‫جامعة حلب‬ ‫كلية اهلندسة الزراعية‬ ‫قسم وقاية النبات‬ ‫األثر التضادي للمورثة كيتيناز يف الفطر املسبب للفحة‬ ‫األسكوكيتا على المص‬ ‫رسالة أعدت لنيل درجة الماجستير في الهندسة الزراعية‬ ‫(تخصص وقاية نبات)‬ ‫إعداد‬ ‫باسل عيد العسكر‬ ‫‪ 2018‬م – ‪ 1440‬ه‬ ‫جامعة حلب‬ ‫كلية اهلندسة الزراعية‬ ‫قسم وقاية النبات‬ ‫األثر التضادي للمورثة كيتيناز يف الفطر املسبب للفحة‬ ‫األسكوكيتا على المص‬ ‫رسالة أعدت لنيل درجة الماجستير في الهندسة الزراعية‬ ‫(تخصص وقاية نبات)‬ ‫إعداد‬ ‫باسل عيد العسكر‬ ‫إشراف‬ ‫الدكتور فاتح خطيب‬ ‫أستاذ مساعد في قسم وقاية النبات‬ ‫كلية الهندسة الزراعية – جامعة حلب‬ ‫‪ 2018‬م – ‪ 1440‬ه‬ ‫كلمة شكر‬ ‫ ال يسعني في هذه الكلمات القليلة المتواضعة إال أن أتقدم بجزيل الشكر واالمتنان‬‫لرئيس جامعة حلب أ‪ .‬د‪ .‬مصطفى افيوني‪ ،‬كما أتوجه بالشكر لعمادة كلية الهندسة‬ ‫الزراعية ممثلة ا‪ .‬د صبحي منى ونائب العميد للشؤون اإلدارية أ‪ .‬د‪ .‬جمال حمندوش‬ ‫ونائب العميد للشؤون العلمية أ‪ .‬د‪ .‬محمد أبو شعر واألستاذ حمزة االفندي رئيس الدائرة‬ ‫على جهودهم المتواصلة والمبذولة‪.‬‬ ‫ جزيل الشكر واالمتنان للجنة الحكم على الرسالة أ‪ .‬د‪ .‬بسام بياعة والدكتور محمد‬‫ياسر عبه جي والدكتور فاتح خطيب لتحكيم هذه الرسالة واغناؤها بمقترحاتهم‬ ‫ أتقدم بأسمى آيات الشكر والتقدير إلى جميع أعضاء الهيئة التدريسية والفنية في قسم‬‫وقاية النبات واخص بالذكر رئيس القسم ا‪ .‬د‪ .‬امين حاج قاسم‪.‬‬ ‫ أتوجه بالشكر واالحترام إلى من كان نعم المعين إلى من منحني الثقة بالعمل وكان‬‫شمعة مضيئة وترك بصمه جميلة لكل من يلتقيه إلى من تعجز الكلمات عن ايفائه حقه‬ ‫الدكتور فاتح الخطيب الذي كان نبراساً اضاء طريقي نحو العلم والمعرفة فله عظيم‬ ‫االمتنان واالحترام‪.‬‬ ‫ كما اشكر استاذي الدكتور عبد الناصر تريسي على الدعم والتوجيه الدائم له مني كل‬‫الحب والتقدير‪.‬‬ ‫ ال يسعني اال ان أُعبر عن وافر الشكر واالمتنان والعرفان بالجميل للمركز الدولي‬‫للبحوث الزراعية في المناطق الجافة (إيكاردا) على مساعدتهم في إنجاز هذا العمل وما‬ ‫بذلوه من جهد وأخص بالذكر‪ :‬د‪ .‬مايكل باوم‪ ،‬االنسة ناهد السخني‪ ،‬األستاذ خالد‬ ‫الشمعة واآلنسة أميرة المصري واالنسة نوران عطار لهم مني كل االحترام والمودة‪.‬‬ ‫‪ -‬بطاقة شكر خاصة الى الهيئة العامة للبحوث الزراعية –مركز بحوث حلب واخص‬ ‫بالذكر الدكتور عبد هللا اليوسف والدكتور نعيم الحسين والدكتور يحيى قمري والدكتور‬ ‫سليم خوجة وكافة المهندسين والعاملين في المركز واخص بالذكر م‪ .‬جورجيت فتال‪،‬‬ ‫م‪ .‬رهام أبو الكنج‪ ،‬م‪ .‬روال حموية م‪ .‬يمان جبور م‪ .‬حسين عكة م‪ .‬أسماء معاز فلهم‬ ‫جزيل الشكر واالمتنان على التسهيالت التي قدموها إلتمام هذا البحث‪.‬‬ ‫ أتوجه بالشكر واالمتنان الى كل من أمدني بالعلم والمعرفة واسدى لي النصح واخص‬‫بالذكر األستاذ الدكتور بسام بياعة والدكتور محمد قاسم والدكتور احمد شمس الدين‬ ‫شعبان والدكتورة رشا كيالي و م‪ .‬خالد كيالي‪.‬‬ ‫ بطاقة شكر موجهة الى اخوتي واصدقائي المهندسين‪ :‬عالء الخطيب ‪-‬عبد المالك‬‫الساير‪ -‬محمد الطه ‪-‬بدر العبيد ‪-‬عبد الجبار الفصيح‪ -‬محمد كامل‪-‬نبهان النبهان‪-‬‬ ‫ايهم شاقوقة‪.‬‬ ‫الشكر الجزيل الى والدي ووالدتي رحمها هللا واخوتي الذين ساندوني في كل وقت خالل‬ ‫مراحل البحث ‪....‬‬ ‫اإلهداء‬ ‫إلى والدي ووالدتي رحمها الله‬ ‫ مُُن كليُُة الهندسُُة‬،‫ُق ُدمت هُُذه الرسُُالة اسُُتكماالً لمتطلبُُات نيُُل درجُُة الماجسُُتير فُُي وقايُُة النبُُات‬ .‫الزراعية في جامعة حلب‬ This thesis has been submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of MSc. in Plant Protection, at the Faculty of Agricultural engineering, Aleppo University, Syria. ‫نوقشت هذه األطروحة في جلسة علنية بتاريخ ‪ ،2018 /11 /29‬وأجيزت أمام لجنة‬ ‫الحكم المؤلفة من السادة‪:‬‬ ‫األستاذ الدكتوربسام بياعة‬ ‫الدكتور محمد ياسر عبه جي‬ ‫الدكتور فاتح خطيب‬ ‫تصريح‬ ‫للمورثة كيتيناز في الفطر المسبب للفحة األسكوكيتا على‬ ُ ‫أصرح بأن هذا البحث " األثر التضادي‬ .‫ وال هو ُمقدم حالياً للحصول على شهادة أخرى‬،‫الحمص" لم يسبق أن ُقبل ألي شهادة‬ ُ ‫المرشح‬ ‫باسل عيد العسكر‬ 2018 /11/29 ‫التاريخ‬ DECLARATION This is here by declared that this work " Antagonistic Effect of Chitinase Gene against Fungus Causing Chickpea Ascochyta Blight " has not been previously accepted for any degree, nor has it been submitted concurrently for any other degree Candidate Basel Eid alaskar Date: 29 / 11/ 2018 ‫شهادة‬ ‫نشهد بأن العمل الموصوف في هذه الرسالة هو نتيجة بحث علمي قام به المرشح باسل عيد العسكر‬ ،‫ كليُُة الهندسُُة الزراعيُُة‬،‫ أسُُتاذ مسُُاعد فُُي قسُُم وقايُُة النبُُات‬،‫تحُُت إش ُراف الدددكتور فدداتح خبيددب‬ .‫ وان أي مراجع أخرى لباحثين آخرين مذكورة في هذه الرسالة ُموثقة في النص‬،‫جامعة حلب‬ ‫بإشراف‬ ‫المرشح‬ ....................... ........................ ‫الدكتور فاتح خطيب‬ ‫باسل عيد العسكر‬ 2018 /11/29 ‫التاريخ‬ CERTIFICAT It is hereby certified that the work in this thesis is the result of the author’s own investigations under the supervision of Associate Professor Fateh Khatib from the Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Aleppo University, and any references to other researcher's work has been duly acknowledged in the text. Candidate …….……………… Basel Eid alaskar Date:29/11/ 2018 Supervisors …………………… Dr. Fateh Khatib Aleppo University Faculty of Agricultural Engineering Department of Plant Protection Antagonistic Effect of Chitinase Gene against Fungus Causing Chickpea Ascochyta Blight A Thesis Submitted to the University of Aleppo for Master Degree in Plant Protection By Basel Eid Alaskar Supervisor Dr. Fateh Khatib Associate Prof. in Department of Plant Protection Faculty of Agricultural Eng. Aleppo University 2018 - 1440 Aleppo University Faculty of Agricultural Engineering Department of Plant Protection Antagonistic Effect of Chitinase Gene against Fungus Causing Chickpea Ascochyta Blight A Thesis Submitted to the University of Aleppo for Master Degree in Plant Protection By Basel Eid Alaskar 2018 - 1440 ‫‪I‬‬ ‫فهرس المحتويات‬ ‫العنوان‬ ‫الصفحة‬ ‫فهرس المحتويات‬ ‫‪I‬‬ ‫فهرس الجداول‬ ‫‪V‬‬ ‫فهرس األشكال‬ ‫‪VI‬‬ ‫الملخص العربي‬ ‫‪VIII‬‬ ‫أولا‪ -‬المقدمة‬ ‫ثانيا‪ -‬الدراسة المرجعية‬ ‫الح ّمص‬ ‫‪ .1-2‬لفحة األسكوكيتا على ُ‬ ‫‪ .2-2‬اإلدارة المتكاملة لمرض لفحة األسكوكيتا على ال ُح ّمص‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪ .1-2-2‬التربية التقليدية‬ ‫‪6‬‬ ‫‪ .2-2-2‬الممارسات الزراعية‬ ‫‪7‬‬ ‫‪ .3-2-2‬المكافحة الكيميائية‬ ‫‪7‬‬ ‫‪ .4-2-2‬المكافحة األحيائية‬ ‫‪8‬‬ ‫‪ .5-2-2‬المقاومة الجهازية المكتسبة‬ ‫‪8‬‬ ‫‪ .3-2‬إستراتيجيات مقاومة األمراض الفطرية عن طريق الهندسة الوراثية‬ ‫‪8‬‬ ‫مرضية‬ ‫‪ .1-3-2‬البروتينات المرتبطة بالُقّدرة اإل ا‬ ‫‪8‬‬ ‫‪ .2-3-2‬البروتينات المضادة للفطور‬ ‫‪9‬‬ ‫‪ .3-3-2‬الفيتوالكسينات‬ ‫‪9‬‬ ‫‪ .4-3-2‬البروتينات المضادة لألحياء الدقيقة‬ ‫‪10‬‬ ‫‪ .5-3-2‬البروتينات والببتيدات المثبطة للريبوزومات النباتية‬ ‫‪10‬‬ ‫ورثات المقاومة‬ ‫‪ُ .6-3-2‬م ّ‬ ‫‪11‬‬ ‫‪ .7-3-2‬تفكك نواتج الستقالب السامة‬ ‫‪11‬‬ ‫‪ .8-3-2‬إخماد الحمض النووي الريبي‬ ‫‪12‬‬ ‫‪ُ .4-2‬م ّورثة الكيتيناز‬ ‫‪12‬‬ ‫‪II‬‬ ‫‪ .5-2‬التحوير الوراثي ودوره في مقاومة األمراض الفطرية‬ ‫‪17‬‬ ‫‪ .6-2‬التحوير الوراثي للنبات بوساطة البكتريا ‪Agrobacterium tumefaciens‬‬ ‫‪18‬‬ ‫للح ّمص‬ ‫‪ .7-2‬التحوير الوراثي ُ‬ ‫‪20‬‬ ‫عدلة وراثيا‬ ‫الم ّ‬ ‫‪ .8-2‬تحليل النباتات ُ‬ ‫‪ .1-8-2‬الغربلة األولية‬ ‫‪22‬‬ ‫‪23‬‬ ‫‪ .2-8-2‬التفاعل التسلسلي للبوليميراز‪PCR‬‬ ‫‪23‬‬ ‫‪ .3-8-2‬تقنية النسخ العكسي‬ ‫‪25‬‬ ‫شرب سذرن‬ ‫‪َ .4-8-2‬ت ّ‬ ‫شرب نورذرن النقطي‬ ‫‪َ .5-8-2‬ت ّ‬ ‫طخ وسترن‬ ‫‪ .6-8-2‬تل ّ‬ ‫ورثات المنقولة‬ ‫‪ .9-2‬التقويم الوظيفي لل ُم ّ‬ ‫‪ . 1-9-2‬التقويم الوظيفي لل ُم ّورثة الواسمة لالنتخاب في النبات‬ ‫‪ . 2-9-2‬التقويم الوظيفي لل ُم ّورثة التي تمنح الصفة المرغوبة‬ ‫ثالث ا‪ .‬أهداف البحث‬ ‫رابعا‪ .‬المواد والطرائق‬ ‫‪26‬‬ ‫‪27‬‬ ‫‪28‬‬ ‫‪29‬‬ ‫‪29‬‬ ‫‪31‬‬ ‫‪33‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪ .1-4‬المادة النباتية‬ ‫‪35‬‬ ‫‪ .2-4‬التركيب الوراثي المنقول للنبات‬ ‫‪35‬‬ ‫‪ .3-4‬استخالص الـ ‪ DNA‬الجينومي‪ ،‬وقياس تركيزه‪ ،‬ونقاوته‪ ،‬واختبار نوعيته‬ ‫‪36‬‬ ‫‪ .1-3-4‬استخالص الـ ‪DNA‬‬ ‫‪36‬‬ ‫‪ .2-3-4‬قياس تركيز الـ ‪ DNA‬بوساطة المطياف الضوئي‬ ‫‪37‬‬ ‫‪ .3-3-4‬اختبار نوعية الـ ‪ DNA‬بالرحالن الكهربائي في هالمة األغاروز‬ ‫‪38‬‬ ‫‪ .1 -3-3-4‬المحاليل المستخدمة‬ ‫‪38‬‬ ‫‪ .2 -3-3-4‬تحضير هالمة األغاروز‬ ‫‪39‬‬ ‫‪ .3 -3-3-4‬تحميل عينات الـ ‪ DNA‬في الهالمة‬ ‫‪39‬‬ ‫‪ .4-3-3 -4‬التلوين والتظهير‬ ‫‪40‬‬ ‫ورثات المنقولة بوساطة التفاعل التسلسلي للبوليميراز‬ ‫‪ .4-4‬الكشف عن ال ُم ّ‬ ‫ورثة كيتيناز بوساطة الـ‪PCR‬‬ ‫الم ّ‬ ‫‪ .1-4-4‬الكشف عن ُ‬ ‫‪40‬‬ ‫‪40‬‬ ‫‪III‬‬ ‫ورثة ‪ bar‬بوساطة الـ ‪.PCR‬‬ ‫الم ّ‬ ‫‪. 2-4-4‬الكشف عن ُ‬ ‫ورثة كيتيناز‪ chitinase‬بطريقة النسخ العكسي‬ ‫الم ّ‬ ‫‪ . 5-4‬الكشف عن نشاط ُ‬ ‫‪ .1-5- 4‬استخالص الحمض النووي الريبي ‪RNA‬‬ ‫المكملة ‪cDNA‬‬ ‫‪ .2-5-4‬تركيب سلسلة الـ ‪DNA‬‬ ‫ّ‬ ‫‪ . 3-5-4‬النسخ العكسي‪ -‬التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪RT-PCR‬‬ ‫شرب سذرن‬ ‫‪ . 6-4‬تهجين الـ‪ DNA‬بتقنية َت ّ‬ ‫‪ .1-6-4‬تحضير ووسم المسبر بالطريقة غير اإلشعاعية‬ ‫‪Southern blot‬‬ ‫‪42‬‬ ‫‪43‬‬ ‫‪43‬‬ ‫‪45‬‬ ‫‪46‬‬ ‫‪47‬‬ ‫‪48‬‬ ‫‪ .2-6-4‬هضم الـ ‪ DNA‬بوساطة أنزيمات القطع‬ ‫‪49‬‬ ‫‪ .3-6-4‬تحميل العينات والرحالن الكهربائي‬ ‫‪50‬‬ ‫‪ .4-6-4‬نقل الـ ‪ DNA‬إلى الغشاء النايلوني ‪Southern transfer‬‬ ‫‪51‬‬ ‫‪ . 5-6-4‬تثبيت ال‪DNA‬على الغشاء النايلوني‬ ‫‪53‬‬ ‫‪ .6-6-4‬تحضير الغشاء للتهجين وعملية التهجين‬ ‫‪53‬‬ ‫‪ .7-6-4‬الغسيل والتظهير‬ ‫‪54‬‬ ‫‪ .8-6-4‬المحاليل المستخدمة‬ ‫‪55‬‬ ‫ورثات المنقولة‬ ‫‪ .7-4‬التقويم الوظيفي لل ُم ّ‬ ‫‪ .1-7-4‬التقويم الوظيفي لل ُم ّورثة الواسمة لالنتخاب ‪bar‬‬ ‫‪56‬‬ ‫‪ .2-7-4‬التقويم الوظيفي لل ُم ّورثة ‪ bar‬باستخدام اختبار ‪Chlorophenol Red‬‬ ‫‪ .8-4‬األثر التضادي لل ُم ّورثة كيتيناز ‪ chitinase‬في تثبيط نمو الفطر المسبب‬ ‫الح ّمص‬ ‫للفحة األسكوكيتا على ُ‬ ‫‪ . 1-8-4‬تنمية العزلة الفطرية‬ ‫‪56‬‬ ‫‪56‬‬ ‫‪57‬‬ ‫‪57‬‬ ‫‪ . 2 -8-4‬عزل البروتين الخام‬ ‫‪57‬‬ ‫‪ .3-8-4‬اختبار تثبيط إنبات األبواغ‬ ‫‪57‬‬ ‫‪ . 4-8-4‬التقويم الوظيفي لل ُم ّورثة كيتيناز‬ ‫المحورة‬ ‫‪ .1-4-8-4‬اختبار الورقة المفصولة للنباتات‬ ‫ّ‬ ‫‪58‬‬ ‫محور‬ ‫‪ .2-4-8-4‬اختبار الورقة المفصولة لصنف غير ّ‬ ‫المحورة‬ ‫‪ .3-4-8-4‬رش كامل النباتات‬ ‫ّ‬ ‫خامس ا‪ .‬النتائج والمناقشة‬ ‫‪58‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪62‬‬ ‫‪IV‬‬ ‫‪ .1-5‬تركيز ونقاوة ونوعية الـ ‪DNA‬‬ ‫‪62‬‬ ‫المورثتين ‪ ،chitinase‬و ‪ bar‬بوساطة التفاعل التسلسلي‬ ‫‪ .2-5‬الكشف عن‬ ‫ّ‬ ‫للبوليميراز ‪PCR‬‬ ‫‪63‬‬ ‫ورثة كيتيناز ‪ chitinase‬بطريقة النسخ العكسي‬ ‫الم ّ‬ ‫‪ .3-5‬الكشف عن نشاط ُ‬ ‫‪.RT-PCR‬‬ ‫‪64‬‬ ‫ورثة التي دخلت إلى جينوم النبات بوساطة َتشّرب‬ ‫الم ّ‬ ‫‪ .4-5‬تحديد عدد نسخ ُ‬ ‫سذرن‬ ‫‪67‬‬ ‫ي‬ ‫للم ّورثة الواسمة لالنتخاب ‪bar‬‬ ‫‪ .5-5‬التقويم الحيو ُ‬ ‫تحمل المبيد)‪Phosphinothricin (PPT‬‬ ‫‪ّ .1-5-5‬‬ ‫‪.2-5-5‬التقويم الكيميائي لألنسجة باستخدام أحمر الكلوروفينول‬ ‫‪70‬‬ ‫‪70‬‬ ‫‪72‬‬ ‫‪Chlorophenol Red (CR‬‬ ‫للم ّورثة كيتيناز ‪ chitinase‬في تثبيط نمو الفطر‬ ‫‪ .6-5‬دراسة األثر التضادي ُ‬ ‫المسبب للفحة األسكوكيتا‬ ‫‪73‬‬ ‫‪ . 1-6-5‬اختبار تثبيط إنبات األبواغ‬ ‫‪73‬‬ ‫لمحورة‬ ‫للم ّورثة كيتينازعلى الورقة المفصولة للنباتات ا ّ‬ ‫‪.2-6-5‬التقويم الوظيفي ُ‬ ‫‪ . 3 -6-5‬التقويم على كامل النبات‬ ‫‪74‬‬ ‫للم ّورثة كيتيناز على الورقة المفصولة للنباتات غير‬ ‫‪ 6.4.-5‬التقويم الوظيفي ُ‬ ‫المحورة‬ ‫ّ‬ ‫سادس ا‪-‬الستنتاجات‬ ‫سابعا‪ -‬المقترحات والتوصيات‬ ‫ثامنا‪ -‬المراجع‬ ‫الملخص اإلنكليزي‬ ‫‪77‬‬ ‫‪79‬‬ ‫‪83‬‬ ‫‪84‬‬ ‫‪85‬‬ ‫‪98‬‬ ‫‪V‬‬ ‫فهرس الجداول‬ ‫الجدول‬ ‫ورثة كيتيناز‬ ‫الم ّ‬ ‫الجدول ‪ :1‬مكونات مزيج التفاعل األساسي للكشف عن ُ‬ ‫بوساطة الـ ‪PCR‬‬ ‫ي‬ ‫ورثة كيتيناز‪.‬‬ ‫الم ّ‬ ‫الجدول ‪ :2‬برنامج التدوير الحرار لمكاثرة قطعة من ُ‬ ‫ي‬ ‫ورثة ‪.bar‬‬ ‫الم ّ‬ ‫الجدول ‪ :3‬برنامج التدوير الحرار لمكاثرة قطعة من ُ‬ ‫الجدول ‪ :4‬مكونات مزيج تفاعل التسخ العكسي‪.‬‬ ‫الصفحة‬ ‫‪41‬‬ ‫‪42‬‬ ‫‪43‬‬ ‫‪46‬‬ ‫ي‬ ‫ورثة ‪ actin‬داخلية‬ ‫الم ّ‬ ‫الجدول ‪ :5‬برنامج التدوير الحرار لمكاثرة قطعة من ُ‬ ‫المنشأ‪.‬‬ ‫‪47‬‬ ‫الجدول ‪ :6‬مزيج التفاعل الـتسلسلي للبوليميراز المستخدم في وسم المسبر‬ ‫‪48‬‬ ‫بالطريقة غير اإلشعاعية‪.‬‬ ‫الح ّمص باألنزيم‬ ‫الجدول ‪ :7‬مكونات مزيج هضم الـ ‪ DNA‬الجينومي لنبات ُ‬ ‫‪.BamHI‬‬ ‫‪49‬‬ ‫الح ّمص‬ ‫الجدول ‪ :8‬تركيز الـ ‪ DNA‬المستخَلص من عينات أوراق نبات ُ‬ ‫‪62‬‬ ‫ونقاوته حسب قراءة المطياف الضوئي‪.‬‬ ‫الجدول ‪ :9‬عدد المستعمرات المتشكلة من أبواغ الفطر ‪Ascochyta rabiei‬‬ ‫على وسط ‪ CDA‬بعد معاملتها بتخفيفات مختلفة من مستخلص النبات‬ ‫المعدل وراثي ا والشاهد‪.‬‬ ‫‪73‬‬ ‫‪VI‬‬ ‫فهرس األشكال‬ ‫الشكل‬ ‫الصفحة‬ ‫الشكل ‪ :1‬الدول العشر األوائل المنتجة لل ُح ّمص في العالم‬ ‫‪2‬‬ ‫الشكل ‪ :2‬أعراض اإلصابة بلفحة األسكوكيتا على األجزاء المختلفة من نبات‬ ‫‪4‬‬ ‫الح ّمص‪.‬‬ ‫ُ‬ ‫الح ّمص ‪.Ascochyta rabiei‬‬ ‫الشكل ‪ :3‬األبواغ الكونيدية لفطر األسكوكيتا على ُ‬ ‫الح ّمص‪.‬‬ ‫الشكل ‪ :4‬دورة حياة الفطر ‪ Ascochyta rabiei‬على ُ‬ ‫الشكل ‪ .5‬بنية الكيتين ومواقع تفكيكه‬ ‫‪5‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪13‬‬ ‫الشكل ‪ .6‬تركيب البالزميد ‪Ti plasmid‬‬ ‫‪19‬‬ ‫للح ّمص باستخدام البكتريا ‪A. tumefaciens‬‬ ‫الشكل ‪ :7‬مراحل التحوير الوراثي ُ‬ ‫الشكل ‪ :8‬مقارنة بين التفاعل السلسلي للبوليميراز بالزمن الحقيقي ‪Real Time‬‬ ‫‪22‬‬ ‫‪24‬‬ ‫‪ ،PCR‬والتفاعل التسلسلي للبوليميراز التقليدي ‪conventional PCR‬‬ ‫المكملة ‪ cDNA‬عن سلسلة ‪ RNA‬مفردة‬ ‫الشكل ‪ :9‬مراحل اصطناع السلسلة‬ ‫ّ‬ ‫الشكل ‪ :10‬مقارنة بين طرائق التهجين الثالث‪.‬‬ ‫‪26‬‬ ‫‪29‬‬ ‫الشكل ‪ :11‬رسم تخطيطي للبالزميد ‪.pGII-vst-chit‬‬ ‫‪36‬‬ ‫الشكل ‪ :12‬تحميل العينات في حفر هالمة األغاروز وترحيلها‪.‬‬ ‫‪51‬‬ ‫الشكل ‪ :13‬نقل قطع الـ ‪ DNA‬من الهالمة إلى الغشاء النايلوني بالخاصية‬ ‫‪52‬‬ ‫الشعرية‪.‬‬ ‫الشكل ‪ :14‬ضبط الحرارة في فرن التهجين (اليمين) ووضع الغشاء في أنابيب‬ ‫‪54‬‬ ‫التهجين (الوسط)‪ ،‬ثم القيام بعملية التهجين بالتحريك الدوراني (اليسار)‪.‬‬ ‫الشكل ‪ :15‬غمر الغشاء في محلول الكشف‪.‬‬ ‫‪55‬‬ ‫الشكل ‪ .16‬مساحة التماوت‪ /‬النكرزة والبقعة المتبوغة المستخدمة في حساب‬ ‫‪59‬‬ ‫شدة اإلصابة وفق سلم التقييس‪.‬‬ ‫الشكل ‪ :17‬اختبار نوعية الـ ‪ DNA‬بالرحالن الكهربائي على هالمة األغاروز‬ ‫تركيز ‪. %1‬‬ ‫‪62‬‬ ‫‪VII‬‬ ‫الشكل ‪ :18‬الرحالن الكهربائي على هالمة أغاروزتركيز ‪ %1.2‬لنواتج التفاعل‬ ‫الح ّمص الجيل ‪.T5‬‬ ‫التسلسلي للبوليميراز‬ ‫للمورثتين ‪، chitinase‬و‪ bar‬في نباتات ُ‬ ‫ّ‬ ‫الشكل ‪:19‬الرحالن الكهربائي على هالمة أغاروز ‪ %1.2‬لنواتج تفاعل الـ ‪PCR‬‬ ‫لح ّمص‪.‬‬ ‫لسلسلة الـ ‪DNA‬‬ ‫المكملة )‪ (cDNA‬للمورثتين ‪ chitinase‬و‪ actin‬في ا ُ‬ ‫ّ‬ ‫ورثة كيتيناز باستخدام التفاعل التسلسلي للبوليميراز‬ ‫الم ّ‬ ‫الشكل ‪ :20‬وسم مسبر ُ‬ ‫الشكل ‪ :21‬تهجين الـ ‪ DNA‬على الغشاء النايلوني باستخدام مسبر موسوم‬ ‫‪63‬‬ ‫‪65‬‬ ‫‪67‬‬ ‫‪68‬‬ ‫بالطريقة غير اإلشعاعية‪.‬‬ ‫الح ّمص للمبيد ‪ phosphinothricin‬بتركيز ‪1500‬‬ ‫الشكل ‪ :22‬مقاومة أوراق ُ‬ ‫‪70‬‬ ‫مغ‪/‬ل بالمقارنة مع حساسية أوراق نبات الشاهد لذات التركيز‬ ‫الح ّمص المعدل وراثيا (أسفل) والشاهد‬ ‫الشكل ‪ :23‬التقويم الكيميائي لوريقات ُ‬ ‫(أعلى) باستخدام أحمر الكلوروفينول‪.‬‬ ‫‪72‬‬ ‫الشكل ‪ :24‬تشكل المستعمرات من أبواغ الفطر ‪ Acochyta rabiei‬المعاملة بعدة‬ ‫‪74‬‬ ‫المحورة (أعلى) والشاهد‬ ‫الح ّمص‬ ‫تخفيفات من المستخَلص األنزيمي لنباتات ُ‬ ‫ّ‬ ‫(أسفل) بعد نشرها على وسط ‪. CDA‬‬ ‫الشكل ‪ :25‬نمو الميسليوم الفطري بعد معاملة األبواغ بعدة تخفيفات من‬ ‫‪74‬‬ ‫عدلة وراثيا (أعلى) والشاهد غير‬ ‫الم ّ‬ ‫المستخَلص األنزيمي لنباتات ُ‬ ‫الح ّمص ُ‬ ‫المعدل (أسفل)‪.‬‬ ‫الشكل ‪ :26‬نسبة اإلصابة بالفطر ‪ A. rabiei‬عند معاملة أوراق النبات الشاهد‬ ‫‪75‬‬ ‫غير المعدل وراثي ا‪.‬‬ ‫الشكل ‪ :27‬نسبة اإلصابة بالفطر ‪ A. rabiei‬عند معاملة أوراق النبات المعدل‬ ‫‪75‬‬ ‫وراثيا‪.‬‬ ‫الشكل ‪ :28‬شدة اإلصابة بالفطر ‪ A. rabiei‬في مكررات النبات الشاهد‪.‬‬ ‫‪76‬‬ ‫الشكل ‪ :29‬شدة اإلصابة بالفطر ‪ A. rabiei‬في مكررات النبات المعدل وراثي ا‪.‬‬ ‫‪77‬‬ ‫الح ّمص‬ ‫الشكل ‪ :30‬تباين شدة اإلصابة بالفطر ‪ A. rabiei‬على وريقات ُ‬ ‫عدلة وراثي ا (اليمين) بالمقارنة مع وريقات الشاهد (اليسار)‪.‬‬ ‫لم ّ‬ ‫اُ‬ ‫الح ّمص للصنف‬ ‫الشكل ‪ :31‬تباين شدة اإلصابة بفطر األسكوكيتا على وريقات ُ‬ ‫غاب‪.1‬‬ ‫‪77‬‬ ‫‪79‬‬ ‫‪VIII‬‬ ‫الملخص‬ ‫الحمص ‪ Cicer arietinum L.‬في المرتبة الثالثة عالميا من حيث األهمية‬ ‫يصنف ُ‬ ‫الحمص بالعديد من األمراض الفطرية‪ ،‬ويعد مرض‬ ‫بين المحاصيل البقولية الغذائية‪ .‬يصاب ُ‬ ‫لفحة األسكوكيتا المتسبب عن الفطر ‪ Acochyta rabiei‬من األمراض التي تهدد زراعته ‪،‬‬ ‫حيث ينتشر هذا المرض في أماكن زراعة المحصول‪ .‬يتم من خالل تقنيات الهندسة الوراثية‬ ‫معالجة المادة الوراثية في الخلية إلنتاج صفات جديدة في الكائن الحي مثل مقاومة‬ ‫الممرضات النباتية‪ .‬مازال استخدام الهندسة الوراثية محدودا في مقاومة الممرضات النباتية‪،‬‬ ‫ولكن حدثت تطورات مهمة في هذا المجال‪ .‬تم تعريف وعزل عدة أنواع من ُمورثة الكيتيناز‬ ‫من كائنات حية مختلفة‪ ،‬ونقلها إلى النبات بهدف منح هذه النباتات صفة المقاومة‬ ‫للممرضات الفطرية‪ .‬هدفت هذه الدراسة إلى إجراء تحليل جزيئي يتضمن الكشف عن‬ ‫الحمص بتقنيات الهندسة الوراثية‪ ،‬واستخدام‬ ‫المورثتين ‪ ،chitinase‬و ‪ bar‬المنقولتين لنباتات ُ‬ ‫المورثة ‪،chitinase‬‬ ‫تقنية النسخ العكسي ‪ reverse transcription‬في الكشف عن نشاط ُ‬ ‫وتقنية تهجين الـ ‪ DNA‬لمعرفة عدد النسخ المنقولة‪ .‬أما على النمط الظاهري فقد هدفت‬ ‫المورثة ‪ bar‬في منح صفة المقاومة للمبيد العشبي‬ ‫الدراسة إلى تقويم دور ُ‬ ‫‪ ،)Glufosinate(phosphinothricin‬واألثر التضادي لل ُمورثة ‪ chitinase‬في تثبيط نمو‬ ‫الفطر المسبب للفحة األسكوكيتا‪ .‬تم استخالص الـ ‪ DNA‬من األوراق بطريقة ‪ ،CTAB‬ثم‬ ‫ُقدر تركيز ونقاوة ونوعية الـ ‪ DNA‬المستخَلص‪ .‬استخدمت بادئات متخصصة في الكشف‬ ‫عن المورثتين ‪ ،chitinase‬و‪ bar‬بوساطة التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪ .PCR‬تم أيضا هضم‬ ‫الـ ‪ DNA‬الجينومي المستخَلص بوساطة أنزيم القطع ‪ ،BamHI‬وفصل نواتج الهضم في‬ ‫هالمة أغاروز‪ ،‬ونقل نواتج الهضم على غشاء نايلوني‪ ،‬ثم تهجينها مع مسبر موسوم‬ ‫بالطريقة غير اإلشعاعية‪ .‬كما استُخلص الـ ‪ RNA‬من األوراق بعد يومين من وخزها بوساطة‬ ‫المورثة ‪ ،chitinase‬ومن ثم ُقدر تركيزه ونقاوته بوساطة المطياف‬ ‫إبرة معقمة لتحريض ُ‬ ‫الضوئي‪ُ .‬ركبت سلسلة مفردة مكملة ‪ (cDNA) complementary DNA‬عن طريق النسخ‬ ‫العكسي لسلسلة الـ ‪ ،mRNA‬ثم استخدمت هذه السلسلة كقالب في التفاعل التسلسلي‬ ‫المورثة ‪ .chitinase‬اختبرت نوعية الـ ‪ ،DNA‬وفصلت‬ ‫للبوليميراز ‪ PCR‬للكشف عن نشاط ُ‬ ‫منتجات الـ ‪ ،PCR‬ونواتج الهضم على هالمة أغاروز بتراكيز مناسبة لكل حالة‪ُ .‬دهنت أوراق‬ ‫النباتات بتراكيز مختلفة من مبيد األعشاب ‪ Phosphinothricin‬تراوحت بين ‪1500 – 150‬‬ ‫‪IX‬‬ ‫المورثة ‪.bar‬‬ ‫مغ‪/‬ل الختبار مقاومتها للمبيد‪ ،‬والتركيز‪ ،‬ومدى التحمل الذي يمكن أن تمنحه ُ‬ ‫المورثة ‪ bar‬بإجراء اختبار على النسيج النباتي بوساطة أحمر‬ ‫كما ُقومت وظيفة ُ‬ ‫الكلوروفينول )‪ .chlorophenol red (CR‬أجريت عملية تقويم وظيفي لل ُمورثة ‪ chitinase‬من‬ ‫خالل اختبار دور أربعة تخفيفات من المستخَلص األنزيمي الخام في تثبيط نمو أبواغ الفطر‬ ‫‪ A. rabiei‬وذلك بحساب عدد المستعمرات المتشكلة بعد المعاملة ونشر كمية ‪ 100‬ميكرولتر‬ ‫من كل تحفيف على الوسط المغذي ‪ .)CDA) Chickpea dextrose agar‬كما أعديت أوراق‬ ‫نباتية بمعلق بوغي للفطر بطريقة الورقة المفصولة‪ ،‬ورش كامل النبات بالمعلق البوغي‬ ‫للفطر‪ ،‬ثم حسبت نسبة اإلصابة وشدتها وفق سلم تقييس للمقارنة بين النباتات المعدلة وراثيا‬ ‫ونباتات الشاهد‪ ،‬كما استخدمت أبواغ الفطر بعد تحضينها مع تخفيفات المستخَلص األنزيمي‬ ‫في إعداء أوراق صنف الحمص غاب‪ 1‬عالي القابلية لإلصابة بطريقة الورقة المفصولة‪،‬‬ ‫صممت التجارب بطريقة التصميم العشوائي الكامل ‪ ،CRD‬وحللت إحصائيا باستخدام برنامج‬ ‫‪ SPSS22‬لتحليل التباين ‪ ،ANOVA‬أظهرت نتائج التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪PCR‬‬ ‫باستخدام البادئات المتخصصة الحصول على القطع المتوقعة من المورثتين ‪ chitinase‬و‬ ‫‪ bar‬وهما بطول ‪ 555‬و ‪ 264‬زوجا نكليوتيديا )‪ (bp‬على التوالي‪ ،‬مما يدل على ثبات‬ ‫المورثتين المنقولتين في األجيال المتعاقبة حتى الجيل الخامس ‪ ،T5‬كما أظهر االختبار ذاته‬ ‫المورثة ‪ chitinase‬فعالة ويتم نسخها إلى الحمض‬ ‫لكن على السلسلة المكملة ‪ cDNA‬أن ُ‬ ‫النووي الريبي الرسول ‪ mRNA‬وال توجد في حالة إخماد‪ .‬بينت نتائج تهجين الـ ‪ DNA‬أن‬ ‫المورثة قد تم نقلها إلى النبات‪ ،‬وهذه تعد ميزة في مثل هذه الحاالت‪،‬‬ ‫هناك نسخة وحيدة من ُ‬ ‫المورثة ‪ bar‬إلى‬ ‫حيث نتجنب أحد العوامل المسببة لعملية إخماد المورثات المنقولة‪ .‬أدى نقل ُ‬ ‫الحمص صفة المقاومة للمبيد ‪ Phosphinothricin‬حتى التركيز ‪ 1500‬مغ‪/‬ل‪،‬‬ ‫منح نباتات ُ‬ ‫كما تطابقت نتائج اختبار أحمر الكلوروفينول )‪ (CR‬مع نتائج دهن األوراق بالمبيد‪ ،‬وتلون‬ ‫المورثة ‪ .bar‬أدى استخدام‬ ‫محلول الكشف باللون األصفر أو البرتقالي مما يدل على نشاط ُ‬ ‫الحمص وبفروق معنوية مع‬ ‫المستخَلص البروتيني الخام إلى تثبيط نمو أبواغ فطر أسكوكيتا ُ‬ ‫التخفيفات األخرى ومع مستخلص نباتات الشاهد‪ ،‬وقد انعكس ذلك على شكل انخفاض في‬ ‫كمية الميسيليوم المتشكلة بعد المعاملة أو عدم تشكله عند التركيز المرتفع‪ ،‬وكذلك انخفاض‬ ‫شدة اإلصابة بالفطر عند إعداء أوراق الصنف غاب‪ 1‬بأبواغ معاملة بالمستخَلص السابق‪،‬‬ ‫لكن ليس نسبة اإلصابة‪ .‬أظهرت نتائج التقويم الوظيفي لل ُمورثة ‪ chitinase‬عدم وجود فروق‬ ‫معنوية في نسبة اإلصابة بين النباتات المعدلة وراثيا والشاهد‪ ،‬لكن كانت هناك فروق‬ ‫‪X‬‬ ‫إحصائية في شدة اإلصابة‪ ،‬وبالمحصلة بقي النبات عالي القابلية لإلصابة‪ .‬سجلت فروق‬ ‫معنوية في نسبة اإلصابة على النبات الكامل بين النباتات المحورة‪ ،‬حيث بلغت‬ ‫وسطيا ‪ ،57.75‬ونباتات الشاهد‪ ،‬حيث تراوحت فيها بين ‪ .% 100- 80‬كما كانت هناك‬ ‫فروق معنوية في شدة اإلصابة على النبات الكامل بين النباتات المحورة وغير المحورة‪،‬‬ ‫حيث بلغت وسطيا ‪ 22.25‬و‪ 62.5‬على التوالي‪ .‬أظهرت نتائج التحليل اإلحصائي لنسبة‬ ‫اإلصابة على الورقة المفصولة وجود فروق معنوية بين النباتات المعدلة وراثيا ونباتات‬ ‫الشاهد‪ ،‬حيث بلغت هذه النسبة وسطيا ‪ %69.6‬للمعدلة‪ %100،‬للشاهد‪ .‬كما تباينت شدة‬ ‫اإلصابة‪ ،‬حيث بلغت ‪ 56.6‬على أوراق النباتات المعدلة وراثيا‪ ،‬و‪ 85.2‬على الشاهد‪ ،‬لكن‬ ‫بقي توصيف النبات بأنه عالي القابلية لإلصابة وفق سلم التقييس‪.‬‬ ‫الفصل الول‬ ‫المقدمة والدراسة المرجعية وأهداف البحث‬ ‫‪Introduction, Literature Review and Objectives‬‬ ‫‪1‬‬ ‫أولا‪ -‬مقـدمــة‬ ‫الحمص ‪ Cicer arietinum L.‬نباتا عشبيا حوليا ينتمي إلى الفصيلة البقولية ‪ ،Fabaceae‬ويحتل‬ ‫يعد ُ‬ ‫المرتبة الثالثة عالميا من حيث األهمية بعد الفاصولياء والبازالء (‪ ،(FAOSTAT, 2015‬تستهلك أوراقه‬ ‫وبذوره وقرونه بشكل خام أو بشكل مطبوخ‪ ،‬ويعد أحد المصادر المهمة والغنية بالبروتين ‪ ،%25‬واأللياف‪،‬‬ ‫ومصدر جيد للكربوهيدرات ‪ ،% 67.7-48.2‬والنشاء ‪ %50-41‬والدهون ‪ ،% 6‬والعناصر المعدنية‬ ‫)‪ .(Geervani and Umadevi 1989‬يزرع الحمص في العديد من المناطق المعتدلة وشبه االستوائية‬ ‫)‪ .(Mansfeld, 2008‬فيما يقارب ‪ 50‬بلدا حول العالم‪ ،‬وتنتج الهند بمفردها ‪ %70‬من اإلنتاج العالمي‪،‬‬ ‫بينما ال يتجأوز إنتاج سورية ‪ %1‬رغم أنها من الدول العشر األوائل المنتجة للحمص في العالم (الشكل‬ ‫الحمص في البلدان المنتجة له مابين غلة منخفضة نسبيا تتراوح بين ‪ 600 – 500‬كغ‪/‬هـ‬ ‫‪ .)1‬تتباين غلة ُ‬ ‫في كل من‪ :‬إيران‪ ،‬وماالوي‪ ،‬والمغرب‪ ،‬وباكستان‪ ،‬وسورية‪ .‬وبين غلة مرتفعة نسبيا في كل من‪ :‬إثيوبيا‪،‬‬ ‫والمكسيك‪ ،‬بينما تحافظ الهند على غلة ثابتة تقدر وسطيا بحوالي ‪ 900‬كغ‪/‬هـ‪ ،‬ويعود ارتفاع الغلة في‬ ‫المكسيك كونه يزرع في الغالب مرويا وينمو خالل فصل الشتاء البارد ‪(Muehlbauer and Sarker,‬‬ ‫)‪.2017‬‬ ‫الحمص ليس فقط من استخدامه كغذاء لإلنسان )‪ ،(Malik et al., 2011‬أو كعلف‬ ‫تأتي أهمية ُ‬ ‫للحيوانات‪ ،‬ولكن أيضا من كونه يسهم في تثبيت اآلزوت الجوي‪ ،‬مما يساعد على إدارة خصوبة التربة ال‬ ‫الحمص في عروتين‪ :‬ربيعية خالل شهري شباط‬ ‫سيما في األراضي الجافة )‪ .)Islam et al., 2011‬يزرع ُ‬ ‫وآذار بمعدل ‪ 80-50‬كغ‪/‬هكتار‪ ،‬وشتوية في أوائل كانون الثاني بمعدل بذار ‪120 -100‬كغ‪/‬هكتار‬ ‫)‪ .(Mazid, et al., 2009‬اعتمدت في‬ ‫الحمص‬ ‫سورية خمسة أصناف من‬ ‫ُ‬ ‫للزراعة الشتوية‪ :‬غاب‪ ،1‬غاب‪ ،2‬غاب‪،3‬‬ ‫غاب‪ ،4‬غاب ‪ .5‬استبعد الصنفان غاب ‪1‬‬ ‫وغاب‪2‬‬ ‫من الخطة الزراعية وذلك‬ ‫لقابليتهما لإلصابة بلفحة األسكوكيتا بينما‬ ‫يزرع الصنف البلدي في الزراعة الربيعية‬ ‫الحمص‬ ‫)‪ .(Mazid, et al., 2009‬يزرع ُ‬ ‫في سورية بعال ومرويا تبعا للظروف‬ ‫المناخية السائدة ومدى توافر مياه الري‬ ‫في كل من محافظات‪ :‬الحسكة‪ ،‬وحلب‪،‬‬ ‫الشكل ‪ .1‬الدول العشر األوائل المنتجة للحمص في العالم‬ ‫وادلب‪ ،‬وحماه‪ ،‬وحمص‪ ،‬والسويداء‪ ،‬وبمساحات صغيرة جدا ال تكاد تذكر في باقي المحافظات (المجموعة‬ ‫‪2‬‬ ‫الحمص إلى نمطين‪ :‬كابولي ‪ Kabuli‬بذوره كبيرة الحجم كروية‪،‬‬ ‫اإلحصائية السورية لعام ‪ .)2009‬يقسم ُ‬ ‫سطحها أملس‪ ،‬وغالف البذرة ذو لون كريمي‪ ،‬ينمو هذا النوع في المناطق المعتدلة‪ ،‬ويزرع في منطقة‬ ‫البحر المتوسط‪ ،‬وغرب آسيا‪ ،‬وشمال أفريقية‪ ،‬وأستراليا‪ ،‬وشمال أمريكا‪ .‬النمط الثاني ديزي ‪ Desi‬بذوره‬ ‫صغيرة الحجم زأوية الشكل‪ ،‬سطحها خشن‪ ،‬ولون غالف البذرة يتدرج من األصفر إلى األسود ( ‪Malhotra‬‬ ‫‪.)et al,1987‬‬ ‫الحمص من المحاصيل الحولية ثنائية الصيغة الصبغية (‪ )16 = 2n‬صبغيا‪ ،‬ويبلغ حجم المجين‬ ‫نبات ُ‬ ‫‪ Genome‬فيه ‪ 738‬ميغا زوج نكليوتيدي )‪(Arumuganathan and Earle, 1991) ،Mega base pairs (Mbp‬‬ ‫وهو من المحاصيل ذاتية التلقيح‪ ،‬حيث ال تتجاوز نسبة التلقيح الخلطي فيه ‪.%1-0‬‬ ‫يشير مصطلح الهندسة الوراثية ‪ ،Genetic engineering‬أو الـ ‪ DNA‬المؤشب ‪ recombinant DNA‬أو‬ ‫التحوير الوراثي ‪ transformation‬إلى تقنية يمكن من خاللها نقل مورثات من كائنات مانحة لها إلى‬ ‫النبات المستقبل (‪ ،)Gold, 2003‬وبذلك يمكن استخدامها في معالجة المادة الوراثية في الخلية إلنتاج‬ ‫صفات جديدة في الكائن الحي الذي نقلت إليه‪ .‬وتتميز هذه التقنية بالقدرة على نقل مورثات من أي كائن‬ ‫حي كالنباتات أو الجراثيم أو غيرها ومن ثم إدخالها في النبات المراد تحسين صفاته ( ‪Azhaguvel et al.,‬‬ ‫‪ .)2006‬يمكن من خالل الهندسة الوراثية نقل مورثات تعزز من قدرة النبات على مقاومة الممرضات التي‬ ‫تصعب مكافحتها بالطرائق المتاحة حاليا‪ ،‬وبذلك تساعد على زيادة غلة المحصول (‪.)Amalu, 2004‬‬ ‫ماتزال النباتات ال ُمعدلة وراثيا المقاومة ألمراض النبات قليلة نسبيا‪ ،‬حيث ال تتجاوز المساحة المزروعة بها‬ ‫‪ %2‬من إجمالي المساحة الكلية المزروعة بهذه النباتات (‪ .)Gold, 2003‬بالرغم من ذلك فقد أظهرت عدة‬ ‫دراسات نتائج إيجابية فيما يتعلق بتطوير نباتات معدلة وراثيا مقاومة لألمراض الفطرية ‪(Yang, et al.,‬‬ ‫)‪.2009‬‬ ‫ُ‬ ‫ثاني ا‪ -‬الدراسة المرجعية‬ ‫الح ّمص‪:‬‬ ‫‪ .1-2‬لفحة السكوكيتا على ُ‬ ‫الحمص في الكثير من دول العالم‪،‬‬ ‫يعد مرض لفحة األسكوكيتا من أكثر األمراض خطورة على نبات ُ‬ ‫الحمص (‪ .)Hamza et al., 2000‬سجل المرض في ‪ 34‬دولة ضمن‬ ‫وينتشر هذا المرض في أماكن زارعة ُ‬ ‫‪ 6‬قارات مثل‪ :‬بلدان شبه القارة الهندية‪ ،‬وبلدان غرب آسيا‪ ،‬وشمال أفريقية‪ ،‬وأوروبا‪ ،‬والواليات المتحدة‬ ‫األمريكية وأستراليا‪ ،‬وكندا‪ ،‬ويمكن أن ينتشر في بلدان غير موجود فيها حتى اآلن‪.‬‬ ‫المسبب المرضي هو فطر )‪ Ascochyta rabiei (Pass.‬من رتبة ‪ Sphaeropsidales‬وفصيلة‬ ‫‪ ،Sphaerioidaceae‬طوره الجنسي )‪ Didymella rabiei )Kovatsch.‬من رتبة ‪ Dothidiales‬وفصيلة‬ ‫‪.)Udupa and Weigand, 1997( Botryosphaeriaceae‬‬ ‫‪3‬‬ ‫تخرج األبواغ الكونيدية في الظروف الرطبة في هالمة مخاطية تتوضع على فويهة الوعاء البكنيدي‪ ،‬ثم‬ ‫تذوب بقطيرات المطر‪ ،‬وتنتشر بالرياح المصاحبة لقطيرات المطر إلى مسافات متباينة قد تصل إلى عدة‬ ‫أمتار في الزراعة الربيعية‪ ،‬والى مئات األمتار في الزراعة الشتوية ‪(Armstrong et al., 2001; Kaiser,‬‬ ‫)‪.1997‬‬ ‫ويسبب هذا المرض خسائر كبيرة تصل أحيانا إلى ‪ %100‬عند توافر الظروف البيئية المالئمة‪ .‬تتعلق شدة‬ ‫الخسائر الناتجة عن لفحة األسكوكيتا بثالثة عوامل هي‪ :‬الظروف البيئية‪ ،‬ودرجة قابلية الصنف لإلصابة‪،‬‬ ‫وشراسة الممرض )‪ .) Khan et al., 1999‬تصاب كل األجزاء الهوائية بالمرض خالل أي مرحلة من‬ ‫مراحل النمو )‪ .(Khan et al.,1999‬تبدأ اإلصابة في الحقل بشكل بؤر صغيرة‪ ،‬وينتشر المرض حتى يعم‬ ‫جميع نباتات الحقل عند توافر الظروف‬ ‫الجوية المناسبة‪ .‬تظهر على الوريقات‬ ‫والقرون بقع دائرية بنية اللون ومحاطة‬ ‫غالبا بحافة بنية ُمحمرة‪ .‬تظهر على‬ ‫البقع إثمارات الفطر على هيئة نقط‬ ‫سوداء (أوعية بكنيدية)‪ ،‬تتوضع في‬ ‫دوائر متداخلة وقد تظهر مثل هذه البقع‬ ‫على البذور أيضا إذا أصيبت القرون‬ ‫(الشكل ‪ .(2‬أماعلى الساق والفروع‬ ‫فتكون البقع بنية متطاولة (‪ 4 -3‬سم)‬ ‫تتطور عليها األوعية البكنيدية‪ ،‬وقد‬ ‫تحيط بالجزء المصاب مسببة موت‬ ‫الجزء الواقع فوقها‪ ،‬واذا ظهرت هذه‬ ‫البقع على الساق األصلي في منطقة‬ ‫الشكل ‪ .2‬أعراض اإلصابة بلفحة األسكوكيتا على األجزاء‬ ‫الحمص‪.‬‬ ‫المختلفة من نبات ُ‬ ‫التاج يموت النبات كامال أو ينكسر بفعل الرياح )‪ .(Kaiser,1997; Reddy and Singh, 1990‬تتراوح درجة‬ ‫الح اررة المالئمة النتشار المرض بين ‪º 25-20‬س بوجود رطوبة نسبية تتراوح بين ‪ %95-85‬شريطة أن‬ ‫ررة أقل من ‪º 6‬س‪ ،‬أو أعلى من ‪30‬‬ ‫تبقى هذه الرطوبة مدة ‪ 48‬ساعة‪ ،‬وال تحدث اإلصابة عند درجات ح ا‬ ‫‪º‬س (‪.)Pande et al , 2005‬‬ ‫‪4‬‬ ‫تسود الظروف المالئمة النتشار الفطر في سورية خالل‬ ‫شهر آذار‪ ،‬وعليه فإن الزراعات المبكرة (العروة الشتوية)‬ ‫هي التي تصاب بشدة‪ ،‬بينما قد تنجو الزراعات الربيعية‬ ‫المتأخرة من اإلصابة بالمرض‪ ،‬كما تسهم األمطار‬ ‫الربيعية المتأخرة في زيادة اإلصابة وانتشارها بشكل‬ ‫كبير لتصبح وبائية‪. (Saxena and Singh, 1984)،‬‬ ‫تتألف دورة حياة الفطر ‪ A. rabiei‬من طورين‪ :‬جنسي‪،‬‬ ‫وال جنسي‪ ،‬يتمثل الطور الالجنسي بتشكيل إثمارات‬ ‫سوداء تدعى األوعية البكنيدية ‪ ،Pycnidia‬تتشكل‬ ‫بداخلها أبواغ كونيدية‪ ،‬تتطور على حوامل كونيدية‬ ‫قصيرة‪ ،‬األبواغ الكونيدية إهليلجية الشكل إلى مستقيمة‬ ‫أو منحنية من طرف واحد أو من كال الطرفين‪ ،‬شفافة‬ ‫الشكل ‪ .3‬األبواغ الكونيدية لفطر‬ ‫األسكوكيتا على الحمص ‪Ascochyta‬‬ ‫‪rabiei‬‬ ‫أحادية الخلية وأحيانا ثنائية (الشكل ‪ (3‬أبعادها (‪ )12-6( × )6-4‬ميكرون (‪ .)Saxena et al.,1984‬قد‬ ‫يتشكل الطور الجنسي لهذا المرض ‪ Didymella rabiei‬في أجسام ثمرية كاذبة من نوع ‪Pseudothecia‬‬ ‫الحمص المصابة طبيعيا‪ ،‬وتتكون بداخلها الزقاق واألبواغ الزقية (الشكل ‪.)4‬‬ ‫على بقايا نباتات ُ‬ ‫اكتشف الطور الجنسي ألول مرة في بقايا المحصول في جنوب بلغاريا )‪ ، (Kovacheski, 1936‬أما في‬ ‫سورية فقد تم تسجيله ألول مرة في عام ‪ 1987‬على بقايا النباتات المصابة )‪.(Haware, 1987‬‬ ‫للممرض عدة دورات ال جنسية خالل موسم نمو المحصول )‪ .(Kaiser, 1997‬تسهم األبواغ الزقية المنقولة‬ ‫بوساطة الرياح بدور مهم كلقاح ُم ْعد أولي‪ ،‬إذ يعتقد أنها تؤدي إلى انتشار المرض بشكل وبائي في‬ ‫الحقول على بعد يصل حتى ‪ 15‬كم من مصدر العدوى‪ .‬كما تسهم األبواغ الزقية بدور في حفظ حيوية‬ ‫الفطر من موسم لآلخر على بقايا المحصول‪ (Armstrong et al., 2001) .‬ويعتقد أن الطور الجنسي يسهم‬ ‫بدور في زيادة التنوع الوراثي في الكائن الممرض مما يؤدي إلى ظهور سالالت جديدة أكثر شراسة تكون‬ ‫الحمص المعتمدة‪ .‬حددت عزالت جمعت من سورية ولبنان عام ‪،1983‬‬ ‫قادرة على كسر مقاومة أصناف ُ‬ ‫الحمص ‪Reddy and‬‬ ‫وصنفت في ست سالالت تبعا لشراستها وذلك باستخدام ‪18‬صنفا تفريقيا من ُ‬ ‫) ‪.)Kabbabeh, 1985‬‬ ‫أعيد تصنيف ‪ 53‬عزلة جمعت من مناطق مختلفة من سورية (بما فيها السالالت الست السابقة)‪،‬‬ ‫فوضعت في ثالثة أنماط مرضية (‪ ،)Pathotypes‬فكان النمط ‪ 1‬هو األقل شراسة‪ ،‬والنمط الممرض ‪ 3‬هو‬ ‫األكثر شراسة‪ ،‬وذلك اعتمادا على رد فعل ثالثة أصناف تفريقية‪ ،‬وعلى بعض المؤشرات الجزيئية‬ ‫)‪ (Udupa et al., 1998‬ثم سجل )‪ (Bayaa et al. 2004‬العزالت األكثر شراسة من هذا الفطر‪ ،‬وذلك عندما‬ ‫‪5‬‬ ‫تمكنت عزالت من مناطق مختلفة في سورية من كسر مقاومة الصنفين التفريقيين ‪ ICC-12004‬و ‪ICC-‬‬ ‫‪ 3996‬المقاومين للنمط الممرض ‪ ،3‬ثم سجل رسميا كنمط ممرض رابع ‪ Pathotype-4‬األكثر شراسة من‬ ‫الفطر ‪ D .rabiei‬في سورية )‪. (Imtiaz et al., 2011‬‬ ‫الحمص‬ ‫الشكل ‪ .4‬دورة حياة الفطر ‪ Ascochyta rabiei‬على ُ‬ ‫الح ّمص‬ ‫‪ .2-2‬اإلدارة المتكاملة لمرض لفحة السكوكيتا على ُ‬ ‫‪ .1-2-2‬التربية التقليدية‪:‬‬ ‫تعد تربية أصناف مقاومة لمرض لفحة األسكوكيتا موضوعا معقدا نظ ار لوجود مجال واسع من مصادر‬ ‫المقاومة المختلفة التي تمتلك مورثات مقاومة مختلفة‪ .‬إن إدخال مورثات المقاومة بشكل كمي وتراكمي في‬ ‫األصناف المعتمدة يسهم في الوصول إلى مستوى جيد من المقاومة‪ ،‬والحفاظ على استمرارها وثباتها (‬ ‫‪.)Muehlbauer and Chen, 2007‬‬ ‫أشارت دراسات وراثية أجريت من قبل )‪ (Tewari and Pandy 1986‬إلى وجود ثالثة مورثات سائدة‬ ‫الحمص (‪ ،)P1215-1, EC 26446 and pg 82-1‬ومورثة‬ ‫منعزلة بشكل مستقل موجودة في بعض طرز ُ‬ ‫متنحية عند الطراز ‪ .BRG 8‬وأشارت دراسات أخرى إلى أن آلية توريث المقاومة لألسكوكيتا تعود لوجود‬ ‫‪6‬‬ ‫عدة مواقع للصفات الكمية أيضا)‪ Quantitative trait loci (QTL‬تتحكم بهذه الصفة ( ‪Flandez- Galvez‬‬ ‫الحمص لمرض لفحة األسكوكيتا يتحكم‬ ‫‪ .)et al., 2003‬كما أشارت بعض الدراسات أن المقاومة في نبات ُ‬ ‫بها مورثة سائدة وحيدة أو مورثة متنحية (‪.)Singh and Reddy,1991‬‬ ‫تزوج‬ ‫أشارت نتائج دراسة االنعزال ضمن عشيرة ‪ population‬مكونة من سالالت مؤشبة ناتجة عن ا‬ ‫األقارب )‪ Recombinant inbred lines (RILs‬إلى وجود ثالثة مورثات رئيسة متنحية ومتكاملة‪ ،‬إضافة‬ ‫الحمص لمرض لفحة األسكوكيتا‪ .‬ففي حال‬ ‫إلى عدد من المورثات الثانوية كلها مسؤولة عن مقاومة طرز ُ‬ ‫غياب واحدة أو اثنتين من المورثات الرئيسة يكون النبات قابال لإلصابة‪ ،‬إال أن وجود المورثات الثانوية‬ ‫يحدد درجة مقاومة الطراز الوراثي‪.‬‬ ‫‪ .2-2-2‬الممارسات الزراعية‪:‬‬ ‫في الواقع ال بد من القيام بسلسلة من العمليات الزراعية لمؤازرة المكافحة المتاحة بالطرائق الوراثية‬ ‫وتعزيزها‪ .‬تشمل الطرائق الزراعية إزالة البقايا النباتية المصابة وحرقها أو قلبها في التربة‪ ،‬وزراعة البذار‬ ‫السليم‪ .‬كما تشمل اتباع دورة زراعية رباعية على األقل‪ ،‬والزراعة في حقول بعيدة عن حقل كان قد ُزرع‬ ‫الحمص‪ ،‬وبخاصة إذا كان المرض موجودا في تلك المنطقة في السنوات السابقة‬ ‫في السنة السابقة ب ُ‬ ‫(‪.)Kaiser et al., 2000‬‬ ‫‪ .3-2-2‬المكافحة الكيميائية‪:‬‬ ‫اختبرت العديد من المبيدات الفطرية إزاء مرض لفحة األسكوكيتا وأظهرت نتائج مختلفة‪ ،‬ومن هذه‬ ‫المبيدات‪ :‬مانكوزيب ‪ ,mancozeb‬مانيب ‪ , maneb‬ميتيرام ‪ ، metiram‬كلوروثالونيل ‪،chlorothalonil‬‬ ‫كابتافول ‪،captafol‬و زينيب ‪ zineb‬ولكنها تستخدم وقائيا قبل حدوث المرض ( ‪.)Mcmurray et al .2006‬‬ ‫يعد مبيد كلوروثالونيل من أكثر المبيدات الفطرية التي استخدمت لمكافحة لفحة األسكوكيتا وهو موجود‬ ‫تحت أسماء تجارية مختلفة منها‪ :‬برافو ‪ ،Bravo‬وكلور توسيب ‪ ،Chlor tucip‬كما تعد بعض المبيدات‬ ‫الفطرية الجهازية مثل‪ :‬بينوميل ‪ ,benomyl‬وثيابندازول ‪ ، thiabendazole‬وتيبوكونازول ‪،tebuconazole‬‬ ‫وأزوكسي ستروبين ‪ ،azoxystrobin‬وكاربندازيم ‪ carbendazim,‬فاعلة في مكافحة هذا المرض‬ ‫)‪ .)Demirci et al., 2003‬تتسم هذه المبيدات بخاصية حيث يمكن استخدامها بعد ثالثة أيام من حدوث‬ ‫اإلصابة أو بعد األمطار‪ ،‬فاستخدامها بعد حدوث اإلصابة الحقيقية يخفف من استخدام المبيدات بشكل‬ ‫أكبر من المبيدات الوقائية التي تعتمد على التنبؤ بالمرض (‪ ،)Davidson and Kimber, 2007‬باإلضافة‬ ‫إلى معاملة البذور بالمطهرات الفطرية مثل‪ :‬المبيد ثيابندازول ‪ ، thiabendazole‬و)‪)Thiram+carboxine‬‬ ‫فيتافكس ‪.vitavax‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪ .4-2-2‬المكافحة الحيائية‪:‬‬ ‫أشارت دراسة أجريت من قبل (‪ )Bajwa et al., 2008‬إلى أن استخدام تراكيز منخفضة ‪ %2-1‬من‬ ‫المستخلصات المائية والكحولية لنبات الداتو ار يؤدي إلى تثبيط نمو مستعمرة الفطر ‪ D. rabiei‬بنسبة ‪-23‬‬ ‫‪.%40‬‬ ‫‪ .5 -2-2‬المقاومة الجهازية المكتسبة‪:‬‬ ‫تُعرف المقاومة الجهازية المكتسبة (‪ Systemic acquired resistance )SAR‬بأنها نظام يستحث أنسجة‬ ‫النبات (على الرغم من غياب مورثات المقاومة) بوساطة الكائنات الممرضة أو بمحرضات كيميائية‪،‬‬ ‫فتتولد إشارة ‪ Signal‬لم تعرف طبيعتها حتى اآلن‪ ،‬تنتقل هذه اإلشارة جهازيا إلى جميع أنسجة النبات فتولد‬ ‫فيها مقاومة ذاتية إزاء الكائن المهاجم )‪.(Oostendorp et al., 2001‬‬ ‫أشارت بعض الدراسات إلى أن معاملة النبات بحمض السالسليك وفوسفات البوتاسيوم الثنائية أدت إلى‬ ‫زيادة معنوية في تركيز البيروكسيداز والفينوالت كمؤشر على تحريض المقاومة الجهازية المكتسبة‬ ‫وتخفيض اإلصابة بلفحة األسكوكيتا)‪ .(Chaudhry et al., 2001‬في دراسة أخرى قام بها ( ‪Atik et al.,‬‬ ‫الحمص ظهر‬ ‫‪ )2012‬لدراسة تأثير معامالت مختلفة من مركبات البيون في لفحة األسكوكيتا على ُ‬ ‫تحريض المقاومة الجهازية المكتسبة‪ ،‬وخفضت من اإلصابة بنسبة وصلت حتى ‪ %49‬وذلك بطريقة الرش‬ ‫الورقي للباذرات‪ .‬وقد عزي هذا التأثير لمركب البيون إلى طبيعته الجهازية‪ ،‬وقدرته على االنتقال داخل‬ ‫النبات‪ ،‬وتحريضه على تشكيل بروتينات دفاعية (‪ )PRs‬لها صفة المقاومة ألمراض النبات مثل‪:‬‬ ‫الغلوكوناز (‪ ،)PR2‬والكيتيناز (‪ )PR3‬التي أثبتت دو ار في تثبيط نمو الكائن الممرض بصورة أو بأخرى‬ ‫)‪.)Louws et al.,2001( (Cortes-Barco et al.,2010‬‬ ‫‪ .3-2‬استراتيجيات مقاومة المراض الفطرية عن طريق الهندسة الوراثية‪:‬‬ ‫استخدمت عدة استراتيجات لتطوير نباتات ُمعدلة وراثيا مقاومة ألمراض النبات يمكن جمعها في الفئات‬ ‫التالية‪:‬‬ ‫‪ .1-3-2‬البروتينات المرتبطة بالقدرة اإلمراضية ‪Pathogenesis-related (PR) proteins‬‬ ‫تعد البروتينات المرتبطة بالقدرة اإلمراضية ‪ Pathogenesis-related(PR)proteins‬من المصادر المهمة‬ ‫والمرشحة الستخدامها في مقاومة األمراض الفطرية على النبات‪ ،‬حيث أظهرت أبحاث ‪(Van Loon and‬‬ ‫)‪ van Strein, 1999‬أن نبات التبغ أنتج مثل هذه البروتينات وذلك بعد إعدائه بفيروس موزاييك التبغ‪،‬‬ ‫حيث يحتوي النبات العائل على العديد من البروتينات المرتبطة بالقدرة اإلمراضية والتي يمكن استخدامها‬ ‫‪8‬‬ ‫في مقاومة األمراض الفطرية‪ .‬هذه البروتينات ال يتم تحفيزها عن طريق الممرض فقط‪ ،‬إنما أيضا بوساطة‬ ‫الجروح‪ ،‬وجدار الخلية‪ ،‬واإليثلين‪ ،‬واألشعة فوق البنفسجية‪ ،‬والمعادن الثقيلة‪ ،‬والمحرضات‪ .‬كما يتم‬ ‫تحريضها كاستجابة لفرط الحساسية)‪ ،Hypersensitivity (HR‬وأيضا أثناء المقاومة الجهازية‬ ‫المكتسبة )‪ ،systemic acquired resistance (SAR‬ولذلك ساد اعتقاد بأن يكون لها دور في آليات الدفاع‬ ‫الطبيعية أو المقاومة في النباتات‪ .‬هناك نوع أخر من البروتينات تسهم بدور مباشر في الدفاع ضد‬ ‫الممرض من خالل مهاجمة وتفكيك مكونات جدار الخلية الفطرية مثل‪ :‬بروتينات ‪ ،osmotin‬و‪thaumatin‬‬ ‫)‪ ،like proteins (TLP‬وبروتينات أخرى تم نقلها إلى المحاصيل المختلفة من خالل الهندسة الوراثية‪.‬‬ ‫أظهر التعبير الوراثي لبروتين ‪ Thaumatin‬في النبات كاستجابة لمجموعة من اإلجهادات‪ ،‬نشاطا‬ ‫مضادا في المختبر ضد عدد من مسببات األمراض‪ ،‬بما في ذلك‪،Rhizoctonia ، Fusarium،Botrytis :‬‬ ‫‪ .)Koiwa et al.,1997) Sclerotinia‬كما أظهر البروتين ‪ osmotin‬نشاطا مضادا لفطر اللفحة المتأخرة‬ ‫على البطاطا‪ ،‬حيث أدى إلى تأخر ظهور أعراض المرض)‪. (Florack and Stiekema, 1994‬‬ ‫‪ .2-3-2‬البروتينات المضادة للفطور ‪Antifungal proteins‬‬ ‫أدى إدخال المورثة كيتيناز ‪ Chitinase‬في نباتات التبغ واألرز إلى تعزيز مقاومة الفطور عند هذه‬ ‫النباتات (‪ .)Lee and Raikel, 1995; Nishizawa et al., 1999‬يعمل أنزيم الكيتيناز على تحطيم المكونات‬ ‫األساسية لجدار الخلية الفطرية‪ ،‬إال أن الحصول على التعبير الوراثي المشترك لمورثة كيتيناز وغلوكوناز‬ ‫في نباتات التبغ والبندورة منح مستوى أعلى من المقاومة فيما لو استخدمت كل مورثة على حده‪ .‬كما أن‬ ‫استخدام المورثات المثبطة للريبوزومات النباتية (‪ ribosome-inactivating proteins )RIP‬مع مورثة‬ ‫الكيتيناز أعطى تأثي ار أعلى في المقاومة للفطور‪ .‬كذلك أظهرت نباتات التبغ المعدلة وراثيا التي تحوي‬ ‫مورثة الليزوزيم البشري مقاومة عالية للفطر ‪ ،Erysiphe cichoracearum‬حيث أدت إلى تخفيض تشكيل‬ ‫األبواغ الكونيدية ونمو الفطر‪ ،‬وتخفيض حجم المستعمرة (‪.)Nakajima et al., 1997‬‬ ‫‪ .3-3-2‬الفيتوالكسينات ‪Phytoalexins‬‬ ‫الفيتوالكسينات هي مركبات منخفضة الوزن الجزيئي‪ ،‬تمتلك خصائص مضادة لألحياء الدقيقة‪ ،‬وقد‬ ‫طورت لمقاومة مسببات أمراض النبات الفطرية والبكتيرية (‪ .)Leckband and Lorz, 1998‬تسهم أنواع‬ ‫األوكسجين الفعالة )‪ Active oxygen species (AOS‬وبيروكسيد الهيدروجين بدور مهم في مقاومة النبات‬ ‫لمسببات األمراض الفطرية‪ .‬أدى التعبير الوراثي للمورثة غلوكوز أوكسيديز ‪ glucose oxidase‬في نبات‬ ‫البطاطا ال ُمعدلة وراثيا بهذه المورثة إلى إفراز مستويات عالية من البيروكسيد ‪ ، H2O2‬والتي أدت بدورها‬ ‫إلى تعزيز مستويات المقاومة عند النبات تجاه الممرضات الفطرية والبكتيرية على حد سواء‪ ،‬وبشكل‬ ‫خاص الممرض ‪ .)Wu et al., 1995( Verticillium‬استخدمت أيضا المورثة ‪vitis stilbene synthase‬‬ ‫)‪ (vst‬المعزولة من الكرمة في زيادة مقاومة نباتات الشعير )‪ ،(Leckband and Lorz, 1998‬والكرمة‬ ‫‪9‬‬ ‫)‪ (Dabauza et al., 2015‬للفطر ‪ Botrytis cinerea‬المسبب للعفن الرمادي‪ ،‬كما نقلت المورثة ‪ vst-1‬إلى‬ ‫الحمص والعدس بهدف زيادة مقاومتهما للممرضات النباتية ( ‪.)Khatib,2008‬‬ ‫محصولي ُ‬ ‫‪ .4-3-2‬البروتينات المضادة لألحياء الدقيقة ‪Antimicrobial Proteins‬‬ ‫استخدمت البروتينات المضادة للجراثيم في نبات الجيرانيوم للحد من تطور الفطر‪Bi ( Botrytis cinerea‬‬ ‫‪ ،)et al., 1999‬وقد تم تصنيع الببتيدات المضادة للجراثيم في المختبر بطول (‪ 20-10‬حمض أميني)‬ ‫وذلك الستخدامها لمقاومة الفطور)‪ ،)Cary et al., 2000‬كما استخدم التعبير الوراثي للثيوينن ‪ thionins‬في‬ ‫النباتات المعدلة وراثيا للحد من تطور العديد من مسببات األمراض المختلفة ‪Alternaria, Fusarium‬‬ ‫ُ‬ ‫‪ ،Plasmodiophora,‬وأمن مقاومة تجاه مرض الذبول الفيرتسليومي ‪ Verticillium‬على البطاطا تحت‬ ‫الظروف الحقلية )‪.(Gao et al., 2000‬‬ ‫‪.5-3-2‬‬ ‫البروتينات والببتيدات المثبطة للريبوزومات النباتية ‪Plant ribosome-inactivating‬‬ ‫‪proteins and other peptides‬‬ ‫وهي عبارة عن أنزيمات نباتية تمتلك نشاط ‪28S r RNA N-glycosidase‬‬ ‫بفضل خصائصها يمكن أن‬ ‫تعطل ريبوزومات من النوع نفسه أو من أنواع متباعدة مما يؤدي إلى توقف اصطناع البروتينات‪ .‬كما‬ ‫تقوم بتعطيل الريبوزومات الرئيسة في األنواع بعيدة الصلة وحقيقيات النوى األخرى بما في ذلك الفطور‪.‬‬ ‫استخدمت هذه البروتينات المثبطة مخبريا بشكل نقي من نبات الشعير ومنعت نمو العديد من الفطور‪ .‬في‬ ‫دراسة أخرى أظهر التعبير الجيني للبروتينات المثبطة في نبات التبغ التي تشفر للحمض النووي للشعير‬ ‫مقاومة أفضل لفطر ‪ ،(Logemann et al., 1993) R. solani‬كما تحسنت مستويات المقاومة عند استخدام‬ ‫البروتينات المثبطة مع البروتينات المرتبطة بالممرض ‪ PR3-PR2‬للفطر نفسه‪ ،‬أيضا استخدمت الببتيدات‬ ‫الموجبة ‪ )melittin) cecropin‬وأعطت نشاطا واسع الطيف ضد العديد من الممرضات الفطرية ‪Osusky‬‬ ‫)‪ ،)et al., 2000‬وعند استخدام هذا النوع من الببتيدات في نبات البطاطا أبدت مقاومة ضد عدد من‬ ‫مسببات األمراض الفطرية مثل‪ ،Colletotrichum, Fusarium, Phytophthora :‬حيث تعمل هذه‬ ‫الببتيدات على تحلل الخيوط الفطرية‪ ،‬وتمنع تشكل جدار الخلية أو إضعاف تكوينه‪ .‬إن القدرة على تركيب‬ ‫ببتيدات‪ ،‬وتصنيعها مخبريا‪ ،‬ودمجها يمكن أن يوفر فرصا إضافية لمقاومة مجموعة من مسببات األمراض‬ ‫في وقت واحد (‪ .)Dhekney et al., 2007‬أظهر الببتيد ‪ MsrA2‬مقاومة لمرض لفحة السنابل الفيو ازريومي‬ ‫)‪ Fusarium head blight (FHB‬على القمح والشعير الذي يسببه الفطر ‪ .Fusarium graminearum‬تم‬ ‫إدخال مورثات التريكوثيسينات ‪ Trichothecenes‬لنبات القمح بهدف زيادة آلية دفاع النبات تجاه الفطر‬ ‫المسبب للفحة سنابل القمح )‪ ،(FHB‬وتقليل أو منع اإلصابة األولية (‪.)Osusky, 2004‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪ .6-3-2‬مورثات المقاومة ‪: Resistance genes‬‬ ‫أظهرت نتائج استنساخ منتجات مورثات المقاومة )‪ resistance genes (R-genes‬من نباتات‪ :‬البندورة‪،‬‬ ‫والتبغ‪ ،‬واألرز‪ ،‬والكتان‪ ،‬واألرابيدوبسيس‪ ،‬والعديد من األنواع النباتية األخرى أنها تشترك بواحدة أوأكثر من‬ ‫التك ار ارت (الموتيف ‪ :)motif‬نطاق السيرين ‪ ،serine‬أو ثريونين كيناز‪ ،threonine kinase‬أو مواقع ارتباط‬ ‫النوكليوتيدات‪ ،‬أو ليوسين‪ ،‬أو تكرار منطقة ليوسين التي يمكن أن تسهم في إمكانية التعرف المتخصص‬ ‫(‪ .)Takken and Joosten, 2000‬تعمل مورثات المقاومة النباتية كمستقبالت لمنتجات مورثات عدم‬ ‫الشراسة للممرض ‪ ،pathogen’s avirulence (AVR) gene‬وبوجود عوامل تنظيم المقاومة مثل ‪ ،RAR1:‬و‬ ‫‪ SGT1‬فإنها تؤدي إلى شكل من أشكال موت الخاليا يعرف باسم فرط الحساسية ‪Hypersensitivity‬‬ ‫)‪ .)Rowland et al., 2005( (HR‬عزلت مورثات الشراسة ‪ AVR‬من فطور البياض الدقيقي كممثل عن‬ ‫المجموعة الرئيسة الثالثة للطفيليات إجبارية التطفل )‪ .)Ridout et al., 2006‬أشارت النتائج إلى أن الفطر‬ ‫لديه ذخيرة كبيرة من مورثات عدم الشراسة ‪ AVR‬التي يمكن أن تكون بمنزلة مؤثرات مساهمة في شراسة‬ ‫الطفيل‪ .‬نسخ متعددة من مورثات عدم الشراسة المتمايزة ذات الصلة التي تُمكن مورثات الشراسة بالتغلب‬ ‫على مورثات المضيف مع الحفاظ على وحدتها‪ .‬مزيج من عدة مورثات متفاعلة مماثلة لفعل البروتينات‬ ‫المضادة للفطور يمكن أن تساعد على فهم أكثر لمورثات الشراسة ووظيفتها‪ ،‬وبالتالي إمكانية تعديل‬ ‫المجاالت الوظيفية في المستقبل للتكيف مع هذه المورثات الستخدامها في توفير مقاومة واسعة الطيف‬ ‫لألمراض في النباتات ال ُمعدلة وراثيا )‪.(Dempsey et al., 1998‬‬ ‫‪ .7-3-2‬تفكك نواتج الستقالب السامة ‪:Degradation of Phytotoxic metabolites‬‬ ‫يعمل جدار الخلية النباتية كحاجز ضد اختراق مسببات األمراض الفطرية التي طورت عدة إستراتيجيات‬ ‫للتغلب على جدر الخاليا (‪ .(Walton., 1994‬تفرز الفطور النباتية مركبات سامة مثل‪ :‬السموم الفطرية‪،‬‬ ‫وحمض األكساليك التي تسهل إصابة أنسجة المضيف وبالتالي موت الخاليا‪ .‬إذا استطعنا تفكيك هذه‬ ‫المركبات التي تفرزها الفطور بوساطة األنزيمات وتعبيرها الوراثي في النباتات ال ُمعدلة وراثيا األمر الذي‬ ‫يوفر فرصة لزيادة مقاومة األمراض الفطرية‪ .‬مثال على ذلك‪ ،‬الحصول على تعبير أنزيم ‪trichothecene‬‬ ‫في نباتات التبغ المعدلة وراثيا‪ ،‬حيث عمل هذا األنزيم على تفكيك مفرزات الفطر‬ ‫‪Fusarium‬‬ ‫‪ ،sporotrichioides‬وخفض الضرر على النسيج النباتي‪ ،‬وحفز وجود ‪ trichothecene‬من انبثاق‬ ‫البادرات )‪ .(Muhitch et al., .2000‬نتج عن نشاط األنزيم ‪ trichothecene‬على ركيزة حمض األكساليك‬ ‫عزز من صالبة‬ ‫حفز الحقا استجابة آليات الدفاع في النبات وي ا‬ ‫إلى إنتاج ‪ ،CO2‬و‪ ،H2O2‬الذين يمكن أن ي ا‬ ‫الجدر الخلوية‪ .‬حفز تعبير أنزيم أكساالت أوكسيديز ‪ oxalate oxidase‬مقاومة التبقع السبتوري على‬ ‫الحور الهجين المعدل وراثيا‪ ،‬بينما حفز تعبير أنزيم أكساالت ديكربوكسيالز ‪oxalate decarboxylase‬‬ ‫مقاومة البندورة للفطر ‪ Sclerotinia sclerotiorum‬المسبب للعفن األبيض (‪.)Thompson et al., 1995‬‬ ‫وتشير هذه النتائج إلى أن تثبيط عوامل الشراسة لممرض محدد مثل السموم‪ ،‬من خالل المورثات وتعبيرها‬ ‫‪11‬‬ ‫الوراثي في النباتات ال ُمعدلة وراثيا‪ ،‬سوف يكون لديه القدرة على الحد من تطور مسببات أمراض فطرية‬ ‫محددة‪.‬‬ ‫‪ .8-3-2‬إخماد الحمض النووي الريبي ‪:RNA silencing‬‬ ‫يتم إخماد الحمض النووي الريبي ‪ RNA‬للمورثة كأداة عكسية الستهداف مورثات األمراض النباتية‬ ‫المتسببة عن الفطور‪ ،‬أو البكتيريا‪ ،‬أو الفيروسات (‪ .)Sanghera et al., 2009‬تعتمد عملية اإلخماد هذه‬ ‫على التطابق ‪ Homology‬الذي يتم إيجاده بين المورثة المنقولة ومورثة المرض للوصول إلى حالة اإللغاء‬ ‫المشترك ‪ ،co-suppression‬أو الحمض النووي الريبي مضاعف السلسلة ‪ dsRNA‬والتي تم شرحها عند‬ ‫العديد من الفطور‪:‬‬ ‫‪Magnaporthae oryzae (Kadotani et al., 2003), Venturia inaequalis (Fitzgerald et al., 2004),‬‬ ‫‪Neurospora crassa (Goldoni et al., 2004), Aspergillus nidulans (Hammond and Keller‬‬ ‫‪2005), Fusarium graminearum (Nakayashiki et al., 2005).‬‬ ‫وذلك باستخدام تقنية ناقل دبوس الشعر ‪hairpin-vector technology‬‬ ‫التي تميزت بقدرة عالية على‬ ‫إخماد متزامن للبروتين األخضر الفلوريستيني (‪ green fluorescent protein )GFP‬كمورثة منقولة‪،‬‬ ‫والمورثة ثالثي هيدروكسي نفتالين ريديكتاز(‪)THN‬‬ ‫‪trihydroxy naphthalene reductase‬‬ ‫كمورثة‬ ‫داخلية المنشأ في فطر جرب التفاح ‪ .V. inaequalis‬استخدمت المورثة ‪ GFP‬المنقولة كمؤشر واضح‬ ‫يمكن اكتشافه بسهولة‪،‬أما المورثة تراي هيدروكسي نفتالين ريديكتاز ‪ THN‬فلها دور في التصنيع الحيوي‬ ‫للميالنين‪ .‬تم بوساطة هذه التقنية إخماد عمل المورثة ‪ ،mpg1‬والمورثات ‪.polyketide synthase-like‬‬ ‫تفيد المورثة ‪ mpg1‬في التصاق األبواغ وتطور العدوى كجزء من العملية اإلمراضية للفطور‬ ‫)‪.(Nakayashiki et al., 2005‬‬ ‫‪ .4-2‬مورثة الكيتيناز ‪:Chitinase gene‬‬ ‫الكيتيناز ‪ chitinase‬أو الكيتو ديكستريناز ‪ 4-1( chitodextrinase‬بولي استيل غولكوزامينداز ‪1,4-poly-‬‬ ‫‪ )N-acetylglucosaminidase‬عبارة عن محلمهات للجليكوزيل ‪ glycosyl hydrolases‬التي تحفز التحلل‬ ‫المائي للبوليمير المرتبط بالمركب استيل غلوكوز أمين )‪ N-acetylglucosamine (GlcNAc‬في الكيتين‪،‬‬ ‫والذي يعد المكون الرئيس الثاني بعد السيليلوز‪ .‬يتكون الكيتين من سالسل خطية ‪ B-4-1‬التي تربط‬ ‫السكر في نهايتها‪ .‬يوجد الكيتين في جدران الخاليا الفطرية بنسبة ‪ ،%20‬وفي الهيكل الخارجي لمفصليات‬ ‫األرجل بنسبة ‪ ،%30‬وفي النيماتودا والحشرات بنسبة ‪ .%37‬يستخدم الكيتين في العديد من المجاالت‬ ‫الطبية‪ ،‬والزراعة‪ ،‬والمست ُحضرات الصيدالنية‪.‬‬ ‫‪12‬‬ ‫الشكل ‪ .5‬بنية الكيتين ومواقع تفكيكه‬ ‫تسهم هذه المورثة بدور مهم في حياة الكائنات خالل المراحل التطورية‪ ،‬كالتخلص من الكيوتكل في‬ ‫الحشرات‪ ،‬والدفاع ضد الممرضات في النباتات الراقية‪ ،‬والتغذية‪ ،‬والتطفل عند البكتريا‪ ،‬والفطور‪ ،‬وفصل‬ ‫الخاليا البنت الناتجة عن تبرعم الخميرة ‪(Renkema, 1995; Carstens et al., 2003; Escott and Adams,‬‬ ‫)‪.1995‬‬ ‫تصنف الكيتيناز تبعا لطريقة تأثيرها إلى فئتين‪:‬‬ ‫ داخلية التأثير التي تحلل الكيتين بشكل عشوائي في المواقع الداخلية للرابطة الغليكوزيدية ‪ B-4-1‬منتجة‬‫الكيتو تترايوز ‪ ،chitotetraose‬وكيتو تريوز ‪ ، chitotriose‬وداي استيل كيتو بيوز ‪diacetylchitobiose‬‬ ‫ خارجية التأثير التي لديها نشاط على نهايات سلسلة الكيتين غير المحددة‪ ،‬ولها تحت نمطين األول كيتو‬‫بيوزيداز‪ ، chitobiosidases‬والثاني استيل غلوكوز امينداز ‪.β-(1,4) N-acetyl glucosaminidases‬‬ ‫هناك مسار آخر يحول فيه الكيتين ديسيتالز ‪ chitin deacetylase‬الكيتين إلى كيتوزان ‪ chitosan‬الذي‬ ‫يتحول بالكيتوزناز ‪ Chitosanaze‬إلى بقايا من الجلوكوزامين ‪(Davis and Eveleigh, glucos amine‬‬ ‫)‪1984; Dahiya, 2005‬‬ ‫كما تصنف أنزيمات كيتيناز تبعا لتسلسل األحماض األمينية ومجال التحفيز إلى ثالث عائالت‪ ،‬تختلف‬ ‫هذه العائالت عن بعضها البعض بالتركيب ثالثي األبعاد‪:‬‬ ‫ العائلة ‪ 18‬تحتوي على أنزيمات الكيتيناز داخلية وخارجية التأثير من الفيروسات‪ ،‬والبكتريا‪ ،‬والفطور‪،‬‬‫والحشرات‪ ،‬والحيوانات وبعض النباتات (الفئة الثالثة والخامسة)‪.‬‬ ‫‪13‬‬ ‫‪-‬‬ ‫العائلة ‪ 19‬تتكون بشكل رئيس من أنزيمات الكيتيناز النباتية‪ ،‬وكيتيناز بكتريا ‪( Streptomyces‬الفئة‬ ‫األولى والثانية والرابعة)‪.‬‬ ‫‪-‬‬ ‫العائلة ‪ 20‬تحوي على أنزيمات الكيتيناز من البكتريا الممرضة لإلنسان ‪،Vibrio harveyi‬‬ ‫و‪.Dictyostelium discoideum‬‬ ‫تتكون معظم أنزيمات الكيتيناز من المكونات التالية‪ :‬ببتيدات كإشارة‪ ،‬ومجال التحفيز‪ ،‬ورابطة الكيتينية‬ ‫من نوع الفيبرونكتين‪ .‬تعد الكيتيناز النباتية عبارة عن بروتينات صغيرة وزنها الجزيئي ‪ 40-25‬كيلو دالتون‬ ‫)‪.(Nielsen et al., 1994‬‬ ‫تم تقسيم الكيتيناز النباتية بناء على تركيبها األولي إلى سبع فئات‪ ،‬وال يوجد اختالف واضح بين الفئات‬ ‫المختلفة كونها موجودة في أنواع نباتية معينة أو نسيج ما‪ ،‬ومع ذلك تختلف بعض األشكال فيما بينها‬ ‫بطريقة التحريض‪ ،‬على سبيل المثال ففي البطاطا يتم تحفيز مورثة الكيتيناز التابعة للنوع األول بقوة‬ ‫باستخدام اإليثيلين والجروح‪ ،‬في حين أن النوع الثاني يتم تحريضه بحمض الساليسيليك ‪(Buchter et al.,‬‬ ‫)‪ 1997‬وهذه الفئات هي‪:‬‬ ‫ الفئة األولى ‪ :Class I Chitinases‬هي الكيتيناز النباتي الغنية بالسيستيئين توجد في الرز‪ ،‬والتبغ‬‫‪،‬والبطاطا‪.‬‬ ‫‪ -‬الفئة الثانية ‪ :Class II Chitinases‬توجد في نبات األرابيدوبسس‪ ،‬والفطور‪ ،‬والشعير‪ ،‬والتبغ‪ ،‬والبكتريا‪،‬‬ ‫ولها تركيب النوع األول نفسه )‪ ،)Fukamizo, 2001‬ولكنها فقيرة بالسيستيئين‪.‬‬ ‫‪ -‬الفئة الثالثة ‪ :Class III Chitinases‬مشابهة لكيتيناز بدائيات النوى‪ ،‬توجد في نباتات الخيار‬ ‫الحمص‪.‬‬ ‫واألاربيدوبسس‪ ،‬والتبغ‪ ،‬و ُ‬ ‫‪ -‬الفئة الرابعة ‪ :Class IV Chitinases‬تشابه الفئة األولى ولكنها أصغر نظ ار إلى حذف مجال التحفيز‬ ‫والمنطقة الغنية بالسيستئين‪ ،‬وقد وجدت في الفول‪ ،‬والشوندر‪ ،‬واللفت‪.‬‬ ‫‪ -‬الفئة الخامسة ‪ :ClassV Chitinases‬وجدت بشكل رئيس في التبغ وتشبه كيتيناز البكتريا‪.‬‬ ‫‪ -‬الفئة السادسة ‪ :Class VI Chitinases‬مشابهة لكيتيناز الفئة األولى الموجودة في الشوندر السكري‪،‬‬ ‫وتمتلك نهايات غنية بالبرولين ‪.proline‬‬ ‫‪ -‬الفئة السابعة ‪ :Class VII Chitinases‬تم تصنيفها إلى أربع عوائل هي‪Chia, Chib, Chic, ( :‬‬ ‫‪ ،)Chid‬يتبع لها تسع فئات (‪.)Meins,et al., 1994‬‬ ‫تعد الكيتيناز واحدة من أهم البروتينات التي أبدت نشاطا مضادا في المختبر للعديد من األنواع الفطرية‬ ‫حيث أشارت العديد من التقارير المتوفرة حاليا إلى إمكانية استنساخ ونقل العديد من الكيتيناز النباتية‬ ‫بنجاح‪ ،‬حيث تم استنساخ الكيتيناز من مصادر أخرى أيضا من الفطور كفطر تريكوديرما ( ‪Hayes et al.,‬‬ ‫‪14‬‬ ‫‪ )1994‬التي تم إدخالها إلى التفاح ( ‪ ،) Bolar et al., 2000‬والبطاطا (‪ ،)Mora and Earle, 2001‬والتبغ‬ ‫)‪ ،(Lorito et al., 1998‬والعنب )‪.(Kikkert et al., 2000‬أيضا أدخلت هذه المورثة من فطر ‪Rhizopus‬‬ ‫‪ oligosporus‬إلى نبات التبغ (‪ ،)Terakawa et al., 1997‬كذلك أدخلت مورثة الكيتيناز من الميكوري از‬ ‫(‪ (Glomus mosseae‬إلى نبات البازالء (‪ )Slezack et al., 2001‬كما تم االستفادة من التعبير الوراثي‬ ‫للمورثة كيتيناز المعزولة من فطر الخميرة (‪ )Saccharomyces cerevisiae‬في نبات التبغ ( ‪Carstens et‬‬ ‫‪ .)al., 2003‬تم االستفادة من التعبير الوراثي لمورثة الكيتيناز التي مصدرها الحشرات في خفض معدل‬ ‫نمو يرقات الحشرة ‪.(Ding et al., 1998) Heliothis virescens‬عزلت المورثة كيتيناز من أصل بكتيري‬ ‫(العائلة ‪ )19‬ألول مرة من البكتريا ‪ ،Streptomyces griseus‬ثم نقلت إلى الرز باستخدام البكتريا ‪A‬‬ ‫‪ .tumefaciens‬الساللة ‪ ،EHA101‬وقد أظهرت النباتات المحورة بهذه المورثة نشاطا مضادا للفطر ‪reesei‬‬ ‫‪ .(Itoh et al. 2003) Trichoderma‬تم تعريف وعزل واستنساخ العديد من مورثات الكيتيناز ذات األصل‬ ‫البكتيري‪ ،‬ولكن القليل منها تم الحصول على تعبيره في النبات‪ .‬عزلت المورثة ‪ ChitA‬من البكتريا‬ ‫‪ ،Serratia marcescens‬ثم نقلت إلى نبات التبغ لالستفادة من تعبيرها الوراثي في هذا النبات ‪(Howie et‬‬ ‫)‪.a l. 1994‬‬ ‫استخدمت الكيتيناز النباتية األصل للعمل على تحليل ومنع النمو الفطري مخبريا ( ‪Schlumbaum et al.,‬‬ ‫‪ ،)1986; Mauch et al., 1988a and 1988b‬وتمت عملية تحريض الكيتيناز في نبات البازالء التي تم‬ ‫إعداؤها بفطر ‪ ،Fusarium solani‬أو من خالل عوامل اإلجهاد األحيائية والال أحيائية ( ‪Mauch et al.,‬‬ ‫‪ .)1988a‬استطاع البروتين الذي تم الحصول عليه من نبات البازالء تثبيط نمو ‪ 15‬من أصل ‪ 18‬نوعا من‬ ‫الفطور المدروسة تحت ظروف المختبر‪ .‬في حين ثبط الكيتيناز النقي نوعا واحدا من الفطور‪ ،‬أما مزيج‬ ‫الكيتيناز والغلوكوناز فقد ثبط نمو جميع الفطور المختبرة )‪ ،(Mauch et al., 1988b‬وفي وقت الحق تم‬ ‫التحقق من هذه الدراسة في عدة أنواع كالتبغ (‪ ،)Yun et al., 1996‬والعنب (‪،)Derckel et al., 1998‬‬ ‫الحمص (‪ ،)Giri et al., 1998‬واألرز (‪ )Velazhahan et al., 2000‬والعديد من النباتات‪ .‬وقد خلصت هذه‬ ‫و ُ‬ ‫الدراسات إلى أن بعض أشكال األنزيم غير قادرة على تثبيط نمو الفطور ) ‪ (Ji et al., 2000‬على سبيل‬ ‫المثال‪ ،‬أظهرت الفئة األولى من الكيتيناز من التبغ نشاطا مضادا ضد الفطر ‪ Fusarium solani‬ولكن‬ ‫النمط الثاني من الكيتيناز أظهر تثبيطا طفيفا في نمو الفطر (‪ ،)Jach et al., 1995‬وقد كان تعبير‬ ‫الكيتيناز أقوى وأسرع تأثي ار عند األصناف المقاومة مما هو عليه في األصناف الحساسة تجاه بعض‬ ‫الممرضات النباتية على الشوندر السكري )‪ ،(Nielsen et al., 1993‬والقمح )‪، (Anguelova et al., 2001‬‬ ‫‪15‬‬ ‫والبندورة )‪.(Lawrence et al., 2000‬تظهر بعض أشكال الكيتيناز نشاطا مضادا للفطور‪ ،‬بينما لبعضها‬ ‫اآلخر وظائف إضافية في النبات مثل منع التجمد )‪.(Yeh et al., 2000‬‬ ‫استخدمت المورثة كيتيناز المعزولة من نبات الفاصولياء مع الحاث ‪ CaMV 35S‬في عملية التحوير‬ ‫الوراثي لنبات التبغ باستخدام بكتيريا التدرن التاجي كوسيط‪ ،‬حيث بلغ مستوى نشاط المورثة كيتيناز من‬ ‫‪ 40- 20‬ضعفا مقارنة مع الشاهد‪ ،‬وقد أظهرت مقاومة للفطر ‪ ،Rhizoctonia solani‬وأخرت من ظهور‬ ‫أعراض المرض‪ .‬في حين لم تبد النباتات أي مقاومة للفطر ‪ Pythium aphanidermatum‬كونه غير حاو‬ ‫على الكيتين (‪ .)Broglie, et al.,1991‬في د ارسة أخرى لمورثة الكيتيناز التي عزلت من نبات البندورة‬ ‫ونقلت إلى نبات اللفت الزيتي‪ ،‬حيث اختبرت السالالت الناتجة على ثالثة أنواع من الفطور في موقعين‬ ‫حقليين مختلفين )‪ ،)Grison,et al., 1996‬وعلى مدى ‪ 52‬يوما كان مستوى الحماية للفطور الثالثة من‬ ‫‪ %23‬إلى ‪ %79‬مع تأخر في ظهور األعراض‪ .‬سجلت أعلى حماية ضد الفطر ‪ Cylindrosporium‬الذي‬ ‫يحتوي على الكيتين كعنصر رئيس في جدار الخلية الفطرية‪ ،‬في حين كانت المقاومة منخفضة تجاه‬ ‫الفطرين اآلخرين‪.‬‬ ‫تمت عملية التحوير الوراثي بالمورثة كيتيناز على عدة محاصيل وأشجار كالعنب‪ ،‬والرز‪ ،‬والفستق وذلك‬ ‫لتعزيز مقاومتها لألمراض النباتية‪ ،‬ففي نبات العنب استخدمت مورثة الكيتيناز التي مصدرها نبات األرز‬ ‫لزيادة المقاومة لفطر البياض الدقيقي ‪ ،(Yamamoto,et al.,2000) Uncinula necator‬كما أظهرت مورثة‬ ‫الكيتيناز في نبات الرز مقاومة للفطر ‪.)Datta, et al.,2001( Rhizoctonia solani‬‬ ‫في دراسة أخرى استخدمت مورثة الكيتيناز المنقولة إلى نبات الفول السوداني في مقاومة تبقعات األوراق‬ ‫التي يسببها الفطر ‪ ،(Rohini,and Rao, 2001) Cercospora arachidicola‬كما شملت عمليات التحوير‬ ‫الوراثي استخدام مورثة كيتيناز من أصل غير نباتي في زيادة مقاومة نباتات قابلة لإلصابة باألمراض‬ ‫الفطرية في األصناف الحساسة‪ ،‬تم في هذا المجال نقل مورثة الكيتيناز من الفطر‬ ‫‪Trichoderma‬‬ ‫‪ harzianum‬إلى نباتات البطاطا والتبغ حيث أبدت النباتات المحورة مقاومة للفطور‪، Botrytis cinerea‬و‬ ‫‪Rhizoctonia solani، A. solani،Alternaria alternata‬‬ ‫(‪ .)Lorito,et al.,1998‬أيضا نقلت المورثة‬ ‫كيتيناز من الفطر ‪ Rhizopus oligosporus‬إلى نبات التبغ‪ ،‬وأدت إلى تأخير أعراض المرض‬ ‫(‪.)Terakawa, et al., 1997‬‬ ‫طورت نباتات فول صويا ُمعدلة وراثيا بمورثة كيتيناز (‪ ،)Chi‬وبروتين الشعير المثبط للريبوزوم‬ ‫ُ‬ ‫‪ .(Li et al., 2004) Ribosome‬في دراسة أخرى قام بها )‪ (Tohidfar et al., 2005‬وذلك على نبات القطن‬ ‫لمقاومة الفطور باستخدام المورثة‪ . Chi‬استخدمت المورثة كيتيناز (‪ )chi11‬التي مصدرها األرز لمقاومة‬ ‫الفطور على الشعير‪ .‬كما تم استخدامها مع بروتين ‪ thaumatin‬وذلك لفترة طويلة ( ‪Tobiaset, et al.,‬‬ ‫‪16‬‬ ‫‪ ،)2007‬حيث أظهرت نباتات الشعير ال ُمعدلة مقاومة لألمراض الفطرية‪ .‬قام‬ ‫باستخدام المورثة كيتيناز )‪ )ricchi11‬واالستفادة من تعبيرها الوراثي لمقاومة األمراض الفطرية‪ ،‬وفي العام‬ ‫)‪(He et al., 2008‬‬ ‫نفسه تم الحصول على نباتات بطاطا مقاومة لألمراض الفطرية باستخدام المورثة )‪ )ChiC‬المعزولة من‬ ‫بكتريا ‪ .)Raham et al., 2008) Streptomyces griseus‬أما عن مقاومة أمراض نبات البازالء الفطرية‬ ‫الشائعة فقد تم عن طريق إدخال المورثة كيتيناز )‪ (chit30‬المعزولة من البكتريا ‪Streptomyces‬‬ ‫‪ .)Hassan et al. 2009( olivaceoviridis‬في األوان األخير تم تطوير مقاومة لفطور الدخن عن طريق‬ ‫إدخال المورث كيتيناز )‪. (Ignacimuthu and Ceasar, 2012) (chi11‬‬ ‫‪ .5-2‬التحوير الوراثي ودوره في مقاومة المراض الفطرية‪:‬‬ ‫يشغل موضوع مكافحة األمراض النباتية حي از كبي ار من اهتمام العاملين في مجال الهندسة الوراثية للنبات‪،‬‬ ‫حيث يتم الحصول على النباتات ال ُمعدلة وراثيا عن طريق إضافة واحدة أو أكثر من المورثات إلى‬ ‫(المجين) النباتي بوسائل غالبا ما تسمى بعملية التعديل الوراثي ‪Newell, ( genetic Transformation‬‬ ‫‪ )2000‬وتُعرف بالنباتات ال ُمعدلة وراثيا‪ .‬استخدمت تقنية الـ ‪ DNA‬المؤشب ‪ recombinant DNA‬في‬ ‫تحسين المحاصيل النباتية‪ ،‬وزيادة مقاومة النبات لألمراض‪ ،‬ومقاومة النبات للحشرات‪ ،‬إضافة إلى مقاومة‬ ‫النبات لمبيدات األعشاب )‪ .)Dunwell, 2000‬يعمل حاليا علماء أمراض النبات على إنتاج نباتات مقاومة‬ ‫لعدة أمراض (فيروسية‪ ،‬بكتيرية‪ ،‬فطرية) )‪.(Dahleen et al., 2001‬‬ ‫تعد الهندسة الوراثية أحد أهم األدوات التي تم الترويج لها لعقدين من الزمن كوسيلة لمكافحة األمراض‬ ‫النباتية‪ ،‬لكن حتى اآلن لم يطور سوى عدد محدود من األنواع النباتية المقاومة لألمراض‪ ،‬بينما تشكل‬ ‫النباتات المقاومة لمبيدات األعشاب نسبة ‪ ،%47‬والمقاومة للحشرات نسبة ‪ ،%12‬في حين لم تتجاوز‬ ‫مساحة المحاصيل المحورة لمقاومة األمراض الفطرية والفيروسية نسبة ‪ %1‬من المحاصيل المزروعة‬ ‫بشكل تجاري )‪.(James 2016‬‬ ‫تمتلك الهندسة الوراثية القدرة على التغلب على كثير من العوائق التي يمكن أن تكون مترافقة مع‬ ‫التربية التقليدية‪ ،‬وذلك من خالل استخدام طيف واسع ومتنوع من المورثات بطريقة يمكن التحكم بنشاطها‪.‬‬ ‫إضافة إلى ذلك‪ ،‬يمكن زيادة تحمل النبات للعديد من الممرضات‪ ،‬مع تقليل األضرار باألحياء الدقيقة‬ ‫المفيدة في التربة‪ .‬بالمقارنة مع النباتات ال ُمعدلة وراثيا والمقاومة للحشرات أو مبيدات األعشاب التي تزرع‬ ‫على نطاق واسع في العالم منذ أكثر من ‪ 20‬سنة‪ ،‬فإن النجاح في تطوير نباتات ُمعدلة وراثيا مقاومة‬ ‫لألمراض الفطرية أو البكتيرية كان محدودا‪ .‬في عام ‪ 2016‬قامت شركة ‪ Simplot‬بتطوير أصناف من‬ ‫البطاطا مقاومة لفطر اللفحة المتأخرة المتسببة عن الفطر ‪ ،Phytophtora infestan‬وتحتوي على نسبة‬ ‫منخفضة من ‪ ،acrylamide‬وذلك في معهد ‪ John Innes‬في المملكة المتحدة ;‪(Simplot Website, 2016‬‬ ‫‪17‬‬ ‫)‪ NBC News, 2016‬حيث تم اعتماد هذه األصناف من قبل و ازرة الزراعة في عام ‪ .2017‬هذه األصناف‬ ‫المقاومة قللت من استخدام المبيدات الفطرية ألكثر من ‪ ،%45‬وقللت من الضرر‪ ،‬وزادت اإلنتاجية بنسبة‬ ‫‪.%15‬‬ ‫يعزى االنخفاض في تطوير مثل هذه النباتات واستخدامها بشكل تجاري في مجال مقاومة األمراض إلى‬ ‫أمرين أساسيين‪ :‬األول‪ ،‬هو الحصول على مستويات منخفضة من المقاومة أدنى من المستوى المطلوب‬ ‫من قبل المنتجين لهذه النباتات‪ .‬والثاني‪ ،‬هو الحصول على مستويات عالية من المقاومة‪ ،‬لكن إزاء‬ ‫ممرض أو ساللة محددة‪ ،‬مثل هذه اإلخفاقات ستقود إلى تقليل عدد النباتات التي تصل إلى مرحلة‬ ‫االختبار النهائي في الحقل‪ ،‬والتي سيتم طرحها في األسواق )‪.(Wally and Zamir, 2010‬‬ ‫‪ .6-2‬التحوير الوراثي للنبات بوساطة البكتريا ‪:Agrobacterium tumefaciens‬‬ ‫تتشابه بروتوكوالت التحوير الوراثي للنبات في الخطوات الرئيسة‪ ،‬وتختلف عن بعضها في الجزء النباتي‬ ‫المستخدم كمستقبل للـ ‪ DNA‬الغريب‪ ،‬وفي تركيب األوساط المغذية‪ ،‬والتوليفات الهرمونية من األوكسينات‬ ‫والسيتوكينينات المستخدمة في زراعة األنسجة لتجديد ‪ regeneration‬نبات معدل وراثيا من خلية أو عدة‬ ‫خاليا نباتية‪ ،‬وفي طريقة نشوء األعضاء ‪، organogenesis‬حيث يمكن أن تكون بشكل غير مباشر‬ ‫‪ indirect organgenesis‬عن طريق المرور بمرحلة الكالوس ‪callus‬‬ ‫‪ ،‬أو بشكل مباشر‬ ‫‪direct‬‬ ‫‪ organogenesis‬دون المرور بتلك المرحلة‪.‬‬ ‫اعتمدت أول طريقة موثقة للتحوير الوراثي للنبات على نوع من البكتريا هي‬ ‫‪Agrobacterium‬‬ ‫‪ tumefaciens‬التي تصيب النبات‪ ،‬وتسبب مرض التدرن التاجي‪ ،‬وهي بكتيريا سالبة غرام تعيش في‬ ‫التربة‪ ،‬تهاجم بشكل طبيعي الكثير من النباتات ثنائية الفلقة‪.‬‬ ‫تسبب العدوى بالـبكتريا ‪ Agrobacterium‬تحريض نمو ورمي في مواقع العدوى‪ ،‬فتسبب مرض التدرن‬ ‫التاجي‪ ،‬تنتج استجابة النمو هذه عندما يتم نقل جزء صغير من الـ ‪ DNA‬هو ‪ T- DNA‬من البالزميد‬ ‫المحرض لألورام ‪ tumor inducing (Ti) plasmid‬في البكتريا إلى الخلية النباتية‪ .‬يدخل هذا الـ ‪T- DNA‬‬ ‫الذي يحمل المورثات المسؤولة عن تخليق األورام وتهيئة الخاليا أثناء العدوى‪ ،‬وهي توجد في منطقة الـ‬ ‫‪ ،(Gelvin, 2003) T- DNA‬يحمل البالزميد أنواعا أخرى من المورثات تدعى بمورثات الشراسة‬ ‫‪ Virulence genes‬التي تسهم بدور مهم في انتقال قطعة الـ ‪ T- DNA‬من الخلية البكتيرية إلى الخلية‬ ‫النباتية‪.‬‬ ‫‪18‬‬ ‫الشكل ‪ .6‬تركيب البالزميد ‪Ti plasmid‬‬ ‫يجب أن تدخل المورثات الموجودة بين الحدين األيمن واأليسر لقطعة الـ ‪ T- DNA‬إلى الخاليا النباتية‪،‬‬ ‫ويمكن معرفة النسيج المحور بوساطة ‪Agrobacterium‬‬ ‫بالنمو الطبيعي‪ ،‬والذي يتكاثر بشكل سريع‬ ‫على األوساط الخالية من الهرمون بسبب تغيير التوازن الهرموني‪ ،‬لكن من جهة ثانية يكون التالعب‬ ‫الوراثي النباتي بالبالزميد المحرض لألورام ذا قيمة محدودة إذا كانت الخاليا النباتية المحورة الناتجة ورمية‬ ‫وغير قادرة على التجدد إلى نباتات خصبة طبيعية‪.‬‬ ‫لذلك من الضروري جدا استبعاد الخواص الورمية للـ ‪ T- DNA‬التي تثبط التمايز الطبيعي للخاليا النباتية‪،‬‬ ‫لذلك يتم نزع المورثات المسببة لألورام من ‪ T- DNA‬مع االحتفاظ بالمناطق الحدودية وبالتالي القدرة على‬ ‫نقل الـ ‪ T- DNA‬إلى صبغيات النبات من جهة‪ ،‬ومن جهة أخرى تجديد نباتات طبيعية ‪(Hellens et al.,‬‬ ‫)‪ ،2000‬بعدئذ يمكن تحديد النباتات المتجددة من النسيج المحور بوساطة البالزميد غير الممرض والذي‬ ‫يحتوي على مورثات تصنيع األوبينات ‪( Opines‬نواتج تكثيف سكريات مع حموض أمينية تتغذى عليها‬ ‫البكتريا)‪ .‬الطريقة األكثر فعالية والمستخدمة لتعريف خاليا النبات المحورة تتم بإضافة مورثة واسمة‬ ‫‪19‬‬ ‫لالنتخاب ضمن قطعة الـ ‪ T- DNA‬مثل‪ ،‬المورثة التي تمنح صفة المقاومة للمضادات الحيوية مثل‬ ‫الكاناميسين‪ ،‬أو مورثات المقاومة لمبيدات األعشاب‪.‬‬ ‫ففي هذه الحالة تستطيع الخاليا المحورة فقط النمو على الوسط الحاوي على عامل االنتخاب (كاناميسين‪،‬‬ ‫أو غلوفوسينات األمونيوم مثال)‪ ،‬بينما التستطيع الخاليا غير المحورة النمو على هذا الوسط‪.‬‬ ‫عمليا بعد تركيب الناقل وتطعيمه بالمورثة المرغوبة تُجرى عملية نقله إلى خاليا البكتريا ‪Agrobacterium‬‬ ‫بط ارئق عديدة منها‪ :‬طريقة التزواج األبوي‪ ،‬أو بالصدمة الح اررية‪ ،‬أو بالتثقيب الكهربائي‪ ،‬حيث يتم إضافة‬ ‫المورثة التي تمنح الصفة المرغوبة إلى معلق ساللة ‪ Agrobacterium‬والتي تم سابقا وضعها في حجرة‪،‬‬ ‫ويتم تعريض معلق الخاليا لصدمة كهربائية لمدة ثوان معدودة‪ ،‬ويؤدي إلى إحداث ثقوب في خاليا‬ ‫البكتريا ‪ Agrobacterium‬ويتم من خالل هذه الثقوب دخول ‪ T- DNA‬إليها‪.‬‬ ‫ويتم التأكد من ذلك قبل البدء بإجراء عمليات التحوير الوراثي للنبات‪ ،‬حيث تستخدم تقانة التفاعل‬ ‫التسلسلي للبوليميراز ‪ PCR‬بهدف تضخيم جزء محدد من الـ‪ DNA‬أضعافا مضاعفة‪ ،‬ثم يتم فصل الـ‬ ‫ـ‪ DNA‬المضخم أو المكاثر حسب حجمه عبر هالم األغاروز باستخدام جهاز رحالن كهربائي‪ ،‬ثم ُتلون‬ ‫بمادة بروميد اإليثيديوم‪ ،‬ثم تُعرض الهالمة لألشعة فوق البنفسجية ليتم الكشف عن ‪ DNA‬الغريب وتحديد‬ ‫حجمه‪.‬‬ ‫يتم عادة تحميل ‪ DNA‬معلوم الوزن الجزيئي في الهالمة في حفرة إلى جانب العينات المختبرة لمقارنة‬ ‫حجم ‪ DNA‬المنقول مع حجم الـ ‪ DNA‬المعلوم‪.‬‬ ‫بعد ذلك تُجرى عملية الزراعة المشتركة لخاليا النبات مع ‪ Agrobacterium‬المحتوية على المورثة‬ ‫المرغوبة وذلك لمدة ‪ 3‬أيام تقريبا‪ ،‬حيث يتم من خاللها انتقال الـ ‪DNA‬‬ ‫من الـبكتريا ‪Agrobacterium‬‬ ‫إلى خاليا النبات‪ ،‬ثم يتم غسل خاليا النبات بمضاد حيوي للتخلص من البكتريا‪ ،‬ثم تزرع خاليا النبات‬ ‫على أوساط حاوية على مضاد حيوي انتخابي يحوي هرمونا نباتيا من أجل تجديد نبات كامل من هذه‬ ‫الخاليا‪.‬‬ ‫‪ .7-2‬التحوير الوراثي للحمص‪:‬‬ ‫اعتمدت معظم البرتوكوالت المستخدمة في التحوير الوراثي للحمص على النشوء المباشر لألعضاء دون‬ ‫المرور بمرحلة الكالوس‪ ،‬وعلى استخدام األجنة الناضجة كجزء نباتي مستقبل للـ ‪ DNA‬الغريب‪.‬‬ ‫تتم عملية التحوير الوراثي باستخدام البكتريا ‪ A. tumefaciens‬كوسيط بتحضير البكتريا أوال‪ ،‬وذلك‬ ‫باستنساخ قطعة الـ ‪ DAN‬المراد نقلها للنبات على بالزميد مناسب في البكتريا ‪ ،Echerichia coli‬ثم عزله‬ ‫واعادة إدخاله في البكتريا ‪.A. tumefaciens‬‬ ‫‪20‬‬ ‫الحمص الناضجة سطحيا بوساطة الكلوراكس تركيز‪ ، %2.5‬ثم يتم فصل األجنة الناضجة عن‬ ‫تُعقم بذور ُ‬ ‫البذور‪ ،‬يتم قص حوالي ‪ 2‬مم من القمة النامية‪ ،‬ثم تغمر األجنة في المعلق البكتيري‬ ‫للبكتريا‪ Agrobacterium tumefaciens‬التي تحمل على بالزميدها المورثات التي نرغب بنقلها إلى النبات‪.‬‬ ‫تترك األجنة في المعلق لمدة ساعتين لضمان حدوث عملية العدوى‪ ،‬تنقل األجنة المعداة بالبكتريا إلى‬ ‫وسط الزراعة المشتركة ‪ Co-cultivation‬وتحضن في الظالم لمدة ‪ 4‬أيام‪ ،‬حيث يتم في هذه المرحلة‬ ‫انتقال المورثات من البالزميد في البكتريا إلى عدد من الخاليا النباتية لألجنة المعداة (التتجاوز نسبتها‬ ‫‪ %1‬من الخاليا المعداة)‪ ،‬تغسل األجنة النامية بماء معقم يحوي اللتر منه على ‪ 150‬مغ من المضاد‬ ‫الحيوي ‪، Ticarcillin‬وذلك للتخلص من البكتريا‪ ،‬تنقل األجنة النامية بعد ذلك إلى وسط زراعة جديد‬ ‫يسمى وسط التجديد ‪ regeneration‬الذي يحرض على تشكل فروع خضرية جديدة وتترك عليه لمدة ‪9‬‬ ‫أيام‪ ،‬تنقل الفروع الخضرية بعدها إلى وسط يحرض النمو الطولي للفروع ‪ elongation‬وتترك لمدة ‪21‬‬ ‫يوما‪ ،‬تقسم الفروع الخضرية الناتجة عن كل جنين إلى عدة أجزاء‪ ،‬ثم تزرع في وسط االنتخاب ‪selection‬‬ ‫الذي يحتوي على عامل االنتخاب (مبيد أعشاب عام التأثير أو مضاد حيوي) وتترك فيه لمدة ‪ 14‬أسبوعا‬ ‫مع تجديد الوسط المغذي مرة كل أسبوعين‪ ،‬حيث تنقل الفروع الخضرية الحية فقط وذلك بعد إزالة‬ ‫األنسجة الميتة التي تلونت باللون البني‪ ،‬يضاف مضاد حيوي واسع الطيف مثل ‪ Ticarcillin‬لألوساط‬ ‫المغذية كافة بعد مرحلة الزراعة المشتركة لضمان عدم نمو البكتريا التي بقيت في المسافات البينية‬ ‫للخاليا‪ .‬تُطعم الفروع الخضرية الناتجة من أصل بذري غير محور وراثيا‪ ،‬أو تُجذر على وسط تجذير‬ ‫مناسب‪ ،‬ثم تنقل البادرات إلى تربة معقمة في غرفة الزراعة ألقلمتها (الشكل ‪ .)5‬يتم التأكد من نجاح‬ ‫عملية نقل المورثات في نباتات الجيل ‪ T0‬بوساطة اختبار تفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪ ،PCR‬وذلك‬ ‫باستخدام زوج من البادئات ‪ Primers‬المتخصصة على التركيب الوراثي الذي تم نقله‪ ،‬كما يتم الحقا إجراء‬ ‫عملية تقويم حيوي للكشف عن نشاط المورثات المنقولة إلى النبات‪ ،‬والتأكد من ثباتها عبر األجيال‬ ‫المتعاقبة للنبات(‪.)Khatib,2008‬‬ ‫‪21‬‬ ‫‪ -1‬حصاد البكتريا‬ ‫‪ -2‬التطهير السطحي للبذور‬ ‫‪ -3‬العدوى بالبكتريا‬ ‫‪ -4‬بداية الزراعة المشتركة‬ ‫‪ -5‬نهاية الزراعة المشتركة‬ ‫‪ -6‬التجديد‬ ‫‪ -7‬االستطالة‬ ‫‪-8‬االنتخاب‬ ‫‪ -9‬نبيتات معدلة وراثيا‬ ‫الشكل ‪ .7‬مراحل التحوير الوراثي للحمص باستخدام البكتريا ‪( A. tumefaciens‬عن خطيب‪)2008 ،‬‬ ‫أشارت عدة تقارير إلى تحوير نباتات حمص ُمعدلة وراثيا باسخدام البكتريا ‪ ،A. tumefaciens‬وقد هدفت‬ ‫هذه األعمال في البداية إلى تطوير بروتوكول مناسب لعملية التحوير باستخدام المورثة ‪gusA‬‬ ‫‪(Fontana et al.,1993; Kar et al., 1996; Krishnamurthy et al.,2000; Tewari- Singh et al.,2004‬‬ ‫)‪ .Senthil et al., 2004‬بينما ركزت دراسات أخرى على نقل صفة المقاومة للحشرات التي تمنحها أنواع‬ ‫المورثات ‪ cry‬المعزولة من البكتريا ‪(Kare et al.,1997; Sarmah et al.,2004; Bacillus thuringiensis‬‬ ‫)‪ .Ignacimuthu and Prakash, 2006, Mehrotra et al., 2011‬أشار عدد قليل من الدراسات على‬ ‫الحمص‬ ‫الحمص إلى نقل مورثات مقاومة للممرضات النباتية إلى ُ‬ ‫ُ‬ ‫)‪ ،)Khatib, 2008( ،al.,2017‬أو تحمل اإلجهادات الالأحيائية (‪.)Ibrahim et al., 2016‬‬ ‫‪(Kiesecker, 2000; Yadav et‬‬ ‫عدلة وراثيا‪:‬‬ ‫‪ .8-2‬تحليل النباتات ال ُم ّ‬ ‫بعد القيام بعملية نقل المورثات إلى النبات بالطرائق التي تم شرح واحدة منهاسابقا‪ ،‬يتم إجراء مجموعة من‬ ‫االختبارات لتأكيد عملية النقل وتعبير المورثة في النبات‪ .‬تتطلب عملية تطوير صنف نباتي محور وراثيا‬ ‫إنتاج عشرات السالالت الوراثية والتي يمكن أن نختار منها ساللة واحدة على األقل أو عدة سالالت‬ ‫مناسبة لهذا الغرض‪.‬‬ ‫‪22‬‬ ‫يشكل الموقع الوحيد للتركيب الوراثي ‪ construct‬المنقول في جينوم النبات والذرية ‪ progeny‬الناتجة حدثا‬ ‫أو واقعة ‪ .event‬وبناء على ذلك‪ ،‬فإن كل حدث تحوير وراثي يقال عنه بأنه مستقل ‪ independent‬عن‬ ‫الحوادث األخرى‪ ،‬بمعنى أن النمط الظاهري سوف يتغير بالطريقة المتوقعة لكل حدث‪ ،‬ومن الضروري‬ ‫تعريف حوادث التحوير المستقلة وتمييزها عن النباتات غير المحورة‪ .‬تتم هذه العملية من خالل إجراء‬ ‫مجموعة من االختبارات باالعتماد على النمط الظاهري‪ ،‬أو التركيب الوراثي‪.‬‬ ‫‪ .1-8-2‬الغربلة الولية‬ ‫يجب أن تكون عملية تعريف التحوير المفترض ‪ putative transformants‬بسيطة‪ ،‬واقتصادية‪ ،‬وذات‬ ‫مردود عال‪ .‬استخدم اختصاصيو التقانات الحيوية مصطلحا مفترضا ”‪ “putative‬بشكل متفائل‪ ،‬إذ يبقى‬ ‫النبات معدال وراثيا بشكل مفترض حتى يتم الحصول على دليل قاطع من نتائج االختبارات الجزيئية على‬ ‫نجاح عملية التحوير‪ .‬تهدف عملية الغربلة األولية إلى تقليل حاالت النتائج اإليجابية الخاطئة للنباتات‬ ‫التي هربت من عملية االنتخاب لكنها فعليا غير محورة‪ ،‬مما يقلل من عدد العينات التي سيتم اختبارها‬ ‫الحقا بطرائق أخرى مثل تهجين الـ ‪ .DNA‬ويتم تعريف حوادث التحوير المفترضة للنباتات التي أظهرت‬ ‫مقاومة لعامل االنتخاب أو بوساطة تفاعل الـ ‪ PCR‬و‪/‬أو ‪ .ELISA‬كما يمكن استخدام عامل االنتخاب في‬ ‫الغربلة األولية عن طريق دهن‪ ،‬أو رش األوراق بمبيد األعشاب أو المضاد الحيوي تبعا لنوع مورثة‬ ‫االنتخاب المستخدمة في تطوير هذه النباتات‪.‬‬ ‫‪ .2-8-2‬التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪PCR‬‬ ‫تستخدم عادة اختبارات الـتفاعل التسلسلي للبوليميراز )‪ Polymerase chain reaction (PCR‬التقليدية‬ ‫لمعرفة ما أذا كانت المادة النباتية محورة أم غير محورة‪ ،‬حيث يتم تحليل النتائج وذلك بترحيلها على‬ ‫هالمة أغاروز أو بولي أكريالميد (‪ ،)Sambrook and Russel, 2001‬ويتم تظهير نواتج المكاثرة باستخدام‬ ‫األشعة فوق البنفسجية وذلك بعد تلوينها ببروميد اإليثيديوم‪ .‬قبل إجراء مثل هذه االختبارات يتم تحضير‬ ‫البادئات المناسبة والتأكد من مطابقتها لسلسلة ‪ DNA‬وحساسيتها للكشف عن الحمض النووي‬ ‫المستهدف‪ .‬ففي ظروف الكشف العادية يجب أن يتم الكشف على ‪ 10-1‬نسخ من الـ ‪ DNA‬الهدف في‬ ‫أقل من ‪ 40‬دورة ح اررية للجهاز (‪ ،)Hübner et al., 2001‬ويجب أن تتم عملية الكشف بموثوقية ال تقل‬ ‫عن ‪ ،%95‬وبمجال خطأ ‪. (Engl, 2008) % 5‬يتم تجريبيا التأكد من تخصص البادئات ومطابقتها‬ ‫للسلسلة الهدف من خالل استخدام عينات مشابهة للمحورة لكن ال تحوي الـ ‪ DNA‬المستهدف‪ ،‬وذلك‬ ‫للتأكد من مدى تخصص البادئات وقدرتها على التمييز بين المنطقة المستهدفة وغير المستهدفة المشابهة‬ ‫لها‬ ‫)‪.) Broothaerts et al. 2008‬‬ ‫يعد التفاعل التسلسلي للبوليميراز من الطرائق الدقيقة والحساسة )‪ (Mullis, 1990‬للكشف عن عملية انتقال‬ ‫المورثات وتعبيرها‪ ،‬أو المورثات الواسمة لالنتخاب وذلك بعد استخالص الـ ‪ ،DNA‬يجري التفاعل ضمن‬ ‫‪23‬‬ ‫أنبوب اختبار بحيث يحتوي مزيج التفاعل على بادئتين ‪ (Reece 2004).‬مكملتين للنهايتين )’‪(5’-------3‬‬ ‫لسلسلة الـ ‪ DNA‬المراد الكشف عنها‪ ،‬حيث تتم مكاثرة السلسلة المحصورة بينهما‪ .‬يجب أن تتم عملية‬ ‫المقارنة مع شاهد سلبي وشاهد إيجابي واال تعد نتائج االختبار غير صالحة‪ .‬تعد نتائج الـ ‪ PCR‬على‬ ‫نباتات الجيل األول ‪ T1‬أكثر موثوقية من نباتات الجيل ‪ T0‬ألن هناك احتماال أقل للتلوث بالبكتريا‬ ‫‪.Agrobacterium‬‬ ‫كما يجب توخي الحذر عند تقويم حاالت تحوير وراثي ناتجة عن استخدام البكتريا ‪Agrobacterium‬‬ ‫كوسيط‪ ،‬حيث يمكن أن يكون البالزميد الذي تحمله البكتريا هو مصدر النتيجة اإليجابية الخاطئة‪ ،‬ولكن‬ ‫الواقع الفعلي هو أن المورثة لم تدخل جينوم النبات‪ ،‬ويعود ذلك إلى قدرة البكتريا إلى الدخول جهازيا إلى‬ ‫العديد من النباتات ثنائية الفلقة )‪ ،(Cubero and Lopez 2005‬لذلك ال يمكن إجراء هذا االختبار على‬ ‫البادرات الناتجة مباشرة عن عملية النقل دون أن تعامل هذه األجزاء بمضاد حيوي مناسب لقتل البكتريا‬ ‫مثل ‪ ،(Cheng et al. 1997) carbenicillin‬أو ‪ .(Broothaerts et al. 2005) , cefotaxime‬وبالرغم من‬ ‫ذلك يمكن أن تبقى بعض الخاليا البكتيرية حية ضمن األنسجة النباتية‪ ،‬أما البذور ال ُمعدلة وراثيا والناتجة‬ ‫عن التحوير بطريقة تغطيس األزهار في المعلق البكتيري فيتم غسلها بمحلول مخفف من هيبوكلوريت‬ ‫الصوديوم قبل زراعتها)‪.(Weigel and Glazebrook, 2002‬‬ ‫‪Conventional PCR‬‬ ‫‪Real Time PCR‬‬ ‫الشكل ‪ .8‬مقارنة بين التفاعل التسلسلي للبوليميراز بالزمن الحقيقي ‪( Real Time PCR‬اليمين) والتفاعل‬ ‫التسلسلي للبوليميراز التقليدي ‪( conventional PCR‬اليسار)‪.‬‬ ‫‪24‬‬ ‫‪ .3-8-2‬تقنية النسخ العكسي‪Reverse Transcripion (RT)-PCR :‬‬ ‫اكتُشفت تقنية النسخ العكسي ‪ RT-PCR‬أثناء دراسة تكاثر الفيروس ونقل مادته الوراثية‪ ،‬حيث حلت هذه‬ ‫التقنية محل تقنية لطخة نورذرن ‪ Northern blot‬كطريقة للكشف عن الحمض النووي الريبي ( ‪Bustin,‬‬ ‫‪ ،)2000‬منذ ذلك الحين أصبحت هذه التقنية مستخدمة للكشف عن تعبير الحمض النووي الريبي‬ ‫ومستوياته وذلك ألسباب متعددة‪ ،‬حيث أنها ال تتطلب عمليات معالجة‪ ،‬إضافة إلى أنها تعطي بيانات‬ ‫كمية ونوعية دقيقة (‪.)Bustin, 2005‬‬ ‫غالبا مايتم الخلط بين التفاعل التسلسلي للبوليميراز اللحظي أو بالزمن الحقيقي )‪Real Time (RT-PCR‬‬ ‫‪ PCR‬أو التفاعل التسلسلي للبوليميراز الكمي )‪ Quantitative PCR (qPCR‬وبين تقنية النسخ العكسي‬ ‫حيث تعد كل تقنية منفصلة عن األخرى (‪ ،) Mackay, 2007‬حيث تستخدم تقنية النسخ العكسي للكشف‬ ‫عن التعبير الوراثي للحمض النووي الريبي‪ ،‬وذلك من خالل تكوين السلسلة المكملة للـ ‪)cDNA( DNA‬‬ ‫‪ complementary DNA‬بدءا من سلسلة الحمض النووي الريبي الرسول ‪ mRNA‬للمورثة المراد دراسة‬ ‫تعبيرها‪ ،‬حيث تحول بوساطة أنزيم النسخ العكسي ‪ reverse transcriptase‬إلى سلسلة ‪ DNA‬مكملة‬ ‫‪ ،cDNA‬وتستخدم هذه األخيرة كقالب مكاثرة في تفاعل ‪ PCR‬عادي يتم الكشف عن نواتجه بالرحالن‬ ‫الكهربائي على هالمة أغاروز (الشكل ‪ .)7‬إذا في المحصلة تكون نتيجة هذا االختبار نوعية ‪qualitative‬‬ ‫وليست كمية‪ ،‬أي أن النبات محور أو غير محور‪ ،‬والمورثة تعبر أو هي خامدة دون أن يقدر كمية الـ‬ ‫‪ DNA‬الموجودة في العينة‪ ،‬أو كمية الـ ‪ RNA‬التي نسخت عنها‪ ،‬أما تقنية التفاعل التسلسلي للبوليميراز‬ ‫اللحظي أو بالزمن الحقيقي ‪ Real Time PCR‬فتعتمد على استخدام جهاز يحاكي جهاز التدوير الحراري‬ ‫العادي باستخدام مجسات ‪ ،probes‬أو صباغ ‪ dye‬موسومة ‪ labeled‬يستطيع الجهاز الكشف عنها أو‬ ‫تحسسها في وقت حدوثها وليس في نهاية التفاعل كما في تفاعل الـ‪ PCR‬التقليدي (الشكل ‪ ،)6‬ويمكن‬ ‫مراقبة ذلك على شاشة الحاسوب المرفق بالجهاز‪ ،‬حيث تزداد شدة التوهج مع تطور التفاعل نتيجة تراكم‬ ‫نواتج المكاثرة في كل دورة‪ ،‬عند انتهاء التفاعل يمكن حساب كمية ناتج التفاعل بالمقارنة مع عينات‬ ‫قياسية من الـ ‪ ،DNA‬أو الـ ‪.)Schmittgen et al., 2000( RNA‬‬ ‫‪25‬‬ ‫الشكل ‪ .9‬مراحل اصطناع السلسلة المكملة ‪ cDNA‬عن سلسلة ‪ RNA‬مفردة‬ ‫تشرب سذرن ‪Southern blot‬‬ ‫‪ّ .4-8-2‬‬ ‫بعد القيام بعملية إدخال المورثات الغريبة للنبات بالطرائق المختلفة للتحوير الوراثي‪ ،‬ال بد من إجراء‬ ‫مجموعة من االختبارات على النباتات التي نتجت عن هذه التجارب‪ ،‬والتي يفترض أنها تعطي عددا كبي ار‬ ‫من السالالت المستقلة عن بعضها تبعا لموقع دخول المورثة في الجينوم‪ ،‬وبالتالي يجب أن نختار من‬ ‫بينها الساللة التي تحوي على نسخة وحيدة من المورثة‪ ،‬وتعبر بمستوى عال عن الصفة التي نقلت إليها‪.‬‬ ‫كما يجب أن نميز ضمن هذا العدد الكبير من السالالت بين النباتات التي انتقلت إليها المورثة وتلك التي‬ ‫ال تحويها‪ .‬يتطلب هذا األمر إجراء سلسلة من التحاليل المادية‪ ،‬والمظهرية‪ ،‬والوراثية (‪.)Birch,1997‬‬ ‫هناك عدة احتماالت تشرح االختالفات في مستوى تعبير المورثات بين سالالت النباتات ال ُمعدلة وراثيا‬ ‫غير عدد نسخ المورثة المنقولة‪ .‬ال تعد المورثات المنقولة بطريقة التحوير الوراثي وحدة نسخ مستقلة‪،‬‬ ‫وانما هي جزء من قطعة الـ ‪ T-DNA‬التي تنقلها البكتريا ‪ A. tumefaciens‬إلى مواقع مختلفة على‬ ‫صبغيات النبات‪ ،‬وعند دخول هذه المورثة في منطقة يوكروماتين ‪ euchromatin‬والتي تعد منطقة نسخ‬ ‫نشطة‪ ،‬عندها قد تتأثر المورثة المنقولة بالسالسل المنظمة للمورثات المجاورة في هذا الموقع الوراثي‪ .‬أما‬ ‫عند دخول المورثة بشكل قريب من منطقة تكرار للـ‪ ،DNA repetitive DNA‬أو كروماتين متباين‬ ‫‪ heterochromatin‬فيمكن عنده أن يثبط عمل المورثة‪ .‬من العوامل المهمة األخرى المؤثرة في تعبير‬ ‫المورثة هو عدد نسخ المورثة في موقع اإلدخال‪ .‬حيث يمكن لنظام اإلدخال المستخدم في عملية التحوير‬ ‫الوراثي أن يدخل نسختين أو أكثر من قطعة الـ ‪ T-DNA‬في الموقع نفسه على الصبغي‪ ،‬وهذه النسخ‬ ‫يمكن أن تتوضع في هذا الموقع بتراتيب مختلفة (رأس إلى ذيل ‪ ،head to tail‬أو تك اررات مباشرة‪،‬أو رأس‬ ‫‪26‬‬ ‫إلى رأس‪ ،‬أو ذيل إلى ذيل كتك اررات معكوسة‪ ،‬حيث يظهر هذا األخير مستويات منخفضة من تعبير‬ ‫المورثة (‪.)Stam et al.,1997‬‬ ‫استخدمت تقنية تشرب سذرن ‪ ،Southern blot‬أو تهجين الـ ‪ DNA hybridization DNA‬بهدف تأكيد‬ ‫عملية انتقال المورثة‪ ،‬ومعرفة عدد النسخ المنقولة‪ .‬اكتشف هذا االختبار في سبعينيات القرن الماضي من‬ ‫قبل البروفسور أدوين سذرن (‪ ،)Southern, 1975‬يتكون هذا االختبار من عدة خطوات تتم على عدة أيام‪،‬‬ ‫حيث يتطلب عزل كميات كافية من الـ ‪( DNA‬عشرات الميكروغرامات)‪ ،‬ثم يتم عملية هضم الـ ‪DNA‬‬ ‫بواحد أو أكثر من أنزيمات القطع يتم اختيارها بعناية‪ ،‬يتم فصل قطع الـ ‪ DNA‬الناتجة عن عملية الهضم‬ ‫على هالمة أغاروز تبعا لوزنها الجزيئي‪،‬ثم تنقل هذه القطع إلى غشاء نايلوني مشحون بشحنة موجبة‪ ،‬بعد‬ ‫ذلك يتم تثبيت قطع الـ ‪ DNA‬على الغشاء‪ ،‬ثم تُهجن مع مسبر موسوم بمادة مشعة أو لونية ‪(Feinberg‬‬ ‫)‪.and Vogelstein , 1984‬‬ ‫يحتاج هذا االختبار إلى ‪ DNA‬عالي النوعية ذي وزن جزيئي عال (أكبر من ‪ 20‬كيلو زوج نكليوتيدي‬ ‫‪ ،)Kb‬إذ ال يمكن تمييز العصابات في حال كانت قطع الـ‪ DNA‬مقطعة‪ ،‬أما إذا لم يتم هضم الـ ‪DNA‬‬ ‫عندها سوف تنتج حزمة ذات وزن جزيئي عال غير صالحة للتحليل (‪ .(Birch 1997‬يمتلك الـ ‪DNA‬‬ ‫شحنة سالبة وذلك الحتوائه على مجموعة الفوسفات والتي تنتقل إلى الغشاء ذي الشحنة الموجبة‪ ،‬حيث‬ ‫يتم وضع الهالمة على الغشاء وتوضع فوقها أوزان مختلفة‪ ،‬تنتقل العصابات إلى الغشاء بعملية تسمى‬ ‫التشرب بالخاصية الشعرية (‪ .)Sambrook and Russell 2001‬يعد غشاء النايلون سهل التعامل معه في‬ ‫العمليات الالحقة وأكثر مالءمة للمسبر‪ .‬هناك طريقتان لهضم الجينوم‪ :‬الطريقة األولى‪ ،‬باستخدام أنزيم‬ ‫يقطع مرة واحدة بالقرب من أحد الحدين مثل ‪ ،EcoRI‬ويفضل الحد األيمن ألنه األكثر موثوقية في‬ ‫االنتقال من الحد األيسر)‪ . (Caplan et al. 1985‬والطريقة الثانية‪ ،‬باستخدام أنزيم يقطع مرة واحدة في الـ‬ ‫‪ DNA‬المنقول مثل ‪ ،SacI‬ثم التهجين بوساطة مسبر يرتبط مع أي من جهتي القطع‪ ،‬حيث يتم‬ ‫الحصول على النتيجة ذاتها من كلتا الطريقتين (‪.)Taylor and Fauquet, 2002‬‬ ‫يتم حساب عدد النسخ المدخلة من قطعة الـ ‪ DNA‬من خالل عدد الحزم المتشكلة على الغشاء النايلوني‬ ‫ويستخدم البالزميد كشاهد إيجابي‪ ،‬كما ويستخدم نبات غير معدل كشاهد سلبي‪ .‬تجدر اإلشارة إلى أن‬ ‫حجم الحزمة الناتجة عن البالزميد تكون ذات حجم مختلف عن تلك المدخلة في جينوم النبات ( ‪Birch,‬‬ ‫‪.)1997‬‬ ‫تشرب نورذرن النقطي ‪Northern blot‬‬ ‫‪ّ .5-8-2‬‬ ‫استخدم اختبار تشرب سذرن النقطي بالتهجين مع سلسلة مسبر مكملة للكشف‪ ،‬والتقدير الكمي ‪(Thomas,‬‬ ‫)‪ ،1980‬ورصد تعبير المورثة المنقولة في نسيج معين على مستوى ‪ .mRNA‬وكما هو الحال في تشرب‬ ‫سذرن يحتاج اختبار تشرب نورذرن النقطي إلى كميات كبيرة من الحمض النووي جيد النوعية‪ ،‬لكنه‬ ‫‪27‬‬ ‫يختلف عن تشرب سذرن بعدم الحاجة إلى عملية هضم باألنزيمات‪ ،‬ألن المنسوخ مج أز بشكل طبيعي‪.‬‬ ‫يعد الـ ‪ RNA‬غير مستقر بالمقارنة مع الـ‪ ، DNA‬فقد يتحطم بسهولة بوساطة كل أنواع األنزيم ‪RNase‬‬ ‫على اليدين‪ ،‬واألدوات البالستيكية‪ ،‬واألدوات الزجاجية‪ ،‬والماء المقطر‪ ،‬لذلك يجب أن تعالج كل المحاليل‪،‬‬ ‫واألدوات الزجاجية‪ ،‬واالنابيب‪ ،‬ورؤوس الماصات للتخلص من ‪ RNase‬لمنع تحطم الـ ‪(Sambrook RNA‬‬ ‫)‪ ،and Russell 2001‬حيث يتم عزل واستخالص الـ ‪ RNA‬الكلي وفصله تبعا لوزنه الجزيئي عن طريق‬ ‫الرحالن الكهربائي على هالمة األغاروز‪ .‬يمكن أن يشكل الـ ‪ RNA‬تراكيب ثانوية فيلتف على نفسه‬ ‫بتشكيل روابط هيدروجينية بين القواعد المكملة لبعضها‪ ،‬لذلك يضاف الفورم الدهيد ‪ ،formaldehyde‬أو‬ ‫‪ glyoxal‬إلى الهالمة ومحلول تحميل العينات لكسر مثل هذه الروابط‪ .‬عند إضافة الفورم الدهيد للهالمة‬ ‫يجب التخلص منه قبل نقل الـ ‪ RNA‬للهالمة‪ ،‬ثم ينقل الـ ‪ RNA‬بالخاصة الشعرية من الهالمة إلى الغشاء‬ ‫النايلوني )‪ (Feinberg and Vogelstein, 1984‬المشحون بشحنة موجبة‪ ،‬يتم الكشف عن المنسوخ عن‬ ‫طريق التهجين بوساطة مسبر موسوم بمادة مشعة أو لونية‪ ،‬ومن الممكن أن يكون المسبر سلسلة ‪،RNA‬‬ ‫أو ‪ DNA‬مفردة )‪.(Memelink et al. 1994; Sambrook and Russell 2001‬‬ ‫‪ .6-8-2‬تلطخ وسترن ‪western blot‬‬ ‫تنتج المورثة التي تمنح الصفة بروتينا مؤشبا في النبات المعدل وراثيا‪ ،‬ويظهر تحليل تلطخ وسترن تقدي ار‬ ‫شبه كمي لهذا البروتين‪ ،‬ويستطيع الباحث من خالل هذا التحليل معرفة فيما إذا كانت المورثة تنتج‬ ‫البروتين الذي يمنح الصفة بشكل صحي )‪ .(Burnette, 1981‬تعتمد هذه التقنية على عزل البروتين‪ ،‬ثم‬ ‫فصله على هالمة بولي اكريالميد‪ ،‬ثم ينقل البروتين إلى غشاء نايلوني‪ ،‬ويتم الكشف عنه باستخدام‬ ‫أجسام مضادة أولية وثانوية‪ .‬من أكثر أنواع الهالم المستخدم في فصل البروتين )‪ (Reece, 2004‬تبعا‬ ‫لوزنه الجزيئي هو (‪ Sodium dodecyl sulfate polyacrylamies.)SDS-PAGE‬يستخدم في هذا النوع من‬ ‫الهالم عوامل إرجاع مثل ‪ ß-mercaptoethanol‬أو‪ ،DTT‬وذلك لدنترة أو فصل البروتين إلى سالسل‬ ‫عديد الببتيد ‪ ،polypeptides‬بينما يشحن الـ ‪ SDS‬السالسل الببتيدية بشحنة سالبة ‪(Memelink et al.‬‬ ‫)‪ ،1994‬ولذلك تنتقل هذه السالسل بالرحالن نحو القطب الموجب‪ .‬ينقل البروتين إلى غشاء‬ ‫)‪ Polyvinylidene fluoride (PVDF‬عن طريق التشرب الكهربائي ‪ ،electroblotting‬ثم ُيحضن الغشاء‬ ‫مع أجسام مضادة ترتبط بوساطة روابط هيدروجينية مع البروتين المؤشب ;‪(Memelink et al. 1994‬‬ ‫)‪ ،Sambrook and Russell 2001‬يتم الكشف عن األجسام المضادة عن طريق االقتران األنزيمي لجسم‬ ‫مضاد ثانوي بسبب تغير لوني يمكن الكشف عنه )‪ ،(Memelink et al., 1994‬يقدر البروتين بشكل شبه‬ ‫كمي تبعا لكثافة الحزم الناتجة‪ ،‬أو بالمقارنة مع بروتين قياسي‪.‬‬ ‫‪28‬‬ ‫الشكل ‪ .10‬مقارنة بين طرائق التهجين الثالث‬ ‫‪ .9-2‬التقويم الوظيفي للمورثات المنقولة‪:‬‬ ‫‪ .1-9-2‬التقويم الوظيفي للمورثة الواسمة لالنتخاب في النبات‬ ‫تتوزع المورثات الواسمة لالنتخاب في النبات ضمن مجموعتين رئيستين‪:‬‬ ‫‪ -A‬أنظمة االنتخاب اإليجابي‪:‬‬ ‫تمنح ميزات للخاليا ال ُمعدلة وراثيا بأن تتفوق بالنمو على الخاليا غير المحورة‪ ،‬تعتمد آلية العمل على‬ ‫إضافة مادة كيميائية سامة إلى وسط النمو كي تقتل الخاليا غير المحورة بشكل اصطفائي‪ ،‬بينما تسمح‬ ‫للخاليا المحورة بالنمو‪ ،‬ألن المورثة الواسمة لالنتخاب تمنح هذه الخاليا خاصية تعطيل ُسمية المادة‬ ‫الكيميائية المضافة‪.‬‬ ‫‪ -B‬أنظمة االنتخاب السلبي‪:‬‬ ‫تُشفر هذه المورثات لمركبات سامة تسبب قتل الخاليا المحورة بشكل اصطفائي‪ ،‬يقسم كال النظامين‬ ‫أيضا إلى شرطي تضاف فيه مادة إلى وسط النمو وغير شرطي ال يحتاج إلى إضافة مادة إلى وسط‬ ‫النمو‪.‬‬ ‫‪29‬‬ ‫تعد أنظمة االنتخاب اإليجابي الشرطي أكثر أنواع االنتخاب المستخدمة في مجال التحوير الوراثي للنبات‬ ‫والتي تقسم بدورها إلى‪:‬‬ ‫‪ -1‬النتخاب بوساطة المضادات الحيوية‬ ‫تعد المورثة )‪ neomycin phosphotransferase (nptII‬من أكثر مورثات االنتخاب شيوعا‪ ،‬وقد تم عزلها‬ ‫من المورثة النقالة ‪ Tn5‬من البكتريا ‪ .E. coli‬تشفر هذه المورثة لتركيب األنزيم‬ ‫‪neomycin‬‬ ‫‪ phosphotransferase‬الذي يعطل ُسمية العديد من المضادات الحيوية من مجموعة أمينو غليكوزيد‬ ‫‪ aminoglycoside‬مثل‪ :‬كانامايسين ‪ ،kanamycin‬وجنتسين ‪ ،G418‬وبارومومايسين ‪،paromomycin‬‬ ‫ونيومايسين ‪.neomycine‬‬ ‫تختلف األنواع النباتية من حيث استجابتها ل ُسمية هذه المركبات ولذلك يجب اختيار المركب األمثل منها‬ ‫لعملية االنتخاب‪ ،‬فعلى سبيل المثال‪ ،‬يعد استخدام المضاد الحيوي ‪ kanamycin‬مشكلة في انتخاب الرز‪،‬‬ ‫بينما يمكن استخدام المضاد الحيوي ‪ genticin‬لهذا الغرض‪.‬‬ ‫تم أيضا عزل المورثة ‪ hpt‬أو ‪ hph‬من البكتريا ‪ ،E. coli‬التي تشفر لتركيب األنزيم‬ ‫‪hygromycin‬‬ ‫‪ ،phosphotransferase‬استخدمت هذه التركيبة ‪ hpt/hygromycin B‬بنجاح في عملية التحوير الوراثي‬ ‫للتبغ‪ ،‬واألرابيدوبسس‪ ،‬والذرة‪ ،‬والرز‪ ،‬واألعشاب الرعوية‪ ،‬يملك المركب ‪ُ hygromycin‬سمية أكثر من‬ ‫المضاد الحيوي ‪ kanamycin‬خاصة على محاصيل الحبوب ولكنه سام أيضا لإلنسان‪.‬‬ ‫‪ -2‬النتخاب بوساطة مبيدات العشاب‬ ‫يسبب مبيد األعشاب)‪ Phosphinothricin (PPT‬بوجود مصدر الطاقة )‪ )ATP‬تثبيط عمل األنزيم‬ ‫)‪ Glutamine syntheetase (GS‬الموجود في النبات‪ ،‬األمر الذي يؤدي إلى تراكم سريع لألمونيا في‬ ‫الفراغات البينية للخاليا‪ ،‬وتوقف عمليتي التنفس والتمثيل الضوئي‪ ،‬وتمزق الجسيمات الصانعة الخضراء‪،‬‬ ‫وموت النبات خالل عدة أيام من رش المبيد (‪.)Wild et al.,1989‬‬ ‫عزلت المورثتان ‪ pat‬و‪ bar‬اللتان تمنحا صفة المقاومة للمبيد )‪ phophinothricin (PPT‬وذلك من نوعين‬ ‫من البكتيريا التابعة للجنس ‪ Streptomyces‬والرتبة ‪.Actinomycetales‬‬ ‫يتم اكتساب صفة المقاومة من خالل التشفير لتصنيع األنزيم ‪phosphinothricin acetyl transferase‬‬ ‫)‪ (PATs‬الذي يعطل عمل المبيد في النبات بإضافة مجموعة أستيل إلى المركب‪ .‬عزلت المورثة ‪bar‬‬ ‫التي تشفر لألنزيم ‪ PAT‬من النوع ‪ ،S. hygroscopicus‬بينما يتم التشفير لهذا األنزيم من قبل المورثة ‪pat‬‬ ‫والتي تم عزلها من النوع ‪ .S. viridochromogenes‬من أهم مميزات المبيد ®‪ Basta‬الذي يستخدم فيه‬ ‫‪ phosphinothricin – PPT‬كمادة فعالة تأثيره الموضعي‪ ،‬وبذلك فإن الخاليا التي تحوي على المورثة ‪bar‬‬ ‫‪30‬‬ ‫)‪ (bialaphos resistance gene‬تعطل ُسمية مبيد األعشاب في هذه الخاليا‪ ،‬مما يسهل من عملية‬ ‫االنتخاب عند استخدام هذا المبيد في عملية االنتخاب للخاليا المحورة )‪.(Stewart, 2008‬‬ ‫تتم عملية التقويم الوظيفي للمورثة الواسمة لالنتخاب بدهن ورقة من النبات بعامل االنتخاب‪ ،‬أو برش‬ ‫كامل النبات‪ ،‬بإضافة عامل االنتخاب بتركيز محدد‪ ،‬ثم زراعة البذور عليه بعد تطهيرها سطحيا‪ .‬تظهر‬ ‫أعراض ال ُسمية نتيجة المعاملة بالمبيد بشكل أوضح من المضادات الحيوية وخالل فترة زمنية قصيرة‬ ‫(حوالي أسبوع) حيث يؤدي إلى احتراق األوراق وتلونها بالبني‪ ،‬أما عند استخدام المضاد الحيوي كعامل‬ ‫انتخاب فتتلون األوراق بلون أصفر نتيجة فقدان اليخضور‪.‬‬ ‫‪ .2-9-2‬التقويم الوظيفي للمورثة التي تمنح الصفة المرغوبة‬ ‫تتطلب عملية غربلة النباتات من حيث مقاومتها لألمراض النباتية تقنيات فعالة تُمكن الباحثين من التمييز‬ ‫بين األنماط الحساسة واألنماط المقاومة وذلك بأقل جهد‪ .‬سابقا كانت التجارب الحقلية التي تجرى في ظل‬ ‫الظروف الطبيعية السائدة هي الطريقة السائدة‪ ،‬حيث كانت األكثر فعالية في عملية الغربلة والفحص‬ ‫بخاصة أنها تسمح بتعرض األنماط الوراثية لألمراض تحت ظروف الطبيعة‪ ،‬ولكن هذه الطريقة لم تكن‬ ‫تسمح بالتحكم بالظروف المناخية كالح اررة‪ ،‬والرطوبة‪ ،‬وحدوث المرض‪ ،‬أو حتى وجود فطور أخرى لم‬ ‫يكن باإلمكان التحكم بها‪ ،‬إضافة إلى أن احتياجاتها غالية الثمن والوقت الطويل الذي تحتاجه ‪Foolad et‬‬ ‫)‪ .)al., 2000‬الحقا استخدمت التجارب المخبرية التي سمحت بالسيطرة على عملية العدوى وتوقيتها‬ ‫وكذلك الظروف البيئية‪ .‬من هذه الطرائق اختبار الورقة المفصولة التي تجرى في أطباق بتري والتي تسمح‬ ‫بتحكم أكبر بظروف العدوى‪ ،‬يمكن من خالل اختبارات الورقة المفصولة الكشف عن مدى مقاومة الحقل‬ ‫أو المحصول لمسببات األمراض النباتية‪ ،‬وقد تم تطوير هذا االختبار من قبل )‪.)Tedford et al., 1990‬‬ ‫تمتلك اختبارات الورقة المفصولة ميزات متعددة‪ ،‬حيث يمكن من خاللها اختبار عدة سالالت وأنماط من‬ ‫الممرض بدون تحريض المقاومة الجهازية المكتسبة ‪ ،SAR‬كما تمتاز بالمقدرة على االختبار والمحافظة‬ ‫على النباتات الحساسة (وهو أمر ضروري في االختبارات الوراثية)‪ ،‬وزبادة المكررات وذلك من خالل‬ ‫زيادة عدد األوراق في حال اختبار نباتات ذات نمط وراثي فريد‪ .‬على سبيل المثال‪ ،‬استخدم هذا االختبار‬ ‫للتمييز بين األنماط الوراثية الحساسة والمقاومة لفطر ‪Phytophthora palmivora‬‬ ‫‪(Vawdrey et‬‬ ‫)‪ ، al.,2005‬كما تم استخدام هذا االختبار لدراسة مقاومة القمح والشعير لفطر البياض الدقيقي ‪(Brown‬‬ ‫)‪ ،&Wolfe ,1990‬أيضا استخدم هذا االختبار في دراسة لمقاومة نبات القمح لفطر ‪Mycosphaerella‬‬ ‫الحمص لفطر األسكوكيتا‪ ،‬حيث تم‬ ‫‪ ،(Arraiano et al., 2001) graminicola‬وكذلك في دراسة مقاومة ُ‬ ‫تقويم شدة المرض واإلصابة باستخدام الورقة المفصولة بأطباق بتري (‪.)Dolar et al.,1994‬‬ ‫‪31‬‬ ‫قام )‪ )Dolar, 1997‬بدراسة تأثير عمر الورقة وتركيز األبواغ لساللتين مختلفتين من فطر أسكوكيتا‬ ‫الحمص‪ ،‬استخدم خاللها أوراق نبات حمص حديثة وأخرى قديمة بعمر ‪ 30‬يوما‪ ،‬وقد أوضحت الدراسة أن‬ ‫ُ‬ ‫األوراق الحديثة أظهرت مقاومة أكثر مما هو عليه عند األوراق القديمة‪ ،‬كما توصل الباحث إلى أن زيادة‬ ‫تركيز األبواغ أدت إلى زيادة شدة اإلصابة‪ .‬استخدم اختبار الورقة المفصولة في دراسة أخرى على نبات‬ ‫الرز لتقويم مقاومته تجاه البكتريا ‪ ، Xanthomonas oryzae pv. oryzicola‬وكانت النتائج مرضية‬ ‫)‪ ،(Xie&Mew ,1998‬كذلك أعطى اختبار الورقة المفصولة نتائج جيدة في دراسة أجريت الختبار مقاومة‬ ‫عدة أصناف من الرز تجاه الفطر ‪Magnaporthe grisea‬‬ ‫‪32‬‬ ‫)‪.)Jia et al., 2003‬‬ ‫ثالثا‪ -‬أهداف البحث ‪Research Objectives‬‬ ‫حققت الهندسة الوراثية للنبات نجاحا مهما خالل السنوات الماضية في مجال مكافحة اآلفات الز ارعية‬ ‫وبخاصة مكافحة الحشرات‪ ،‬وتحمل مبيدات األعشاب‪ .‬تعد األمراض الفطرية من اإلجهادات األحيائية‬ ‫المهمة التي تسبب خسائر اقتصادية في الغلة‪ ،‬وقد تسهم البروتينات المرتبطة باإلمراضية ‪pathogenesis‬‬ ‫‪ related- proteins‬التي يمكن نقلها للنبات عن طريق الهندسة الوراثية في التقليل من نمو الممرض‬ ‫وتطور األعراض على النباتات المصابة‪ .‬عند ضمان تعبير أحد هذه المورثات مثل الكيتيناز ‪chitinase‬‬ ‫بشكل مستقر في النبات‪ ،‬يمكن أن يعزز ذلك من مقاومة هذا النبات للممرضات الفطرية‪.‬‬ ‫بناء على ذلك‪ ،‬فقد هدفت هذه الدراسة إلى‪:‬‬ ‫الحمص بوساطة التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪.PCR‬‬ ‫‪ .1‬الكشف عن المورثة ‪ chitinase‬في نباتات ُ‬ ‫والتي تمنح المقاومة لمبيد األعشاب‬ ‫‪ .2‬التقويم الحيوي للمورثة الواسمة لالنتخاب ‪bar‬‬ ‫‪.Phosphinothricin‬‬ ‫‪ .3‬الكشف عن نشاط المورثة كيتيناز ‪ chitinase‬بطريقة النسخ العكسي ‪.RT-PCR‬‬ ‫‪ .4‬تحديد عدد نسخ المورثة التي دخلت إلى جينوم النبات بوساطة تشرب سذرن ‪.Southern blot‬‬ ‫‪ .5‬دراسة األثر التضادي للمورثة كيتيناز ‪ chitinase‬في تثبيط نمو الفطر المسبب للفحة األسكوكيتا على‬ ‫الحمص‪.‬‬ ‫ُ‬ ‫‪33‬‬ ‫الفصل الثاني‬ ‫مواد البحث وطرائقه‬ ‫‪Materials and Methods‬‬ ‫‪34‬‬ ‫رابعا‪ -‬المواد والطرائق ‪Materials and Methods‬‬ ‫نفذ البحث خالل الفترة الواقعة بين عامي ‪ 2017 – 2014‬في مخبر أبحاث وقاية النبات في كلية الهندسة‬ ‫الزراعية في جامعة حلب بالتعاون مع المركز الدولي للبحوث الزراعية في المناطق الجافة (إيكاردا)‪ ،‬وقد‬ ‫استخدمت األدوات التالية في تنفيذ البحث‪:‬‬ ‫‪ o‬أصص بالستيكية‪.‬‬ ‫‪ o‬ورق نشاف‪.‬‬ ‫‪ o‬أنابيب اختبار‪.‬‬ ‫‪ o‬الوسط المغذي بيئة حمص آغار)‪ Chickpea Dextrose Agar (CDA‬لزراعة الفطر‪.‬‬ ‫‪ o‬حجرة عزل‪ ،‬جهاز تعقيم ‪ ،Autoclave‬ومجهر ضوئي‪ ،‬وحاضنات‪ ،‬وبراد‪ ،‬وميزان حساس‪ ،‬وشريحة‬ ‫عد كريات الدم الحمراء‪ ،‬وهاون بورسالن‪.‬‬ ‫‪ o‬رجاج ‪ ،vortex‬وجهاز طرد مركزي لألنابيب الصغيرة ‪ ،microfuge‬وجهاز تدوير حراري‪ ،‬وجهاز‬ ‫رحالن كهربائي أفقي‪ ،‬وجهاز طحن العينات‪ ،‬وجهاز المطياف الضوئي ‪،Spectrophotometer‬‬ ‫وماصات قياسية ‪ ،standard micropipette‬وجهاز توثيق الهالم ‪ ،gel documentation‬وحاضنة‬ ‫تهجين‪.‬‬ ‫‪ .1- 4‬المادة النباتية‬ ‫استخدم في هذه الدراسة الجيل الخامس لبذور حمص ُمعدلة وراثيا من الساللة ‪( N-292 /T5‬النمط ديزي‬ ‫‪ )desi‬التي تم تحويرها باستخدام البكتريا ‪( Agrobacterium tumefaciens‬خطيب وباوم‪ ،‬نتائج غير‬ ‫منشورة) كوسيط نقل إليها مورثة الكيتيناز ‪ Chit30‬التي مصدرها البكتريا ‪Streptomyces olivaceoviridis‬‬ ‫‪ ATCC 11238‬بهدف زيادة مقاومته للممرضات الفطرية‪.‬‬ ‫زرعت البذور في ‪ 6‬أصص سعة ‪ 2‬كغ‪ ،‬تحوي خلطة ترابية معقمة مكونة من التربة والبيتموس بنسبة‬ ‫‪ ،1:3‬بمعدل ثالث بذور في كل أصيص‪ ،‬كما زرع أصيصان من بذور غير محورة من المدخل‬ ‫‪( ICC12004‬النبات األب) بالطريقة نفسها تحت ظروف الحاضنة عند ‪º 2± 22‬س‪ ،‬تمت العناية‬ ‫بالنباتات من حيث الري والتسميد حسب الحاجة‪.‬‬ ‫‪ .2- 4‬التركيب الوراثي المنقول للنبات‬ ‫تحتوي المورثة كيتيناز المنقولة لنبات الحمص على إطار قراءة مفتوح مكون من ‪ 888‬زوجا نكليوتيديا‪،‬‬ ‫ويشفر ‪ 296‬حمضا أمينيا مع كودون بداية ‪ ،GTG‬ويشكل الغوانين والسيتوزين ‪ %70‬من قوام السلسلة‬ ‫‪35‬‬ ‫)‪ ،(70% GC‬وينتج عنها بروتين وزنه الجزيئي ‪ 28.9‬كيلو دالتون ‪ .)Hassan, 2006( KDa‬استخدم‬ ‫البالزميد ‪ pGIIvst-Chit‬الذي يحمل المورثة ‪ chitinase‬مع الحاث ‪ ،vst promoter‬إضافة إلى المورثة‬ ‫‪ bar‬التي تمنح صفة المقاومة لمبيد األعشاب )‪( Phosphinothricin (PPT‬الشكل ‪ )9‬والتي استخدمت‬ ‫كمورثة واسمة لالنتخاب في النبات‪.‬‬ ‫الشكل ‪ .11‬رسم تخطيطي للبالزميد ‪pGII-vst‬‬ ‫(عن ‪)Hassan, 2006‬‬ ‫‪ .3- 4‬استخالص الـ ‪ DNA‬الجينومي وقياس تركيزه ونقاوته واختبار نوعيته‬ ‫‪ .1.3- 4‬استخالص الـ ‪DNA‬‬ ‫الحمص الستخدامها في التفاعل التسلسلي‬ ‫تم استخالص الـ ‪ DNA‬من حوالي ‪ 0.3‬غ من أوراق ُ‬ ‫للبوليميراز (‪ )PCR‬وذلك باتباع خطوات االستخالص لكميات صغيرة من الـ ‪ DNA‬بطريقة الـ ‪CTAB‬‬ ‫المعتمدة من قبل )‪ (Doyle and Doyle, 1990‬مع تعديل في طريقة طحن العينات‪.‬‬ ‫‪ُ .1‬سحقت األوراق النباتية في ‪ 500‬ميكرولتر من محلول االستخالص‪ ،‬ثم نقل المزيج إلى أنبوب اختبار‬ ‫معقم سعة ‪ 2‬مل‪.‬‬ ‫بدأت عملية االستخالص بعد طحن العينة‪ ،‬وتسخين الحمام المائي ومحلول االستخالص للدرجة ‪° 60‬س‬ ‫على النحو التالي‪:‬‬ ‫‪36‬‬ ‫‪ .2‬أضيفت كمية ‪ 300‬ميكرولتر من محلول االستخالص ‪ CTAB‬المسخن مسبقا عند الدرجة ‪° 60‬س إلى‬ ‫العينة‪ ،‬وبذلك أصبح حجمه ‪ 800‬ميكرولتر‪ ،‬ويتكون محلول االستخالص من‪:‬‬ ‫)‪(3% CTAB, 1.4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, pH, 8.0, 0.5% PVP‬‬ ‫ُخلط المعلق بشكل جيد‪ ،‬ثم حضنت العينات لمدة ‪ 30‬دقيقة في الحمام المائي عند درجة الح اررة ‪° 60‬س‪.‬‬ ‫‪.3‬أضيفت كمية ‪ 800‬ميكرولتر من المزيج كلورفورم‪ :‬أيزوميل الكحول (‪chloroform isomyl )1:24‬‬ ‫‪ alcohol‬إلى العينة ‪ ،‬وخلطت المكونات بهدوء عن طريق التقليب لتجنب تقطيع الـ ‪.DNA‬‬ ‫‪.4‬فصلت مكونات المزيج بالطرد المركزي لمدة ‪ 10‬دقائق عند سرعة ‪ 13200‬دورة ‪/‬الدقيقة‪ ،‬على ح اررة‬ ‫الغرفة‪.‬‬ ‫‪.5‬نقل الرائق العلوي (الطور المائي) فقط إلى أنابيب جديدة‪ ،‬وأهمل الطور السفلي (العضوي للكلورفورم)‬ ‫‪ ،‬ثم أضيف إلى الرائق ثلثي حجمه من األيزوبروبانول ‪ isopropanol‬البارد (‪° 20-‬س) لترسيب الـ ‪DNA‬‬ ‫في الرائق‪.‬‬ ‫‪.6‬جمع الراسب (الـ ‪ )DNA‬بالطرد المركزي لمدة ‪10‬دقائق عند سرعة ‪ 13200‬دورة‪ /‬الدقيقة‪.‬‬ ‫‪ .7‬أهمل الرائق وأضيف فوق الراسب لغسيله كمية ‪ 200‬ميكرولتر من سائل الغسيل ‪10 ( WB‬ملليمولر‬ ‫خالت األمونيوم‪ 76 % ،‬كحول إيتيلي)‪.‬‬ ‫‪ .8‬تم التخلص من سائل الغسيل بعد عملية التثفيل بصبه بهدوء لتجنب فقدان الراسب‪ ،‬ثم تركت العينة‬ ‫لمدة ‪ 60 – 30‬دقيقة في جو معقم لتجف‪ ،‬أو جففت في المفرغة ‪ vacuum‬لمدة ‪ 10‬دقائق‪.‬‬ ‫علق الراسب في ‪ 200‬ميكرولتر من المحلول المنظم ‪ TE‬الذي يحوي أنزيم الـ ‪ RNase‬بتركيز‪100‬‬ ‫‪ُ .9‬‬ ‫ميكروغرام‪/‬مل‪ ،‬ثم حضنت العينة عند درجة ح اررة ‪° 37‬س لمدة ‪ 30‬دقيقة لتحطيم الـ ‪ RNA‬في العينة‪.‬‬ ‫‪ .10‬أضيفت كمية ‪ 100‬ميكرولتر من خالت األمونيوم ‪ Ammonium acetate‬تركيز ‪ 7.5‬مولر‪ ،‬و‪750‬‬ ‫ميكرولتر من الكحول اإليثيلي المطلق‪ ،‬وخلطت المكونات بهدوء‪.‬‬ ‫‪ .11‬أعيدت عملية الترسيب لمدة ‪ 10‬دقائق بالسرعة القصوى المذكورة سابقا‪.‬‬ ‫‪.12‬التخلص من الرائق‪ ،‬ثم تجفيف الراسب لمدة ساعة على درجة ح اررة الغرفة حتى تطاير الكحول‪ ،‬أو‬ ‫لمدة ‪ 10‬دقائق باستخدام المفرغة ‪.Vacuum‬‬ ‫‪ .13‬أضيفت كمية ‪ 200‬ميكرولتر من الماء المقطر والمعقم إلذابة الـ ‪ ، DNA‬حيث تركت العينات طوال‬ ‫الليل عند ح اررة ‪° 4‬س‪.‬‬ ‫‪ .2.3- 4‬قياس تركيز الـ ‪ DNA‬بوساطة المطياف الضوئي‬ ‫تم تقدير كمية الـ ‪ DNA‬المستخلص ونقاوته بوساطة المطياف الضوئي ‪ Spectrophotometr‬من نوع‬ ‫‪ ،Eppendorf BioPhotometer Plus 6132‬ثم تم تحضير تراكيز موحدة منه الستخدامها في التفاعل‬ ‫التسلسلي للبوليميراز ‪ PCR‬وذلك على النحو التالي‪:‬‬ ‫‪37‬‬ ‫تمت معايرة جهاز المطياف الضوئي بوساطة ‪ 200‬ميكرولتر من الماء المستخدم في إذابة الـ ‪ ،DNA‬ثم‬ ‫حضرت العينة المراد قياس تركيزها وذلك بأخذ كمية ‪ 10‬ميكرولتر من الـ ‪ DNA‬واضافتها إلى ‪190‬‬ ‫ُ‬ ‫ميكرولتر من الماء (عامل التخفيف ‪ُ .)1:20‬مزجت العينات على الرجاج ‪ vortex‬لمجانستها‪ ،‬ثم نقلت‬ ‫العينة إلى خلية الجهاز ‪ ،Cuvette‬وأُخذت القراءة عند طول موجة ‪ 260‬نانومتر لقياس الـ ‪ DNA‬و‪280‬‬ ‫نانومتر لقياس البروتين‪ ،‬حيث يكون االمتصاص أعظميا لكل منهما‪ ،‬تدل قيمة الكثافة الضوئية‬ ‫‪OD260‬‬ ‫‪ = 1‬على أن العينة المختبرة تحتوي ‪ 50‬ميكروغراما ‪/DNA‬مل‪ ،‬في حين توافق هذه القيمة كمية ‪40‬‬ ‫ميكرو غراما ‪/‬مل من الـ ‪، RNA‬أو الـ ‪ DNA‬أحادي السلسلة‪ ،‬و‪ 37‬بالنسبة إلى النكليوتيدات‪.‬‬ ‫يتم تقويم نوعية الـ ‪ DNA‬المستخلص وخلوها من البروتين والمركبات الفينولية من خالل النسبة بين قيمة‬ ‫نانومتر(‪ ،)OD260/OD280‬حيث يجب أن تتراوح هذه النسبة في العينات‬ ‫ا‬ ‫القراءة عند طول الموجة ‪ 260‬و‪280‬‬ ‫النقية مابين ‪ ،2-1.8‬ويدل انحراف القيمة عن هذا المعدل على تلوث العينة بالبروتين‬ ‫‪Sambrook and‬‬ ‫)‪ .)Russel, 2001‬تم تخفيف العينات إلى تركيز ‪50‬نانوغرام‪/‬ميكروليتر في حجم نهائي ‪ 100‬ميكرولتر‪،‬‬ ‫وذلك باستخدام المعادلة‪C1×V1 = C2×V2 :‬‬ ‫حيث إن‪:‬‬ ‫‪ :C1‬تركيز الـ ‪ DNA‬في المستخلص المركز وتؤخذ من قراءة الجهاز عند طول موجة ‪ 260‬نانومتر‪.‬‬ ‫‪ :V1‬الحجم الواجب أخذه من التركيز‪ C1‬للحصول على التركيز النهائي المخفف‪.‬‬ ‫‪ :C2‬التركيز النهائي الالزم تحضيره (‪ 50‬نانوغرام‪ /‬ميكروليتر)‪.‬‬ ‫‪ :V2‬الحجم النهائي المراد تحضيره (‪ 100‬ميكروليتر)‪.‬‬ ‫‪ .3.3- 4‬اختبار نوعية الـ ‪ DNA‬بالرحالن الكهربائي في هالمة الغاروز‪:‬‬ ‫جرى فحص نوعية الـ ‪ DNA‬والتأكد من سالمته من حيث حجم القطع الناتجة‪ ،‬وذلك بوساطة الرحالن‬ ‫الكهربائي على هالمة األغاروز ‪ agarose gel‬تركيز ‪ .%1‬تظهر جزيئات الحمض النووي ذات الوزن‬ ‫الجزيئي المرتفع على هالمة األغاروز كعصابات‪/‬حزم (‪ )bands‬واضحة أعلى الهالمة‪ ،‬بينما تبدو‬ ‫األشكال المكسرة جزئيا بشكل لطخة ‪ Smear‬مشوهة بأحجام طويلة وصغيرة تمتد على طول المسار ‪.lane‬‬ ‫‪ .1.3.3- 4‬المحاليل المستخدمة‪:‬‬ ‫‪ -1‬محلول تحميل العينات بتركيز ‪6x Loading dye buffer‬‬ ‫لتحضير ‪ 5‬مل من محلول التحميل‪ ،‬تخلط الكميات التالية‪:‬‬ ‫‪ 2‬مل غليسيرول‬ ‫‪ 3‬مل ماء مقطر ومعقم‬ ‫‪ 0.11‬غ من مادة ‪pH, 8.0 EDTA‬‬ ‫‪ 0.01‬غ من مادة التلوين ‪Bromophenol blue‬‬ ‫‪38‬‬ ‫يحفظ المزيج في البراد عند درجة ح اررة ‪° 4‬س‪.‬‬ ‫‪ -2‬المحلول المنظم ‪10x TBE‬‬ ‫لتحضير ‪ 1‬ليتر يلزم‪:‬‬ ‫‪ 0.89‬مولر ‪Tris-base‬‬ ‫‪ 0.89‬مولر ‪Boric acid‬‬ ‫‪ 20‬ملليمولر ‪ .pH, 8.0 ،EDTA‬يحفظ المحلول عند درجة ح اررة الغرفة‪.‬‬ ‫‪ .2.3.3- 4‬تحضير هالمة الغاروز‬ ‫ اُستخدمت صفيحة (قالب صب) األغاروز المخصصة لتحضير الهالمة‪ ،‬حيث تم وضع مشط‬‫مناسب حسب عدد العينات لتشكيل حفر بعد تصلب الهالمة‪ ،‬بحيث تستخدم هذه الحفر ‪wells‬‬ ‫لتحميل العينات‪.‬‬ ‫ ُحضرت هالمة أغاروز بتركيز ‪ ،%1‬وذلك بوزن كمية ‪ 1‬غ أغاروز واضافتها إلى كمية ‪ 100‬مل من‬‫محلول الرحالن ‪.1x TBE‬‬ ‫ ُسخن المزيج السابق في فرن األمواج القصيرة ‪ microwave‬لفترة قصيرة (حوالي دقيقتين)‪ ،‬حتى ذاب‬‫األغاروز بشكل كامل‪ ،‬ثم تم تبريده إلى درجة ح اررة ‪° 55‬س‪.‬‬ ‫ ُسكبت الهالمة في الصفيحة بهدوء مع الحرص على عدم تشكل فقاعات هوائية في الهالمة‪ ،‬وقد تم‬‫التخلص منها في حال تشكلها باستخدام رأس ماصة معقم‪.‬‬ ‫ بعد تصلب الهالمة تماما‪ ،‬وضعت الهالمة مع الصفيحة في جهاز الرحالن الكهربائي التي ملئت‬‫بكمية ‪ 500‬مل من محلول الرحالن ‪ 1x TBE‬حتى غطى سطح الهالمة بشكل كامل على ارتفاع‬ ‫حوالي ‪ 0.5‬سم‪.‬‬ ‫‪ .3.3.3- 4‬تحميل عينات الـ ‪ DNA‬في الهالمة‬ ‫ ُحضرت العينات بأخذ كمية ‪ 5‬ميكروليتر من الـ ‪ DNA‬المستخلص‪ ،‬و ‪ 5‬ميكروليتر ماء مقطر‬‫ومعقم‪ ،‬ثم أضيف لكل عينة ‪ 2‬ميكرولتر من محلول التحميل تركيزه ‪.6X loading dye buffer 6X‬‬ ‫ ُحملت عينات الـ ‪ DNA‬بعناية مع تجنب الخلط بين العينات‪ ،‬كما حمل في بداية كل مشط عينة‬‫مؤشر قياسي معلوم التركيز لمقارنة التركيز والنوعية (استخدمت كمية ‪ 50‬نانوغرام من المؤشر‬ ‫‪-‬‬ ‫القياسي المدا )‪.)λ DNA‬‬ ‫أغلق غطاء جهاز الرحالن الكهربائي ووصل بالتيار الكهربائي‪ ،‬حيث ُشغل عند فرق كمون ‪100‬‬ ‫فولت لمدة ‪ 50‬دقيقة‪.‬‬ ‫‪39‬‬ ‫‪ .4.3.3- 4‬التلوين والتظهير‬ ‫‪ -‬غسلت الهالمة بماء مقطر للتخلص من األمالح الموجودة في محلول الرحالن‪.‬‬ ‫‪ -‬غمرت الهالمة في محلول بروميد اإلثيديوم تركيز ‪ 0.5‬ميكروغرام‪ /‬مل‪ ،‬ولمدة ‪ 30-20‬دقيقة‪.‬‬ ‫‪ -‬غسلت الهالمة بالماء للتخلص من محلول التلوين‪ ،‬ثم صورت بوساطة كامي ار رقمية ملحقة بجهاز‬ ‫توثيق الهالم ‪ gel documentation‬تحت األشعة فوق البنفسجية‪ ،‬وحفظت الصورة في الحاسب‬ ‫الموصول بالجهاز ليصار إلى تحليلها الحقا‪.‬‬ ‫‪ .4-4‬الكشف عن المورثات المنقولة بوساطة التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪PCR‬‬ ‫تم االعتماد على اختبار التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪ PCR‬في الكشف عن المورثتين ‪ bar‬و‪Chitinase‬‬ ‫الحمص‪ ،‬يعتمد هذا االختبار على مكاثرة سلسلة الـ ‪ DNA‬مخبريا للمورثة التي تم نقلها‪،‬‬ ‫فى جينوم نبات ُ‬ ‫أو ألي جزء معلوم تسلسل‪ ،‬أو تتابع النكليوتيدات فيه من قطعة الـ ‪ T-DNA‬التي يفترض انتقالها بالكامل‬ ‫إلى الخلية النباتية‪ ،‬ويستخدم لهذا الغرض اثنتان من البادئات ‪ Primers‬المتخصصة‪ ،‬تتم عملية المكاثرة‬ ‫في جهاز التدوير الحراري ‪ Thermocycler‬وذلك بعد خلط المكونات الالزمة للتفاعل وهي الـ ‪DNA‬‬ ‫المستخلص من النبات‪ ،‬والمحلول المنظم للتفاعل ‪ ،PCR buffer‬ويستخدم اثنتان من البادئات أماميـة‬ ‫‪ Forward primer‬وعكسية ‪ ،Reverse primer‬ويستخدم أيضا وحدات البناء للسالسل الجديدة ‪،dNTPs‬‬ ‫وأنزيم بلمرة الـ ‪ DNA‬تاك ‪ ،DNA Taq polymerase‬ويكمل الحجم النهائي بماء مقطر معقم منزوع‬ ‫الشوارد‪.‬‬ ‫‪ .1-4-4‬الكشف عن المورثة كيتيناز ‪ Chitinase‬بوساطة الـ ‪PCR‬‬ ‫ُنفذ هذا االختبار باستخدام زوج من البادئات لمكاثرة قطعة بطول ‪ 555‬زوجا نكليوتيديا من المورثة كيتيناز‬ ‫البادئة األمامية‪ ،Chit 555-F: 5'-GGTGACATCGTCCGCTACAC-3' :‬والبادئة العكسية‪Chit 555- :‬‬ ‫'‪ .)Hassan,2006( R: GGTGTTCCAGTACCACAGCG-3‬إلجراء التفاعل‪ُ ،‬حضر أوال مزيج تفاعل‬ ‫ميكرولتر للعينة الواحدة‪ ،‬بحيث يحوي كل‬ ‫ا‬ ‫أساسي لكل العينات ‪ Master mix‬في حجم نهائي ‪20‬‬ ‫المكونات ماعدا الـ ‪ DNA‬المراد مكاثرتها‪ ،‬ويرتبط حجم هذا المزيج مع عدد العينات المراد اختبارها بما‬ ‫فيها عينات الشاهد اإليحابي والسلبي‪ ،‬ونسبة ‪ % 10‬زيادة على عدد العينات لضمان عدم حدوث نقص‬ ‫في حجم المحلول نتيجة السحب بالماصة‪.‬‬ ‫‪40‬‬ ‫‪ .1‬تحضير مزيج التفاعل الساسي‪:‬‬ ‫ُحضر مزيج التفاعل األساسي بحساب الكمية الالزمة لتحضير عينة واحدة بالتركيز المطلوب لكل مادة‬ ‫من مكونات التفاعل‪ ،‬وبناء عليه حسبت الكميات الالزمة لتحضير العدد الكلي من العينات المراد اختبارها‬ ‫(الجدول ‪.)1‬‬ ‫الجدول ‪ .1‬مكونات مزيج التفاعل األساسي للكشف عن المورثة كيتيناز بوساطة الـ ‪PCR‬‬ ‫التركيز النهائي المطلوب‬ ‫المكونات‬ ‫مزيج التفاعل الالزم لـ‬ ‫الحجم الالزم لعينة‬ ‫‪ 12‬عينة (ميكرولتر)‬ ‫واحدة (ميكرولتر)‬ ‫‪24‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪1x‬‬ ‫‪36‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪0.2 mM‬‬ ‫‪2 mM dNTPs‬‬ ‫‪12‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪0.5 µM‬‬ ‫) ‪Chit555-F ( 10 µM‬‬ ‫‪12‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪0.5 µM‬‬ ‫) ‪Chit555-R ( 10 µM‬‬ ‫‪2.4‬‬ ‫‪0.2‬‬ ‫‪1U‬‬ ‫‪129.6‬‬ ‫‪10.8‬‬ ‫‪Taq DNA Polymerase‬‬ ‫)‪(5 unit/μl‬‬ ‫‪ddH2O‬‬ ‫‪-‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪216‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪10x PCR Buffer +‬‬ ‫)‪MgCl2 (15 mM‬‬ ‫‪100 ng‬‬ ‫‪DNA‬‬ ‫‪Total‬‬ ‫مزجت المكونات بهدوء لمنع تشكل الرغوة التي تنتج عن وجود األنزيم‪ ،‬ثم ُجمعت أسفل األنبوب بعملية‬ ‫طرد مركزي سريعة تحت ظروف التبريد‪.‬‬ ‫ميكرولتر من مزيح التفاعل األساسي على أنابيب التفاعل ‪ ،PCR strips‬ثم أضيف إلى‬ ‫ا‬ ‫وزعت كمية ‪18‬‬ ‫كل أنبوب كمية ‪ 2‬ميكرولتر من الـ ‪ 50 ( DNA‬نانوغرام‪/‬ميكرولتر)‪.‬‬ ‫ُجمعت االعينات (‪ 20‬ميكرولتر لكل عينة) أسفل أنابيب التفاعل بالطرد المركزي لثوان معدودة مع التبريد‬ ‫ررة ‪° 4‬س‪ ،‬ثم وضعت العينات في جهاز التدوير الحراري ‪(Eppendorf Mastercycler,‬‬ ‫عند ح ا‬ ‫)‪ Germany‬الذي تم تشغيله أثناء تحضير مزيح التفاعل حتى يسخن الغطاء للدرجة ‪° 103‬س‪.‬‬ ‫‪41‬‬ ‫‪ .2‬برنامج التدوير الحراري‬ ‫تمت عملية المكاثرة بوساطة الـ ‪ PCR‬باستخدام برنامج تدوير حراري مناسب للمورثة كيتيناز ‪(Hassan,‬‬ ‫)‪ 2006‬وذلك وفق الخطوات التالية الواردة في الجدول (‪.)2‬‬ ‫الجدول ‪ .2‬برنامج التدوير الحراري لمكاثرة قطعة من المورثة كيتيناز‬ ‫درجة الح اررة‬ ‫المدة الزمنية‬ ‫عدد الدورات‬ ‫المرحلة‬ ‫الفصل األولي‬ ‫‪95‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪1‬‬ ‫الفصل الثاني‬ ‫‪94‬‬ ‫‪1‬‬ ‫ارتباط البادئات‬ ‫‪60‬‬ ‫‪1‬‬ ‫االمتداد‬ ‫‪72‬‬ ‫‪1‬‬ ‫االمتداد النهائي‬ ‫‪72‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪1‬‬ ‫حفظ التفاعل‬ ‫‪4‬‬ ‫∞‬ ‫‪-‬‬ ‫(‪°‬س)‬ ‫(دقيقة)‬ ‫‪29‬‬ ‫‪ .2-4-4‬الكشف عن المورثة ‪ bar‬بوساطة الـ ‪PCR‬‬ ‫‪ .1‬تحضير مزيج التفاعل‪:‬‬ ‫تم تحضير مزيج التفاعل للعدد ذاته من العينات بالطريقة نفسها الموضحة للمورثة ‪ Chitinase‬مع‬ ‫اختالف وحيد وهو البادئات‪ ،‬حيث استخدم زوج من البادئات لمكاثرة قطعة بطول ‪ 264‬زوجا نكليوتيديا من‬ ‫المورثة ‪:bar‬‬ ‫ البادئة األمامية‬‫‪ -‬البادئة العكسية‬ ‫'‪bar- F : 5'- GCAGGAACCGCAGGAGTGGA-3‬‬ ‫'‪bar- R: 5'- AGCCCGATGACAGCGACCAC-3‬‬ ‫‪42‬‬ ‫‪ .2‬برنامج التدوير الحراري‬ ‫الجدول ‪ .3‬برنامج التدوير الحراري لمكاثرة قطعة من المورثة ‪bar‬‬ ‫درجة الح اررة‬ ‫المدة الزمنية‬ ‫عدد الدورات‬ ‫المرحلة‬ ‫الفصل األولي‬ ‫‪94‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪1‬‬ ‫الفصل الثاني‬ ‫‪94‬‬ ‫‪1.5‬‬ ‫ارتباط البادئات‬ ‫‪62‬‬ ‫‪1.5‬‬ ‫االمتداد‬ ‫‪72‬‬ ‫‪0.5‬‬ ‫االمتداد النهائي‬ ‫‪72‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪1‬‬ ‫حفظ التفاعل‬ ‫‪4‬‬ ‫∞‬ ‫‪-‬‬ ‫(ثانية)‬ ‫(‪°‬س)‬ ‫‪30‬‬ ‫بعد انتهاء التفاعل‪ ،‬أضيف إلى كل عينة كمية ‪ 4‬ميكرولتر من محلول التحميل ‪6x loading dye buffer‬‬ ‫(بنسبة تخفيف ‪ ،)5:1‬ثم حملت كمية ‪ 10‬ميكروليتر من ناتج التفاعل على هالمة أغاروز تركيز ‪،%1.2‬‬ ‫تمت عملية الرحالن عند فرق كمون ‪ 100‬فولت ولمدة‪ 50‬دقيقة‪ ،‬وُلونت الهالمة ببروميد اإليثيديوم تركيز‬ ‫ظهرت تحت األشعة فوق البنفسجية في جهاز توثيق الهالم‪ ،‬وأخذت صورة رقمية‬ ‫‪ 0.5‬ميكروغرام‪/‬مل‪ ،‬ثم ُ‬ ‫للهالمة لتحليل النتائج‪.‬‬ ‫تمت مقارنة حجوم القطع الناتجة عند أي عملية رحالن كهربائي مع مؤشر قياسي للوزن الجزيئي ‪100‬‬ ‫زوج نكليوتيدي ‪.Molecular weight marker 100 bp‬‬ ‫‪ .5- 4‬الكشف عن نشاط المورثة كيتيناز ‪ chitinase‬بطريقة النسخ العكسي‬ ‫‪ .1-5-4‬استخالص الحمض النووي الريبي ‪RNA‬‬ ‫تهدف عملية عزل الـ ‪ RNA‬إلى الكشف عن نشاط المورثة المنقولة‪ ،‬حيث يتم نسخ الحمض النووي‬ ‫الريبي الرسول ‪ mRNA‬عن سلسلة الـ ‪ ، DNA‬ثم يترجم الـ ‪ mRNA‬إلى البروتين أو األنزيم‪ ،‬تم في‬ ‫البداية تحريض الحاث ‪ vst promoter‬المشغل للمورثة كيتيناز ‪ chitinase‬وذلك عن طريق وخز أوراق‬ ‫الحمص ال ُمعدلة وراثيا ونباتات الشاهد عدة مرات وهي على النبات بوساطة إبرة رفيعة معقمة وذلك‬ ‫نباتات ُ‬ ‫لضمان تراكم نسخ الـ ‪ mRNA‬عن المورثة المنقولة‪ ،‬تُركت األوراق لمدة ‪ 48‬ساعة على النبات‪ ،‬ثم فصلت‬ ‫عنه الستخدامها في عزل الحمض النووي الريبي الكلي ‪ ،total RNA‬تمت عملية االستخالص وفق‬ ‫تعليمات الشركة الصانعة )‪ (Promega, USA‬مع إجراء تعديل بسيط وهو سحق العينة النباتية الطازجة‬ ‫مباشرة في محلول االستخالص من المحلول المنظم ‪.RNA lysis buffer‬‬ ‫‪43‬‬ ‫الحمص‪ ،‬وسحقت مباشرة في ‪ 175‬ميكرولت ار من محلول‬ ‫‪ .1‬جمعت كمية ‪ 30‬مغ تقريبا من أوراق نبات ُ‬ ‫االستخالص )‪.RNA lysis buffer (RLA‬‬ ‫‪ .2‬نقل المزيج إلى أنابيب ابندورف ‪ Eppendorf‬سعة ‪ 2‬مل‪.‬‬ ‫ميكرولتر من المحلول )‪ ،RNA dilution buffer (RDA‬وخلطت المكونات بشكل جيد‪،‬‬ ‫ا‬ ‫‪ .3‬أضيف ‪350‬‬ ‫ثم تم فصلها بالطرد المركزي عند سرعة ‪ 3200‬دورة ‪/‬دقيقة ولمدة ‪ 10‬دقائق‪.‬‬ ‫‪ .4‬نقل الرائق إلى أنابيب طرد مركزي جديدة مع تجنب تحريك البقايا النباتية أو نقلها مع الرائق‪.‬‬ ‫‪ .5‬أضيف للرائق ‪ 200‬ميكرولتر كحول إيثيلي تركيز ‪ ،% 95‬ومزجت المكونات بالتقليب ‪ 4-3‬مرات‪ ،‬نقل‬ ‫المزيج إلى مجموعة التنقية أو عمود الفصل ‪ ، Spain column Assembly‬ثم ثفلت عند سرعة ‪13200‬‬ ‫دورة ‪/‬بالدقيقة لمدة دقيقة واحدة‪.‬‬ ‫‪ .6‬تم التخلص من السائل في أنبوب الجمع ‪ ،collection tube‬وأعيد تركيب عمود الفصل عليه مرة ثانية‪،‬‬ ‫حيث أضيفت كمية ‪ 600‬ميكرولتر من محلول الغسيل )‪ RNA wash solution (RWA‬إلى عمود الفصل‪،‬‬ ‫ثم أجريت عملية طرد مركزي عند السرعة السابقة لمدة دقيقة واحدة‪.‬‬ ‫‪ .7‬التخلص من السائل (محلول الغسيل) في أنبوب الجمع‪ ،‬واعادة تركيب عمود الفصل عليه إلى‬ ‫الحامل‪.‬‬ ‫‪ .8‬تم تحضير مزيج مكون من )‪ 5‬ميكرولتر ‪ 5 ،DNaseI‬ميكرولتر من كلوريد المغنزيوم ‪ MgCl2‬تركيزه‬ ‫‪ 0.09‬مولر‪ 40 ،‬ميكرولتر من المحلول ‪ )yellow core‬وذلك للتخلص من الـ ‪ DNA‬في كل عينة‪.‬‬ ‫(ت ُحضر الكمية المطلوبة من هذا المزيج تبعا لعدد العينات‪ ،‬ويحفظ األنزيم في الثلج‪ ،‬تتم عملية الخلط‬ ‫برفق‪ ،‬وال يستخدم الرجاج في عملية الخلط)‪.‬‬ ‫‪ .9‬أضيف ‪ 50‬ميكرولتر من هذا المزيج السابق فوق الفلتر في عمود الفصل الموجود في عمود الفصل‬ ‫مباشرة مع التأكد أن المزيج يغطي قاعدة األنبوب تماما‪.‬‬ ‫‪ُ .10‬حضنت العينات لمدة ‪ 15‬دقيقة على ح اررة الغرفة‪ ،‬ثم أضيف ‪ 200‬ميكرولتر من محلول إيقاف‬ ‫األنزيم )‪ ،DNAse stop solution (DSA‬ثم ثفلت عند السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة‪.‬‬ ‫(ال حاجة إلى تفريغ أنبوب الجمع قبل الخطوة التالية)‬ ‫‪ .11‬إضافة ‪ 600‬ميكرولتر من محلول الغسيل )‪ ،RNA Wash Solution (RWA‬وتم التثفيل عند السرعة‬ ‫القصوى لمدة دقيقة واحدة‪.‬‬ ‫ميكرولتر مرة أخرى من محلول الغسيل ‪ ،RWA‬و أعيدت‬ ‫ا‬ ‫‪ .12‬تفريغ أنبوب الجمع واضافة كمية ‪250‬‬ ‫عملية التثفيل السابقة لمدة دقيقتين‪.‬‬ ‫‪44‬‬ ‫‪ .13‬التخلص من أنبوب الجمع‪ ،‬ووضع عمود الفصل ضمن أنابيب التنقية ‪ Elution tube‬سعة ‪ 1.5‬مل‪،‬‬ ‫أضيفت كمية ‪ 100‬ميكرولتر من الماء المعقم فوق الفلتر مباشرة في عمود الفصل‪ ،‬وتُرك لمدة ‪ 5‬دقائق‬ ‫حتى يذوب الحمض النووي فيه‪.‬‬ ‫‪ .14‬التثفيل عند السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة‪ ،‬والتخلص من عمود الفصل‪ ،‬وحفظ الـ ‪RNA‬‬ ‫المستخلص عند ح اررة ‪° 80-‬س لحين استخدامه‪.‬‬ ‫‪ ‬تم قياس تركيز الـ ‪ RNA‬المستخلص ونقاوته بوساطة جهاز المطياف الضوئي بالطريقة نفسها التي‬ ‫استخدمت مع الـ ‪.DNA‬‬ ‫‪ .2-5-4‬تركيب سلسلة الـ ‪ DNA‬المكملة ‪cDNA‬‬ ‫أجريت عملية النسخ العكسي وفق تعليمات الشركة الصانعة باستخدام المجموعة الجاهزة (كيت ‪)kit‬‬ ‫‪ RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit‬من شركة )‪.(Fermentas, Germany‬‬ ‫تم التحضير لالختبار بإذابة المواد المخزنة في الثالجة عند ‪° 20-‬س‪ ،‬وتثفيل عينات الـ ‪ RNA‬لثوان‬ ‫معدودة لجمع المحلول أسفل األنبوب‪ ،‬ثم ُحضنت مباشرة في الثلج‪.‬‬ ‫توصي الشركة الصانعة ‪ Invitrogen‬باستخدام ‪ 5 – 0.1‬ميكروغرام من الـ ‪ RNA‬الكلي الصطناع سلسلة‬ ‫‪ cDNA‬مفردة‪ ،‬وقد تمت العملية وفق الخطوات التالية‪:‬‬ ‫‪ -1‬أضيفت كمية ‪ 11‬ميكروليتر من قالب الـ ‪ RNA‬مع ‪ 1‬ميكروليتر من البادئ (‪ )oligo dT18‬للحصول‬ ‫على حجم نهائي ‪ 12‬ميكروليتر‪.‬‬ ‫‪ -2‬في حال كان قالب الـ ‪ RNA‬غنيا بـ ‪ ،GC‬أو يحتوي على بنى ثانوية‪ ،‬يتم مزج المكونات بشكل‬ ‫لطيف‪ ،‬ثم ثفل لمدة ‪ 3-2‬ثانية‪ ،‬بعدها تحضن عند الدرجة ‪° 65‬س لمدة ‪ 5‬دقائق‪ ،‬ثم يوضع األنبوب‬ ‫مباشرة في الثلج للعمل على ارتباط البادئة مع الـ ‪ ،mRNA‬تجمع القطيرات أسفل األنبوب بالطرد المركزي‬ ‫لمدة ‪ 3- 2‬ثوان‪.‬‬ ‫‪ -3‬تم تحضير مزيج تفاعل يكفي ‪ 10‬عينات‪ ،‬حيث يضاف منه كمية ‪ 8‬ميكرولتر لكل من العينات‬ ‫ميكرولتر وقد احتوى على‬ ‫ا‬ ‫السابقة‪ ،‬وبذلك يصبح الحجم النهائي لمزيج تفاعل النسخ العكسي هو‪20‬‬ ‫المكونات التالية‪:‬‬ ‫‪45‬‬ ‫الجدول ‪ .4‬مكونات مزيج تفاعل التسخ العكسي‬ ‫الكمية الالزمة لـ‬ ‫الكمية الالزمة لعينة واحدة التركيز النهائي في‬ ‫‪ 10‬عينات‬ ‫المكونات‬ ‫( ميكروليتر)‬ ‫مزيج التفاعل‬ ‫‪40‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪1x‬‬ ‫‪20 U‬‬ ‫‪5x Reaction Buffer‬‬ ‫‪RNase RiboLock RNase‬‬ ‫)‪Inhibitor (20U/μl‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪1mM‬‬ ‫‪10 mM dNTP Mix‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪200 U‬‬ ‫‪RevertAid M-MuLV Reverse‬‬ ‫)‪Transcriptase (200 U/μl‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪-‬‬ ‫الحجم الكلي‬ ‫(ميكروليتر)‬ ‫‪ -4‬مزجت المكونات بهدوء‪.‬‬ ‫‪-5‬‬ ‫ررة ‪°42‬س‪ ،‬وذلك الصطناع السلسلة المكملة ‪cDNA‬‬ ‫حضن المزيج لمدة ساعة واحدة عند درجة ح ا‬ ‫باستخدام البادئة ‪.Oligo (dT)18‬‬ ‫‪ -6‬عند انتهاء التفاعل‪ ،‬تم التسخين لمدة ‪ 5‬دقائق عند درجة ‪°70‬س لوقف التفاعل‪.‬‬ ‫يمكن بعدها لناتج تفاعل النسخ العكسي أن يستخدم مباشرة في تضخيم الـ ‪ ،PCR‬أو يخزن عند درجة‬ ‫ح اررة ‪° 20 -‬س لفترة ال تتجاوز األسبوع‪ ،‬وعند الحاجة يخزن لفترات طويلة‪ ،‬عندها يمكن تخزينه عند‬ ‫درجة ح اررة ‪° 70-‬س‪.‬‬ ‫‪ .3-5-4‬النسخ العكسي‪ -‬التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪RT-PCR‬‬ ‫يمتاز هذا االختبار بفعاليته في الكشف عن نشاط المورثة ولكن بشكل نوعي وليس بشكل كمي‪ .‬أنجز‬ ‫هذا االختبار على مرحلتين‪ ،‬تم في المرحلة األولى نسخ سلسلة مفردة مكملة )‪ (cDNA‬عن الـ‪mRNA‬‬ ‫بوساطة أنزيم النسخ العكسي ‪ .Reverse transcriptase‬أما في المرحلة الثانية فقد استخدمت سلسلة الـ‬ ‫)‪ (cDNA‬المكملة كقالب للمكاثرة بوساطة التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪ PCR‬باستخدام بادئات متخصصة‬ ‫على هذه المورثة‪.‬‬ ‫استخدمت كمية ‪ 2‬ميكرولتر من مزيج ‪ cDNA‬كقالب في تفاعل ‪ PCR‬عادي لمكاثرة المورثة كيتيناز‬ ‫باستخدام البادئات ‪ Chit555-F‬و‪ Chit555-R‬وفق شروط التفاعل المذكورة سابقا (‪ ،(2-4‬كما استخدمت‬ ‫الكمية ذاتها من المزيج في تفاعل آخر للكشف عن نشاط المورثة ‪ actin‬كشاهد للمقارنة‪ ،‬وهي مورثة‬ ‫‪46‬‬ ‫داخلية المنشأ ‪ endogenous gene‬في ال ُحمص‪ ،‬وذلك باستخدام بادئات تضاعف قطعة بطول ‪ 164‬زوجا‬ ‫نكليوتيديا من المورثة ‪:actin‬‬ ‫’‪ACT-1-F: 5’- CGTCTTGACCTGGCTGGTCGC-3‬‬ ‫’‪ACT-1-R: 5’-GGCTGTCTCCAGCTCTTGCTCG-3‬‬ ‫تمت عملية المكاثرة للمورثة ‪ actin‬وفق برنامج التدوير الحراري التالي‪:‬‬ ‫الجدول ‪ .5‬برنامج التدوير الحراري لمكاثرة قطعة من المورثة ‪ actin‬داخلية المنشأ‬ ‫درجة الح اررة‬ ‫المدة الزمنية‬ ‫عدد الدورات‬ ‫المرحلة‬ ‫الفصل األولي‬ ‫‪95‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪1‬‬ ‫الفصل الثاني‬ ‫‪94‬‬ ‫‪1‬‬ ‫ارتباط البادئات‬ ‫‪55‬‬ ‫‪1‬‬ ‫االمتداد‬ ‫‪72‬‬ ‫‪1‬‬ ‫االمتداد النهائي‬ ‫‪72‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪1‬‬ ‫حفظ التفاعل‬ ‫‪4‬‬ ‫∞‬ ‫‪-‬‬ ‫(دقيقة)‬ ‫(‪ °‬س)‬ ‫‪35‬‬ ‫فصلت نواتج التفاعل بالرحالن الكهربائي على هالمة أغاروز تركيز ‪ ،%1.2‬ثم لُونت الهالمة في محلول‬ ‫ظهرت صورة الهالمة تحت األشعة فوق البنفسجية في‬ ‫بروميد اإليثيديوم تركيز ‪ 0.5‬ميكروغرام‪/‬مل‪ ،‬و ُ‬ ‫جهاز توثيق الهالم‪ ،‬ثم أخذت صور رقمية للهالمة لتحليل النتائج‪.‬‬ ‫تم التعرف إلى قياس القطع الناتجة باستخدام مؤشر قياسي للوزن الجزيئي ‪ 100‬زوج نكليوتيدي‬ ‫‪.Molecular weight marker 100 bp‬‬ ‫تشرب سذرن ‪Southern blot‬‬ ‫‪ .6- 4‬تهجين الـ ‪ DNA‬بتقنية ّ‬ ‫استخدمت هذه التقنية لتأكيد انتقال المورثة كيتيناز‪ ،‬ومعرفة عدد النسخ من الـ ‪ T-DNA‬المنقولة إلى‬ ‫الحمص وذلك باتباع الخطوات التالية‪:‬‬ ‫جينوم نبات ُ‬ ‫‪47‬‬ ‫‪ .1-6-4‬تحضير ووسم المسبر بالطريقة غير اإلشعاعية‪:‬‬ ‫بينت الدراسات السابقة أنه يمكن وسم المسبر بالطريقة غير اإلشعاعية ‪non-radioactively labeled‬‬ ‫‪ DNA Probe‬واستخدامه في عملية التهجين بكفاءة المسبر نفسه الم ُحضر بالطريقة اإلشعاعية عندما يتم‬ ‫ضبط ظروف العمل بشكل جيد‪.‬‬ ‫تتميز الطريقة غير اإلشعاعية بسهولة تحضير المسبر‪ ،‬وتجنب التأثيرات الضارة للمواد المشعة‪ ،‬كما‬ ‫يمكن استخدام المسبرنفسه لعدة مرات‪.‬‬ ‫تم تحضير مسبر ‪ Probe‬للمورثة ‪ Chitinase‬بالطريقة غير اإلشعاعية وبوساطة التفاعل التسلسلي‬ ‫للبوليميراز ‪ PCR‬وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (‪ ،)Roche Applied Science Germany‬حيث تم‬ ‫استخدام الديكسوجينين ‪ Digoxigenin-11-dUTP‬كمادة للوسم‪ ،‬وقد ُحضر مزيج التفاعل وفق الكميات‬ ‫الموضحة في الجدول (‪.)6‬‬ ‫الجدول ‪ .6‬مزيج التفاعل الـتسلسلي للبوليمراز المستخدم في وسم المسبر بالطريقة غير اإلشعاعية‬ ‫الكمية الالزمة لتحضير‬ ‫الكمية الالزمة‬ ‫الكمية الالزمة‬ ‫الشاهد اإليجابي ‪* TPA‬‬ ‫لتحضير المسبر غير‬ ‫لتحضير المسبر‬ ‫‪29.25‬‬ ‫‪24.25‬‬ ‫‪24.25‬‬ ‫ماء معقم منزوع الشوارد‬ ‫‪5‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪5‬‬ ‫)‪10x PCR Buffer + MgCl2, vial(3‬‬ ‫‪5‬‬ ‫_‬ ‫‪5‬‬ ‫)‪PCR DIG, vial (2‬‬ ‫_‬ ‫‪5‬‬ ‫_‬ ‫)‪dNTPs, vial (4‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪5‬‬ ‫)‪Chi555-F (10µM‬‬ ‫)‪5 μl vial (6‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪5‬‬ ‫)‪Chi555-R (10µM‬‬ ‫‪0.75‬‬ ‫‪0.75‬‬ ‫‪0.75‬‬ ‫)‪Taq DNA Polymerase (5 unit/μl‬‬ ‫)‪5 μl vial (5‬‬ ‫)‪5 μl (10 ng‬‬ ‫)‪5 μl (10 ng‬‬ ‫‪DNA‬‬ ‫‪50 μl‬‬ ‫‪50 μl‬‬ ‫‪50 μl‬‬ ‫الحجم الكلي‬ ‫(ميكرولتر)‬ ‫الموسوم (ميكرولتر)‬ ‫المكونات‬ ‫الموسوم (ميكرولتر)‬ ‫* ‪ : TPA‬مورثة معزولة من اإلنسان تستخدم كشاهد يفيد في التأكد من فاعلية الكيت المستخدم في عملية الوسم‬ ‫‪48‬‬ ‫وزعت كمية ‪ 45‬ميكرولتر من مزيج التفاعل على أنابيب الـ ‪ ، PCR‬ثم أضيفت كمية ‪ 5‬ميكرولتر من الـ‬ ‫‪( DNA‬تركيز ‪ 10‬نانوغرام‪/‬ميكرولتر) لكل عينة مختبرة‪.‬‬ ‫تم أخذ كمية ‪ 5‬ميكرولتر من مزيج التفاعل‪ ،‬وأضيف لها كمية ‪ 1‬ميكرولتر من محلول التحميل ‪6x‬‬ ‫‪ُ ،loading dye buffer‬حمل المزيج للعينات الثالث (المسبر الموسوم وغير الموسوم والشاهد ‪ )TPA‬على‬ ‫هالمة أغاروز تركيز ‪ %1.2‬وذلك وفق شروط الرحالن السابق ذكرها مع التفاعل التسلسلي للبوليميراز‬ ‫‪ PCR‬للمورثة ‪ ،Chitinase‬وأخذت صورة رقمية للهالمة‪.‬‬ ‫‪ .2-6-4‬هضم الـ ‪ DNA‬بوساطة أنزيمات القطع‪:‬‬ ‫تعد عملية الهضم األنزيمي الخطوة األولى في اختبار تشرب سذرن‪ ،‬حيث تقود عملية الهضم إلى إنتاج‬ ‫قطع بأطوال متباينة تبعا لنوع األنزيم المستخدم‪ ،‬العامل المحدد لنوع األنزيم المستخدم في الكشف عن‬ ‫عدد نسخ المورثة المنقولة‪ ،‬أو المواقع الوراثية المتشكلة نتيجة التحوير الوراثي هو أن يكون لألنزيم موقع‬ ‫تعرف أو قطع وحيد ضمن قطعة الـ ‪ T-DNA‬المنقولة للنبات‪ ،‬وقد استخدم األنزيم ‪ BamHI‬في عملية‬ ‫الهضم‪.‬‬ ‫يتطلب هذا التفاعل حوالي ‪ 20‬ميكروغرام من الـ ‪ ،DNA‬وعمليا يحتاج كل ‪ 1‬ميكروغرام من الـ ‪DNA‬‬ ‫إلى وحدة أ نزيمية واحدة إلتمام عملية الهضم‪ ،‬كما يفضل إضافة كمية إضافية من األنزيم في صباح‬ ‫اليوم التالي لضمان الهضم الكامل للـ ‪ DNA‬على اعتبار أن الهضم يتم طوال الليل‪ .‬تجدر اإلشارة هنا‬ ‫إلى نقطة مهمة وقاعدة عامة وهي أن كمية األنزيم يجب أال تزيد عن نسبة )‪ (10:1‬من حجم التفاعل‪.‬‬ ‫ُحضر مزيج تفاعل الهضم األنزيمي لعينة من كل ساللة من السالالت بما فيها النبات األب غير‬ ‫المحور كشاهد‪ ،‬إضافة إلى شاهد إيجابي هو البالزميد الذي استخدم سابقا في عملية التحوير الوراثي‬ ‫للنبات‪ ،‬ويحمل التركيبة الوراثية نفسها المنقولة للنبات‪.‬‬ ‫ُحضر مزيج التفاعل في حجم نهائي ‪ 200‬ميكرولتر‪ ،‬بحيث يحتوي على المكونات الموضحة في الجدول‬ ‫(‪.)7‬‬ ‫الحمص باألنزيم ‪.BamHI‬‬ ‫الجدول ‪ .7‬مكونات مزيج هضم الـ ‪ DNA‬الجينومي لنبات ُ‬ ‫الكمية (ميكرولتر)‬ ‫المكونات‬ ‫‪25‬‬ ‫ماء معقم منزوع الشوارد‬ ‫‪20‬‬ ‫‪10x Enzyme buffer‬‬ ‫‪5‬‬ ‫)‪Bam HI (10 U/µl‬‬ ‫‪150‬‬ ‫‪DNA‬‬ ‫‪200‬‬ ‫الحجم الكلي للتفاعل‬ ‫‪49‬‬ ‫ُحضن مزيج الهضم عند ح اررة ‪° 37‬س طوال الليل (حوالي ‪ 16‬ساعة) وذلك إلتمام عملية الهضم‪ ،‬تمت‬ ‫عملية التنقية والترسيب مرة أخرى للـ ‪ DNA‬كالتالي‪:‬‬ ‫نظ ار إلى استخالص الـ ‪ DNA‬بكميات صغيرة فقد كانت التراكيز كافية لعمل الـ ‪ ،PCR‬بينما يتطلب‬ ‫اختبار تشرب سذرن استخالص الـ ‪ DNA‬بكميات كبيرة‪ ،‬وقد تم تالفي هذا األمر باستخدام كمية كبيرة‬ ‫من مستخلص الـ ‪ DNA‬في الهضم‪ ،‬ثم إعادة ترسيبها وحلها في كمية أقل بما يتناسب مع تحميلها في‬ ‫حفر ‪ well‬هالمة األغاروز تبعا لنوع المشط المستخدم‪.‬‬ ‫‪ -‬أضيف كمية ‪ 100‬ميكرولتر من خالت األمونيوم تركيز ‪ 7.5‬مولر‪ ،‬و‪ 750‬ميكرولتر من الكحول‬ ‫اإليثيلي تركيزه ‪ %100‬المطلق‪ ،‬ثم خلطت المكونات بشكل جيد عن طريق تقليب األنابيب لترسيب الـ‬ ‫‪.DNA‬‬ ‫‪ -‬فصل ال ارسب عن طريق الطرد المركزي للمزيج عند سرعة ‪ 13200‬دورة‪ /‬دقيقة لمدة ‪ 10‬دقائق‪.‬‬ ‫غسل الراسب في كمية ‪ 1‬مل من الكحول اإليثيلي تركيز ‪ ،%75‬ثم ُرسب مرة أخرى عند الشروط السابقة‪.‬‬ ‫ التخلص من الكحول‪ ،‬ثم ترك الراسب لمدة ساعة عند درجة ح اررة الغرفة حتى يجف‪.‬‬‫‪ -‬أضيفت كمية ‪ 40‬ميكرولتر من الماء المقطر والمعقم على الراسب‪ ،‬وتُرك ليذوب عند ح اررة ‪° 4‬س‪.‬‬ ‫‪ .3-6-4‬تحميل العينات والرحالن الكهربائي‬ ‫حضرت العينات بإضافة ‪ 8‬ميكرولتر من محلول التحميل ‪ 6x Loading dye buffer‬إلى كل عينة (‪40‬‬ ‫ُ‬ ‫ميكرولتر)‪ ،‬وحملت العينات بعد مجانستها بوساطة الماصة ‪ Pipette‬في حفر هالمة األغاروز تركيز‬ ‫حملت كمية ‪ 12‬ميكرولتر من المؤشر القياسي للوزن الجزيئي الموسوم ( ‪DIG labeled marker‬‬ ‫‪ُ ،%0.8‬‬ ‫‪ 10( ،)ӀӀ‬ميكرولتر مؤشر قياسي ‪ 2 +‬ميكرولتر محلول تحميل)‪.‬‬ ‫ُحملت كمية ‪ 2‬ميكرولتر من ناتج تفاعل ال ‪ PCR‬للمورثة نفسها كشاهد إيجابي‪ ،‬وذلك بعد ‪ 3‬ساعات من‬ ‫بدء عملية الرحالن (في الحالة المثالية تحمل هذه العينة قبل ساعتين من انتهاء الرحالن طوال الليل‬ ‫والذي يمتد لحوالي ‪ 16‬ساعة عند فرق كمون ‪ 25 – 20‬فولط)‪ ،‬وقد ُعدلت هذه الخطوة بحيث فصلت‬ ‫نواتج الهضم بالرحالن الكهربائي لمدة ‪ 6‬ساعات فقط‪ ،‬وعند فرق كمون ‪ 50‬فولط‪.‬‬ ‫لونت الهالمة بوساطة بروميد اإليثيديوم‪ ،‬وظهرت الصورة بتعريض الهالمة لألشعة فوق البنفسجية في‬ ‫جهاز توثيق الهالم (‪(Gel documentation‬‬ ‫‪50‬‬ ‫الشكل ‪ .12‬تحميل العينات في حفر هالمة األغاروز وترحيلها‬ ‫‪ .4-6-4‬نقل الـ ‪ DNA‬إلى الغشاء النايلوني ‪Southern transfer‬‬ ‫‪ -‬بعد تصوير الهالمة والتأكد من هضم كمية الـ ‪ DNA‬المستخدمة بالكامل‪ ،‬حيث تظهر لطخة ممتدة‬ ‫‪ Smear‬على طول المسار‪.‬‬ ‫‪ -‬غمرت الهالمة لمدة ‪ 10‬دقائق في محلول حمض كلور الماء تركيز ‪ 0.25‬مولر مع التحريك البطيء‬ ‫وذلك لتكسير سالسل الـ ‪ DNA‬الطويلة بنزع قواعد البورينات ‪( Depurination‬األدنين والغوانين)‪.‬‬ ‫مقطر ومعقما للتخلص من الحمض‪.‬‬ ‫ا‬ ‫‪ -‬غسلت الهالمة مرتين بكمية ‪ 250‬مل ماء‬ ‫‪ -‬غمرت الهالمة في كمية ‪ 250‬مل لمدة ‪ 30‬دقيقة على مرحلتين (‪ 15 × 2‬دقيقة) في محلول الفصل‬ ‫‪ Denaturation solution‬مع التحريك لفصل سلسلة الـ ‪ DNA‬المزدوجة إلى سالسل مفردة‪.‬‬ ‫‪ -‬غسلت الهالمة بالماء المعقم والمقطر للتخلص من محلول الفصل‪ .‬تمت معادلة درجة الـ ‪ pH‬بغمر‬ ‫الهالمة في ‪ 250‬مل من محلول التعادل ‪ Neutralization solution‬لمدة ‪ 30‬دقيقة أيضا على مرحلتين (‪2‬‬ ‫× ‪ 15‬دقيقة) مع التحريك لتحييد درجة الحموضة‪.‬‬ ‫ ُحضر الغشاء النايلوني (‪ )Nylon membrane, Roche/Germany‬والمشحون بشحنة موجبة خالل‬‫مراحل االنتظار السابقة‪ ،‬وذلك بقصه على أبعاد الهالمة مضافا إليها ‪ 0.5‬سم من كل جهة‪ ،‬وكذلك قص‬ ‫ثالث قطع من ورق الترشيح تزيد أبعادها عن الهالمة بمقدار ‪ 1‬سم من كل جهة‪ ،‬واستخدمت قطعة واحدة‬ ‫كبيرة كجسر لها عرض القطع الصغيرة نفسها وضعف أو ثالثة أمثال طولها‪.‬‬ ‫‪ -‬في البداية غمر الغشاء في محلول النقل ‪ saline-sodium citrate‬المخفف إلى تركيز (‪ )2x SSC‬وترك‬ ‫فيه لمدة ‪ 5‬دقائق‪ ،‬ثم تم القيام بعملية النقل وفق الخطوات التالية‪:‬‬ ‫‪ .1‬وضعت قطعة من لوح زجاجي فوق وعاء يحوي كمية كافية من محلول النقل األساسي ‪.20x SSC‬‬ ‫‪51‬‬ ‫‪ُ .2‬رطبت قطعة ورق الترشيح الطويلة في محلول النقل‪ ،‬ووضعت على اللوح الزجاجي بحيث تكون‬ ‫نهايتها في محلول النقل الموجود في الوعاء‪.‬‬ ‫‪ .3‬تم طرد الفقاعات المتشكلة بين ورقة الترشيح واللوح الزجاجي بتمرير ماصة زجاجية فوقها‪.‬‬ ‫‪ .4‬وضعت كمية من محلول النقل في مركز ورقة الترشيح‪ ،‬ثم وضعت الهالمة بحذر مقلوبة رأسا على‬ ‫عقب فوق ورقة الترشيح‪.‬‬ ‫‪ .5‬نقل الغشاء النايلوني بعد ترطيبه بوساطة ملقطين‪ ،‬ووضع فوق الهالمة‪ ،‬ثم طردت الفقاعات التي قد‬ ‫تعيق عملية النقل إلى الغشاء‪.‬‬ ‫‪ .6‬وضعت قطعة من الرقاقات البالستيكية ‪ Plastic foil‬بين حافة الوعاء والغشاء بحيث تغطي حوالي‬ ‫‪ 0.5‬سم من طرف الغشاء ومن كل الجهات‪ ،‬وذلك للفصل بين الغشاء وورقة الترشيح من جهة والمناديل‬ ‫الورقية من الجهة األخرى‪ ،‬وبذلك يبقى الطريق الوحيد لمرور محلول النقل من الوعاء نحو المناديل‬ ‫الورقية عبر الهالمة والقطع الصغيرة من ورق الترشيح‪ ،‬حيث تنتقل قطع الـ ‪ DNA‬من الهالمة إلى الغشاء‬ ‫النايلوني بالخاصية الشعرية‪.‬‬ ‫‪ُ .7‬رطبت قطع ورق الترشيح الثالث الصغيرة في محلول النقل المخفف )‪ ، (2x SSC‬ووضعت فوق‬ ‫الغشاء واحدة تلو األخرى مع طرد الفقاعات في كل مرة‪.‬‬ ‫‪ .8‬وضعت كمية من المناديل الورقية بارتفاع حوالي ‪ 8‬سم فوق ورقة الترشيح‪.‬‬ ‫‪ .9‬وضع لوح زجاجي آخر فوق المحارم‪ ،‬وفوقه وزن ‪500- 250‬غ بحيث يتوزع الثقل بشكل متجانس فوق‬ ‫الهالمة دون أن يفتتها‪.‬‬ ‫‪ .10‬تركت الهالمة طوال الليل (‪16‬ساعة على األقل) إلتمام عملية النقل (الشكل ‪.)11‬‬ ‫الشكل ‪ .13‬نقل قطع الـ ‪ DNA‬من الهالمة إلى الغشاء النايلوني بالخاصية الشعرية‬ ‫‪52‬‬ ‫‪ .5-6-4‬تثبيت الـ ‪ DNA‬على الغشاء النايلوني‬ ‫‪ ‬في اليوم التالي تم أخذ الغشاء بعد رفع األجزاء الموجودة فوقه (الوزن‪ ،‬واللوح الزجاجي‪ ،‬والمناديل‬ ‫الورقية‪ ،‬وورق الترشيح) ثم ُغسل بهدوء في محلول ‪ ،2x SSC‬ووضع بين ورقتي ترشيح لتجفيفه عند درجة‬ ‫ح اررة الغرفة‪.‬‬ ‫‪ ‬وضع الغشاء بعد لفه بورقة ألمنيوم في الفرن المسخن مسبقا لدرجة ‪° 120‬س‪ ،‬و لمدة ‪ 20‬دقيقة لتثبيت‬ ‫الـ ‪ DNA‬أحادي السلسلة المنقول على الغشاء‪ ،‬تم في هذه األثناء أخذ صورة أخرى للهالمة للتأكد من‬ ‫انتقال كل كمية الـ ‪ DNA‬التي تم هضمها وترحيلها من الهالمة إلى الغشاء‪.‬‬ ‫‪ .6-6-4‬تحضير الغشاء للتهجين وعملية التهجين‬ ‫‪ ‬أخذت كمية ‪ 10‬ميكرولتر من المسبر الموسوم (‪ 2‬ميكرولتر لكل ‪ 1‬مل محلول تهجين وفق تعليمات‬ ‫الشركة الصانعة ‪ ،‬ويمكن زيادة هذه الكمية عندما يكون ناتج المكاثرة ضعيفا)‪ ،‬ثم أكمل الحجم إلى‬ ‫‪50‬ميكرولتر ماء مقطر وخلطت بشكل جيد وهي موضوعة في الثلج‪.‬‬ ‫‪‬‬ ‫ررة ‪° 95‬س ولمدة ‪5‬‬ ‫فصلت السلسلة المزدوجة للمسبر عند استخدامه ألول مرة بتسخينه عند درجة ح ا‬ ‫دقائق‪ ،‬ثم حضن مباشرة في الثلج‪.‬‬ ‫‪‬‬ ‫وضع الغشاء في أنابيب التهجين في مرحلة ماقبل التهجين ‪ ، pre-hybridisation‬وأضيف له محلول‬ ‫التهجين بمعدل ‪ 10‬مل‪ 100 /‬سم‪ 2‬من مساحة الغشاء بدون إضافة المسبر‪ ،‬وتُرك لمدة ‪ 30‬دقيقة‬ ‫ررة ‪42‬‬ ‫(يمكن أن تمتد هذه الفترة حتى ‪ 3‬ساعات كحد أقصى) وذلك في فرن التهجين عند درجة ح ا‬ ‫‪°‬س مع التحريك الدوراني‪.‬‬ ‫‪ ‬استبدل المحلول السابق بمحلول التهجين ‪ DIG hybridization buffer‬الحاوي على المسبر بإضافة‬ ‫محلول التهجين الحاوي على المسبر بمعدل ‪ 3.5‬مل‪ 100 /‬سم‪ 2‬من مساحة الغشاء وبالطريقة نفسها‬ ‫التي تم شرحها سابقا‪.‬‬ ‫‪ ‬أضيف المسبر (‪ 2‬ميكرولتر من المسبر لكل ‪ 1‬مل محلول تهجين) الذي فصلت سالسله مسبقا‬ ‫بالتسخين إلى سالسل مفردة إلى أضيف إلى محلول التهجين مباشرة في أنبوب التهجين‪ ،‬ثم أغلق‬ ‫الغطاء بشكل جيد لمنع التبخر من أنبوب التهجين‪.‬‬ ‫‪ ‬أعيد أنبوب التهجين مرة أخرى إلى فرن التهجين الذي ضبطت ح اررته سابقا في مرحلة ما قبل‬ ‫التهجين عند ‪° 42‬س‪.‬‬ ‫‪ ‬تمت عملية التهجين بالتحريك الدوراني ألنابيب التهجين عند سرعة حوالي ‪ 12‬دورة‪/‬دقيقة(الشكل ‪.)12‬‬ ‫ مالحظة ‪ :1‬الشروط المثالية لعملية التهجين تتطلب االستمرار تحت هذه الشروط لمدة ‪ 16‬ساعة أو طوال الليل‬‫ولكن تم فعليا اختصارها إلى ‪ 6‬ساعات أو أقل تبعا لتوفر الكهرباء في المخبر‪.‬‬ ‫‪53‬‬ ‫ مالحظة ‪ :2‬يمكن استخدام المسبر من ثالث إلى أربع مرات‪ ،‬وفي هذه الحالة يتم فصل السلسلة بتسخين‬‫محلول التهجين الحاوي على المسبر عند الدرجة ‪° 68‬س لمدة ‪ 10‬دقائق‪ ،‬ثم حفظه بالثلج أو صبه مباشرة‬ ‫على الغشاء في مرحلة التهجين‪.‬‬ ‫الشكل ‪ .14‬ضبط الح اررة في فرن التهجين (اليمين)‪ ،‬ووضع الغشاء في أنابيب التهجين (الوسط)‪ ،‬ثم‬ ‫القيام بعملية التهجين بالتحريك الدوراني (اليسار)‬ ‫‪ .7-6-4‬الغسيل والتظهير‬ ‫‪o‬‬ ‫ررة ‪20 -‬‬ ‫في اليوم التالي تم نقل محلول التهجين مع المسبر إلى أنبوب اختبار وحفظه عند درجة ح ا‬ ‫‪°‬س الستخدامه مرة أخرى‪.‬‬ ‫‪ o‬غسل الغشاء لمدة ‪ 10‬دقائق على مرحلتين (‪ 5 × 2‬دقيقة) في المحلول المكون من ( ‪2x SSC +‬‬ ‫‪ )0.1% SDS‬عند درجة الح اررة ‪° 42‬س‪.‬‬ ‫ررة ‪65‬‬ ‫‪ o‬غسل الغشاء لمرة واحدة ولمدة ‪ 15‬دقيقة في المحلول )‪ (0.5x SSC + 0.1% SDS‬عند درجة ح ا‬ ‫‪°‬س‪.‬‬ ‫‪ o‬تم تحضير الغشاء للتلوين بغمره في محلول ‪ 1x Maleic acid buffer‬لمدة ‪ 5‬دقائق عند درجة ح اررة‬ ‫الغرفة‪ ،‬ثم غمره في محلول السد (‪ )1x Blocking solution‬لمدة ‪ 30‬دقيقة‪.‬‬ ‫‪ o‬استبدل المحلول السابق بذات المحلول (‪ )1x Blocking solution‬الحاوي على األجسام المضادة‬ ‫بتركيز (‪ ،Anti-digoxigenin-AP )1:5000‬وتُرك في الظالم بدون تحريك لمدة ‪ 30‬دقيقة‪.‬‬ ‫‪ o‬تم التخلص من األجسام المضادة غير المرتبطة بتحضين الغشاء على مرحلتين لمدة ‪ 30‬دقيقة‬ ‫(‪ )15×2‬في محلول الغسيل (‪.)1x Washing buffer‬‬ ‫‪ o‬استخدمت الطريقة اللونية (‪ )Colorimetric detection‬في الكشف عن العصابات (‪ )Bands‬على‬ ‫الغشاء النايلوني وذلك بغمره في ‪ 10‬مل من محلول الكشف (‪ )1x Detection buffer‬في الظالم ولمدة‬ ‫‪ 10‬دقائق كمرحلة أولى عند درجة ح اررة الغرفة‪ ،‬ثم ترك طوال الليل عند عدم ظهور اإلشارة‪.‬‬ ‫‪54‬‬ ‫‪ o‬تم التخلص من المحلول السابق‪ ،‬ثم أعيد إضافة كمية جديدة من محلول الكشف الذي أضيف له‬ ‫المادة الملونة (‪ 33‬ميكرولتر ‪ 16.5 + NBT‬ميكرولتر ‪ )BCIP‬لكل ‪ 5‬مل محلول كشف‪.‬‬ ‫‪ُ o‬حضن الغشاء في الظالم لمدة ‪ 5‬دقائق‪ ،‬ثم تُرك في الظالم طوال الليل عند عدم ظهور اإلشارة (الشكل‬ ‫‪.)13‬‬ ‫الشكل ‪ .15‬غمر الغشاء في محلول الكشف‬ ‫‪ .8-6-4‬المحاليل المستخدمة‬ ‫محلول التعادل‬ ‫‪2- Neutralization solution‬‬ ‫‪pH, 7.5‬‬ ‫‪Tris- HCl,‬‬ ‫‪0.5 M‬‬ ‫‪Na Cl‬‬ ‫‪1.5 M‬‬ ‫محلول النقل‬ ‫محلول الفصل ‪1- Denaturation solution‬‬ ‫‪NaOH‬‬ ‫‪0.5 M‬‬ ‫‪NaCl‬‬ ‫‪1.5 M‬‬ ‫‪pH, 8.9‬‬ ‫‪3- Maleic acid buffer‬‬ ‫‪4- 20x SSC‬‬ ‫‪0.1 M Malic acid‬‬ ‫‪3 M NaCl‬‬ ‫‪0.15 M NaCl‬‬ ‫‪0.3 M sodium citrate‬‬ ‫‪Adjust with NaOH (solid) to pH 7.‬‬ ‫‪Adjust pH to 7.0 (20◦ C) and autoclave‬‬ ‫‪55‬‬ ‫محلول الغسيل‬ ‫محلول السد‬ ‫‪6- Washing Buffer‬‬ ‫‪5- 1x Blocking solution‬‬ ‫‪Dilute 10 x Blocking solution in 1x Maleic‬‬ ‫)‪acid buffer (1:10‬‬ ‫‪0.1 M Malic acid‬‬ ‫‪0.15 M NaCl‬‬ ‫محلول الكشف‬ ‫‪0.3% (v/v) Tween 20‬‬ ‫‪7- Detection Buffer‬‬ ‫‪0.1 M Tris-HCl‬‬ ‫‪pH, 7.5‬‬ ‫‪0.1 M NaCl‬‬ ‫‪pH, 9.5‬‬ ‫تحضير مادة التلوين‪:‬‬ ‫‪o‬‬ ‫‪o‬‬ ‫‪ 50‬مغ‪/‬مل ‪ BCIP‬تذاب في ‪ dimethylformamide‬تركيز ‪% 100‬‬ ‫‪ 50‬مغ‪/‬مل ‪ NBT‬تذاب في ‪ dimethylformamide‬تركيز ‪% 70‬‬ ‫‪ .7-4‬التقويم الوظيفي للمورثات المنقولة‬ ‫‪ .1-7-4‬التقويم الوظيفي للمورثة الواسمة لالنتخاب ‪bar‬‬ ‫الحمص وذلك بدهن السطح العلوي لألوراق بوساطة قطعة قطن‬ ‫تم التقويم الوظيفي للمورثة ‪ bar‬في نبات ُ‬ ‫مبللة بالمبيد ‪ PPT‬باستخدام التراكيز التالية‪ 1500 ,1000 ,600 ,300 ,150 :‬مغ‪/‬ل‪ ،‬أضيف لها مادة‬ ‫‪ Tween 20‬بتركيز ‪ %0.1‬للمساعدة على نشر المبيد على سطح األوراق‪ ،‬ثم أـخذت النتائج بعد أسبوع من‬ ‫دهن األوراق‪.‬‬ ‫‪ .2-7-4‬التقويم الوظيفي للمورثة ‪ bar‬باستخدام اختبار ‪Chlorophenol Red‬‬ ‫تمت عملية التقويم الوظيفي للمورثة ‪ bar‬وذلك في عشرة أنابيب من النباتات المحورة والشاهد‪ ،‬حيث تم‬ ‫حضر مزيج اإلختبار بحجم ‪10‬‬ ‫قطاف القمة النامية لثالث وريقات من النباتات ووضعها في األنابيب‪ ،‬ثم ُ‬ ‫مل وفق مايلي‪ 200( :‬ميكرولتر من المبيد ‪ PPT‬تركيز ‪ 300‬مغ‪/‬ل‪ ،‬و ‪ 34‬ميكرولتر من الهرمون ‪BAP‬‬ ‫بنزيل أمينو بيورين ‪ ،BAP‬و ‪ 1‬ميكرولتر من الهرمون ‪ NAA‬حمض النفتاليك (تركيز ‪1‬مغ‪/‬مل لكل‬ ‫منهما)‪،‬و ‪ 100‬ميكرولتر من وسط غذائي ‪ 1250 ،Gambrog‬ميكرولتر من المشعر ‪،Chlorophenol‬‬ ‫‪ 8415‬ميكرولتر ماء معقما‪ .‬تم بعد ذلك ضبط درجة الحموضة للمزيج إلى (‪ ،)pH, 6‬ثم أضيف لكل‬ ‫أنبوب ‪ 500‬ميكرولتر من المزيج بحيث غمرت الوريقات في المحلول‪ُ ،‬حضنت األنابيب عند درجة ح اررة‬ ‫‪56‬‬ ‫‪° 22‬س لمدة يومين‪ ،‬ثم أخذت القراءة‪ ،‬حيث يعد تحول لون المزيج من األحمر إلى البرتقالي أو األصفر‬ ‫نباتا مقاوما للمبيد‪.‬‬ ‫‪ .8-4‬الثر التضادي للمورثة كيتيناز ‪ chitinase‬في تثبيط نمو الفطر المسبب للفحة السكوكيتا على‬ ‫الح ّمص‬ ‫ُ‬ ‫‪ .1-8-4‬تنمية العزلة الفطرية‪:‬‬ ‫تم عزل الفطر من أوراق حمص مصابة ُجمعت من منطقة الغاب وذلك بتطهير األوراق سطحيا‬ ‫بهيبوكلوريت الصوديوم تركيز ‪ % 0.5‬لمدة دقيقتين‪ ،‬ثم غسلها بالماء المقطر المعقم عدة مرات‪ُ ،‬جففت‬ ‫الحمص‪-‬‬ ‫األوراق المصابة بوضعها على ورق ترشيح معقم‪ ،‬ثم وضعت على مستنبت مستخلص بذور ُ‬ ‫ديكستروز‪ -‬آغار )‪ .Chickpea Seed Extract-Dextrose-Agar (CDA‬حضنت األطباق عند درجة ح اررة‬ ‫الحمص‪-‬‬ ‫‪° 20‬س‪ ،‬لمدة ‪ 10‬أيام‪ ،‬وفترة إضاءة ‪( 8/16‬إضاءة‪/‬ظالم) على مستنبت مستخلص بذور ُ‬ ‫ديكستروز‪-‬آغار )‪.Chickpea Seed Extract-Dextrose-Agar (CDA‬‬ ‫ُحضر المستنبت بسلق ‪ 40‬غ من البذور صنف حمص حساس في ليتر ماء‪ ،‬ثم أخذت الرشاحة وأضيف‬ ‫لها ‪ 20‬غ ديكستروز‪ ،‬و‪ 18‬غ آغار‪ ،‬ثم أكمل الحجم بالماء المقطر إلى ‪ 1‬ليتر‪ ،‬و ُعقم عند درجة ح اررة‬ ‫‪º 121‬س لمدة ‪ 20‬دقيقة (‪.)Kaisar,1973‬‬ ‫‪ .2-8-4‬عزل البروتين الخام‬ ‫حفزت مورثة الكيتيناز عن طريق وخز بعض أوراق النباتات ال ُمعدلة وراثيا ونباتات الشاهد بإبرة رفيعة‬ ‫معقمة‪ ،‬ثم جمعت كمية ‪ 1‬غ من األوراق بعد ‪ 3‬أيام من الوخز‪ ،‬تم سحق كل عينة على حدة في ‪ 3‬مل‬ ‫من محلول االستخالص ‪ 0.1‬مولر أسيتات الصوديوم ضمن هاون بورسالن معقم‪ ،‬ثم حضن المستخلص‬ ‫في البراد عند درجة ح اررة ‪° 4‬س لمدة ساعتين‪ ،‬تم فصل مكونات المستخلص عن طريق الطرد المركزي‬ ‫لمدة ‪ 30‬دقيقة‪ ،‬عند سرعة ‪ 13000‬دورة ‪/‬الدقيقة‪ ،‬ودرجة ح اررة ‪° 4‬س‪ ،‬تم سحب الرائق وتعقيمه بالترشيح‬ ‫‪ filtration‬بوساطة مرشحات أقطار ثقوبها ‪ 0.22‬ميكرومتر‪.‬‬ ‫‪ .3-8-4‬اختبار تثبيط إنبات البواغ‬ ‫حصدت أبواغ الفطر ‪ Ascochyta rabiei‬من أطباق حديثة في كمية ‪ 10‬مل من الماء المقطر المعقم ضمن‬ ‫حجرة العزل وذلك بتحريكها رحويا بهدوء‪ ،‬ثم سحب السائل‪ ،‬وعدت األبواغ بوساطة شريحة عد كريات الدم‬ ‫الحمراء وضبط عددها عند ‪ 6 10 × 1.32‬بوغة‪/‬مل‪.‬‬ ‫نفذت التجربة في أنابيب اختبار سعة ‪ 1.5‬مل وفق تصميم كامل العشوائية‬ ‫‪Completely Randomized‬‬ ‫‪ Design (CRD‬بحيث تحتوي على معاملتين (مستخلص من نباتات محورة وغير محورة)‪ 4 ،‬تراكيز أو‬ ‫‪57‬‬ ‫تخفيفات لألنزيم و‪ 3‬مكررات‪ ،‬أضيف ‪ 10‬ميكرولتر من المعلق البوغي السابق ذكره وذلك لكل أنبوب من‬ ‫الحمص السائل (‪ )CDA‬السائل وفق النسب التالية‪:‬‬ ‫المعامالت‪ُ .‬خفف المستخلص بوساطة مستنبت ُ‬ ‫‪(A‬‬ ‫‪ 0‬مستنبت سائل‪ 3 :‬مستخلص (‪ 10 + )90 : 0‬ميكرو لتر معلق بوغي‬ ‫‪(B‬‬ ‫‪ 1‬مستنبت سائل‪ 2 :‬مستخلص (‪ 10 +(60 : 30‬ميكرو لتر معلق بوغي‬ ‫‪(C‬‬ ‫‪ 1‬مستنبت سائل‪ 1 :‬مستخلص (‪ 10 + )45 : 45‬ميكرو لتر معلق بوغي‬ ‫‪(D‬‬ ‫‪ 3‬مستنبت سائل‪ 0 :‬مستخلص (‪ 10 + )0 : 90‬ميكرو لتر معلق بوغي‬ ‫‪( 2‬معاملة) × ‪( 4‬تراكيز) × ‪( 3‬مكررات) = ‪24‬‬ ‫ ُحضنت األنابيب عند درجة ح اررة ‪° 2 ± 22‬س لمدة ‪ 3‬أيام‪.‬‬‫‪ -‬خفف المزيج لكل معاملة‪/‬تركيز بنسبة ‪ ،100:1‬ثم نشر منه كمية ‪ 100‬ميكروليتر على المستنبت‬ ‫‪ ،CDA‬وحضنت األطباق عند الشروط المناسبة لمدة ‪ 8‬أيام‪ ،‬أخذت القراءة بعد المستعمرات المتشكلة على‬ ‫األطباق للمعامالت والتراكيز المختلفة‪.‬‬ ‫ ُحللت النتائج إحصائيا بوساطة البرنامج ‪ SPSS 22‬لتحليل التباين ‪ ،ANOVA‬وحساب أقل فرق معنوي‬‫بين المتوسطات عند مستوى معنوية ‪.%5‬‬ ‫‪ -‬أخذت عينات من كل معاملة‪ ،‬ولُونت بأزرق القطن للكشف عن النمو الفطري وأخذت صور رقمية لكل‬ ‫معاملة‪.‬‬ ‫‪ .4-8-4‬التقويم الوظيفي للمورثة كيتيناز‬ ‫‪ .1-4-8-4‬اختبار الورقة المفصولة للنباتات المحورة‬ ‫طهرت األوراق بغمرها في الكحول‬ ‫تم جمع ‪ 10‬أوراق من النباتات المحورة والعدد ذاته من نباتات الشاهد‪ُ ،‬‬ ‫طهرت في هيبو كلوريت الصوديوم ‪ % 0.5‬لمدة ‪ 2‬دقيقة‪ ،‬ثم ُغسلت‬ ‫اإليثيلي ‪ %70‬لمدة ‪ 30‬ثانية‪ ،‬ثم ُ‬ ‫األوراق بالماء المقطر المعقم لمدة دقيقة ثالث مرات‪ ،‬ثم وضعت على ورق ترشيح معقم لكي تجف‪ ،‬نقلت‬ ‫بعد ذلك األوراق إلى أطباق ‪( WA‬ماء ‪-‬آغار)‪ ،‬حيث وضعت ورقة في كل طبق وتم تثبيتها جيدا‪،‬‬ ‫ُحضر معلق بوغي بتركيز ‪ 510 × 1‬بوغة‪/‬مل‪ ،‬وأعديت الوريقات بكمية ‪ 5‬ميكرولتر منه‪ .‬أغلقت األطباق‬ ‫بالبا ارفيلم ووضعت في الحاضنة عند درجة ح اررة ‪° 2 ± 22‬س و ‪ 8 /16‬تناوب إضاءة‪/‬ظالم‪ُ .‬حسبت‬ ‫‪58‬‬ ‫نسبة اإلصابة ‪ Disease Incidence DI‬وشدتها ‪ Disease severty DS‬بعد ‪ 12‬يوما من العدوى في كل‬ ‫طبق وفق سلم تقييس ‪ )Harijati and Keane, 2012( 10-0‬والمعادلة التالية‪:‬‬ ‫مجموع (عدد وريقات الفئة × قيمة الفئة)‬ ‫× ‪100‬‬ ‫شدة المرض ‪= DS‬‬ ‫العدد الكلي للوريقات × ‪10‬‬ ‫حيث أن‪:‬‬ ‫‪ : 0‬تدل على عدم وجود بقعة‪.‬‬ ‫‪ :5 ،4 ،3 ،2‬تشير إلى وجود بقعة نكروزية واحدة‪ ،‬أو ‪ 3-2‬بقع نكروزية نقطية‪ ،‬أو عدة بقع نكروزية‬ ‫نقطية‪ ،‬وتكون المساحة المصابة بحدود ‪ ،%10‬على التوالي‪.‬‬ ‫‪ :10، 9، 8 ،7 ،6‬تشير إلى أن‪ ،%100-%80 ،%70-%60 ،%50 ،%40-%30 ،%25 :‬على‬ ‫التوالي من مساحة الوريقة مصابة مع تشكل أوعية بكنيدية في المنطقة المركزية (الشكل ‪.)16‬‬ ‫الشكل ‪ .16‬مساحة التماوت‪ /‬النكرزة والبقعة المتبوغة المستخدمة في حساب شدة اإلصابة وفق‬ ‫سلم التقييس‪.‬‬ ‫حيث اعتبر النمط الوراثي‪:‬‬ ‫ عالي القابلية لإلصابة‪ :‬عندما تكون شدة اإلصابة أكبر من ‪.%40‬‬‫ متوسط القابلية لإلصابة‪%39 – 25 :‬‬‫ متوسط المقاومة‪% 24 – 20 :‬‬‫‪ -‬عالي المقاومة‪%19 – 5 :‬‬ ‫‪59‬‬ ‫حسبت أيضا نسبة اإلصابة )‪ Disease Incidence (DI‬وفق المعادلة التالية‪:‬‬ ‫عدد الوريقات ذات البقع المتبوغة ‪ +‬عدد الوريقات ذات البقعة المنكرزة‬ ‫× ‪100‬‬ ‫نسبة اإلصابة ‪= DI‬‬ ‫العدد الكلي للوريقات‬ ‫حيث اعتبر النمط الوراثي‪:‬‬ ‫ عالي القابلية لإلصابة‪ :‬عندما تكون النسبة أكبر من ‪.%50‬‬‫ متوسط القابلية لإلصابة‪%49 – 30 :‬‬‫ متوسط المقاومة‪% 29 – 20 :‬‬‫‪ -‬عالي المقاومة‪%19 – 5 :‬‬ ‫‪ .2-4-8-4‬اختبار الورقة المفصولة لصنف غير محور‬ ‫هدفت هذه التجربة إلى معرفة التركيز المثـبط لنمـو األبـواغ‪ ،‬وذلـك بعـد معاملتهـا بمسـتخلص البـروتين الخـام‬ ‫الحمص ال ُمعدلة وغير ال ُمعدلة وراثيا‪.‬‬ ‫ألوراق نباتات ُ‬ ‫بعـد انقضـاء فتـرة تحضـين أبـواغ الفطـر ‪ Ascochyta rabiei‬مـع مسـتخلص البـروتين الخـام للنباتـات المحـورة‬ ‫وغير المحورة وراثيا‪ ،‬استخدمت المعامالت (الفقرة ‪)3-8-4‬‬ ‫فـي إعـداء أوراق مـن نباتـات الصـنف غـاب‪1‬‬ ‫القابــل لإلصــابة بفطــر األســكوكيتا‪ ،‬وذل ـك بطريقــة الورقــة المفصــولة‪ ،‬وضــعت ورقــة واحــدة فــي طبــق بتــري‬ ‫يح ــوي وس ــط ‪ WA‬بع ــد تطهيره ــا س ــطحيا‪ ،‬أع ــديت ك ــل وريق ــة ‪ leaflet‬بكمي ــة ‪ 5‬ميكرولت ــر م ــن المع ــامالت‬ ‫الســابقة (مســتنبت ‪ +‬مســتخلص ‪ +‬معلــق بــوغي)‪ ،‬حضــنت األطبــاق عنــد درجــة ح ـ اررة ‪° 22‬س لمــدة‬ ‫‪12‬‬ ‫يوما‪ ،‬ثم حسبت نسبة اإلصابة وشدتها لكل المعامالت وفق سلم التقييس المذكور سابقا‪.‬‬ ‫‪ .3-4-8-4‬رش كامل النباتات المحورة‬ ‫الحمص في أصص صغيرة بمعدل ‪ 4‬أصص لكل طراز وراثي (المعدل والشـاهد)‪ ،‬وذلـك فـي‬ ‫زرعت بذور ُ‬ ‫خلطة ترابية معقمة مكونة من التربة والبيتموس بنسبة (‪.)1:3‬‬ ‫تــم رش النباتــات بعمــر ‪ 4‬أســابيع‬ ‫بمعلــق بــوغي مــن فطــر األســكوكيتا بتركيــز ‪10 × 1‬‬ ‫‪6‬‬ ‫بوغــة‪/‬مل‪ ،‬ثــم‬ ‫حضنت لمـدة ‪3‬‬ ‫وضعت ضمن كيس بالستيكي شفاف‪ ،‬وأغلقت األكياس لتأمين رطوبة نسبية للعدوى‪ ،‬ثم ُ‬ ‫أيــام عنــد درجــة ح ـ اررة ‪° 24‬س‪ ،‬رفعــت األكيــاس البالســتيكية مــع االســتمرار فــي عمليــة ترطيــب النباتــات‬ ‫ليومين آخرين بمعدل كـل سـاعتين مـرة بوسـاطة مـرش يـدوي صـغير‪ ،‬أخـذت قـراءات نسـبة وشـدة اإلصـابة‬ ‫بعد ‪ 12‬يوما من العدوى وفق سلم التقييس السابق‪.‬‬ ‫‪60‬‬ ‫الفصل الثالث‬ ‫النتائج والمناقشة‬ ‫‪Results and Discussion‬‬ ‫‪61‬‬ ‫خامسا‪ -‬النتائج والمناقشة‬ ‫‪ .1-5‬تركيز ونقاوة ونوعية الـ ‪DNA‬‬ ‫تروح‬ ‫أظهرت نتائج استخالص الـ ‪ DNA‬الحصول على تراكيز جيدة وكافية من العينات المدروسة‪ ،‬حيث ا‬ ‫تركيز الـ ‪ DNA‬ما بين ‪ 285-111‬نانوغرام‪/‬ميكرولتر‪ ،‬وذلك حسب قراءة المطياف الضوئي‪ ،‬كما بينت‬ ‫نتائج حساب النسبة ‪ 280/260‬أن النقاوة كانت جيدة في العينات المدروسة وخالية من البروتين حيث‬ ‫تروحت النسبة عموما ما بين ‪(1.99 -1.88‬الجدول ‪ ،)8‬وتعد هذه النسبة كافية الستخدام الـ ‪ DNA‬في‬ ‫ا‬ ‫االختبارات الجزيئية وبخاصة التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪.PCR‬‬ ‫الحمص ونقاوته حسب قراءة المطياف‬ ‫الجدول ‪ .8‬تركيز الـ ‪ DNA‬المستخلص من عينات أوراق نبات ُ‬ ‫الضوئي‪.‬‬ ‫رقم العينة‬ ‫تركيزالـ ‪DNA‬‬ ‫النقأوة‬ ‫(نانوغرام‪/‬ميكرولتر)‬ ‫(النسبة ‪( 260/280‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪5‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪7‬‬ ‫‪8‬‬ ‫‪177‬‬ ‫‪285‬‬ ‫‪144‬‬ ‫‪139‬‬ ‫‪200‬‬ ‫‪166‬‬ ‫‪198‬‬ ‫‪111‬‬ ‫‪1.88‬‬ ‫‪1.88‬‬ ‫‪1.95‬‬ ‫‪1.97‬‬ ‫‪1.96‬‬ ‫‪1.99‬‬ ‫‪1.97‬‬ ‫‪1.93‬‬ ‫المتوسط‬ ‫‪177.5‬‬ ‫‪1.94‬‬ ‫عند اختبار نوعية الـ ‪ DNA‬على هالمة أغاروز ‪ %1‬أظهرت النتائج الحصول على نوعية الـ ‪DNA‬‬ ‫سليمة‪ ،‬وذات وزن جزيئي مرتفع‪ ،‬وهي في هذه الحالة تعادل حجم جينوم البكتريوفاج المدا (حوالي ‪50‬‬ ‫كيلو نكليوتيد)‪ ،‬حيث ظهر الـ ‪ DNA‬على شكل حزمة ‪ band‬وحيدة أعلى الهالمة‪ ،‬كما كانت الهالمة‬ ‫خالية من الحمض النووي ‪ RNA‬نتيجة استخدام األنزيم ‪ Rnase‬أثناء عملية االستخالص (الشكل ‪.)17‬‬ ‫الشكل ‪ .17‬اختبار نوعية الـ ‪ DNA‬بالرحالن الكهربائي على هالمة األغاروز تركيز ‪%1‬‬ ‫‪ :M‬المدا ‪ 100‬نانوغرام‪ ،‬المسارات من ‪ :2-1‬عينات الـ ‪ DNA‬المستخلص من نباتات الشاهد‪ ،‬المسارات ‪-3‬‬ ‫‪ : 10‬عينات الـ ‪ DNA‬المستخلص من النباتات المحورة‪.‬‬ ‫‪62‬‬ ‫‪ .2-5‬الكشف عن المورثتين ‪ chitinase‬و‪ bar‬بوساطة التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪PCR‬‬ ‫أظهرت نتائج التفاعل التسلسلي للبوليميراز‪ PCR‬باستخدام بادئات متخصصة على المورثات المنقولة‬ ‫الحمص بطريقة التعديل الوراثي وجود المورثتين ‪ ،chitinase‬و‪ bar‬في جينوم النباتات المختبرة‪.‬‬ ‫لنبات ُ‬ ‫فقد أظهرت نتائج الرحالن الكهربائي على هالمة أغاروز ‪ % 1.2‬الحصول على القطعتين المتوقعتين‬ ‫من هاتين المورثتين وهما بطول ‪ 555‬و‪ 264‬زوجا نكليوتيديا )‪ ،(bp‬على التوالي (الشكل ‪ ،)18‬تظهر‬ ‫الحمص وتوريثهما بشكل مستقر إلى الذرية‬ ‫هذه النتائج استقرار المورثتين المنقولتين في جينوم نبات ُ‬ ‫الناتجة حتى الجيل الخامس ‪ T5‬الذي تم اختباره‪.‬‬ ‫أجري االختبار بوجود عينة الماء كشاهد سلبي (بدون ‪ ،)DNA‬إضافة إلى عينتين من النباتات غير‬ ‫المحورة كشواهد سلبية‪ ،‬وعينة بالزميد كشاهد إيجابي‪ ،‬تمت مقارنة النتائج على هالمة األغاروز بوجود‬ ‫مؤشر قياسي للوزن الجزيئي ‪ 100‬زوج نكليوتيدي (‪ ،) Molecular marker weight 100 bp‬كما ان عملية‬ ‫الكشف عن المورثة ‪ bar‬تطابقت مع نتائج المقاومة للمبيد ‪.PPT‬‬ ‫الشكل ‪ .18‬الرحالن الكهربائي على هالمة أغاروز تركيز ‪ %1.2‬لنواتج التفاعل التسلسلي للبوليميراز‬ ‫الحمص الجيل ‪.T5‬‬ ‫للمورثتين ‪( chitinase‬أعلى)‪ ،‬و ‪( bar‬أسفل) في نباتات ُ‬ ‫‪ :M‬مؤشر قياسي للوزن الجزيئي ‪ 100‬زوج نكليوتيدي‪ ،‬المساران‪ 1 :‬و‪ :2‬نباتات حمص غير ُمعدلة وراثيا‪ ،‬المسارات‪:‬‬ ‫‪ :8-3‬نباتات حمص ُمعدلة وراثيا‪ :w- ،‬عينة ماء (شاهد سلبي بدون ‪ :pls+ ، )DNA‬شاهد إيجابي (البالزميد‬ ‫‪.)pGIIvst-Chit‬‬ ‫بعد القيام بعملية نقل المورثات بالطرائق المختلفة‪ ،‬البد من إجراء مجموعة من االختبارات لتأكيد عملية‬ ‫النقل‪ ،‬ويعد التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪ PCR‬أحد أهم هذه االختبارات‪ ،‬وأبسطها وأسرعها‪ ،‬كما يراعى‬ ‫‪63‬‬ ‫تكرار هذا االختبار على األجيال الالحقة للتأكد من استقرار المورثة وانتقالها عبر البذور من جيل إلى‬ ‫جيل أخر‪ ،‬حيث يمكن أن تفقد في بعض الحاالت‪ .‬يستخدم عادة الـ‪ PCR‬للكشف عن المورثات‬ ‫المنقولة باستخدام زوج من البادئات المتخصصة‪ ،‬ويعد هذا االختبار من أكثر الطرائق استخداما‬ ‫للكشف عن عملية التحوير الوراثي وذلك لقدرته على تضخيم قطعه محددة من الـ ‪Marmiroli, DNA‬‬ ‫)‪ .)2008‬تعتبر تقنية ‪ PCR‬تقنية متخصصة ونوعية وآمنة للكشف عن التحوير الوراثي‬ ‫)‪.)Giovannini and Concillo, 2002‬‬ ‫استخدمت هذه التقنية في الكشف عن المورثات المنقولة إلى النبات كعمل روتيني بعد أي عملية‬ ‫تحوير وراثي‪ ،‬وكمثال على ذلك نذكر استخدام هذا االختبار في الكشف عن مورثة الكيتيناز‪Chit33‬‬ ‫وانتقالها إلى جينوم نبات الكانوال وذلك لمقاومة فطر العفن األبيض ‪Sclerotinia sclerotiorum‬‬ ‫‪Solgi‬‬ ‫)‪ ،)et al., 2015‬كما استخدم هذا االختبار أيضا لتأكيد انتقال المورثة ‪ ،bar‬إلى جينوم نبات ‪Lotus‬‬ ‫‪ japonicas‬وذلك بعد تحويره باستخدام البكتريا ‪ Agrobactrium‬بهدف مقاومة المبيدات‪ ،‬وذلك‬ ‫باستخدام زوج من البادئات المتخصصة التي تكاثر قطعة بطول ‪ 300‬زوج نكليوتيدي‪ ،‬حيث يعد نتيجة‬ ‫أولية على نجاح عملية التحوير الوراثي (‪ .)Lohar et al.,2001‬في دراسة أخرى استخدمت تقنية‬ ‫التفاعل التسلسلي للبوليميراز في الكشف عن المورثة كيتيناز‬ ‫)‪30‬‬ ‫‪ (Chit‬في نبات البازالء الذي تم‬ ‫تطويره لمقاومة األمراض الفطرية (‪ .)Hassan., 2006‬في دراسة أجريت عام‬ ‫‪2015‬‬ ‫تم الكشف عن‬ ‫المورثة كيتيناز وانتقالها إلى جينوم نبات الفول السوداني (‪ ،)Chen et al., 2015‬أيضا استخدم اختبار‬ ‫‪PCR‬‬ ‫للكشف عن المورثة كيتيناز المعزولة من خميرة الخبز ‪ Saccharomyces cerevisiae‬والمنقولة‬ ‫إلى نباتات التبغ وذلك لتعزيز مقاومتها لمرض العفن الرمادي ‪Carstens et al., ( Botrytis cinerea‬‬ ‫‪ .)2003‬في ‪ 2010‬قام ‪ Nirala‬وآخرون بنقل مورثة الكيتيناز التي مصدرها نبات األرز إلى العنب‬ ‫وذلك باستخدام البكتريا‬ ‫‪ Agrobactrium‬كوسيط‪ ،‬حيث تم نقل مورثة الكيتيناز بهدف تعزيز مقاومة‬ ‫النبات لفطر البياض الدقيقي‪ ،‬حيث أظهرت نتائج الـ‬ ‫‪PCR‬‬ ‫دخول المورثة في جينوم النبات المستهدف‬ ‫(‪.)Nirala et al., 2010‬‬ ‫‪ . 3-5‬الكشف عن نشاط المورثة كيتيناز ‪ chitinase‬بطريقة النسخ العكسي ‪.RT-PCR‬‬ ‫يعد دخول المورثة المنقولة عن طريق التحوير الوراثي ‪ transformation‬في جينوم النبات وتأكيد ذلك‬ ‫بوساطة الـ ‪ PCR‬اختبا ار أوليا لتأكيد عملية النقل‪ ،‬لكن ليس له أي داللة فيما يتعلق بتعبير هذه المورثة‬ ‫ومنحها للصفة المطلوبة‪ .‬قد تتعرض المورثة بعد نقلها لعملية مثلتة ‪ methylation‬تعيق عملية النسخ‬ ‫‪ ،transcription‬وينشأ عن ذلك حالة إخماد لعمل المورثة ‪.gene silencing‬‬ ‫‪64‬‬ ‫تم تحريض المورثة ‪ chitinase‬عن طريق وخز األوراق الرتباط تشغيلها بحاث متخصص‬ ‫‪specific‬‬ ‫الحمص بالمقارنة مع المورثة ‪ actin‬من خالل الكشف‬ ‫‪ُ ،promoter‬درس تعبير المورثة المنقولة إلى نبات ُ‬ ‫عن الحمض النووي الريبي الرسول ‪ mRNA‬الذي تنسخه هاتين المورثتين وذلك بعد تحويله إلى سلسلة‬ ‫‪ DNA‬مكملة له )‪ (cDNA‬بطريقة النسخ العكسي ‪ .RT-PCR‬أظهرت نتائج الرحالن الكهربائي على هالمة‬ ‫أغاروز تركيز ‪ %1.2‬لنواتج تفاعل الـ ‪ PCR‬باستخدام سالسل الـ ‪ DNA‬المكملة لكل من المورثتين‬ ‫‪ chictinase‬و‪ actin‬كقالب لعملية المكاثرة‪ ،‬وبوساطة بادئات متخصصة على هاتين المورثتين الحصول‬ ‫على القطع المتوقعة من كل مورثة وهي بطول ‪ 555‬زوجا نكليوتيديا للمورثة ‪ chitinase‬و‪ 164‬زوجا‬ ‫نكليوتيديا للمورثة ‪( actin‬الشكل ‪.)19‬‬ ‫الشكل ‪ .19‬الرحالن الكهربائي على هالمة أغاروز ‪ %1.2‬لنواتج تفاعل الـ ‪ PCR‬لسلسلة الـ ‪DNA‬‬ ‫الحمص‪.‬‬ ‫المكملة )‪ (cDNA‬للمورثتين ‪( chitinase‬أعلى)‪ ،‬و ‪( actin‬أسفل) في ُ‬ ‫‪ :M‬مؤشر قياسي للوزن الجزيئي ‪ 100‬زوج نكليوتيدي‪ ،‬المساران‪ 1 :‬و‪ :2‬نباتات حمص غير ُمعدلة وراثيا‪ ،‬المسارات‪:‬‬ ‫‪ :8-3‬نباتات حمص ُمعدلة وراثيا‪ :w- ،‬عينة ماء (شاهد سلبي بدون ‪ :pls+ ، )DNA‬شاهد إيجابي (البالزميد‬ ‫‪.)pGIIvst-Chit‬‬ ‫تجدر اإلشارة هنا إلى غياب تعبير المورثة كيتيناز في العينتين ‪ 1‬و‪ 2‬ألنهما نباتي حمص غير‬ ‫محورين وراثيا بهذه المورثة (نباتات شاهد)‪ ،‬في حين تم الكشف عن تعبير المورثة كيتيناز في باقي‬ ‫عينات النباتات ال ُمعدلة وراثيا (العينات ‪ ،)8-3‬في حين تم الكشف عن تعبير المورثة ‪ actin‬في كل‬ ‫العينات المختبرة سواء أكانت ُمعدلة أم غير ُمعدلة وراثيا (العينات ‪ ،)8- 1‬ويعود ذلك إلى أن هذه‬ ‫المورثة موجودة أصال في النبات (مورثة داخلية المنشأ ‪ )endogenous gene‬ولها تعبير مستقر في‬ ‫جميع مراحل نمو النبات‪ ،‬ويمكن االستدالل على ذلك من كثافة العصابات ‪ bands‬الناتجة عن تعبير‬ ‫المورثة في كل العينات المختبرة‪ ،‬في حين تتباين هذه الشدة بالنسبة إلى المورثات المنقولة تبعا لكمية‬ ‫‪65‬‬ ‫الحمض النووي الرسول الذي ينسخ عنها‪ ،‬على اعتبار أنه القالب الذي استخدم في بناء السالسل‬ ‫المكملة‪ ،‬مع التذكير بأن هذا االختبار هو اختبار نوعي وليس كميا‪ ،‬حيث يمكن اللجوء إلى اختبار‬ ‫التفاعل التسلسلي اللحظي أو بالزمن الحقيقي ‪ Real time PCR‬في التقدير الكمي لمنسوخ المورثة‬ ‫‪.gene transcript‬‬ ‫تم خالل هذه الدراسة إجراء االختبارات الوراثية ضمن ظروف متحكم بها للمورثة الكيتيناز التي تمنح صفة‬ ‫المقاومة للممرضات الفطرية‪ ،‬تبين بنتيجة هذه االختبارات تأكيد وجود هذه المورثة في النباتات المختبرة‬ ‫بوساطة التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪ ،PCR‬مما يدل على استقرارها في مجين النباتات المحورة‪ ،‬كما‬ ‫استطاعت النباتات التعبير على المستوى الجزيئي من خالل الكشف عن الحمض النووي الريبي الرسول‬ ‫‪ mRNA‬الذي تشفر له المورثة كيتيناز‪ ،‬وبالتالي عدم تعرض سلسلة ‪ DNA‬المورثة لعملية اإلخماد‬ ‫)‪ (silencing‬في مرحلة ما قبل النسخ ‪ ،pre-transcription‬كما تم الكشف عن وجود نسخة وحيدة من‬ ‫الحمص المختبرة بوساطة اختبار تهجين الـ ‪ ، DNA‬األمر الذي‬ ‫المورثة المنقولة كيتيناز في مجين نباتات ُ‬ ‫يقلل من احتمالية تعرض المورثة لإلخماد في مرحلة ما بعد النسخ ‪ ،post-transcription‬وعدم تشكل‬ ‫األ نزيم الذي تشفر له المورثة في حال دخول عدد كبير من النسخ‪ .‬تجدر اإلشارة هنا إلى أن هذه النباتات‬ ‫قد عدلت وراثيا باستخدام البكتريا ‪ A.tumefaciens‬كوسيط في عملية النقل‪ ،‬وهي طريقة تتميز بقلة عدد‬ ‫النسخ المدخلة للنبات إذا ما قورنت بطريقة القصف الحيوي ‪.)Li et al.,2004( biolistic‬‬ ‫هناك عدة احتماالت تشرح االختالفات في مستوى تعبير المورثات بين سالالت النباتات ال ُمعدلة وراثيا‬ ‫غير عدد نسخ المورثة المنقولة‪ .‬ال تعد المورثات المنقولة بطريقة التحوير الوراثي وحدة نسخ مستقلة‪ ،‬وانما‬ ‫هي جزء من قطعة الـ ‪ T-DNA‬التي تنقلها البكتريا ‪ A. tumefaciens‬إلى مواقع مختلفة على صبغيات‬ ‫النبات‪ ،‬وعند دخول هذه المورثة في منطقة يوكروماتين ‪ euchromatin‬والتي تعد منطقة نسخ نشطة‪،‬‬ ‫عندها قد تتأثر المورثة المنقولة بالسالسل المنظمة للمورثات المجاورة في هذا الموقع الوراثي‪ ،‬أما عند‬ ‫دخول المورثة بشكل قريب من منطقة تكرار للـ‪ ،DNA repetitive DNA‬أو كروماتين متباين‬ ‫‪ heterochromatin‬عنده يمكن أن يثبط عمل المورثة‪ .‬من العوامل المهمة األخرى المؤثرة في تعبير‬ ‫المورثة هو عدد نسخ المورثة في موقع اإلدخال‪ ،‬حيث يمكن لنظام اإلدخال المستخدم في عملية التحوير‬ ‫الوراثي أن يدخل نسختين أو أكثر من قطعة الـ ‪ T-DNA‬في الموقع نفسه على الصبغي‪ ،‬وهذه النسخ‬ ‫يمكن أن تتوضع في هذا الموقع بتراتيب مختلفة رأس إلى ذيل ‪ ،head to tail‬أو تك اررات مباشرة‪ ،‬أو رأس‬ ‫إلى رأس‪ ،‬أو ذيل إلى ذيل كتك اررات معكوسة‪ ،‬حيث يظهر هذا األخير مستويات منخفضة من تعبير‬ ‫المورثة (‪.)Stam et al., 1997‬‬ ‫‪66‬‬ ‫تشرب سذرن‬ ‫‪ . 4-5‬تحديد عدد نسخ المورثة التي دخلت إلى جينوم النبات بوساطة ّ‬ ‫بينت عملية فصل نواتج التفاعل التسلسلي للبوليميراز الهادفة لتحضير المسبر نجاح عملية الوسم‪ ،‬حيث‬ ‫تم الحصول على قطعة أكبر من القطعة المتوقعة من استخدام البادئات (العينة ‪ ،)A‬وبكمية كافية للقيام‬ ‫بعملية التهجين حيث توهجت العصابة بقوة عند تلوينها ببروميد اإليثيديوم‪ ،‬بينما أمكن الحصول على‬ ‫القطعة المتوقعة وهي بطول ‪ 555‬زوج نكليوتيدي عند عدم استخدام الدكسوجينين كمادة وسم (العينة ‪،)B‬‬ ‫كما دلت نواتج الشاهد اإليجابي للعينة ‪ TPA‬على فعالية الكيت المستخدم في عملية الوسم عملية (الشكل‬ ‫‪.)20‬‬ ‫الشكل ‪ .20‬وسم مسبرالمورثة كيتيناز باستخدام التفاعل التسلسلي للبوليميراز‬ ‫‪ :M‬مؤشر قياسي للوزن الجزيئي ‪ 100‬زوج نكليوتيدي‪ ،‬المسار ‪ :A‬المسبر الموسوم للمورثة كيتيناز‪ :B ،‬المسبر غير‬ ‫الموسوم للمورثة كيتيناز ‪ :TPA ،‬الشاهد اإليجابي لفعالية الكيت‬ ‫أظهرت نتائج تهجين الـ ‪ DNA‬بمسبر المورثة ‪ chitinase‬موسوم بالطريقة غير اإلشعاعية وجود نسخة‬ ‫الحمص في العينتين المدروستين‪ ،‬وكذلك في الشاهد اإليجابي‬ ‫وحيدة من المورثة المنقولة إلى نبات ُ‬ ‫(التهجين مع ناتج تفاعل ‪ PCR‬للم ورثة كيتيناز)‪ ،‬في حين لم يكن هناك أي عصابة في عينة الشاهد‬ ‫غير المعدل وراثيا (الشكل ‪.)21‬‬ ‫‪67‬‬ ‫الشكل ‪ .21‬تهجين الـ ‪ DNA‬على الغشاء النايلوني باستخدام مسبر موسوم بالطريقة غير اإلشعاعية‪.‬‬ ‫‪ :M‬مؤشر قياسي موسوم‪ ،‬المسارات ‪ :2-1‬نباتات حمص غير ُمعدلة وراثيا‪ :4-3 ،‬نباتات حمص ُمعدلة وراثيا‪،‬‬ ‫‪ :pls+‬شاهد إيجابي‪.‬‬ ‫كما تبين أيضا من نتائج التهجين ‪ Southern hybridization‬أن هذه النباتات قد احتوت نسخة واحدة من‬ ‫الـ‪ ،T-DNA‬إذا يمكن أن يتم تأكيد دخول المورثة المرغوب بنقلها إلى مجين النبات الهدف بوساطة التفاعل‬ ‫التسلسلي للبوليميراز‪ ،‬لكن ليس بالضرورة أن تعبر المورثة في النبات أو تمنحه الصفة المرغوبة‪ ،‬وهي ظاهرة‬ ‫شائعة في مجال التحوير الوراثي للنباتات‪ ،‬وتعرف بإخماد المورثة ‪.Gene silencing‬‬ ‫حيث يمكن أن تحدث هذه الظاهرة في النباتات األولية المحورة األصلية ‪ ،Primary transformants‬أو النسل‬ ‫الناتج عنها في األجيال التالية‪ ،‬واليمكن التنبؤ بحدوثها‪ ،‬حيث يمكن أن تحدث في بعض النباتات دون األخرى‬ ‫حتى لو كانت محورة بالبالزميد ذاته )‪.(Fu et al., 1999‬‬ ‫لوحظت هذه الظاهرة ألول مرة منذ قرابة عقدين من الزمن في نباتات البيتونيا المحورة والتي احتوت على عدد‬ ‫زائد من المورثة ‪ ،chalcone synthase‬األمر الذي يحتمل أنه قد تسبب في إخماد المورثة المنقولة‪ ،‬أو‬ ‫المورثات الداخلية المشابهة في النبات على حد سواء‪ ،‬وقد أطلق على هذه الظاهرة اسم الكبت المشترك ‪(Co-‬‬ ‫)‪( suppression‬وتعرف بمنع التعبير عن المورثات المحورة والمشابهة للـ ‪ DNA‬األصلي والمحور وراثيا عن‬ ‫طريق التفاعل بين ‪ mRNA‬األصلي والمحور وراثيا)‪. (Napoli et al., 1990) ،‬‬ ‫يمكن أن نميز بين نوعين من إخماد المورثات سواءأكان في النبات أم في حقيقيات النوى بشكل عام‪ :‬األول‪،‬‬ ‫هو إخماد نسخ المورثة )‪ ،Transcriptional gene silencing (TGS‬والثاني‪ ،‬إخماد المورثة بعد النسخ‬ ‫)‪.(Carthew, 2001; Waterhouse et al., 2001 a,b) Posttranscriptional gene silencing (PTGS‬‬ ‫‪68‬‬ ‫رزه في هذا المجال خالل السنوات األخيرة حتى اآلن فإن آلية كل من ‪ PTGS‬و ‪TGS‬‬ ‫رغم التقدم الذي تم إح ا‬ ‫ليست معروفة بشكل دقيق‪ .‬يرتكز إخماد المورثة بعد النسخ ‪ PTGS‬على رصد كمية الـ‪ RNA‬في الخلية حيث‬ ‫يتم التعرف إليه عند نسخه بشكل مفرط على أنه غريب عن الخلية‪ ،‬ويتم تحطيمه بوساطة آلية دفاع العائل‬ ‫تجاه الفيروسات )‪ .(Carthew, 2001; Waterhouse et al., 2001,b‬يعد تشكل سالسل مضاعفة من الـ‬ ‫‪ RNA‬من العوامل الحيوية والمهمة في حدوث ظاهرة إخماد المورثة بعد النسخ ‪ ،PTGS‬حيث تتحطم هذه‬ ‫السالسل المضاعفة في الخلية إلى قطع صغيرة أحادية السلسلة من )‪ 21‬إلى ‪ 25‬نيوكليوتيدا(‪ .‬يمكن لهذه‬ ‫السالسل المفردة أن ترتبط مع سالسل مشابهة وتشكل سالسل مزدوجة تكون أيضا عرضة للتحطيم‪ ،‬هذا النوع‬ ‫من اإلخماد قابل لالنتشار في النباتات كسلسلة متخصصة )‪.(Miller et al., 2001‬‬ ‫تنطلق هذه الفرضية في تفسير تحطيم سالسل الـ ‪ RNA‬المزدوجة من الحقيقة المعروفة عن آلية مقاومة‬ ‫الفيروسات النباتية‪ ،‬حيث تعد مضاعفة‪ RNA‬الفيروس مرحلة وسط في مكاثرته داخل الخلية النباتية‪،‬‬ ‫وتتعرف إليها أنظمة الدفاع في الخلية‪ ،‬وتقوم بتحطيمها‪ ،‬وبذلك تظهر هذه النباتات مقاومتها للفيروس‪ .‬لوحظ‬ ‫من دراسة النباتات المحورة أنه عند دخول عدد كبير من نسخ الـ ‪ T-DNA‬فإن ذلك يترافق مع توضعها في‬ ‫تكرار معكوس‪ ،‬وهذا يعطي شرحا مبسطا لحدوث ظاهرة اإلخماد‪ ،‬حيث ينسخ عن مثل هذه المورثات سالسل‬ ‫الـ ‪ RNA‬مكملة ترتبط مع بعضه‪ ،‬مشكلة سالسل مزدوجة في حالة مشابهة لإلصابة بالفيروسات تكون في‬ ‫النهاية عرضة للتحطيم من قبل الخلية )‪.(Lessard et al., 2002‬‬ ‫يحدث النوع الثاني من اإلخماد (إخماد نسخ المورثة ‪ )TGS‬نتيجة إضافة مجموعة ميثيل )‪(Methylation‬‬ ‫إلى موقع مخصص من سلسلة الحاث ‪ ، Promoter‬أوسلسلة التشفير ‪ Coding sequence‬في المورثة ذاتها‪،‬‬ ‫مما يمنع عملية نسخ المورثة )‪ .(Carthew, .2001; Waterhouse et al., 2001 b‬على أي حال فقد تم تسجيل‬ ‫حدوث ظاهرة اإلخماد للمورثة مع وجود نسخة واحدة منها )‪ .( Geier, 1989‬بالرغم من العالقة بين وجود نسخ‬ ‫مزدوجة والعدد الكبير من نسخ المورثة المنقولة‪ ،‬وما بين مستقبالت مجموعة الميثيل ومقاومة الحاث‬ ‫الرتباطها مع حدوث ظاهرة اإلخماد‪ ،‬إال أن هذا الموضوع لم يتم التوثيق له بشكل كاف بحيث يمكن التغلب‬ ‫على هذه الظاهرة‪ ،‬ونظ ار إلى أن هذه الظاهرة ال يمكن التنبؤ بها‪ ،‬فقد توجه الباحثون في هذا المجال إلى‬ ‫التخلص من النباتات المحورة التي ال تعبر فيها المورثة عن الصفة المرغوبة‪ ،‬واستخدام تلك النباتات التي‬ ‫تكون فيها المورثة فعالة )‪.(Veluthambi et.al., 2003‬‬ ‫‪69‬‬ ‫‪ .5-5‬التقويم الحيوي للمورثة الواسمة لالنتخاب ‪bar‬‬ ‫تحمل المبيد )‪Phosphinothricin (PPT‬‬ ‫‪ّ .1-5-5‬‬ ‫يفيد هذا االختبار في الكشف عن تعبير المورثة ‪ ،bar‬ونشاط األنزيم ‪ ،PAT‬ومجال التحمل لمبيد‬ ‫الحمص الجيل ‪ T5‬بخمسة تراكيز‪:‬‬ ‫األعشاب‪ .‬قومت المورثة ‪ bar‬وظيفيا بدهن أوراق نباتات ُ‬ ‫(‪ )1500 ,1000 ,600 ,300 ,150‬مغ‪/‬ل من مبيد األعشاب ‪ ،phosphinothricin (PPT) Basta‬حيث‬ ‫الحمص ال ُمعدلة وراثيا مقاومة لكل التراكيز المستخدمة‪ ،‬في حين ماتت أوراق النباتات‬ ‫أظهرت نباتات ُ‬ ‫غير المحورة بعد أسبوع من عملية الدهن (الشكل ‪ ،)22‬ويستدل من ذلك على استقرار المورثة ‪ bar‬في‬ ‫جينوم النبات وقدرتها على التعبير عن الصفة التي تمنحها‪ ،‬حيث اكتسبت النباتات صفة المقاومة‬ ‫لمبيدات األعشاب‪ .‬تشغل هذه المورثة بوساطة حاث بنائي ‪ constitutive promoter‬يعمل على تحفيزها‬ ‫بشكل مستمر‪ ،‬لذلك يمكن االعتماد عليها في مكافحة األعشاب في أي مرحلة من عمر النبات‪.‬‬ ‫الحمص للمبيد ‪ phosphinothricin‬بتركيز ‪ 1500‬مغ‪/‬ل (اليمين) بالمقارنة‬ ‫الشكل ‪ .22‬مقاومة أوراق ُ‬ ‫مع حساسية أوراق نبات الشاهد لذات التركيز (اليسار)‬ ‫مازال استخدام مورثات المقاومة للمبيدات يعد أم ار حيويا وضروريا في تطوير نباتات ُمعدلة وراثيا‪،‬‬ ‫حيث تستطيع هذه المورثات في حال وجودها في الخلية إبطال ُسمية المبيد‪ ،‬بينما تتأثر فقط الخاليا‬ ‫غير المحورة ويتسبب المبيد بقتلها‪ ،‬مما يساعد على عملية تجديد نبات كامل معدل وراثيا من هذه‬ ‫الخاليا‪ .‬تستطيع مورثات أخرى أن تسهم بهذا الدور مثل المورثات التي تمنح صفة التحمل للمضادات‬ ‫الحيوية مثل الكانامايسين )‪ ،(Indurker et al.,2007‬والتي يقتصر دورها على تطوير النبات في مرحلة‬ ‫زراعة األنسجة‪ ،‬ولكنها تكون غير مفيدة ألداء النبات في الحقل‪ ،‬بل على العكس هناك مخاوف من‬ ‫‪70‬‬ ‫ناحية األمان الحيوي حول وجودها في النباتات ال ُمعدلة وراثيا عند إطالقها في البيئة‪ ،‬واتجهت الكثير‬ ‫من األبحاث نحو نزعها من النبات )‪.(Miki and McHugh, 2004‬‬ ‫أكدت هذه النتيجة وجود المورثة الواسمة لالنتخاب في النبات والمعروفة باسم ‪ ،bar gene‬والتي‬ ‫تركيز منه‪.‬‬ ‫استطاعت إبطال ُسمية مبيد األعشاب ‪ phosphinothricin‬عند دهن أوراق النباتات بعدة ا‬ ‫يستدل من هذه النتيجة أيضا على أن المورثة ‪ chitinase‬التي تمنح صفة المقاومة لألمراض الفطرية‬ ‫قد انتقلت مع هذه المورثة‪ ،‬حيث يتم ربط هاتين المورثتين مع بعضهما البعض عند نقلها للنبات‬ ‫بطريقة التحوير الوراثي‪ .‬استخدم في هذه الدراسة مبيد ‪ phosphinothricin‬مقارنة مع تجارب أخرى‬ ‫استخدم فيها المبيد ‪ phosphinothricin‬عالميا لتطوير نباتات حمص ُمعدلة وراثيا حيث استطاع كل‬ ‫من (‪ )Krishnamurthy et al., 2000, Kiesecker, 2000, Senthile et al., 2004‬الحصول على نباتات‬ ‫حمص محورة وراثيا بانتخابها على وسط يحتوي ‪ 20 ،10 ،2.5‬مغ‪/‬ل من المبيد ‪ PPT‬على التوالي‪.‬‬ ‫حيث استطاع هؤالء الباحثون الحصول على نباتات حمص محورة من النمط ‪ desi‬و ‪ ،kabuli‬وتأكيد‬ ‫الحمص‪ ،‬وانتقال صفة المقاومة للنبات حتى الجيل ‪ T1، T0‬فقط‪ .‬في‬ ‫انتقال المورثة إلى جينوم نبات ُ‬ ‫الحمص باستخدام البكتريا ‪Agrobactterium‬‬ ‫عام ‪ 2008‬تمكن (‪ )Khatib, 2008‬من تحوير صنفين من ُ‬ ‫الحمص‬ ‫‪ tumefaciens‬كوسيط‪ ،‬وتأكيد انتقال المورثة ‪ bar‬وتقويمها وظيفيا حتى الجيل ‪ T3‬في نباتات ُ‬ ‫المحورة‪ .‬كما هو مالحظ فإن التراكيز التي استخدمت في عملية االنتخاب هي أقل بعشرة أمثال أو‬ ‫أكثر من التراكيز التي تعامل بها النباتات في الحقل‪ ،‬ويمكن تفسير ذلك بأن عدد الخاليا المحورة في‬ ‫المراحل األولى تكون قليلة‪ ،‬وبالتالي تعطي كمية قليلة من األنزيم غير قادرة على منح الصفة مع‬ ‫وجود تراكيز مرتفعة من عامل االنتخاب‪ ،‬بينما يتحمل النبات الكامل التراكيز المرتفعة ألن كل خالياه‬ ‫أصبحت تشفر لهذا األنزيم )‪.(Stewart, 2008‬‬ ‫أخي ار يمكن القول إن صفة تحمل مبيدات األعشاب عامة التأثير هي من الصفات الزراعية المهمة‬ ‫ثنائية الغرض‪ ،‬حيث تستخدم المورثات التي تمنح المقاومة لها كمورثات واسمة لالنتخاب في مرحلة‬ ‫تطوير النبات المحور وراثيا‪ ،‬ويكون لها تطبيق زراعي مهم في مكافحة األعشاب النامية في الحقول‬ ‫التي تزرع فيها هذه المحاصيل‪ .‬تعد صفة تحمل مبيدات األعشاب عامة التأثير مثل الغاليفوسيت‬ ‫والغلوفوسينيت أمونيوم من أهم الصفات التي تم نقلها إلى المحاصيل ال ُمعدلة وراثيا والمزروعة على‬ ‫نطاق تجاري مثل‪ :‬القطن‪ ،‬والذرة‪ ،‬وفول الصويا‪ ،‬والكانوال‪ ،‬وقد أسهم نقل هذه الصفة في زيادة إنتاجية‬ ‫هذه المحاصيل عن طريق خفض الخسائر التي تسببها األعشاب وبخاصة في الدول المتقدمة أو‬ ‫‪71‬‬ ‫الصناعية التي تعتمد على مبيدات األعشاب بنسبة ‪ %100‬في مكافحة هذا النوع من اإلجهادات‬ ‫األحيائية )‪.(James, 2017‬‬ ‫‪.2-5-5‬‬ ‫التقويم الكيميائي لألنسجة باستخدام أحمر الكلوروفينول )‪Chlorophenol Red (CR‬‬ ‫يعتمد هذا االختبار على التغيرات اللونية لمشعر ‪ indicator dye‬أحمر الكلوروفينول الذي يحدث نتيجة‬ ‫تغير درجة الحموضة ‪ pH‬محلول الكشف (‪ ،)Trieu and Harrison, 1996‬حيث يكون لونه أحمر عند‬ ‫درجة حموضة ‪ ،pH = 6‬ويعتبر في هذه الحالة النسيج الورقي حساسا للمبيد ‪ ،PPT‬أما إذا كانت درجة‬ ‫الحموضة أقل من ‪ pH < 6‬فيتلون المحلول باللون األصفر أو البرتقالي‪ ،‬ويكون النسيج الورقي في هذه‬ ‫الحالة مقاوما للمبيد ‪.PPT‬‬ ‫أجري هذا االختبار ضمن أنابيب سعة ‪ 0.5‬مل بمعدل ‪ 5‬أنابيب لكل من النبات المعدل والشاهد‪ ،‬حيث‬ ‫أظهرت النتائج االختبار أن األنابيب الحاوية على وريقات نبات المعدل تلونت باللون البرتقالي‪ ،‬في‬ ‫حين بقيت األنابيب الحاوية على وريقات نبات الشاهد بلون أحمر‪ ،‬مما يدل على أن وريقات النبات‬ ‫المعدل وراثيا كانت مقاومة للمبيد‪ ، PPT‬في حين حافظ محلول الكشف على لونه األحمر عند تحضين‬ ‫وريقات نبات الشاهد فيه مما يدل على أنها حساسة للمبيد ‪( PPT‬الشكل ‪ .)23‬أظهر اختبار أحمر‬ ‫الكلوروفينول ‪ chlorophenol red‬كفاءته في الكشف عن النباتات المقاومة للمبيد بطريقة لونية بسيطة‬ ‫يمكن اعتمادها بدال من االختبارات الجزيئية في حال عدم توافرها‪ .‬استخدمت هذه الطريقة في الكشف‬ ‫عن‬ ‫مقاومة‬ ‫غلوفوسينيت‬ ‫الذي‬ ‫المبيد‬ ‫تمنحه‬ ‫المورثة ‪ bar‬في التوت البري‬ ‫(‪ (Song et al., 2008‬وكذلك‬ ‫على النبات البقولي‬ ‫‪Lotus‬‬ ‫‪Lohar et al., ( japonicus‬‬ ‫‪.)2001‬‬ ‫الحمص المعدل وراثيا‬ ‫الشكل ‪ .23‬التقويم الكيميائي لوريقات ُ‬ ‫(أسفل)‪ ،‬والشاهد (أعلى) باستخدام أحمر الكلورفينول‬ ‫‪72‬‬ ‫‪ .6-5‬دراسة الثر التضادي للمورثة كيتيناز ‪ chitinase‬في تثبيط نمو الفطر المسبب للفحة السكوكيتا‬ ‫‪ .1-6-5‬اختبار تثبيط إنبات البواغ‬ ‫ســجل عــدد المســتعمرات الناتجــة عــن نشــر ‪ 100‬ميكرولتــر مــن تخفيفــات المســتخلص األنزيمــي مــع المعلــق‬ ‫البوغي (الجدول ‪ ،9‬الشكل ‪ ،)24‬ثم حللت البيانات إحصائيا‪.‬‬ ‫أظهـ ــرت نتـ ــائج التحليـ ــل اإلحصـ ــائي باسـ ــتخدام برنـ ــامج ‪ SPSS22‬وجـ ــود فـ ــروق معنويـ ــة بـ ــين المعـ ــامالت‬ ‫والتخفيفـات المسـتخدمة )‪ (F = 534.34, P = 0.0001‬للمعـامالت‪ ،‬و )‪ (F = 20.78, P = 0.0001‬للتخفيفـات‪،‬‬ ‫فـي حــين كانــت هنــاك فـروق معنويــة بســيطة للفعــل المتبـادل‪ ،‬حيــث أظهــرت نتــائج اختبـار أقــل فــرق معنــوي‬ ‫لمستخلص النباتات ال ُمعدلة وراثيا تفوق التخفيف (‪ 0‬مستنبت‪ 3 :‬مستخلص أنزيمي) على التخفيفين (‪)1:1‬‬ ‫و (‪ )0:3‬بفروق عالية معنوية‪ ،‬في حين لم تكن هناك فروق معنويـة بـين التخفيفـين (‪ )3:0‬و (‪ ،)2:1‬تـاله‬ ‫التخفيــف (‪ )2:1‬الــذي تفــوق بفــروق عاليــة المعنويــة علــى التخفيفــين (‪ )1:1‬و (‪ ،)0:3‬كمــا تفــوق التخفيــف‬ ‫(‪ )1:1‬على التخفيف (‪ )0:3‬بفروق معنوية‪.‬‬ ‫أما بالنسبة للنباتات غير المحورة فقد ظهرت مسـتعمرات الفطـر فـي كـل المكـررات وتباينـت التخفيفـات فيمـا‬ ‫بينهـا بفـروق معنويــة وذلـك عنـد مســتوى معنويـة ‪ ،%5‬حيــث تفـوق فيهـا التخفيــف (‪ 0‬مسـتنبت‪ 3:‬مســتخلص‬ ‫أنزيم ــي) عل ــى التخفيف ــات (‪ )2:1‬و (‪ )1:1‬و (‪ )0:3‬بف ــروق معنوي ــة‪ .‬يمك ــن تفس ــير ذل ــك ب ــأن عملي ــة وخ ــز‬ ‫النبـات قـد حرضـت مورثـات داخليـة المنشـأ أدت إلـى تثبـيط نمـو األبـواغ ‪ ،‬فقـد اسـتطاع ‪(Shahid et al.,‬‬ ‫)‪ 2009‬الكشف عن نشـاط كـل مـن مورثـات الكيتينـاز‪ ،‬والغلوكانـاز‪ ،‬و‪ RIPs‬فـي نباتـات حمـص غيـر ُمعدلـة‬ ‫وراثيا تم تعريضها إلى عدوى صناعية بفطر األسكوكيتا‪.‬‬ ‫الجدول ‪ .9‬عدد المستعمرات المتشكلة من أبواغ الفطر ‪ Ascochyta rabiei‬على وسط ‪ CDA‬بعد معاملتها‬ ‫بتخفيفات مختلفة من مستخلص النبات المعدل وراثيا والشاهد‬ ‫النبات‬ ‫معدل وراثيا‬ ‫التخفيف‬ ‫المكرر‬ ‫المكرر‬ ‫المكرر‬ ‫(مستنبت ‪ :‬مستخلص أنزيمي)‬ ‫األول‬ ‫الثاني‬ ‫الثالث‬ ‫‪3 :0‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪0.6‬‬ ‫‪2 :1‬‬ ‫‪12‬‬ ‫‪11‬‬ ‫‪9‬‬ ‫‪10.6‬‬ ‫‪1: 1‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪32‬‬ ‫‪26‬‬ ‫‪29.3‬‬ ‫‪0:3‬‬ ‫‪150‬‬ ‫‪135‬‬ ‫‪130‬‬ ‫‪138.3‬‬ ‫)‪ (F = 534.34, P = 0.0001‬للمعامالت‬ ‫غير معدل‬ ‫المتوسط‬ ‫)‪ (F = 20.78, P = 0.0001‬للتخفيفات‬ ‫‪3 :0‬‬ ‫‪4‬‬ ‫‪2‬‬ ‫‪1‬‬ ‫‪2.3‬‬ ‫‪2 :1‬‬ ‫‪32‬‬ ‫‪22‬‬ ‫‪13‬‬ ‫‪22.3‬‬ ‫‪1: 1‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪54‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪39.6‬‬ ‫‪73‬‬ ‫‪0:3‬‬ ‫‪158‬‬ ‫‪139‬‬ ‫‪130‬‬ ‫‪142.3‬‬ ‫الشكل ‪ .24‬تشكل المستعمرات من أبواغ الفطر ‪ Acochyta rabiei‬المعاملة بعدة تخفيفات من المستخلص‬ ‫الحمص المحورة (أعلى)‪ ،‬والشاهد (أسفل) بعد نشرها على وسط ‪CDA‬‬ ‫األنزيمي لنباتات ُ‬ ‫تم تأكيد هذه النتائج من صور الم ُحضرات المجهرية التي تم تحضيرها من كل تخفيف في المعامالت‬ ‫السابقة وتلوينها بأزرق القطن‪ ،‬فقد تباينت التخفيفات فيما بينها في كثافة النمو الميسليومي‪ ،‬كذلك لوحظ‬ ‫تباين في تبوغ الفطر‪ ،‬وتشكل األوعية البكنيدية بين النسب المختلفة (الشكل ‪.)23‬‬ ‫الشكل ‪ .25‬نمو الميسليوم الفطري بعد معاملة األبواغ بعدة تخفيفات من المستخلص األنزيمي لنباتات‬ ‫الحمص ال ُمعدلة وراثيا (أعلى) والشاهد غير المعدل (أسفل)‪.‬‬ ‫ُ‬ ‫‪ .2-6-5‬التقويم الوظيفي للمورثة كيتيناز على الورقة المفصولة للنباتات المحورة‬ ‫بــدأت أع ـراض اإلصــابة بفطــر األســكوكيتا بــالظهور بــدءا مــن اليــوم الســادس فــي كــل األطبــاق‪ ،‬واســتمرت‬ ‫بالتطور حتى اليوم الثاني عشر‪ ،‬حيث حسبت شدة اإلصابة ونسبتها في كل طبق من األطباق‪ ،‬ولكل من‬ ‫النباتــات ال ُمعدلــة وراثيــا والشــاهد‪ ،‬أصــيبت جميــع الوريقــات المعــداة مــن نباتــات الشــاهد بــالفطر‪ ،‬ولـم تالحــظ‬ ‫هنـاك أيــة فــروق معنويــة بــين األطبــاق المعــداة‪ ،‬حيــث بلغــت نســبة اإلصــابة ‪ Disease incidence‬أكثــر مــن‬ ‫‪ ،%90‬حيث كانت النباتات عالية القابلية لإلصابة في كل األطباق (الشكل ‪.)24‬‬ ‫‪74‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪100‬‬ ‫المكرر الخامس‬ ‫‪100‬‬ ‫المكرر الرابع‬ ‫‪100‬‬ ‫المكرر الثالث‬ ‫‪100‬‬ ‫المكرر الثاني‬ ‫‪100‬‬ ‫المكرر األول‬ ‫‪100‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪40‬‬ ‫االوراق المصابة ‪%‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪0‬‬ ‫نسبة اإلصابة‬ ‫نسبة االصابة ‪%‬‬ ‫الشكل ‪ .26‬نسبة اإلصابة بالفطر ‪ A. rabiei‬عند معاملة أوراق النبات الشاهد غير المعدل وراثيا‬ ‫في حين تباينت نسبة اإلصابة في النبات المعدل وراثيا‪ ،‬حيث كان النبات متوسط القابلية لإلصابة ‪= DI‬‬ ‫‪ %30‬في الطبق األول‪ ،‬بينما كانت في الطبق الثاني والثالث والرابع عالية القابلية لإلصابة وبلغت قيمة =‬ ‫‪ ،%80 , %90 , %88 DI‬علــى الت ـوالي‪ ،‬فــي حــين انخفضــت نســبة اإلصــابة إلــى ‪ %50‬فــي الطبــق‬ ‫الخامس‪ ،‬وكان النبات متوسط القابلية لإلصابة (الشكل ‪.)25‬‬ ‫‪120‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪100‬‬ ‫‪88‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪40‬‬ ‫‪20‬‬ ‫المكرر الخامس‬ ‫‪50‬‬ ‫المكرر الرابع‬ ‫‪80‬‬ ‫المكرر الثاني‬ ‫‪88‬‬ ‫المكرر الثالث‬ ‫‪100‬‬ ‫المكرر األول‬ ‫‪30‬‬ ‫‪0‬‬ ‫نسبة اإلصابة‬ ‫نسبة االصابة ‪%‬‬ ‫الشكل ‪ .27‬نسبة اإلصابة بالفطر ‪ A. rabiei‬عند معاملة أوراق النبات المعدل وراثيا‬ ‫‪75‬‬ ‫االوراق المصابة ‪%‬‬ ‫‪80‬‬ ‫ولدى إجراء التحليل اإلحصائي لمقارنة نسبة اإلصابة للنبات الشاهد والنبات المعدل وراثيا لوحظ وجود‬ ‫فروق معنوية بين النبات الشاهد والمعدل‪ ،‬حيث كانت قيمة ‪ p-vlue =0.04‬حيث بلغت نسبةاإلصابة‬ ‫وسطيا‬ ‫‪69.6‬‬ ‫للمعدلة‪ ،‬و‪ %100‬للشاهد‪ .‬كذلك حسبت شدة اإلصابة في كل طبق لكل من النبات الشاهد‬ ‫والمعدل وراثيا وفق السلم المذكور والمعادلة المقترحة‪ ،‬حيث ترأوحت شدة اإلصابة في الطبق األول ‪، 80‬‬ ‫في حين كانت شدة اإلصابة في الطبق الثاني ‪ ،81‬وفي الطبق الثالث والرابع بحدود ‪ ، 90‬بينما كانت‬ ‫بالطبق الخامس بحدود ‪ ،85‬ولم تالحظ أي فروق بين النباتات في شدة اإلصابة‪ ،‬وكانت النباتات عالية‬ ‫القابلية لإلصابة (الشكل ‪.)28‬‬ ‫‪90‬‬ ‫‪92‬‬ ‫‪89‬‬ ‫‪90‬‬ ‫‪88‬‬ ‫‪84‬‬ ‫‪81‬‬ ‫‪82‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪80‬‬ ‫قيمة شدة المصابة‬ ‫‪85‬‬ ‫‪86‬‬ ‫‪78‬‬ ‫‪76‬‬ ‫المكرر الخامس‬ ‫المكرر الرابع‬ ‫المكرر الثالث‬ ‫‪85‬‬ ‫‪90‬‬ ‫‪89‬‬ ‫المكرر الثاني‬ ‫المكرر األول‬ ‫‪81‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪74‬‬ ‫‪DS‬‬ ‫شدة االصابة‬ ‫الشكل ‪ .28‬شدة اإلصابة بالفطر ‪ A. rabiei‬في مكررات النبات الشاهد‬ ‫في حين كانت قراءات شدة اإلصابة في النبات المعدل في الطبق األول ‪ ،35‬واعتبر النبات متوسط‬ ‫القابلية لإلصابة‪ ،‬وازدادت شدة اإلصابة في الطبق الثاني والثالث والرابع‪ ،‬حيث بلغت ‪DS = 66, 64 ,68‬‬ ‫وكانت نباتات عالية القابلية لإلصابة‪ ،‬ثم انخفضت شدة اإلصابة إلى ‪ 50‬في الطبق الخامس‪ ،‬وكان‬ ‫النبات عالي القابلية لإلصابة (الشكل ‪.)29‬‬ ‫‪76‬‬ ‫‪80‬‬ ‫‪68‬‬ ‫‪66‬‬ ‫‪64‬‬ ‫‪70‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪40‬‬ ‫‪30‬‬ ‫قيمة شدة المصابة‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪10‬‬ ‫المكرر الخامس‬ ‫المكرر الرابع‬ ‫المكرر الثالث‬ ‫المكرر الثاني‬ ‫المكرر األول‬ ‫‪50‬‬ ‫‪68‬‬ ‫‪64‬‬ ‫‪66‬‬ ‫‪35‬‬ ‫‪0‬‬ ‫‪DS‬‬ ‫شدة االصابة‬ ‫الشكل ‪ .29‬شدة اإلصابة بالفطر ‪ A. rabiei‬في مكررات النبات المعدل وراثيا‬ ‫ولدى تحليل بيانات شدة اإلصابة لكل من‬ ‫النبات الشاهد والمعدل و ارثيا لوحظ وجود‬ ‫فروق معنوية بين النباتات الشاهد والمعدل‬ ‫وراثيا ( ‪ ، (P-value =0.003‬حيث تم تأكيد‬ ‫انخفاض شدة اإلصابة إحصائيا وبفروق‬ ‫معنوية بين النباتات ال ُمعدلة وراثيا ونباتات‬ ‫الشاهد حيث بلغت ‪ 56.6‬على أوراق‬ ‫المعدلة وراثيا‪ ،‬و‪ 85.2‬على الشاهد‪،‬‬ ‫النباتات ُ‬ ‫أي استطاع أنزيم الكيتناز التخفيف من شدة‬ ‫اإلصابة (الشكل ‪.)30‬‬ ‫الشكل ‪ .30‬تباين شدة اإلصابة بالفطر ‪A. rabiei‬‬ ‫على وريقات الحمص المعدلة وراثيا (اليمين)‬ ‫بالمقارنة مع وريقات الشاهد (اليسار)‬ ‫‪ .3-6-5‬التقويم على كامل النبات‬ ‫تم في هذه التجربة زراعة البذور في األصص تحت ظروف متحكم بها‪ ،‬ثم رش كامل النبات بالمعلق‬ ‫البوغي‪ ،‬أخذت قراءات نسبة وشدة اإلصابة على ثالث أوراق من المستوى نفسه على كل نبات‪ ،‬واستبعدت‬ ‫األوراق السفلية في كل األصص‪.‬‬ ‫‪77‬‬ ‫أظهرت نتائج حساب نسبة اإلصابة للنباتات الشاهد تقاربا فيما بينها‪ ،‬حيث أصيبت جميع األوراق تقريبا‬ ‫وفي كل األصص‪ ،‬وترأوحت نسبة اإلصابة بين ‪ ،%100 – 80‬ولكن لم يظهر على النباتات أي فروق‬ ‫فيما بينها من حيث نسبة اإلصابة‪ .‬تطابقت هذه النتيجة مع نتائج اختبار الورقة المفصولة‪ ،‬وكانت‬ ‫النباتات عالية القابلية لإلصابة‪.‬‬ ‫أما بالنسبة للنباتات ال ُمعدلة وراثيا فقد تباينت نسبة اإلصابة فيما بينها‪ ،‬حيث بلغت على النبات األول‬ ‫حوالي ‪ ،%27‬وكان النبات متوسط المقاومة‪ ،‬في حين كانت على النبات الثاني ‪ ،%83‬وعلى النبات الثالث‬ ‫‪ ،%55‬وعلى النبات الرابع ‪ ،%66‬واعتبرت النباتات الثالث األخيرة عالية القابلية لإلصابة‪.‬‬ ‫أظهرت نتائج التحليل اإلحصائي لكل من النباتات ال ُمعدلة وراثيا ونباتات الشاهد وجود فروق معنوية بين‬ ‫النبات الشاهد والمعدل حيث االحتمالية ‪ .p-vlue =0.001‬حيث بلغت نسبة اإلصابة في النباتات المعدلة‬ ‫وسطيا ‪57.75‬‬ ‫‪ ،‬وفي نباتات الشاهد تراوحت بين‬ ‫‪100- 80‬‬ ‫‪.%‬‬ ‫أيضا عند تحليل بيانات شدة اإلصابة لكل من النباتات األربع سواء أكانت ال ُمعدلة أم الشاهد المزروعة‪،‬‬ ‫حيث بلغت شدة اإلصابة على النبات الشاهد األول‪ ، 64‬ثم انخفضت إلى ‪ 55‬على النبات الثاني‪ ،‬و‪69‬‬ ‫على النبات الثالث‪ ،‬و‪62‬على النبات الرابع‪ ،‬وكانت جميعها عالية القابلية لإلصابة‪.‬‬ ‫أما على النباتات ال ُمعدلة وراثيا فقد بلغت قيمة شدة اإلصابة ‪ 9‬على النبات األول وكان النبات عالي‬ ‫المقاومة عند هذه القيمة‪ ،‬بينما ارتفعت إلى ‪ 35‬على النبات الثاني واعتبر النبات متوسط القابلية لإلصابة‪،‬‬ ‫في حين بلغت شدة اإلصابة ‪ 24‬على النبات الثالث وكان النبات عند هذه القيمة متوسط المقاومة‪ ،‬أيضا‬ ‫بلغت شدة اإلصابة على النبات الرابع ‪ 21‬وكان النبات أيضا متوسط المقاومة‪.‬‬ ‫أيضا حللت نتائج شدة اإلصابة إحصائيا لكل من النبات الشاهد والمعدل وراثيا حيث أظهرت النتائج فروقا‬ ‫معنوية في شدة اإلصابة بين النبات الشاهد والنبات المعدل وراثيا )‪ ،(P-value = 0.001‬وهذا يتطابق مع‬ ‫نتائج التقويم بوساطة الورقة المفصولة‪ .‬حيث بلغت شدة اإلصابة وسطيا في النباتات المحورة ‪ 22.25‬و‬ ‫‪ 62.5‬في النباتات غير المحورة‪.‬‬ ‫استطاع أنزيم الكيتيناز خفض شدة اإلصابة بفطر األسكوكيتا على النبات المعدل وراثيا بالمقارنة مع‬ ‫نباتات الشاهد وبخاصة عند رش كامل النبات‪ ،‬ويعزى هذا األمر إلى اختالف آلية وفيزيولوجيا المقاومة‬ ‫في الورقة المفصولة عما هو عليه في الورقة المتصلة‪ ،‬ومن المتوقع أن تكون شدة اإلصابة أعلى مما هو‬ ‫عليه في الحقل‪ ،‬ويفسر ذلك بأن الظروف التي تتوافر في اختبار الورقة المفصولة تكون مشجعة على تبوغ‬ ‫الفطر‪ ،‬وانتاج أبواغ بنسبة أكبر‪ ،‬حيث أشارت بعض الدراسات إلى أن تعريض األنماط الوراثية المقاومة‬ ‫لفترات طويلة تحت الظروف الرطبة يؤدي إلى انخفاض مقاومتها (‪.)Collard et al., 2001‬‬ ‫أما عند مقارنة نسبة اإلصابة عند تقويمها بطريقة الورقة المفصولة من جهة‪ ،‬وعلى كامل النبات من جهة‬ ‫ثانية‪ ،‬فقد لوحظ أن هناك تقاربا في النتائج على كل من نباتات الشاهد والنباتات ال ُمعدلة وراثيا‪ ،‬حيث‬ ‫أصيبت جميع النباتات‪.‬‬ ‫‪78‬‬ ‫‪ .4-6-5‬التقويم الوظيفي للمورثة كيتيناز على الورقة المفصولة للنباتات غير المحورة‬ ‫أظهرت نتائج هذه التجربة إصابة جميع الوريقات المعداة بالفطر ‪ A. rabiei‬عند جميع التخفيفات‬ ‫المستخدمة (مستنبت‪ :‬مستخلص أنزيمي‪ :‬معلق بوغي) للمستخلص األنزيمي من نباتات الشاهد والنباتات‬ ‫ال ُمعدلة وراثيا‪ .‬لم تالحظ أية فروق معنوية بين األطباق من حيث نسبة اإلصابة‪ ،‬حيث بلغت نسبة‬ ‫اإلصابة ‪ Disease incidence‬أكثر من ‪ ،%90‬وكانت النباتات عالية القابلية لإلصابة في معامالت‬ ‫مستخلص النبات الشاهد‪ ،‬وكذلك مستخلص النبات المعدل وراثيا‪.‬‬ ‫عند حساب شدة اإلصابة بعد العدوى بتخفيفات مستخلص النبات المعدل وراثيا تفوقت النسبة ‪ 3:0‬على‬ ‫بقية النسب المستخدمة وهي‪ 1:2 :‬و‪ 1:1‬و‪ ،0:3‬حيث استطاعت هذه النسبة التخفيف من شدة اإلصابة‬ ‫بالفطر‪ ،‬حيث بلغت قيمتها ‪ 62‬و‪ 69‬في كل مكرر‪ ،‬واعتبر النبات عالي القابلية لإلصابة‪ ،‬تالها النسبة‬ ‫‪ ،1:2‬حيث بلغت شدة اإلصابة ‪ 73‬في حين لم تالحظ أية فروق في شدة اإلصابة بين النسبتين ‪ 1:1‬و‬ ‫‪.0:3‬‬ ‫في حين لم تظهر نسب النبات الشاهد أي تباين في شدة اإلصابة فيما بينها‪ ،‬وكانت النباتات أيضا عالية‬ ‫القابلية لإلصابة‪ ،‬وهذا يتطابق مع ما أظهرته نتائج المعاملة األنزيمية ألبواغ الفطر بالنسب المختلفة‪،‬‬ ‫وكذلك الصور المجهرية لنمو الفطر عند كل تخفيف‪ ،‬حيث أكدت هذه الدراسة أن النسبة ‪ 3:0‬من النبات‬ ‫المعدل هي األفضل كفاءة في تخفيض شدة اإلصابة بالفطر (الشكل ‪.)31‬‬ ‫الحمص للصنف غاب ‪1‬‬ ‫الشكل ‪ .31‬تباين شدة اإلصابة بفطر األسكوكيتا على وريقات ُ‬ ‫الحمص أحدهما‬ ‫استخدم في هذا الدراسة اختبار الورقة المفصولة لتقويم ردة فعل ط ارزين وراثيين من ُ‬ ‫معدل وراثيا‪ ،‬واآلخر هو النبات األب المعدل عنه‪ ،‬وذلك تجاه اإلصابة بفطر ‪ A. rabiei‬المسبب للفحة‬ ‫لحمص‪ .‬أظهرت النتائج أن وجود المورثة كيتيناز قد زاد من تحمل النبات للفطر‬ ‫األسكوكيتا على ا ُ‬ ‫‪79‬‬ ‫المسبب للفحة األسكوكيتا‪ ،‬وغير من مؤشر شدة اإلصابة وتطور المرض‪ ،‬لكنها لم تؤثر في نسبة‬ ‫اإلصابة‪ ،‬حيث أصيبت جميع األوراق أو النباتات المختبرة‪.‬‬ ‫ارتبطت مقاومة المرض بشكل أساسي بكمية األنزيم الناتجة أو بتعبير المورثة كيتيناز في النبات‪ ،‬حيث‬ ‫أمكن الكشف جزيئيا عن نشاط هذه المورثة من خالل اختبار النسخ العكسي ‪ ،RT-PCR‬لكن لم نستطع‬ ‫تحديد الكمية المنتجة منه والتي تتطلب نوعا آخر من االختبارات هو تلطخ وسترن ‪ Western blot‬الذي‬ ‫يكشف عن األنزيم الذي تعبر عنه المورثة‪ .‬لكن في الوقت ذاته تم استقراء هذه النتيجة بطريقة أخرى‬ ‫وذلك عند معاملة أبواغ الفطر بعدة تخفيفات من المستخلص األنزيمي للنبات المعدل وراثيا والشاهد غير‬ ‫المعدل‪ ،‬وقد أظهرت النتائج أن استخدام المستخلص األنزيمي دون تخفيف ثبط عملية تشكل الميسيليوم‪،‬‬ ‫وقام األنزيم بدوره في تحطيم أنبوبة اإلنتاش عند األبواغ‪ ،‬في حين تشكل الميسليوم مع استخدام‬ ‫التخفيفات‪ ،‬ولكن بقيت بعض األبواغ حية وقادرة على إحداث اإلصابة‪ ،‬وهذا ماتم تسجيله عند نشر هذه‬ ‫التخفيفات على وسط مناسب لنمو الفطر ‪ ،CDA‬وكذلك حدوث اإلصابة عند إعداء أوراق الصنف غاب‪1‬‬ ‫القابل لإلصابة بهذا التركيز‪.‬‬ ‫بالعودة إلى طريقة التقويم المستخدمة فقد قام )‪ (Harijati& Keane, 2012‬باختبار ثمانية أصناف من‬ ‫الحمص‪ ،‬وقد استطاع من خاللها‬ ‫الحمص بطريقة الورقة المفصولة الختبار مقاومتها لفطر أسكوكيتا ُ‬ ‫ُ‬ ‫التوصل إلى أن األغار بنسبة ‪ %1‬و‪ %2‬كان األفضل لتحضير وسط ماء‪-‬أغار‪ ،‬والعدوى بمعلق بوغي‬ ‫وتركيز ‪ 510 × 1‬و‪ 410 × 5‬من األبواغ الكونيدية كان األنسب للعدوى في الفصل بين األنماط المقاومة‬ ‫والقابلة لإلصابة واعتماد الطريقة كمؤشر أولي في التمييز بينها‪.‬‬ ‫في دراسات أخرى أجراها كل من )‪ Trapero-Casas and Kaiser (1992‬على مرض لفحة األسكوكيتا‬ ‫الحمص تبين من خاللها بأن تطور المرض كان أبطأ على أوراق بعمر ‪ 8‬أسابيع مما هو عليه عند‬ ‫على ُ‬ ‫أوراق بعمر أسبوعين‪ .‬عند اختبار مقاومة نمطين وراثيين من البازالء تجاه الفطر المسبب للبياض الدقيقي‬ ‫باستخدام الورقة المفصولة‪ ،‬أظهر النمطان مقاومة عالية لهذا الفطر)‪(Azmat et al., 2013‬‬ ‫أظهرت المورثة ‪ Chit33‬عند نقلها إلى نباتات كانوال ‪ canola‬نشاطا مضادا للفطر المسبب للعفن األبيض‬ ‫‪ ،Sclerotinia sclerotiorum‬حيث انخفض حجم التقرحات بشكل معنوي عند المقارنة مع نباتات غير‬ ‫ُمعدلة وراثيا وذلك في تجارب الورقة المفصولة )‪.(Solgi et al., 2015‬‬ ‫أشارت العديد من الدراسات إلى إدخال المورثة كيتيناز في العديد من األنواع النباتية لتعزيز مقاومتها‬ ‫للفطريات‪ ،‬فقد استخدم مستخلص البروتين الخام من نباتات التبغ والبازالء ال ُمعدلة وراثيا في دراسة التأثير‬ ‫المضاد للفطور للمورثة ‪ Chit30‬على الفطر ‪ ، Trichoderma harzianum‬حيث استطاع األنزيم تثبيط‬ ‫نمو ميسليوم الفطر في األطباق‪ ،‬وقد أمكن مالحظة التأثير المضاد خالل ‪ 16- 8‬ساعة من المعاملة‪،‬‬ ‫‪80‬‬ ‫في حين اعتبر أنه في معظم الحاالت يمكن دراسة التأثير بعد ‪ 30 – 24‬ساعة (‪ ،)Hassan, 2006‬أيضا‬ ‫عزلت المورثة كيتيناز من نبات الرز لمقاومة فطر البياض الدقيقي على العنب ‪،Uncinula necator‬‬ ‫تأخر في ظهور المرض وزيادة في تحمل اإلصابة بفطر البياض الدقيقي ولم‬ ‫ا‬ ‫حيث أبدت النباتات ال ُمعدلة‬ ‫تبد النباتات أي تغيرات مظهرية (‪ .)Nirala et al.,2010‬في دراسة أخرى عزل فيها أنزيم الكيتيناز من‬ ‫البكتريا ‪ Bacillus subtilis‬تم عزلها من أوراق وجذور بعض النباتات‪ ،‬حيث استخدم أنزيم الكيتيناز‬ ‫لمقاومة فطر ‪ Fusarium culmorum‬المسبب لتحلل جذور الخضروات‪ ،‬وقد استطاع األنزيم التأثير في‬ ‫الفطر والحد من نمو المستعمرة (‪ .)Nadaroglu et al ., 2014‬في دراسة‬ ‫لمورثة الكيتيناز ‪Chit18H8‬‬ ‫التي عزلت من البكتريا من أحد الترب الكابحة وذلك بهدف دراسة نشاطها ضد ثمانية ممرضات فطرية‬ ‫هي‪:‬‬ ‫‪, Aspergillus niger, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum Alternaria alternat‬‬ ‫‪Colletotrichum gloeosporioides, Penicillium chrysogenum, Rhizopus stolonifera, Trichoderma‬‬ ‫‪ ، harzianum‬حيث أبدت المورثة تأثي ار مضادا تجاه أربعة من الممرضات الرئيسة التي توجد في التربة‬ ‫هي‪Fusarium ،oxysporum Fusarium ،Colletotrichum gloeosporioides ، Alternaria alternat :‬‬ ‫‪ .)Berini et al.,2017( graminearum‬سجل أيضا نشاط مضاد لمورثة الكيتيناز في نبات الرز الهندي‬ ‫صنف ‪ Tetep‬تجاه فطر ‪ Rhizoctonia solani‬المسبب للفحة الغمد‪ ،‬حيث عملت المورثة على تثبيط نمو‬ ‫مستعمرة الفطر ‪ ،Rhizoctonia solani‬وأشارت الدراسة إلى أنه يمكن أن توفر مورثات الكيتيناز مصد ار‬ ‫مهما لعمليات التربية التقليدية في نبات الرز الحساسة بهدف مقاومة هذا الفطر (‪.)Richa et al., 2016‬‬ ‫في دراسة أخرى تم فيها دراسة التغيرات ألنزيمي الكيتيناز‪ ،‬والغلوكاناز وذلك في نباتات حمص تم إعدائها‬ ‫بفطر ‪ ،Fusarium oxysporum‬حيث أبدى األنزيمان نشاطا مضادا للفطر )‪.(Suthar and Shukla, 2016‬‬ ‫من الدراسات التي أجريت على مورثة الكيتيناز‪ EuCHIT2‬والتي تم عزلها من نبات‬ ‫‪Eucommia‬‬ ‫‪ ulmoides‬وادخالها إلى نبات التبغ بهدف دراسة مقاومة فطر البياض الدقيقي ‪Erysiphe cichoracearum‬‬ ‫و ذلك اعتمادا على انخفاض اإلصابة‪ ،‬وعدد األبواغ‪ ،‬والمؤشرات الفيزيوكيميائية‪ ،‬وتحليل التعبير الوراثي‪،‬‬ ‫حيث أبدت المورثة نشاطا مضادا ومقاومة لفطر البياض الدقيقي بنسب معنوية عالية في نباتات التبغ‬ ‫المحورة‪ ،‬وازداد نشاط أنزيمي البيروكسيداز‪ ،‬والكاتالز بعد عملية العدوى في نباتات التبغ المحورة ‪ .‬كما‬ ‫لوحظ انخفاض في عدد األبواغ الكونيدية في النبات المحور مقارنة بالنبات غير المحورة‪ ،‬كما سجل أيضا‬ ‫ازدياد في تركيز البروتينات المرتبطة بالممرض ‪ PR-1a‬بعد عملية العدوى في النبات المعدل‪ ،‬وهذا يعود‬ ‫إلى أن المورثة ‪ EuCHIT2‬تحفز على مقاومة فطر ‪ Erysiphe. cichoracearum‬من خالل التعبير الوراثي‬ ‫للبروتينات المرتبطة بالممرض (‪.)Zhao et al., 2017‬‬ ‫‪81‬‬ ‫في الحقيقة يتطلب هذا النوع من الدراسات تطوير واختبار عدد أكبر من السالالت الوراثية الختيار‬ ‫األفضل منها‪ ،‬وهذا يرتبط بشكل أساسي بالعمل على زيادة كفاءة التحوير الوراثي للحمص الذي يعد‬ ‫صعبا كغيره من البقوليات‪ ،‬كما يمكن تحسين التحمل أو مقاومة المرض من خالل مراكمة أنواع أخرى من‬ ‫المورثات التي تمنح المقاومة لألمراض الفطرية مثل الغلوكاناز ‪ glucanase‬في النبات نفسه بطريقة‬ ‫التهجين التقليدي بين نباتات محورة يحمل كل منها إحدى المورثتين‪.‬‬ ‫تجدر اإلشارة هنا إلى أن هذا البحث يمثل المحاولة األولى الختبار دور المورثة كيتيناز المنقولة للنبات‬ ‫الحمص في سورية‪ ،‬وهو‬ ‫بطريقة الهندسة الوراثية في مقاومة واحد من أهم األمراض الفطرية على نبات ُ‬ ‫لفحة األسكوكيتا هذا من جهة‪ ،‬ومن جهة أخرى تبقى هذه المورثة المنقولة ذات أهمية كمورثة مقاومة‬ ‫الحمص‪،‬‬ ‫للممرضات الفطرية‪ ،‬حيث يمكن اختبار دورها في منح صفة المقاومة ألمراض أخرى تصيب ُ‬ ‫كما يمكن نقلها بطريقة التهجين التقليدي إلى أصناف قابلة لإلصابة من النمط كابولي لتحسين مقاومتها‬ ‫الحمص‪.‬‬ ‫ألهم األمراض الفطرية التي تصيب ُ‬ ‫‪82‬‬ ‫سادسا‪ -‬الستنتاجات‬ ‫‪ .1‬استقرار المورثتين ‪ ، bar‬و ‪ chitinase‬في األجيال المتعاقبة حتى الجيل ‪ T5‬والمنقولتين إلى جينوم‬ ‫الحمص النمط ديزي بطريقة الهندسة الوراثية‪.‬‬ ‫نبات ُ‬ ‫‪ .2‬يفيد التفاعل التسلسلي للبوليميراز ‪ PCR‬في الكشف عن وجود أو غياب المورثة دون تعبيرها‪.‬‬ ‫‪ .3‬ساهمت عملية وخز األوراق في تراكم الحمض النووي الريبي بعد‬ ‫‪48‬‬ ‫ساعة من عملية الوخز‪.‬‬ ‫‪ .4‬دلت عملية النسخ العكسي ‪ Reverse transcription‬للحمض النووي الريبي الرسول ‪ mRNA‬على‬ ‫تجاح عملية النسخ للمورثة المنقولة‪ ،‬وعدم حدوث إخماد ‪ silencing‬للمورثة في هذه المرحلة‪.‬‬ ‫‪ .5‬يعد دهن األوراق النباتية بعامل االنتخاب المستخدم في تطوير النبات المعدل وراثيا من أبسط الطرائق‬ ‫التي يمكن الكشف فيها عن عملية التحوير الوراثي للنبات‪.‬‬ ‫الحمص ال ُمعدلة وراثيا حتى التركيز ‪1500‬مغ‪/‬ل من المبيد ‪ PPT‬دون أن تظهر عليها‬ ‫‪ .6‬تحملت نباتات ُ‬ ‫أعراض ُسمية مما يدل على كفاءة المورثة ‪ bar‬في منح صفة التحمل للمبيد‪.‬‬ ‫‪ .7‬كفاءة الوسم بالطريقة غير اإلشعاعية للمسابر ‪ probes‬في الكشف عن عدد المواقع الوراثية للمورثات‬ ‫المنقولة للحمص‪.‬‬ ‫‪ .8‬احتوت نباتات الحمص المعدلة وراثيا على نسخة وحيدة من المورثة المنقولة‬ ‫‪ .9‬خفضت المورثة كيتيناز من تعداد األبواغ المعاملة بمستخلص البروتين الكلي للنبات الحاوي على‬ ‫األنزيم الذي تشفر له المورثة‪.‬‬ ‫‪ .10‬خفضت المورثة كيتيناز من شدة اإلصابة على أوراق النبات الحاوية على المورثة‪ ،‬لكنها لم تؤثر في‬ ‫نسبة اإلصابة‪.‬‬ ‫‪ .11‬أعطت طريقة التقويم بالورقة المفصولة وعلى كامل النبات نتائج متقاربة من حيث نسبة وشدة‬ ‫اإلصابة بلفحة األسكوكيتا‪.‬‬ ‫‪83‬‬ ‫سابعا‪ -‬المقترحات والتوصيات‬ ‫‪ .1‬اختبار دور المورثة كيتيناز المنقولة للحمص النمط ديزي في مقاومة ممرضات فطرية أخرى على‬ ‫الحمص‪.‬‬ ‫ُ‬ ‫‪ .2‬التقدير الكمي للحمض النووي الرسول ‪ mRNA‬الذي تشفر له المورثة كيتيناز بوساطة التفاعل‬ ‫التسلسلي للبوليميراز اللحظي ‪.Real time PCR‬‬ ‫‪ .3‬الكشف عن كمية األنزيم الذي تشفر له المورثة كيتيناز عن طريق اختبار تلطخ وسترن ‪Western‬‬ ‫‪.blot‬‬ ‫‪ .4‬دراسة كفاءة تراكيز مختلفة من أنزيم كيتيناز النقي في تثبيط إنتاش األبواغ‪.‬‬ ‫‪ .5‬مكاثرة النباتات للحصول على كمية أكبر من البذور‪ ،‬ثم تقويمها تجاه الممرض تحت ظروف االحتواء‬ ‫‪.containment‬‬ ‫الحمص مثل‬ ‫‪ .6‬مراكمة مورثات مقاومة ‪ pyramiding of resistance genes‬أخرى منقولة إلى ُ‬ ‫الغلوكاناز‪ glucanase‬لزيادة مقاومته للممرضات الفطرية‪.‬‬ ‫‪ .7‬االستفادة من مقاومة نباتات الحمص لمبيد األعشاب ‪ Phosphinothricin‬في مكافحة األعشاب‪.‬‬ ‫‪84‬‬ ‫ المراجع‬-‫ثامنا‬ ‫ااا‬ ‫ مصيءياااا اح‬،‫ وزارة الزراعاااا واح ااارا الزراعاااي‬.2009 ‫ المجموعةةةالحاائيةةةلزرالحال ااعرةةةالحال ةةة و ال لعااا‬.1 .‫ سوريا‬،‫ دمشق‬،‫والتخطيط‬ 2. AMALU, C. 2004. Plant biotechnology and food crop development in Sub-Saharan Africa. Technol. Soc. 26:537-550. 3. ANGUELOVA, M.V., WESTHUIZEN, V.D., AND PRETORIUS, Z.A. (2001) Beta-1,3glucanase and chitinase activities and the resistance response of wheat to leaf rust. J. Phytopathol. 149: 381-384. 4. ARMSTRONG, C.L., G. CHONGO, B.D. GOSSEN AND L.J. DUCZEK. 2001. Mating Type Distribution and Incidence of the Teleomorph of Ascochyta rabiei (Didymella rabiei) in Canada. Canadian Journal of Plant Pathology, 23: 110-113. 5. ARRIANO,L.S.,BRADING,P.A.,BROWN,J.K.2001.Adetached seedling leaf technique resistsnce to Mycosphaerella graminicola in wheat.plant pathology.50,339-346. 6. ARUMUGANATHAN, K. AND EARLE, E. D. (1991). Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Molecular Biology Reporter, 9:208–218. 7. ATIK, O., A. EL-AHMED, M. BAUM, S. AHMED, M.M. YABRAK, A. AL-ASSAF AND S. KABBABEH. 2012. The Effects of Different BION® Treatments on Ascochyta Blight (Didymella rabiei) of chickpea. Arab Journal of Plant Protection, 30: 101-109. 8. AZHAGUVEL, P., D. VIDYA, A. SHARMA AND R. K. VARSHNEY (2006). Methodological advancement in molecular markers to delimit the gene(s) for crop improvement, pp. 460-469. In: Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology. Advances and Topical Issues. Teixera da Silva, J. (Eds.) Global Science Books, London, UK. 9. AZMAT, M.A., A.A. KHAN, CHEEMA H.M.N., ASHRAF M., AND NIAZ S., 2013Detached leaf assay coupled with microscopic conidial quantification: an efficient screening method for powdery mildew resistance in pea. Int. J. Agric. Biol, 15: 957–962. 10. BAJWA, R., S SHAFIQUE AND S.SHAFIQUE. 2008. Fungitoxicity of aqueous and organic solvent extracts of Datura metel against Ascochyta rabiei. Mycopathology, 6: 1711. BAYAA, B., S.M. UDUPA, M. BAUM, R.S. MALHOTRA AND S. KABBABEH. 2004. Pathogenic variability in Syrian isolates of Ascochyta rabiei. 5th European Conference on Grain Legumes: Conference Handbook 5th European Conference of Grain Legumes 2nd International Conference on Legume Genomics and Genetics. 7-11 June 2004, Dijon (France) p. 306. (En). European Association for Grain Legumes Research (AEP) Paris (France). 12 . BERINI F., PRESTI I., BELTRAMETTI F., PEDROLI M., KJELL M. V RUM AND FLAVIA M ., 2017-Production and characterization of a novel antifungal chitinase identified by functional screening of a suppressive‑soil metagenome. Microb Cell, Fact (2017) 16:16. 13. BI, Y. M., B. CAMMUE, P. GOODWIN AND P. K. SAXENA (1999). Resistance of Botrytis cinerea in scented geranium transformed with a gene encoding the antimicrobial protein Ace-AmP1. Plant Cell Rep. 18:835-840. 14 . BIRCH RG (1997): Plant transformation: Problems and strategies for practical application. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:297–326. 15 . BOLAR, J.P., NORELLI, J.L., WONG, W.W., HAYES, C.K., HARMAN, G.E. AND ALDWINCKLE, H.S. (2000) Expression of endochitinase from Trichoderma harzianum 85 in transgenic apple increases resistance to apple scab and reduces vigor. Phytopathology. 90: 72-77. 16 . BROGLIE, K., CHET, I., HOLLIDAY, M., CRESSMAN, R., BIDDLE, P., KNOWLTON, S., MAUVAIS, C.J., AND BROGLIE, R. (1991) Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani. Science 254: 1194-1197. 17. BROOTHAERTS W, MITCHELL HJ, WEIR B, KAINES S, SMITH LM, YANG W, MAYER JE, ROA-RODRIGUEZ C, JEFFERSON RA (2005): Gene transfer to plants by diverse species of bacteria. Nature 433:629–633. 18. BROOTHAERTS W, CORBISIER P, SCHIMMEL H, TRAPMANN S, VINCENT S, EMONS H (2008) A single nucleotide polymorphism (SNP839) in the adh1 reference gene affects the quantitation of genetically modified maize (Zea mays L.). J Agric Food Chem 56:8825–8831. 19. BROWN, J.K.M., WOLFE, M.1990. Structure and evolution of population of Erysiphe graminis f.sp.hordi. plant pathology 39,376-390. 20. BUCHTER, R., STROMBERG, A., SCHMELZER, E., AND KOMBRINK, E. (1997) Primary structure and expression of acidic (class II) chitinase in potato. Plant Mol. Biol. 35: 749-761 21. BURNETTE WN (1981): “Western blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem 112:195–203. 22 . BUSTIN SA (October 2000). "Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays". J. Mol. Endocrinol. 25 (2): 169–93. 23 . BUSTIN SA, BENES V, NOLAN T, PFAFFL MW (June 2005). "Quantitative real-time RT-PCR--a perspective". J. Mol. Endocrinol. 34 (3): 597–601. 24. CAPLAN AB, VAN MONTAGU M, SCHELL J (1985): Genetic analysis of integration mediated by single T-DNA borders. J Bacteriol 161:655–664. 25. CARSTENS, M., VIVIER, M.A. AND PRETORIUS, I.S. (2003) The Saccharomyces cerevisiae chitinase, encoded by the CTS1-2 gene, confers antifungal activity against Botrytis cinerea to transgenic tobacco. Transgenic Research. 12: 497-508. 26. CARTHEW, R. W. (2001) gene silencing by double-stranded RNA. Current Opinion in Cell Biology, 13:244-248. 27. CARY, J. W., K. RAJASEKARAN, J. M. JAYNES AND T. E. CLEVELAND (2000). Transgenic expression of a gene encoding a synthetic antimicrobial peptide results in inhibition of fungal growth in vitro and in planta. Plant Sci. 154:171-181. 28. CHAUDHRY, M., N. SARWAR AND F.A. CHAUGHTAL. 2001. Biochemical changes in chickpea plant after induction treatment with simple chemicals for systemic acquired resistance against Ascochyta blight in the field. Journal of Chemical Society of Pakistan, 23: 182-186. 29. CHEN , X.L. SONG , R.T. M.Y. YU, J.M. SUI, J.S. WANG AND QIAO L.X. 2015. Cloning and functional analysis of the chitinase gene promoter in peanut. Genet. Mol. Res. 14 (4): 12710-12722 (2015) 30. CHENG M, FRY JE, PANG S, ZHOU H, HIRONAKA CM, DUNCAN DR, CONNER TW, WAN Y (1997): Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiol 115:971–980. 31. COLLARD, B. C. Y. ADES, P. K. PANG, E. C. K. BROU-WER . J. B AND. J. TAYLOR, P. W. 2001 “Prospecting for Sources of Re- sistance to Ascochyta Blight in 86 Wild Cicer Species,” Aus- tralasian Plant Pathology, Vol. 30, 2001, pp. 271-276. doi:10.1071/AP01036 32. CORTES-BARCO, A.M., P.H. GOODWIN AND T. HSIANG. 2010. Comparison of induced resistance activated by benzothiadiazole, (2R,3R)-butanediol and an isoparaffin mixture against anthracnose of Nicotiana benthamiana. Plant Pathology, 59: 643-653. 33. CUBERO J, LOPEZ M (EDS) (2005): Agrobacterium Persistence in Plant Tissue after Transformation. Humana Press, Totowa, NJ, pp 351–364. 34. DAHIYA, N., TEWARI, R. AND HOONDAL, G.S. (2005) Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review. Appl Microbiol Biotechnol. Online first 35. DAHLEEN, L. S., OKUBARA, P. A. & BLECHL, A. E. 2001. Transgenic Approaches to Combat Fusarium Head Blight in Wheat and Barley. Crop Sci., 41, 628-637 36. DATTA, K., TU, J., OLIVA, N., ONA, I., VELAZHAHAN, R., MEW, T.W., MUTHUKRISHNAN, S., AND DATTA, S.K. (2001) Enhanced resistance to sheath blight by constitutive expression of infection-related rice chitinase in transgenic elite indica rice cultivars. Plant Sci. 160: 405-414. 37. DAVIDSON, J. and R.B.E. KIMBER. 2007. Integrated disease management of ascochyta blight in pulse crops. European Journal of Plant Pathology, 119: 99-110. 38. DAVIS, B. AND EVELEIGH, D.E. (1984) Chitosanases: occurrences, production and immobilization. In: Zikakis, J.P. (ed.) chitin, chitosan and related enzymes. Academic Press, Orlando, USA. 39. DEMIRICI, F., H. BAYRAKTAR, I. BABALLOGULLU, F. S. DOLAR, AND S. MADE N. 2003. In vitro and vivo effects of some fungicides against the chickpea blight pathogen Ascochyta rabiei. Journal of Phytopathology, 151:519 40. DEMPSEY, D. A., H. SILVA and D. F. KLESSIG (1998). Engineering disease and pest resistance in plants. Trends Microbiol 54:54-61. 41. DERCKEL, J., AUDRAN, J., HAYE, B., LAMBERT, B., and LEGENDRE, L. (1998) Characterization, induction by wounding and salicylic acid, and activity against Botrytis cinerea of chitinases and β-1,3-glucanases of ripening grape berries. Physiol. Plant. 104: 56-64 42. DHEKNEY, S. A., Z. T. LI., M. AN AMAN, M. DUTT, J. TATTERSALL AND D. J. GRAY (2007). Genetic transformation of embryogenic cultures and recovery of transgenic plants in Vitis vinifera, Vitis rotundifolia and Vitis hybrids. Acta Hort. 738:743748. 43. DING, X., GOPALAKRISHNAN, B., JOHNSON, L.B., WHITE, F.F., WANG, X., MORGAN, TH.D., KRAMER, K.J. and MUTHUKRISHNAN, S. (1998) Insect resistance of transgenic tobacco expressing an insect chitinase gene. Transgenic Research. 7: 77-84. 44. DOLAR, . F. S. TENUTA A. and HIGGINS, V. J. 1994 “Detached Leaf Assay for Screening Chickpea for Resistance to Asco- chyta Blight,” Canadian Journal of Plant Pathology, Vol. 16, No. 3, 1994, pp. 215-220. 45. DOLAR, F.S. 1997"Effects of leaf age and ı noculum concentration on resistance of detached chickpea leaflets to different races of Ascochyta rabiei (Pass.) labr. 46. DONG X., ZHAO Y., RAN X., GUO L., AND ZHAO D., 2017- Overexpression of a New Chitinase Gene EuCHIT2 Enhances Resistance to Erysiphe cichoracearum DC. In Tobacco Plants. Int. J. Mol. Sci, 2017, 18, 2361. 47. DOYLE, J.J. AND DOYLE, J.L. (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12: 13-15. 48 .DUNWELL J M (2000) Transgenic approaches to crop improvement. J Exp Bot 51:487-496. 87 49. ENGL (2008) Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing. European Network of GMO Laboratories. http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/doc/ Min_Perf_Requir_ Analyt_methods_131008.pdf. Accessed 23 Jan 2009 50. ESCOTT, G.M., AND ADAMS, D.J. (1995) Chitinase activity in human serum and leukocytes. Infection and Immunity. Vol. 63 (12): 4770-4773. 51. FEINBERG AP, VOGELSTEIN B (1984): A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Addendum. Anal Biochem 137:266–267. 52. FINER JJ, DHILLON T (2008) Transgenic plant production. In: Stewart CN Jr (ed) Plant biotechnology and genetics: principles, techniques and applications. Wiley, New York, pp 245–272 53. FITZGERALD, A., J. A. V. KHA AND K. M. PLUMMER (2004). Simultaneous silencing of multiple genes in the apple scab fungus Venturia inaequalis, by expression of RNA with chimeric inverted repeats. Fungal Genet. Biol. 41:963-971 54. FLANDEZ-GALVES, H., R. ADES, R. FORD, E.C.K. PANG, P.W.J. TAYLOR. 2003. QTL analysis for Ascochyta blight resistance in an intraspecific population of chickpea (Cicer arietinum L.). Theoretical and Applied Genetics,107:1257-1265. 55. FLORACK, D. E. A. AND W. J. STIEKEMA (1994). Thionins: properties, possible biological roles and mechanisms of action. Plant Mol. Biol. 26:25-37. 56. FONTANA, G. S., SANTINI, L., CARETTO, S., FRUGIS, G., AND MARIOTTI, D. (1993). Genetic transformation in the grain legume Cicer arietinum L. (chickpea). Plant Cell Reports, 12:194-198. 57. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION (FAO) (2015) FAOSTAT Statistical Database of the United Nation Food and Agriculture Organization (FAO) Statistical Division. Rome. Available at: http://faostat.fao.org/site/ 339/default.aspx. Accessed Jan 2016. 58 . FOOLAD, M. R. NTAHIMPERA N AND CHRIST, B. J. 2000 “Compa- rison of Field, Greenhouse and Detached-Leaflet Evalua- tion of Tomato Germ Plasm for Early Blight Resistance,” Plant Disease, Vol. 84, No. 9, 2000, pp. 967-972. 59 . FREEMAN WM, WALKER SJ, VRANA KE (January 1999). "Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential". BioTechniques. 26 (1): 112–22, 124–5. 60. FU, X., KOHLI, A., TWYMAN, R. M. AND CHRISTOU, P. (1999). Differential concurrent transgene silencing associated with distinct types of nonspreading cytosine methylation. Rice Genetic Newsletter, 16:131-134. 61. FUKAMIZO, T., SASAKI, C., SCHELP, E., BORTONE, K., AND ROBERTUS, J.D. (2001) Kinetic properties of chitinase- 1 from the fungal pathogen Coccidioides immitis. Biochemistry. 40: 2448-2454. 62. GAO, A., S. M. HAKIMI, C. A. MITTANCK, Y. WU, B. M. WOERNER, D. STARK, D. SHAH, J. LIANG AND C. ROMMENS (2000). Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide. Nat. Biotechnol. 18:1307-1310. 63. GEERVANI P AND UMADEVI T 1989 .Effect of maturation of nutrient composition of selected vegetable legumes; J. Sci. Food Agric. 46 243–248 64. GEIER, T. (1989). Mutationsauslosung in Gewebekulturen Zur Entstehung der Kohlerien-Sorte "Orang Glow". Garterborse Gartenwelt, 50:2437-2441. 65. GELVIN ,SB. (2003) Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the gene jockeying tool. Microbiol Mol Biol Rev 67:16–37. 66. GIOVANNINI, T; CONCILLO, L (2002) PCR detection of genetically modified organisms. Starch 54:321-327. 88 67. GIRI, A.P., HARSULKAR, A.M., PATANKAR, A.G., GUPTA, V.S., SAINANI, M.N., DESHPANDE, V.V., AND RANJEKAR, P.K. (1998) Association of induction of protease and chitinase in chickpea roots with resistance to Fusarium oxysporum f.sp. ciceri. Plant Pathol. 47: 693- 699. 68. GOLD, R. (2003). Exclusive rights in life: biotechnology, genetic manipulation, and intellectual property rights. In: Genetic Transformation of Plants. Jackson, J. and Linskens, H., Eds. Springer. Germany 23:2-6. 69. GOLDONI, M., G. AZZALIN, G. MACINO AND C. COGONI (2004). Efficient gene silencing by expression of double stranded RNA in Neurospora crassa. Fungal Genet. Biol. 41:1016-1024. 70. GRISON, R., GREZES-BESSET, B., SCHNEIDER, M., LUCANTE, N., OLSEN, L., LEGUAY, J., AND TOPPAN, A. (1996) Field tolerance to fungal pathogens of Brassica napus constitutively expressing a chimeric chitinase gene. Nature Biotechnol. 114:643-646 71. HAMMOND, T. M. AND N. P. KELLER (2005). RNA silencing in Aspergillus nidulans is independent of RNA-dependent RNA polymerase. Genetics 169:607-617. 72. HAMZA, S., S. SAMIR, A. REBAI, R. SALAH, G. KAHL AND H. MONCEF.2000. Pathotype variation of the representative genotypes of Ascochyt arabiei in the Beja region. Journal of plant pathology, 82:23-28. 73. HARIJATI, N., KEANE,PH.2012. Disease Development Caused by Ascochyta rabiei on Chickpea Detached-Leaves in Petri Dishes. American Journal of Plant Sciences, 2012, 3, 1369-1375. 74. HASSAN, F. 2006. Heterologous expression of a recombinant Chitinase from Streptomyces alivaceoviridis ATCC11238 in transgenic pea (Pisumsativum L.).Ph.D thesis. Wilhelm Leibniz Uneversität Hannover, Germany. 166 pp. 75. HASSAN F, MEENS J, JACOBSEN H, KIESECKER H (2009) A family 19 chitinase (Chit30) fromStreptomyces olivaceoviridis ATCC11238 expressed in transgenic pea affects the development of T. harzianum in vitro. J Biotechnol 143:302–330 76. HAWARE M.P., 1987. Occurrence of Perfect State of Ascochyta rabiei in Syria. International Chickpea Newsletter 17: 29-30. 77. HAYES, C.K., KLEMSDAL, S., LORITO, M., DIPIETRO, A., PETERBAUER, C., NAKAS, J.P., TRONSMO, A. AND HARMAN, G.E. (1994) Isolation and sequence of an endochitinase-encoding gene from a cDNA library of Trichoderma harzianum. Gene. 138: 143-148. 78. HE X, MIYASAKA SC, FITCH MM, MOORE PH, ZHU YJ (2008) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of taro (Colocasia esculenta (L.) Schott) with a rice chitinase gene for improved tolerance to a fungal pathogen Sclerotium rolfsii. Plant Cell Rep 27:903–909 79. HELLENS R, MULLINEAUX P, KLEE H (2000) Technical focus: a guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci 5:446–451. 80. HOWIE, W., JOE, L., NEWBIGIN, E., SUSLOW, T., AND DUNSMUIR, P. (1994) Transgenic tobacco plants which express the chiA gene from Serratia marcescens have enhanced tolerance to Rhizoctonia solani. Transgenic Res. 3: 90-98. 81. HU¨BNER P, WAIBLINGER HU, PIETSCH K, BRODMANN P (2001) Validation of PCR methods for quantitation of genetically modified plants in food. J AOAC Int 84:1855– 1864. 82. IBRAHIM, A.,KHATIB, F.,AND BAUM, M.2016.Assessment the Response of chickpea Genotypes to Agrobactrium- mediated Transformation system.journal university of Zakho. Vol4(A).NO.1.P73-80,2016. 89 83. IGNACIMUTHU S, CEASAR SA (2012) Development of transgenic fingermillet (Eleusine coracana (L.)Gaertn.) resistant to leaf blast disease. J Biosci. 84. IMTIAZ, M., M.M. ABANG, R.S. MALHOTRA, S. AHMED, B. BAYAA, S.M. UDUPA, AND M. BAUM. 2011. Pathotype IV, a New and Highly Virulent Pathotype of Didymella rabiei, Causing Ascochyta Blight in Chickpea in Syria. Plant disease. DOI: 10.1094/PDIS-04-11-0333. 85. INDURKER, S., MISRA, H. S. AND EAPEN S. (2007) Genetic transformation of chickpea (Cicer arietinum L.) with insecticidal crystal protein gene using particle bombardment. Plant Cell Reports. 26(6), 755-763. 86. ISLAM, M., S. MOHSAN, S. ALI, R. KHALID, F. HASSAN, A. MAHMOOD AND A. SUBHANI, 2011. Growth, nitrogen fixation and nutrient uptake by chickpeapea (Cicer arietinum) in response to phosphorus and sulfur application under rain fed conditions in Pakistan. Int. J. Agric. Biol., 13: 725‒730 87. ITOH, Y., TAKAHASHI, K., TAKIZAWA, H., NIKAIDOU, N., TANAKA, H., NISHIHASHI, H., WATANABE, T. AND NISHIZAWA, Y. (2003) Family 19 chitinase of Streptomyces griseus HUT6037 increases plant resistance to the fungal disease. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64 (4): 847-855. 88. JACH, G., BORNHARDT, B., MUNDY, J., LOGEMANN, J., PINSDORF, E., LEAH, R., SCHELL, J., AND MAAS, C. (1995) Enhanced quantitative resistance against fungal disease by combinatorial expression of different barley antifungal proteins in transgenic tobacco. The Plant J. 8: 97-109. 89. JAMES C. 2017 - Global status of commercialized biotech \GM Crops 2016Executive summary - ISAAA Brief No. 52- ISAAA, Ithaca, NY. 90. JAMES, C. (2016) Global status of commercialized biotech/GM crops: 2016. ISAAA Brief 35: http://www.isaaa.org/ esources/publications/briefs/35/highlights/default.html. 91. JI, C., NORTON, R.A., WICKLOW, D.T., AND DOWD, P.F. (2000) Isoform patterns of chitinase and β-1,3-glucanase in maturing corn kernels (Zea mays L.) associated with Aspergillus flavus milk stage induction. J.Agric.Food Chem. 48: 507-511. 92. JIA, Y. VALENT, B. AND LEE, F. N. 2003. “Determination of Host Response to Magnaportha grisea on Detached Rice Lea- ves Using a Spot Inoculation Method,” Plant Disease, Vol. 87, No. 2, pp. 129-133. 93. KADOTANI, N., H. NAKAYASHIKI, Y. TOSA AND S. MAYAMA (2003). RNA silencing in the pathogenic fungus Magnaporthe oryzae. Mol. Plant-Microbe Interact. 16:769-776. 94. KAISER, W.J. 1973. Factors affecting growth, sporulation, pathogenceicity and survival of Ascochyta rabiei, Mycolog., 65: 444-475. 95. KAISER,W.J.1992. Epidemiology of Ascochyta rabiei. In: Disease resistance breeding in Kabuli chickpeas.SINGH,K.B.and SAXENA, M. C. eds.).ICARDA, Aleppo, Syria. pp. 117-143. 96. KAISER,W.J.1997. Inter and International spread of Ascochyta pathogens of chickpea, faba bean, and lentil. Canadian Journal Plant Pathology,19:215-224. 97. KAISER,W.J., M.D. RAMSEY,K.M. MAKKOUK, T.W. BRETAG,N. ACIK GOZ, J. KUMAR and F. W. NUTTER. 2000. Foliar diseases of cool season food legumes and their control. In: (R. KNIGHTed.), Linking research and Marketing opportunities for pulses in the 21st century(pp.437-455). Proceeding of the third International Food Legumes Research Conference.TheNetherlands:Kluwer Academic Publishers. 90 98. KAR S., JOHNSON T.M., NAYAK P. AND SEN S.K. 1996. Efficient transgenic plant regeneration through Agrobacterium-mediated transformation of chickpea (Cicer arietinum L.). Plant Cell Reports, 16:32-37. 99. KAR, S., BASU, D., RAMAKRISHNAN, N. A., MUKHREJEE, P., JOHNSON, T. M., NAYAK, P. AND SEN, S. K. 1997. Expression of Cry 1A(c) gene of Bacillus thuringiensis in transgenic chickpea plants inhibits development of pod borer(Heliothis armigera ) larvae. Transgenic Research, 6:177-185. 100. KHATIB, F. 2008. Production of genetically modified legumes resistant to the herbicide phosphinothricin (PPT) by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. PhD thesis, Aleppo University, Syria, 158 pp. 101. KHAN,M.S.A.,M.D.RAMSEY, R.CORBIERE, A. INFONTINO, A. PORTA- PUGLIA, Z.BOUZNAD AND E.S.SCOTT.1999. Ascochyta blight of chickpea a in Australia: Identification, pathology and mating type. Plant Pathology, 48:230-234. 102. KIESECKER, H. (2000). Entwicklung eines Agrobacterium tumefaciens Vermittelten Gentransfersystems für Kichererben (Cicer arietinum L.). Ph.D Thesis. Hannover University, Germany. 114pp. 103. KIKKERT, J.R., ALI, G.S., WALLACE, P.G., REISCH, B., AND REUSTLE, G.M. 2000. Expression of a fungal chitinase in Vitis vinifera L. ‘Merlot’ and ‘Chardonnay’ plants produced by biolistic transformation. Acta Hortic. (Wagening.). 528: 297- 303. 104. KOIWA, H., H. KATO, T. NAKATSU, J. ODA AND F. SATO (1997). Purification and characterization of tobacco pathogenesis-related protein PR-5d, an antifungal thaumatin like protein. Plant Cell Physiol. 38:783-91. 105. KOVAEVSKI, I.C. 1936. The blight of chick pea, Mycosphaerella rabiei f.sp. ciceri Review of Applied Mycology, 15: 700. 106. KRISHNAMURTHY K.V., SUHASINI, K., SAGARE, A.P. MEIXNER, M., DE KATHEN, A.,PICARDT, T. AND SCHIEDER, O. (2000). Agrobacterium mediated transformation of chickpea (Cicer arietinum L.) embryo axes. Plant Cell Reports, 19:235240. 107. LAWRENCE, C.B., SINGH, N.P., QUI, J., GARDNER, R.G., AND TUZUN, S. (2000) Constitutive hydrolytic enzymes are associated with polygenic resistance of tomato to alternaria solani and may function as an elicitor release mechanism. Physiol. Mol. Plant Pathol. 57: 211-220. 108. LEE, H. I. AND N. V. RAIKEL (1995). Prohevein is poorly processed but shows enhanced resistance to a chitin-binding fungus in transgenic tomato plants. Braz. J. Med. Biol. Res. 28:743-750. 109. LECKBAND, G. AND H. LORZ (1998). Transformation and expression of a stilbene synthase gene of Vitis vinifera L. in barley and wheat for increased fungal resistance. Theor. Appl. Genet. 96:1004-1012 110. LESSARD, P. A., KULAVEERASINGAM, H. YORK, G. M., STRONG, A. AND SINSKEY, A.(2002). Manipulating gene expression for metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4: 67-79. 111. LI, H.Y., Y.M. ZHU, Q.CHEN, R. L.CONNER, X. D.DING, B. B.ZHANG. 2004. Production of transgenic soybean plants with two anti-fungal protein genes via Agrobacterium and particle bombardment. Biologia Plant. 48 91 112. LOGEMANN, J., G. JACH, H. TOMMERUP, J. MUNDY AND J. SCHELL (1993). Expression of a barley ribosome-inactivating protein leads to increased fungal protection in transgenic tobacco plants. Biotechnol. 10:305-308. 113. LOHAR, P.D, SCHULLER.K, BUZAS, D.M.,GRESSHOFF,P.M., STILLER,J.2001.Transformation of Lotus japonicas using the herbicide resistance bare gene as selectable marker.journal of Experimental Botany,vol 52,NO.361,PP.1697-1702. 114. LORITO, M., WOO, S.L., FERNANDEZ, I.G., COLUCCI, G., HARMAN, G.E., PINTO-TORO, J.A., FILIPPONE, E., MUCCIFORA, S., LAWRENCE, C.B., ZOINA, A., TUZUN, S. AND SCALA, F. (1998) Genes from mycoparasitic fungi as a source for improving plant resistance to fungal pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 78607865. 115. LOUWS, F.J., M. WILSON, H.L. CAMPBEL, J.B. JONES, F. SHAHIN AND S.A. MILLER. 2001. Field control of bacterial spot and bacterial speck of tomato using a plant activator. Plant Disease, 85: 481-488. 116. MACKAY, IAN (2007). Real-time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization. Norfolk, England: Caister Academic Press. p. 440. 117. MALHOTRA,R.S., R.P.S.PUNDIR and A.E. SLINKARD.1987 Genetic resources of chickpea. In: M.C. SAXENA and K.B.SINGH.(ed.), The chickpea. C.A.B. International Cambrian News ltd. Aberystwyth, UK. p. 67-81. 118. MALIK, S.R., M. SALEEM, U. IQBAL, M.A. ZAHID, A. BAKHAH AND S.M. IQBAL, 2011. Genetic analysis of physiochemical traits in chickpea (Cicer arietinum) seeds. Int. J. Agric. Biol., 13: 1033‒1036. 119. MANSFELD, 2008. Cicer arietinum subsp. arietinum Mansfeld's World Database of Agricultural and Horticultural Crops. 120. MARMIROLI, N. Methods for detection of GMOs in food and feed. Anal Bioanal Chem. 392, 369–384 (2008). 121. MAUCH, F., HADWIGER, L.A., AND BOLLER, T. (1988a) Antifungal hydrolases in pea tissue I. Purification and characterization of two chitinases and two beta-1,3glucanasesdifferentially regulated during development and in response to fungal infection. Plant Physiol. 87: 325-333. 122. MAUCH, F., MAUCH-MANI, B., AND BOLLER, T. (1988b) Antifungal hydrolases in pea tissue. II. Inhibition of fungal growth by combinations of chitinase and β-1,3glucanase. Plant Physiol. 88: 936-942. 123. MAZID, A., K. AMEGBETO, K. SHIDEED AND R. MALHOTRA. 2009. Impact of crop improvement and management winter-sown chickpea in Syria. International Center for Agricultural Research in Dry Areas (ICARDA), Aleppo, Syria. 47 pages. 124. MCMURRY,L.,J.BRAND, J.DAVIDSON, K. HOBSON, AND M.MATERNE. 2006. Economic chickpea production for southern Australia through Improved cultivars and strategic management to control Ascochyta blight. In Proceeding of 13th Australian Agronomy Conference (p.65)10-15. 125. MEINS F JR, NEUHAUS J-M, SPERISEN C, RYALS J (1992) The primary structure of plant pathogenesis-related glucanohydrolases and their genes. In: Genes involved in plant defense. Edited by Boller T, Meins F Jr, Wein. Spring-Verlag, New York, pp 245-282 92 126. MEHROTRA, M., SANYAL, I. AND AMLA, D.V. 2011. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of chickpea (Cicer arietinum L.) and regeneration of insect-resistant transgenic plants. Plant Cell Rep. 30: 1603-1616. 127. MEMELINK J, SWORDS KMM, STAEHELIN LA, HOGE JHC (EDS) (1994): Southern, Northern and Western Blot Analysis. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 1-F1:1–23. 128. MERCEDES D., VELASCO L., NAVARRO M., BENITO E., HELLIN P., FLORES P ., GARAY A., MARTINEZ M., LACASA.A., 2015- Enhanced resistance to Botrytis cinerea in genetically-modified Vitis vinifera L. plants over-expressing the grapevine stilbene synthase gene. Plant Cell Tiss Organ Cult (2015) 120:229–238. 129. MIKI, B. AND MCHUGH, S (2004) Selectable marker genes in transgenic plants:applications، alternatives and biosafety. Journal of Biotechnol ,107:193–232. 130. MILLER, W., WATERHOUSE, P. M., BRWON, J. W. S. AND BROWNING, K. S. (2001). The RNA world in plants: Post-transcriptional control. III. Plant Cell, 13:17101717. 131. MORA, A.A. AND EARLE, E.D. (2001) Resistance to Alternaria brassicicola in transgenic broccoli expressing a Trichderma harzianum endochitinase gene. Mol Breed. 8: 1-9. 132. MUEHLBAUER, F.J.AND W.CHEN.2007. Resistance to Ascochyta blight of cool season food legumes.European Journal of plant Pathology,119:135-141 133. MUEHLBAUER.J AND SARKER.A.2017. Economic Importance of Chickpea: Production, Value, and World Trad. Springer International Publishing AG 2017. 134. MUHITCH, M. J., S. P. MCCORMICK, N. J. ALEXANDER AND T. M. HOHN (2000). Transgenic expression of the TRI 101 or PDR 5 gene increases resistance of tobacco to the phytotoxic effects of the trichothecene 4:15-diacetoxyscirpenol. Plant Sci. 157:201-207. 135. MULLIS KB (1990): Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Clin (Paris) 48:579–582. 136. NAKAYASHIKI, H., S. HANADA, B. Q. NGUYEN, N. KADOTANI, Y. TOSA AND S. MAYAMA (2005). RNA silencing as a tool for exploring gene function in ascomycete fungi. Fungal Genet. Biol. 42:275-283. 137. NAKAJIMA, H., T. MURANAKA, F. ISHIGE, K. AKUTSU AND K. OEDA (1997). Fungal and bacterial disease resistance in transgenic plants expressing human lysozyme Plant Cell Rep. 16:674-679. 138. NAPOLI, C., LEMIEUX, C., AND JORGENSEN, R. A. (1990). Introduction of a chimeric synthase gene in petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans. Plant Cell, 2: 279-289. 139. NEWELL, C. A. (2000). Plant transformation technology: developments and applications. Mol. Biotechnol. 16:53-65. 140. NIELSEN, K.K., MIKKELSEN, J.D., DRAGH, K.M., AND BOJSEN, K. (1993) An acidic class III chitinase in sugar beet: induction by Cercospora beticola, characterization, and expression in transgenic tobacco plants. Mol. Plant Microbe Interact. 6: 495-506. 141. NIELSEN, K.K., BOJSEN, K., ROEPSTORFF, P., AND MIKKELSEN, J.D. (1994) A hydroxyprolinecontaining class IV chitinase of sugar beet is glycosylated with xylose. Plant Mol. Biol. 25: 241-257. 142. NIRALA N. K., DAS D. K., SRIVASTAVA P. S., SOPORY S. K. and K. C. UPADHYAYA .2010- Expression of a rice chitinase gene enhances antifungal potential in transgenic grapevine (Vitis vinifera L.). Vitis 49 (4), 181–187. 93 143. NISHIZAWA, Y. Z., K. NISHIO, M. NAKAZONO, E. SOMA, M. U. NAKAJIMA AND T. HIBI (1999). Enhanced resistance to blast (Magnaporthe grisea) in transgenic japonica rice by constitutive expression of rice chitinase. Theor. Appl. Genet. 99:383-390. 144. NISHIZAWA, Y. (2003) Family 19 chitinase of Streptomyces griseus HUT6037 increases plant resistance to the fungal disease. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64 (4): 847855. 145. OOSTENDORP, H., W. KUNZ, B. DIETRICH AND S. THEODOR. 2001. Induced disease resistance in plants by chemicals. European Journal of Plant Pathology, 107: 1928. 146. OSUSKY, M., G. ZHOU, L. OSUSKA, R. HANCOCK AND S. MISRA (2000). Transgenic plants expressing cationic peptide chimeras exhibit broad-spectrum resistance to phytopathogens. Nat. Biotechnol. 18:1162-1166. 147. OSUSKY, M. (2004). Transgenic Research. Springer, Germany. 13:181-190. 148. PANDE,S.,K.H.M.SIDDIQUE, G. K. KISHORE, B. BAYAA, P.M.GUAR,C..L. GOWDA, T.W. BRETAG. G. and H. CROUCH.2005. Ascochyta blight of chickpea: a review of biology,pathogennicity,and disease management. Australian of Agriculture Research, 56:317-332. 149. RAHAM SK, RINALDI S, IKUO N, MASAHIROM(2008) Production of transgenic potato exhibiting enhanced resistance to fungal infections and herbicide applications. Plant Biotechnol Rep 2:13–20 150. REDDY, M.V. AND S. KABBABEH. 1985. Pathogenic variability in Ascochyta rabiei (Pass.) Lab. In Syria and Lebanon. Phytopathology Mediterranean, 24: 265-266. 151. REDDY, M. V. and K. B. SINGH. 1990. Relationship between Ascochyta blight severity and yield loss in Chickpea and identification of resistant lines .Phytopathology Mediterranean, 29:32-38. 152. REECE RJ (2004): Analysis of Genes and Genomes. Wiley, Chichester, UK. 153. RENKEMA, G.H., BOOT, R.G., MUIJSERS, A.O., KOOPMAN, W.E.D. AND ERTS, J.M.F.G. (1995) Purification and characterization of human chitotriosidase, a novel member of the chitinase family of proteins. Journal of Biological Chemistry. 270 (5): 21982202. 154. RICHA K., TIWARI IM., KUMARI M., DEVANNA BN., SONAH H., KUMARI A., NAGAR R., SHARMA V., BOTELLA JR AND SHARMA TR 2016- Functional Characterization of Novel Chitinase Genes Present in the Sheath Blight Resistance QTL: qSBR11-1 in Rice Line Tetep. Front. Plant Sci. 7:244. 155. RIDOUT, P., O. PORRITT, S. SACRISTAN, D. JONES AND K. BROWN (2006). Multiple a virulence paralogues in cereal powdery mildew fungi may contribute to parasite fitness and defeat of plant resistance. Plant Cell. 18:2402-2414. 156. ROHINI, V.K., AND RAO, S. (2001) Transformation of peanut (Arachi hypogaea L.) with tobacco chitinase gene: variable response of transformants to leaf spot disease. Plant Sci. 160: 889-898 157. ROWLAND, O., A. LUDWIG, C. J. MERRICK, F. BAILLIEUL, F. E. TRACY, W. E. DURRANT, V. NEKRASOV, K. SJOLANDER AND H. Y. YOSHIOKA (2005). Functional analysis of Avr9/Cf-9 rapidly elicited genes identifies a protein kinase, ACIK1, that is essential for full Cf-9-dependent disease resistance in tomato. Plant Cell. 17:295-310. 158. SAMBROOK J, RUSSELL DW (2001): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 94 159. SANGHERA, G. S., M. S. GILL, S. S. GOSAL AND S. H. WANI (2009). RNA Interference: Its Concept and application in crop plants. In: Biotechnology: Cracking new pastures. Malik C. P. MD Publications, New Delhi, India. p.33-78. 160. SARMAH, B. K., MOORE, A., TATE, W., MOLVIG, L., MORTON, R. L.,; REES, D. P., CHIAIESE, P., CHRISPEELS, M. J., TABE, L. M. AND HIGGINS, T. J. V. (2004). Transgenic chickpea seeds expressing high levels of a bean α-amylase inhibitor. Molecular Breeding, 14:73-82. 161. SAXENA, M.C. AND K.B. SINGH. 1984. Ascochyta blight and winter sowing of chickpeas. (ICARDA), Aleppo, Syria. pp.201-206. 162. SCHLUMBAUM, A., MAUCH, F., VOGELI, U., AND BOLLER, T. (1986) Plant chitinases are potent inhibitors of fungal growth. Nature 324: 365-367. 163. SCHMITTGEN TD, ZAKRAJSEK BA, MILLS AG, GORN V, SINGER MJ, REED MW (October 2000). "Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods". Anal. Biochem. 285 (2): 194–204. 164. SENOL M., NADAROGLU H., DIKBAS N., AND RECEP KOTAN 2014Purification of Chitinase enzymes from Bacillus subtilis bacteria TV-125, investigation of kinetic properties and antifungal activity against Fusarium culmorum . Senol et al. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials,13:35 165. SENTHIL, G., WILLIAMSON, B., DINKINS, R. D. AND RAMSAY, G. (2004). An efficient transformation system for chickpea (Cicer arietinum L.). Plant Cell Reports, 23:297-303. 166. SHAHID, A. A., B. CHAUDHRY, M., RAHMAN AND S. RIAZUDDIN. 2009Detection of anti-fungal genes in chickpea (Cicer arietinum L.) and their effects on fungal growth. Emir. J. Food Agric. 21 (2): 34-41. 167. SHUKLA Y.M., AND SUTHAR K.P., 2016- Alteration in -1, 3 glucanase and chitinase activity in chickpea varieties infected with Fusarium oxysporum f. sp. ciceri race 4. LEGUME RESEARCH An nternational Journal, LR-3671 [1-7]. 168. SINGH, K. B. AND M.V. REDDY. 1991. Advances in disease resistance breeding in chickpea. Advanced Agronomy, 45:191-222. 169. SLEZACK, S., NEGREL, J., BESTEL-CORRE, G., DUMAS-GAUDOT, E. AND GIANINAZZI, S. (2001) Purification and partial amino acid sequencing of a mycorrhizarelated chitinase isoform from Glomus mosseae- inoculated roots of Pisum sativum L. Planta. 213: 781-787. 170. SOLGI T., MORADYAR M., ZAMANI M.R., MOTALLEBI M. (2015): Transformation of canola by chit33 gene towards improving resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Plant Protect. Sci., 51: 6–12. 171. SONG GQ., SINK KC., CALLOW PW., BAUGHAN R., AND HANCOCK JF. 2008Evaluation of a Herbicide-resistant Trait Conferred by the Bar Gene Driven by Four Distinct Promoters in Transgenic Blueberry Plants, J. AMER. SOC. HORT. SCI. 133(4):605–611. 172. SOUTHERN EM (1975): Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.J Mol Biol 98:503–517. 173. STAM, M., J. N. M. MOL AND J. M. KOOTER. 1997. The Silence of Genes in Transgenic Plants, Annals of Botany, 79: 3–12. 174. STEWART, C. N. ; 2008: Plant biotechnology and genetics: Principles, Techniques and Applications, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, USA. 175. TAKKEN, F. L. AND M. H. JOOSTEN (2000). Plant resistance genes: their structure, function and evolution. Europ. J. Plant Pathol. 106:699-713. 95 176 TAYLOR NJ, FAUQUET CM (2002). Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural Biotechnology. DNA Cell Biol 21:963–977. 177. TEDFORD, E. C., T.L. MILLER, AND M.T. NIELSEN. 1990. A detached-leaf technique for detecting resistance to Phytophthora parasitic var.nicotianae in tobacco. Plant Dis. 74:313–3 16. 178. TERAKAWA, T., TAKAYA, N., HORIUCHI, H. AND KOIKE, M. (1997) A fungal chitinase gene from Rhizopus oligosporus confers antifungal activity to transgenic tobacco. Plant Cell Reports. 16: 439-443. 179. TEWARI, S.K. and M.P. PANDY. 1986. Genetics of resistance to Ascochyta blight in chickpea. Euphtica, 35: 211-215. 180. TEWARI-SINGH, N., SEN, J., KIESECKER, H., REDDY, V. S., JACOBSEN, H. J. AND GUHA-MUKHERJEE, S. (2004). Use of a herbicide or lysine plus threonine for nonantibiotic selection of transgenic chickpea. Plant Cell Reports, 22:576-583. 181. THOMAS PS (1980): Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose. Proc Natl Acad Sci USA 77:5201–5205. 182. THOMPSON, C., J. M. DUNWELL, C. E. JOHNSTONE, V. LAY, J. RAY, M. SCHMITT AND G. NISBET (1995). Degradation of oxalic acid by transgenic oilseed rape plants expressing oxalate oxidase. Euphytica 85:169-172. 183. TRAPERO-CASAS A. AND W.J. KAISER, 1992. Influence of temparature, wetness period, plant age, and inoculum concentration on infection and development of Ascochyta blight of chickpea. Phytopathol., 82: 589-596 184. TRIEU AND, HARRISON MJ.1996. Rapid transformation of Medicago truncatula:regeneration via shoot organogenesis.Plant Cell Reports 16,6-11. 185. TOBIAS DJ, MANOHARAN M, PRITSCH C, DAHLEEN LS (2007). Cobombardment, integration and expression of rice chitinase and thaumatin-like protein genes in barley (Hordeum vulgare cv.Conlon). Plant Cell Rep 26:631–639. 186. TOHIDFAR MM, MOHAMMADI T, GHAREYAZIE B (2005) Agrobacteriummediated transformation of cotton (Gossypium hirsutum) using a heterologous bean chitinase gene. Plant Cell Tissue Organ Cult 83:83–96. 187. UDUPA, S.M. AND F. WEIGAND.1997. Pathotyping of Ascochyta rabiei isolates of Syria. In: DNA markers and breeding for resistance to Ascochyta blight in chickpea. Proceeding of the symposium on application of DNA Fingerprinting for Crop Improvement: Marker- Assisted Selection of Chickpea for Sustainable Agriculture in the Dry Areas. Aleppo, Syria: ICARDA, 188. UDUPA, S.M., F. WEIGAND, M. . SAXENA AND G. KAHL. 1998. Genotyping with RAPD and Microsatellite Markers Resolves Pathotype Diversity in the Ascochyta Blight Pathogen of Chickpea. TAG Theoretical and Applied Genetics, 97: 299-307. 189. VAN LOON, L. C. AND E. A. VAN STRIEN (1999). The families of pathogenesisrelated proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins. Physiol. Mol. Plant Pathol. 55:85-97. 190. VAWDREY,L.L., MARTIN, T.M.,DEFAVERI,J.2005.A detached leaf bioassay to screen Durian cultivars for susceptibility to Phytophtora palimorva.Austuraline plant pathology,2005,34,251-253. 191.VELAZHAHAN, R., SAMIYAPPAN, R., AND VIDHYASEKARAN, P. (2000) Purification of an elicitor-inducible antifungal chitinase from suspension-cultured rice cells. Phytoparasitica 28: 131-139. 192. VELUTHAMBI, K., GUPTA, A. K. AND SHARMA, A. (2003). The current status of 96 plant transformation technologies. Current Science, 84 (3):368-380. 193. WALLY O., ,AND ZAMIR K. PUNJA. 2010. Genetic engineering for increasing fungal and bacterial disease resistance in crop plants. GM Crops 1:4, 199-206;. 194. WALTON, J. (1994). Deconstructing the cell wall. Plant Physiol. 104:1113-1118. 195. WATERHOUSE, P. M., WANG, M. AND FENNEGAN, E. J. (2001a). Role of short RNAs in gene silencing. Trends in Plant Science, 6:297-301. 196. WATERHOUSE, P. M., WANG, M. B. AND LOUGH, T. (2001b). Gene silencing as an adabtive defence against viruses. Nature, 411:834-842. 197. WEIGEL D, GLAZEBROOK J (EDS) (2002): Arabidopsis: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 1–354. 198. WILD, A., AND ZIEGLER, C. (1989). The effect of bialaphos on the enzymes ammonium- assimilation and photosynthesis. I. Effect on the enzymes of ammoniumassimilation, Z. Naturforschung, 44 C: 97-102. 199. WU, G. B., J. SHORTT, E. B. LAWERENCE, E. B. LEVINE, K. C. FITZSIMMONS AND D. M. SHAH (1995). Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants. Plant Cell. 7:1357-1368. 200. XIE G. L AND MEW, T. W.1998. “A Leaf Inoculation Method for Detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola from Rice Seed,” Plant Disease, Vol. 82, No. 9, 1998, pp. 1007-1011. 201. YADAV,R., MEHROTRA, M., SINGH, A.K.ET AL.2017. Protoplasma .254:253.https:// DOI 10.1007/s00709-015-0940-0. 202. YAMAMOTO, T., IKETANI, H., LEKI, H., NISHIZAWA, Y., NOTSUKA, K., HIBI, T., HAYASHI, T., AND MATSUTA, N. (2000) Transgenic grapevine plants expressing a rice chitinase with enhanced resistance to fungal pathogens. Plant Cell Reports 19: 639646. 203. YANG, C. Y., Y. C. HOA, J. C. PANGA, S. S. HUANG AND J. S. M. TSCHEN. 2009. Cloning and expression of an antifungal chitinase gene of a novel Bacillus subtilis isolate from Taiwan potato field. Biores Technol. 100:1454-1458. 204. YEH, S., MOFFATT, B.A., GRIFFITH, M., XIONG, F., YANG, D.S.C, WISEMAN, S.B., SARHAN, F., DANYLUK, J., XUE, Y.Q., HEW, C.L., DOHERTY-KIRBY, A., AND LAJOIE, G. (2000) Chitinase genes responsive to cold encode antifreeze proteins in winter cereals. Plant Physiol.124:1251-1263. 205. YUN, D., D’URZO, M.P., ABAD, L., TAKEDA, S., SALZMAN, R., CHEN, Z., LEE, H., HASEGAWA,P.M., AND BRESSAN, R.A. (1996) Novel osmotically induced antifungal chitinases and bacterial expression of an active recombinant isoform. Plant Physiol. 111: 1219-1225. 97 Abstract Chickpea (Cicer arietinum L.) is an important crop ranking third in the world among pulses. The crop is invaded with many fungal diseases especially the ascochyta blight caused by Aschocyta rabiei which spreads where the crop is grown. The techniques of genetic engineering can be used to manipulate the genetic material of a cell in order to produce a new characteristic in an organism. Genetic engineering for fungal resistance has been limited. But several new advances in this area now present an optimistic outlook. Chitinase gene was identified and isolated from different organisms, and transferred into plants for fungal disease resistant. The current study aimed to detect the presence of chitinase and bar genes in transgenic chickpea, studying the chitinase gene expression by reverse transcription (RT)-PCR and DNA hybridization for gene copy number. Beside the molecular analyses, chickpea transgenic plants will be evaluated for the function of bar gene which confer the resistant to the herbicide phosphinothricin and the antagonistic effect of chitinase gene against ascochyta blight. DNA was extracted from chickpea leaves using CTAB method and then the concentration, purity and integrity were estimated for the extracted DNA. The genomic DNA was digested with the enzyme BamHI, separated on agrose gel, transferred onto nylon membrane and hybridized with non-radiolabeled probe. Chickpea leaves were stabbed with fine sterile needle for the induction of chitinase gene. After two days; RNA was extracted and estimated for concentration and purity by spectrophotometer. Single complementary DNA (cDNA) sequence was synthesized by reverse transcription of mRNA which can be used as a template in conventional PCR for the detection for chitinase gene expression. For the previous techniques, DNA quality, enzyme digestion and PCR products were separated on an appropriate concentrations of agarose gel. For the bioassay, chickpea leaves were treated with different concentrations of the herbicide phosphinothricin ranged between 150-1500 mg/l. The histochemical assay was carried out using chlorophenol Red assay. Chitinase gene was induced in plants by stabbing, and then the total protein was isolated. For studying the role of the chitinase gene in the conidial growth inhibition; four dilutions of the crude protein were mixed with one concentration of the conidial spore suspension and incubated at optimum temperature. For each dilution; 100 µl was spread on CDA medium for counting the forming colonies. On the other hand, the dilutions were used for the inoculation of Ghab1 leaves as a high susceptible variety to ascochyta blight. Furthermore, the detached leaves were used to evaluate the antagonistic effect of chitinase gene against ascochyta blight 98 on transgenic chickpea. For the same purpose, the whole chickpea plants were sprayed with conidial spore suspension. The experiments were designed in a complete randomized design (CRD) method and statistically analyzed using SPSS22 for ANOVA analysis. Electrophoresis of PCR products confirmed the integration and stability of chitinase gene in chickpea progeny in subsequent generations. The expected fragments from PCR estimated with 555 bp and 264 bp for chitinase and bar genes respectively, were detected in transgenic chickpea plants. The chitinase gene was transcribed successfully into mRNA and no pre-transcription silencing was reported. Only one T-DNA copy was identified in the transgenic plants which enhance the transgene expression and reduce the possibilities of gene silencing. Chickpea transgenic plants were resistant to the herbicide phosphinothricin up to 1500 mg/l without injuries. Herbicide resistant chickpea leaves changed the chlorophenol Red color into orange or yellow indicating the expression of bar gene. The crude protein containing the chitinase enzyme inhibited the growth of the conidial spores of Ascochyta rabiei and significantly reduced the number of colonies. On the other hand, the inhibition of growth was led to unformed mycelium with high extract concentration, or few amount was formed with low one. The inoculation of Gahb1 leaves with the previous treated spores reduced the disease severity but not the disease incidence. For the functional assessment on the whole transgenic plants, significant differences were reported between the average of disease incidence on the transgenic plants (57.75) and non-transformed plants which ranged between 80-100%. Also, differences were reported regarding the disease severity which estimated with 22.25 and 62.5 in average for transgenic and control plants, respectively. Finally, significant differences between transgenic and control plants were detected on the detached leaves. The disease incidence was estimated in average with 69.6% and 100%, and 56.6 in contrast to 85.2 for disease severity. Unfortunately, the final score of chickpea plants stayed high susceptible. 99 View publication stats