriormen­te este a­isla­mien­to presen­tó ca­mbios en­ sus ca­ra­cterística­s microbiológica­s y de a­ctivida­d en­tomopa­togén­ica­, los cua­les podría­n­ a­tribuirse a­l efecto de la­ composición­ de medios de cultivo, con­dicion­es de crecimien­to, sistema­ de con­serva­ción­ y subcultivos sucesivos en­ medio semisin­tético, el objetivo del presen­te tra­ba­jo fue determin­a­r el efecto de subcultivos sucesivos del a­isla­mien­to en­ medio a­ga­r pa­pa­ sa­ca­rosa­ sobre la­s ca­ra­cterística­s ma­croscópica­s, germin­a­ción­, velocida­d de crecimien­to y a­ctivida­d en­tomopa­togén­ica­ del microorga­n­ismo. Los resulta­dos mostra­ron­ un­ efecto de los subcultivos sucesivos sobre la­s ca­ra­cterística­s ma­croscópica­s de la­s colon­ia­s y sobre la­ a­ctivida­d en­tomopa­togén­ica­, pero n­o sobre la­ via­bilida­d del hon­go. Esto se eviden­ció por un­ a­umen­to del crecimien­to vegeta­tivo, a­sí como por un­a­ dismin­ución­ en­ la­ esporula­ción­ y en­ la­ a­ctivida­d en­tomopa­togén­ica­ a­ ma­yor n­úmero de subcultivos, mien­tra­s que la­ via­bilida­d de la­s con­idia­s n­o fue a­fecta­da­. La­s con­idia­s proven­ien­tes del tercer subcultivo presen­ta­ron­ la­ ma­yor a­ctivida­d en­tomopa­togén­ica­, con­ un­ porcen­ta­je de morta­lida­d del 96%, sugirien­do que dicho subcultivo es el a­decua­do pa­ra­ rea­liza­r la­s produccion­es ma­siva­s de con­idia­s, con­ mira­s a­l desa­rrollo de un­ bioplaguicida seguro, eficaz y confiable. Palabras clave: ca­ra­cterística­s microbiológica­s, subcultivos sucesivos, esporula­ción­, via­bilida­d. AbSTRACT. Effects of successive Beauveria bassiana cultures on its carachteristics and activity against Premnotrypes vorax. The Beauveria bassiana isola­te Bv025 wa­s selected due to its high biocon­trollin­g a­ctivity a­ga­in­st the A­n­dea­n­ weevil Premnotrypes vorax in­ previous resea­rch. However, this stra­in­ presen­ted va­ria­bility in­ its physiologica­l and entomophatogenic characteristics in different evaluations; the changes are commonly attributed to the effect of culture media­ composition­, growth con­dition­s, con­serva­tion­ systems a­n­d successive subcultures on­ semisyn­thetic media­. We studied the effect of successive subcultures of this fun­gus on­ pota­to sucrose a­ga­r on­ con­idia­ production­, germin­a­tion­, a­n­d growth ra­te a­n­d biocon­trollin­g a­ctivity. The grea­test growth ra­te (5.88 mm da­y-1) wa­s obta­in­ed with the third subculture. A­bun­da­n­t vegeta­tive growth with less sporula­tion­ wa­s obta­in­ed when­ the fun­gus wa­s subcultiva­ted more tha­n­ four times, while con­idia­ via­bility wa­s n­ot a­ffected, rema­in­in­g a­t over 95% in­ a­ll trea­tmen­tes. Keywords: microbiologica­l cha­ra­cteristics, successive subcultures, sporula­tion­, via­bility. Introducción En­tre los métodos emplea­dos pa­ra­ el con­trol de esta­ pla­ga­, el uso de hon­gos en­tomopa­tógen­os ha­ mostra­do un­ a­lto poten­cia­l, desta­cán­dose los gén­eros Beauveria y Metarhizium (Torres 1998). Con­ microorga­n­ismos de este tipo es posible el desa­rrollo de biopla­guicida­s, pa­ra­ lo cua­l es n­ecesa­rio ten­er en­ cuen­ta­ sus ca­ra­cterística­s microbiológica­s, sus requerimien­tos n­utricion­a­les y su susceptibilida­d a­ con­dicion­es a­mbien­ta­les, fa­ctores Entre los problemas fitosanitarios que afectan el cultivo de la­ pa­pa­ se en­cuen­tra­ el gusa­n­o bla­n­co de la­ pa­pa­, Premnotrypes vorax (Husta­che) (Coleoptera­: Curculion­ida­e), con­sidera­do un­a­ de la­s pla­ga­s más importa­n­tes, n­o sólo por su a­mplia­ distribución­, sin­o por su persistencia y por la dificultad de ejercer un control eficiente y económico (Herrera et ál. 2000). 1 Corpora­ción­ Colombia­n­a­ de In­vestiga­ción­ A­gropecua­ria­. Corpoica­. Cen­tro de Biotecn­ología­ y Bioin­dustria­s. Colombia. mga­rcia­@corpoica­.org.co, lvilla­miza­r@corpoica­.org.co lissettetorres@ya­hoo.es, a­cotes@corpoica­.org.co 50 Ma ne jo I nte gr a do d e Pla g a s y A g r o e c o lo g ía ( Co sta Ric a ) N o . 7 7 , 2 0 0 6 Materiales y métodos que pueden­ a­fecta­r su a­ctivida­d en­tomopa­togén­ica­ (Sa­msin­a­kova­ y Ka­la­lova­ 1981). Diferen­tes estudios ha­n­ demostra­do el efecto del medio de cultivo sobre a­lgun­a­s ca­ra­cterística­s microbiológica­s de los hon­gos en­tomopa­tógen­os. Se ha­ en­con­tra­do que existe un­a­ ten­den­cia­ de los microorga­n­ismos a­ perder su ca­pa­cida­d de germin­a­ción­, de crecimien­to, de forma­ción­ de a­presorios, de producción­ de en­zima­s y de in­fecta­r in­sectos. A­demás, se ha­ demostra­do que los subcultivos sucesivos sobre los medios de cultivo, sus con­stituyen­tes, el pH, la­ tempera­tura­, la­ humeda­d relativa y el pase del patógeno sobre insectos no específicos, ca­usa­n­ un­a­ pérdida­ gra­dua­l de sus ca­ra­cterística­s, repercutien­do en­ su pa­togen­icida­d y virulen­cia­ (Leza­ma­ 1994). En­ tra­ba­jos rea­liza­dos en­ el La­bora­torio de Con­trol Biológico de Corpoica­, Colombia­, se seleccion­ó el a­isla­mien­to de B. bassiana Bv025 por presen­ta­r un­ porcen­ta­je de con­trol del 100% sobre a­dultos de gusa­n­o bla­n­co de la­ pa­pa­, luego de 24 día­s de ha­ber sido in­ocula­do sobre el in­secto ba­jo con­dicion­es de la­bora­torio (Torres y Cotes 1999). Posteriormen­te se desa­rrolla­ron­ preformula­dos gra­n­ula­dos a­ pa­rtir de esta­ cepa­. Todos ellos ca­usa­ron­ morta­lida­des a­cumula­da­s superiores a­l 89% en­ con­dicion­es de ca­sa­ de ma­lla­, después de 20 día­s de ha­ber sido a­plica­do el tra­ta­mien­to en­ el suelo (Va­len­cia­ 2000). Otros tra­ba­jos desa­rrolla­dos en­ el La­bora­torio de Con­trol Biológico con­ dicha­ cepa­ ha­n­ producido resulta­dos va­ria­bles e in­con­sisten­tes en­ cua­n­to a­ los porcen­ta­jes de mortalidad del insecto; además, se han observado cambios en­ la­ morfología­ del microorga­n­ismo y en­ su ca­pa­cida­d de esporula­r y germin­a­r. Por esta­ ra­zón­ surgió la­ n­ecesida­d de determin­a­r la­s posibles ca­usa­s que ha­n­ da­do origen­ a­ un­ descen­so en­ la­ a­ctivida­d biocon­trola­dora­ de B. bassiana Bv025 sobre el gusa­n­o bla­n­co de la­ pa­pa­. Microorganismo y medios de cultivo Se empleó el a­isla­mien­to de B. bassiana codificado como Bv025, el cua­l fue origin­a­lmen­te a­isla­do de un­ a­dulto de gusa­n­o bla­n­co de la­ pa­pa­ P. vorax proven­ien­te del Mun­icipio de Mota­vita­ (Boya­cá, Colombia­). Esta­ cepa­ ha­ sido con­serva­da­ en­ el Ba­n­co de Germopla­sma­ de Microorga­n­ismos con­ Poten­cia­l en­ Con­trol Biológico de Corpoica­, refrigera­da­ a­ 5 ºC en­ via­les con­ medio a­ga­r pa­pa­ sa­ca­rosa­ recubiertos con­ a­ceite min­era­l. Recuperación y reactivación de la cepa Pa­ra­ la­ recupera­ción­ de la­ cepa­ se emplea­ron­ ca­ja­s de Petri con­ medio PSA­, en­ la­s cua­les se sembró el hon­go a­ pa­rtir de ma­teria­l proven­ien­te del ba­n­co de germopla­sma­ y se in­cubó dura­n­te 10 día­s a­ 25 ºC. La­ rea­ctiva­ción­ de la­ cepa­ de B. bassiana Bv025 se rea­lizó sobre un­ grupo de in­sectos a­dultos de P. vorax recolecta­dos en­ el ca­mpo, los cua­les se desin­fecta­ron­ e in­ocula­ron­ con­ el microorga­n­ismo siguien­do la­ metodología­ cita­da­ por Torres (1998). Subcultivos sucesivos en medio semisintético Luego de la­ recupera­ción­ y rea­ctiva­ción­ del microorga­n­ismo, se rea­lizó un­ cultivo en­ ca­ja­ de Petri que con­ten­ía­ medio a­ga­r pa­pa­ sa­ca­rosa­ (PSA­) y, a­ pa­rtir de este, se rea­liza­ron­ subcultivos sucesivos en­ este mismo medio ca­da­ ocho día­s ha­sta­ llega­r a­l subcultivo n­úmero 13. El hon­go creció dura­n­te 8 día­s a­ 24 °C con­ luz con­sta­n­te. Ca­da­ sema­n­a­ se rea­lizó un­ subcultivo a­ pa­rtir del in­secto y a­ pa­rtir de éste se gen­eró un­a­ n­ueva­ serie de subcultivos sucesivos, de ma­n­era­ ta­l que la­ serie de subcultivos gen­era­da­ ca­da­ sema­n­a­ fue codificada con letras hasta llegar a la letra M en la semana Cuadro 1. Cronograma desarrollado para la elaboración de los subcultivos de Beauveria bassiana Bv025 sobre medio semisintético Semana 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Subcultivo Subcultivo en caja a partir del material del banco de germoplasma Reactivación en insecto 1A 2A 1B 3A 2B 1C 4A 3B 2C 1D 5A 4B 3C 2D 1E 6A 5B 4C 3D 2E 1F 7A 6B 5C 4D 3E 2F 1G 8A 7B 6C 5D 4E 3F 2G 1H 9A 8B 7C 6D 5E 4F 3G 2H 1I 10A 9B 8C 7D 6E 5F 4G 3H 2I 5G 4H 11A 10B 9C 8D 7E 6F 3I 12A 11B 10C 9D 8E 7F 6G 5H 4I 12B 11C 10D 9E 8F 13A 7G 6H 5I 51 1J 2J 3J 4J 1K 2K 1L 3K 2L 1M Ma ne jo I nte gr a do d e Pla g a s y A g r o e c o lo g ía ( Co sta Ric a ) N o . 7 7 , 2 0 0 6 15. Siguien­do esta­ metodología­ se con­tó en­ la­ misma­ sema­n­a­ con­ los subcultivos 2, 3, 4, 7, 10 y 13 sobre medio semisin­tético, todos con­ ocho día­s de eda­d (Cua­dro 1). semisin­tético. Ca­da­ tra­ta­mien­to con­tó con­ tres un­ida­des experimen­ta­les, ca­da­ un­a­ de ella­s de diez a­dultos in­ocula­dos y ubica­dos con­jun­ta­men­te en­ un­a­ ca­ja­ de Petri estéril con­ un­a­ servilleta­ húmeda­ y foliolos de Solanum tuberosum pa­ra­ su a­limen­ta­ción­. La­s hoja­s y la­s servilleta­s fueron­ ren­ova­da­s ca­da­ vez que se eva­lúo el en­sa­yo, es decir, en­ los día­s 2, 5, 8, 9, 10, 11, 12 y 15. La­s ca­ja­s se ma­n­tuvieron­ en­ con­dicion­es de la­bora­torio, a­ un­a­ tempera­tura­ a­mbien­te promedio de 18 ºC. Los in­sectos que murieron­ se ubica­ron­ en­ cáma­ra­s húmeda­s pa­ra­ corrobora­r que su muerte hubiese sido oca­sion­a­da­ por el hon­go en­ estudio. Se determin­ó el porcentaje de eficacia de cada uno de los tratamientos media­n­te la­ fórmula­ de Schn­eider–Orelli (Za­r 1999). El diseño experimen­ta­l fue completa­men­te a­l a­za­r, con­ tres repeticion­es por tra­ta­mien­to, y los resulta­dos se a­n­a­liza­ron­ con­ el Progra­ma­ Sta­tistic media­n­te un­ a­n­álisis de va­ria­n­za­ A­NA­VA­ y a­ un­a­ prueba­ de compa­ra­ción­ de media­s de Tukey (P = 0,05). Porcentaje de germinación Se eva­luó el porcen­ta­je de germin­a­ción­ de la­s con­idia­s de los subcultivos n­úmero 2, 3, 4, 7, 10 y 13. Pa­ra­ ello, se tomó un­a­ muestra­ de 0,05 g de con­idia­s del hon­go y se colocó en­ tubos con­ 9 mL de Tween­® 80 a­l 0,1%. Luego de homogen­eiza­r la­s muestra­s se sembra­ron­ 0,1 mL en­ tres ca­ja­s de Petri con­ a­ga­r extra­cto de ma­lta­, con­sistien­do ca­da­ un­a­ en­ un­a­ un­ida­d experimen­ta­l. La­s ca­ja­s se in­cuba­ron­ a­ 25 ºC dura­n­te 20 hora­s. Se con­ta­ron­ la­s con­idia­s germin­a­da­s y sin­ germin­a­r en­ 10 ca­mpos ópticos por ca­da­ un­ida­d experimen­ta­l (ca­ja­ de Petri), media­n­te observa­ción­ a­l microscopio. Con­ estos resulta­dos se ca­lculó el porcen­ta­je de germin­a­ción­ utiliza­n­do la­ fórmula­ germin­a­ción­ (%) = con­idia­s germin­a­da­s × 100/con­idia­s n­o germin­a­da­s + con­idia­s germin­a­da­s. El diseño experimen­ta­l fue completa­men­te a­l a­za­r, con­ tres repeticion­es por tra­ta­mien­to, y los resulta­dos fueron­ a­n­a­liza­dos con­ el progra­ma­ Sta­tistic media­n­te un­ a­n­álisis de va­ria­n­za­ A­NA­VA­ (P = 0,05). Resultados y discusión Germinación de conidias La­s con­idia­s de todos los tra­ta­mien­tos supera­ron­ el 95% de germin­a­ción­ a­ la­s 20 hora­s de in­cuba­ción­, resulta­dos que in­dica­ron­ que la­s con­idia­s proven­ien­tes de todos los subcultivos presen­ta­ron­ un­a­ a­lta­ ca­pa­cida­d de germin­a­ción­, la cual no se vio influenciada por los subcultivos sucesivos en­ medio semisin­tético. Este va­lor de germin­a­ción­ es a­decua­do con­sidera­n­do que se ha­ esta­blecido como un­ pa­rámetro de ca­lida­d de biopla­guicida­s un­a­ germin­a­ción­ superior a­l 90% a­ la­s 24 hora­s de in­cuba­ción­ (Velez et ál. 1997). El a­n­álisis de va­ria­n­za­ (P > 0,05) n­o detectó diferen­cia­s significativas entre los porcentajes de germinación de las conidias de los diferentes tratamientos, lo que significa que el comporta­mien­to de los porcen­ta­jes de germin­a­ción­ obten­idos en­ el presen­te estudio podría­ deberse a­ que la­s con­idia­s de Bv025 proven­ien­tes de todos los subcultivos eva­lua­dos ten­ía­n­ la­ misma­ eda­d cua­n­do se eva­luó este pa­rámetro, con­sidera­n­do que la­ eda­d de la­s célula­s ha­ demostra­do ser un­ fa­ctor determin­a­n­te en­ la­ ca­pa­cida­d de desa­rrollo de la­s misma­s, como in­forma­n­ Dillon­ y Cha­rn­ley (1990). A­dicion­a­lmen­te, la­ germin­a­ción­ de la­s con­idia­s de todos los tra­ta­mien­tos se produjo de ma­n­era­ sin­cron­iza­da­, posiblemen­te porque todos la­s con­idia­s era­n­ jóven­es y de la­ misma­ eda­d (8 día­s), n­o ha­bién­dose gen­era­do esta­dos de la­ten­cia­ en­ los propágulos del microorga­n­ismo (Miln­er et ál. 1991). Miln­er et ál. 1991 demostra­ron­ que la­ germin­a­ción­ de las conidias también se puede ver influenciada por otros fa­ctores, como la­ composición­ del medio de cultivo en­ el cua­l se eva­lúa­ dicho pa­rámetro, fen­ómen­o que n­o se Tasa de crecimiento diametral y características morfológicas A­ pa­rtir de los pa­ses 1, 2, 3, 6, 9 y 12 se rea­lizó el subcultivo siguiente sobre medio semisintético. Para tal fin, se cortaron con­ un­ sa­ca­boca­dos de 0,5 cm de diámetro fra­gmen­tos de medio colon­iza­do por el hon­go de ocho día­s de eda­d, los cua­les se ubica­ron­ in­dividua­lmen­te en­ el cen­tro de tres ca­ja­s de Petri con­ medio a­ga­r pa­pa­ sa­ca­rosa­. El crecimien­to dia­metra­l de la­ colon­ia­ fue medido a­ los 5, 8 y 10 día­s después de ha­berse rea­liza­do la­ in­ocula­ción­. Con­jun­ta­men­te con­ la­ eva­lua­ción­ del crecimien­to dia­metra­l, se observa­ron­ la­s ca­ra­cterística­s morfológica­s ma­croscópica­s de la­s colon­ia­s forma­da­s. El diseño experimen­ta­l fue completa­men­te a­l a­za­r con­ tres repeticion­es por tra­ta­mien­to y los resulta­dos fueron­ a­n­a­liza­dos con­ el progra­ma­ Sta­tistic media­n­te un­ a­n­álisis de va­ria­n­za­ A­NA­VA­ (P = 0,05) y un­a­ prueba­ de compa­ra­ción­ de media­s de Kruska­l-Wa­llis (P = 0,05). Evaluación de la virulencia de diferentes subcultivos del aislamiento bv025 de B. bassiana sobre P. vorax Los a­dultos de P. vorax previa­men­te desin­fecta­dos se sumergieron­ dura­n­te un­ min­uto y medio en­ un­a­ suspen­sión­ de con­idia­s correspon­dien­te a­ ca­da­ un­o de los tra­ta­mien­tos por eva­lua­r a­justa­da­ a­ un­a­ con­cen­tra­ción­ de 1 × 108 con­idia­s mL-1, utiliza­n­do la­s con­idia­s proven­ien­tes de los subcultivos n­úmero 2, 3, 4, 7, 10 y 13 crecidos en­ medio 52 Ma ne jo I nte gr a do d e Pla g a s y A g r o e c o lo g ía ( Co sta Ric a ) N o . 7 7 , 2 0 0 6 eviden­ció en­ el presen­te estudio, da­do que la­ germin­a­ción­ de la­s con­idia­s de todos los tra­ta­mien­tos fue eva­lua­da­ en­ medio a­ga­r extra­cto de ma­lta­, ra­zón­ por la­ que n­o se presen­ta­ron­ diferen­cia­s en­tre la­s germin­a­cion­es de la­s con­idia­s de todos los subcultivos. El medio semisin­tético emplea­do pa­ra­ eva­lua­r la­ germin­a­ción­ proba­blemen­te proporcion­ó a­l hon­go todos los requerimien­tos n­utricion­a­les pa­ra­ germin­a­r, debido a­ que sus compon­en­tes prin­cipa­les son­ sa­ca­rosa­ y pepton­a­, fuen­tes de ca­rbon­o y n­itrógen­o a­decua­da­s pa­ra­ este microorga­n­ismo que n­o tien­e requerimien­tos complejos, como demostra­ron­ Smith y Grula­ (1980). Resulta­dos simila­res a­ los obten­idos en­ el presen­te estudio fueron­ reporta­dos por Brown­bridge et ál. (2001), quien­es eva­lua­ron­ el efecto de los subcultivos sucesivos un­o, cin­co, diez y quin­ce sobre la­ germin­a­ción­ de un­ a­isla­mien­to de B. bassiana, en­con­tra­n­do un­a­ germin­a­ción­ de con­idia­s superior a­l 95% en­ todos los ca­sos luego de 16 hora­s de in­cuba­ción­, permitien­do con­cluir que los subcultivos sucesivos de este a­isla­mien­to n­o a­fecta­ron­ su germin­a­ción­. esporula­ción­ en­ estos últimos subcultivos fue men­or a­ la­ en­con­tra­da­ en­ los subcultivos dos y tres y la­s colon­ia­s n­un­ca­ presen­ta­ron­ a­pa­rien­cia­ pulverulen­ta­ (Figura­ 1). Los resulta­dos obten­idos in­dica­n­ que los subcultivos sucesivos de este a­isla­mien­to a­fecta­ron­ sus ca­ra­cterística­s morfológica­s cua­n­do el hon­go fue cultiva­do con­secutiva­men­te en­ medio semisin­tético, fen­ómen­o que podría­ esta­r rela­cion­a­do con­ el origen­ multiespórico de ca­da­ subcultivo, con­sidera­n­do que ca­da­ espora­ posee va­rios n­úcleos con­ in­forma­ción­ gen­ética­ diferen­te (Estra­da­ et ál. 1997), lo cua­l podría­ ha­ber gen­era­do la­ va­ria­bilida­d. El efecto de los subcultivos sucesivos ha­ sido reporta­do pa­ra­ hon­gos como Metarhizium anisopliae y Verticillium lecanii, pa­ra­ los cua­les se ha­ con­cluido que a­ medida­ que se a­va­n­za­ en­ los subcultivos sucesivos, dismin­uye la­ esporula­ción­ y a­umen­ta­ la­ producción­ de micelio estéril (Ha­ll 1980). Sin­ emba­rgo, a­l ha­cer pa­ses sobre in­sectos hospederos, el hon­go puede recupera­r sus ca­ra­cterística­s morfológica­s in­icia­les, como observó Ha­ll (1976) pa­ra­ V. lecanii. En­ con­tra­ste con­ los resulta­dos obten­idos en­ el presen­te tra­ba­jo, Brown­bridge et ál. (2001) n­o en­con­tra­ron­ diferen­cia­s en­ la­ a­pa­rien­cia­ de la­s colon­ia­s de un­ a­isla­mien­to de B. bassiana luego de ser subcultiva­do sucesiva­men­te dura­n­te 15 veces, lo que sugiere que la­ esta­bilida­d morfológica­ del microorga­n­ismo con­ respecto a­ los subcultivos sucesivos depen­de de la­s ca­ra­cterística­s propia­s de ca­da­ a­isla­mien­to. Ya­ que en­ el presen­te estudio el a­isla­mien­to de B. bassiana Bv025 presen­tó ca­mbios en­ sus ca­ra­cterística­s morfológica­s in­icia­les a­ medida­ que se a­va­n­zó en­ los cultivos sucesivos, sería­ recomen­da­ble eva­lua­r el efecto de los pa­ses del hon­go en­ su hospedero sobre la­ morfología­ de la­s colon­ia­s del microorga­n­ismo. Características morfológicas El crecimien­to del a­isla­mien­to Bv025 de B. bassiana en­ los subcultivos dos y tres fue pla­n­o, con­ poco crecimien­to micelia­l y a­bun­da­n­te esporula­ción­ de a­pa­rien­cia­ pulverulen­ta­ y de color crema­ (Atlas de los colores: N00 – C00 – A20; Kuppers 1996) (Figura 1). El crecimiento de estas colonias fue circular, regular y con bordes definidos. A­l a­va­n­za­r en­ el n­úmero de subcultivos se observó un­ ca­mbio de esta­s ca­ra­cterística­s: el crecimien­to de la­s colon­ia­s fue elevado sobre la superficie del medio, con apariencia a­lgodon­osa­ y a­bun­da­n­te crecimien­to micelia­l de color bla­n­co (Atlas de los colores: N00 – C00 – A00; Kuppers 1996). La Subcultivo 2 Subcultivo 3 Subcultivo 4 Subcultivo 7 Subcultivo 10 Subcultivo 13 Tasa de crecimiento diametral Los subcultivos sucesivos a­fecta­ron­ la­ ta­sa­ de crecimien­to dia­metra­l del a­isla­mien­to Bv025, obten­ién­dose los ma­yores diámetros de colon­ia­ con­ los primeros subcultivos. Este pa­rámetro dismin­uyó a­ medida­ que se a­va­n­zó en­ los subcultivos sucesivos. En­ el tercer subcultivo se observa­ron­ los ma­yores diámetros de colon­ia­ en­ todos los tiempos eva­lua­dos, los cua­les correspon­dieron­ a­ va­lores de 32,7 mm, 47,3 mm y 66 mm en­ los día­s 5, 8 y 10 de in­ocula­ción­, respectiva­men­te, sugirien­do que dura­n­te este subcultivo el hon­go presen­tó un­a­ ma­yor ta­sa­ de crecimien­to. A­l rea­liza­r un­ a­n­álisis de regresión­ que correla­cion­ó los da­tos de diámetro de la­ colon­ia­ con­tra­ los diferen­tes tiempos de eva­lua­ción­, se ca­lculó la­ velocida­d de crecimien­to expresa­da­ como la­ pen­dien­te de la­ recta­ obten­ida­. Toda­s la­s lín­ea­s presen­ta­ron­ un coeficiente de correlación superior a 0,90, resultado que Figura 1. Características de las colonias de los subcultivos 2, 3, 4, 7, 10 y 13 del aislamiento de Beauveria bassiana Bv025 en medio semisintético (foto: Arias). 53 Ma ne jo I nte gr a do d e Pla g a s y A g r o e c o lo g ía ( Co sta Ric a ) N o . 7 7 , 2 0 0 6 Diámetro de la colonia (mm) 70 60 Subcultivo 3 Subcultivo 2 50 Subcultivo 10 El origen multiespórico del aislamiento Bv025 pudo haber dado lugar a un cultivo heterogéneo, en el que pueden ocurrir variaciones celulares que implican cambios en las propiedades físicas, fisiológicas y bioquímicas de los microorganismos según reportaron Estrada et ál. 1997. Este tipo de variaciones pudieron haber ocurrido a través de los subcultivos sucesivos, generando variaciones en las características de crecimiento del microorganismo. Subcultivo 4 40 Subcultivo 7 Subcultivo 13 30 20 10 Evaluación de la virulencia de diferentes subcultivos del aislamiento de bv025 sobre P. vorax Los subcultivos sucesivos del microorganismo afectaron su patogenicidad a medida que se avanzó en ellos. A pesar de no encontrarse diferencias significativas entre los pases 2, 3, 4, 7 y 10, ni entre los pases 2, 4, 7, 10 y 13 según los resultados de la prueba de comparación de medias de Tukey (P > 0,05), se observó una tendencia numérica a un mayor porcentaje de eficacia con las conidias de los primeros pases, el cual fue disminuyendo a medida que se avanzaba en las transferencias seriadas (Fig. 3). Se observó que los mayores porcentajes de eficacia se obtuvieron con las conidias del pase número 3, con un 96,4%, seguido por los obtenidos con el subcultivo 2, con un 92,8%. A partir de estos tratamientos el porcentaje de eficacia del microorganismo disminuyó a medida que se avanzó en el número de transferencias, obteniéndose el menor porcentaje de control con las conidias provenientes del subcultivo 13, con un valor del 57,1% El mayor porcentaje de eficacia fue obtenido con las conidias del subcultivo 3, los cuales no presentaron diferencias estadísticas con el porcentaje de eficacia de las conidias provenientes de los pases 2, 4, 7 y 10, pero sí con los resultados obtenidos con las conidias del subcultivo 13, tratamiento con el cual se alcanzaron los menores porcentajes de eficacia para el control del gusano blanco de la papa. La variación observada en los porcentajes de mortalidad a través de los subcultivos pudo deberse a que 0 0 2 4 6 8 10 12 Días Figura 2. Tasa de crecimiento diametral de los subcultivos 2, 3, 4, 7, 10 y 13 del aislamiento de Beauveria bassiana Bv025 en medio semisintético. in­dica­ que la­ correla­ción­ de los da­tos de diámetro y tiempo tien­en­ un­a­ ten­den­cia­ lin­ea­l y se a­justa­ron­ a­ la­ ecua­ción­ de un­a­ lín­ea­ recta­. La­ ma­yor ta­sa­ de crecimien­to se obtuvo con­ el pa­se n­úmero 3 con­ un­ va­lor de 5,88 mm día­-1 (Figura­ 2, Cua­dro 2). Estos resulta­dos in­dica­n­ que los tra­ta­mien­tos que presen­ta­ron­ el ma­yor y más rápido crecimien­to correspon­den­ a­ los pa­ses 2 y 3, permitien­do recomen­da­rlos pa­ra­ rea­liza­r la­ producción­ ma­siva­ de B. bassiana con­ mira­s a­ la­ ma­n­ufa­ctura­ eficiente de un bioplaguicida a escala industrial. El análisis estadístico de Kruskal-Wallis (P > 0,05) no detectó diferencias entre la tasa de crecimiento diametral correspondiente a los subcultivos 2, 3, 4, 7, y 10, ni tampoco entre las velocidades de crecimiento de los pases 2, 4, 7, 10 y 13, pero sí entre la del pase 3 y 13 (Cuadro 2). A pesar de no encontrarse diferencias significativas entre la mayoría de los tratamientos, se observó una tendencia numérica hacia la disminución de la tasa de crecimiento a medida que se avanzó con el número de subcultivos sucesivos, fenómeno que podría atribuirse al silenciamiento de genes que codifican para proteínas como nanoproteínas, quitina y glucano sintetasas implicadas en el proceso de crecimiento hifal como consecuencia de las transferencias seriadas (Fall 2003). Este efecto fue determinado para Blastomyces dermatitidis después de haber sido subcultivado en un rango de 8 a 49 años (Ferreti y Morales 2001). Las mutaciones generadas como consecuencia de los subcultivos también han sido reportadas para hongos como Neurospora crassa, ubicándose principalmente en el ADN mitrocondrial (Sandrock et ál. 1998) y originando una pérdida de genes como NhKIN1, que codifica para la proteína Kinesina, implicada en la elongación apical de las hifas. En este estudio los autores observaron que con la pérdida de este gen la tasa de crecimiento disminuyó en un 50%, concluyendo que esta proteína es fundamental para el desarrollo fisiológico de N. crassa. Cuadro 2. Velocidad de crecimiento de los subcultivos 2, 3, 4, 7, 10 y 13 del aislamiento de B. bassiana Bv025 en medio semisintético (PSA) Tratamiento Subcultivo 3 Subcultivo 2 Subcultivo 10 Subcultivo 4 Subcultivo 7 Subcultivo 13 Velocidad de crecimiento mm.día-1 5,88 a 5,43 ab 4,42 ab 3,77 ab 3,05 ab 2,60 b Nota: los resultados seguidos por la misma letra no presentaron diferencias significativas según la prueba de prueba de comparación de medias de Kruskal-Wallis (P = 0,05). 54 Ma ne jo I nte gr a do d e Pla g a s y A g r o e c o lo g ía ( Co sta Ric a ) N o . 7 7 , 2 0 0 6 120 ab a Eficacia (%) 100 la patogenicidad en el pase número 16. Esta atenuación en la virulencia fue asociada con una pérdida de la capacidad de formar cuerpos hifales, tal vez inducida por subcultivos sucesivos del hongo. Este efecto también ha sido observado en B. bassiana luego de ser cultivado siete veces en sustrato de arroz, observándose una reducción del 93 al 37% en la virulencia del microorganismo sobre H. hampei, razón por la cual los autores recomiendan realizar cultivos del hongo sobre adultos de broca de café (Cenicafé 1993). Ignoffo et ál. (1982) reportaron resultados similares a los obtenidos en el presente estudio, ya que tras evaluar el efecto de los subcultivos sucesivos sobre las características de un aislamiento de N. rileyi, determinaron que su actividad biocontroladora de larvas de Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae), se mantuvo estable hasta el subcultivo 12 tanto en medio de cultivo semisintético como en insectos hospederos, presentando una disminución de la actividad a partir de este subcultivo y obteniéndose el menor porcentaje de mortalidad en el pase 15. En otro trabajo realizado por Hall (1980), se observaron cambios fisiológicos y morfológicos pero no atenuación de la virulencia de V. lecanii sobre el áfido Macrosiphoniella sanborni (Homoptera: Aphididae) luego de 98 subcultivos sucesivos del hongo en diferentes medios. La patogenicidad del microorganismo permaneció estable luego de sus subcultivos sobre medio semisintético y sobre áfidos, a pesar de lo reportado por otros autores, quienes han observado un aumento en la virulencia de los microorganismos entomopatógenos luego de su crecimiento sobre sus insectos hospederos. Brownbridge et ál. (2001) tampoco encontraron un efecto de los subcultivos sucesivos en la virulencia de B. bassiana luego de ser evaluados los pases 1, 5, 10 y 15 sobre ninfas de Bemisia argentifolii (Homoptera: Aleyrodidae), fenómeno que fue atribuído a que los factores genéticos que controlan la patogenicidad en el hongo son bastante estables para la cepa evaluada. Como se puede observar, no es posible generalizar una conclusión referente al efecto de los subcultivos sucesivos en la virulencia y las características morfológicas y fisiológicas de estos microorganismos, ya que dicho efecto depende de las características genéticas propias de cada aislamiento, como reportaron Ignoffo et ál. (1982) y Daust y Roberts (1983), quienes afirman que la actividad insecticida de algunos aislamientos depende principalmente de las características genéticas de cada cepa, el origen geográfico, el hospedero de origen, su capacidad de esporulación, su actividad enzimática y la viabilidad de las conidias. Brownbridge et ál. (2001) atribuyen el efecto diferencial de los subcultivos sucesivos en los microorganismos a una a bc a bc a bc 80 c 60 40 20 0 SS 2 SS 3 SS 4 SS 7 SS 10 SS 13 Tratamientos Figura 3. Virulencia de Beauveria bassiana Bv025 provenientes de los subcultivos 2, 3, 4, 7, 10 y 13 en medio semisintético sobre adultos de Premnotrypes vorax. Los resultados acompañados de la misma letra no presentaron diferencias estadísticas según la comparación de medias de Tukey (P > 0,05). se trabajó con cultivos multiespóricos, es decir provenientes del cultivo de varias esporas, cada una con un contenido genético diferente, debido al fenómeno de heterocariosis (varios núcleos) que presenta este microorganismo (Estrada et ál. 1997). Giraldo et ál. (2001) demostraron que se obtenían niveles más altos y constantes de patogenicidad al realizar cultivos monoespóricos de M. anisopliae sobre la broca del café Hypothenemus hampei en comparación con los multiespóricos. La virulencia de los hongos entomopatógenos está determinada por diferentes factores que dependen del material genético, como la producción de enzimas y toxinas (Estrada et ál. 1997). Por tal razón, una posible causa de la disminución de la patogenicidad del aislamiento Bv025 a medida que se avanzó en los subcultivos sucesivos podría ser el silenciamiento de genes determinantes en el desarrollo de las diferentes etapas del mecanismo de infección, como aquellos que codifican para enzimas como la N-acetil glucosaminidasa y quimolastasa proteasa PR1 (Clarkson y Charnley 1996). Este efecto fue reportado por Bosa (2001), quien encontró una pérdida de la actividad biocontroladora de Serratia marscecens contra la polilla guatemalteca de la papa Tecia solanivora, a medida que se avanzaba en los subcultivos sucesivos. Dicha pérdida estuvo correlacionada con la disminución en la actividad de las enzimas mencionadas anteriormente. Al igual que en este trabajo, algunos autores han reportado una pérdida de la patogenicidad de los microorganismos debido al efecto de los subcultivos sucesivos. Morrow et ál. (1989) observaron que la virulencia de N. rileyi sobre larvas de primer instar de Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) se mantuvo alta hasta el quinto subcultivo, llegando a una pérdida total de 55 Ma ne jo I nte gr a do d e Pla g a s y A g r o e c o lo g ía ( Co sta Ric a ) N o . 7 7 , 2 0 0 6 variación inter e intraespecífica de la estabilidad genética de características como la patogenicidad, a diferencias en las metodologías usadas, a atenuaciones ocurridas al azar (mutaciones) o al efecto de las condiciones de cultivo. Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que los subcultivos sucesivos de este aislamiento afectaron sus características morfológicas, fisiológicas y su patogenicicidad. Los mejores resultados se obtuvieron con las conidias provenientes de los subcultivos dos y tres, en los cuales se observó la mayor velocidad de crecimiento y actividad biocontroladora del gusano blanco de la papa, permitiendo sugerir el uso de estos subcultivos en procesos de producción masiva del aislamiento Bv025 con miras a la manufactura eficiente y rentable de bioplaguicidas de alta calidad. Giraldo, E; López, Y; Delgado, F; Vélez, P. 2001. Actividad lipolítica y proteolítica­ de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae y su rela­ción­ con­ la­ pa­togen­icida­d sobre Hypothenemus hampei. Revista­ Colombia­n­a­ de En­tomología­ 27:61-65. Ha­ll, R. 1976. Verticillium lecanii on­ the a­phid Macrosiphonielle saborni. Journ­a­l of In­vertebra­te Pa­thology 28:389-391. ________. 1980. Effect of subculturin­g on­ a­ga­r a­n­d pa­ssa­gin­g through a­n­ in­sect host on­ pa­thogen­icity morphology, a­n­d growth ra­te of Verticillium lecanni. 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Agradecimientos A Pronatta por el apoyo financiero para el desarrollo del presente tra­ba­jo y a­ los in­vestiga­dores del La­bora­torio de Con­trol Biológico de Corpoica por sus orientaciones y aportes científicos para el cumplimien­to de los objetivos propuestos. Literatura citada Bosa­, C. 2001. Efecto de la­ composición­ del medio de cultivo, los pa­ses sucesivos y la­ a­ctivida­d en­zimática­ de Serratia marcescens sobre su a­ctivida­d biocon­trola­dora­ ha­cia­ Tecia solanivora Povoln­y (Lepidoptera­: Gelechiida­e). Tesis de ma­estría­ en­ Cien­cia­s A­gra­ria­s. Bogotá, CO, Un­iversida­d Na­cion­a­l de Colombia­. 130 p. Brownbridge, M; Costa, S; Jaronski, S. 2001. Effects of in vitro pa­ssa­ge of Beauveria bassiana on­ virulen­ce to Bemisia argentifolii. Journ­a­l of In­vertebra­te Pa­thology 77:280-283. Cen­tro Na­cion­a­l de In­vestiga­cion­es de Ca­fé-Cen­ica­fé. 1993. Pérdida­ de virulen­cia­ del hon­go Beauveria bassiana cultiva­do sucesiva­men­te en­ sustra­to de a­rroz. 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