T.C İNÖNÜ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ. RADİOTROFİK BİR FUNGUS OLAN Alternaria alternata DA UV-C NİN BİYOKİMYASAL BELİRTEÇLER ÜZERİNE ETKİLERİ

Transkript

1 T.C İNÖNÜ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ RADİOTROFİK BİR FUNGUS OLAN Alternaria alternata DA UV-C NİN BİYOKİMYASAL BELİRTEÇLER ÜZERİNE ETKİLERİ HANDE TURANCI YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI MALATYA MAYIS 2013

2 Onur Sözü Yüksek Lisans olarak sunduğum Radiotrofik Bir Fungus Olan Alternaria alternata da UV-C nin Biyokimyasal Belirteçler Üzerine Etkileri başlıklı bu çalışmanın bilimsel ahlak ve geleneklere aykırı düşecek bir yardıma başvurmaksızın tarafımdan yazıldığını ve yararlandığım bütün kaynakların, hem metin içinde hem de kaynakça yöntemine uygun biçimde gösterilenlerden oluştuğunu belirtir, bunu onurumla doğrularım. Hande TURANCI

3 Her zaman yanımda olan birtanem anneme;

4

5 ÖZET Yüksek Lisans Tezi RADİOTROFİK BİR FUNGUS OLAN Alternaria alternata DA UV-C NİN BİYOKİMYASAL BELİRTEÇLER ÜZERİNE ETKİLERİ Hande TURANCI İnönü Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı xii sayfa 2013 Danışman: Prof. Dr. Dilek ASMA ÖZET Dünya üzerindeki yaşam sürekli bir radyasyon akışı içerisinde var olmaktadır. Funguslar, radyasyonla yeryüzündeki diğer canlılardan daha farklı bir etkileşim göstererek doğal ya da insan eliyle oluşturulmuş yüksek seviyedeki ultraviyole veya iyonize radyasyon ile başa çıkabilmektedir yılında meydana gelen Çernobil felaketinden 10 yıl sonra, oldukça reaktif olan hasarlı reaktör duvarlarında gelişen ve robotlar yardımıyla toplanan siyah fungusların keşfiyle bu ekstrem canlılarla ilgili araştırmalar başlamıştır. Çernobil reaktörlerinden izole edilen mikobiyotada 37 tür 19 cins saptanmıştır ve çalışmamızda kullanılan Alternaria alternata da bu izole edilen mikobiyota içerisinde yer almaktadır. Çernobil mikobiyotasındaki türler birbiriyle karşılaştırıldığında yüksek radyasyon ile kontamine alanlarda melanin içeren türlerin geniş yayılım gösterdiği belirlenmiştir. Melanin bütün alemlerde bulunan ve çok çeşitli rolleri olan karmaşık bir pigmenttir. Melanin organizmayı düşük/yüksek sıcaklık, radyasyon, kimyasal stres (ağır metal ve okside ajanlar), biyokimyasal streslere karşı korur; çeşitli ilaçlara ve kimyasallara bağlanır, kamuflaj görevi görür. Melanin ayrıca enerji dönüştürücü olarak görev yapar ve yüksek antioksidan özellik gösterir. Melanin hücrelerdeki reaktif oksijen türlerinin miktarında azalışa neden olarak organizmaya ekstrem çevre koşullarına karşı direnç kazandırmaktadır. Melanin elektron akseptörü olarak görev yaparak, peroxidaz gibi bazı enzimlere bağlanarak ya da suyun hidrolizine engel olarak ve bunun gibi birbirinden farklı pek çok mekanizmayı kullanarak radikal oluşumunu önlemektedir. Bu yüzden melanin çalışmanın temel bileşeninin oluşturmaktadır. i

6 Literatür taramaları gösterdi ki; radiotrofik funguslarda UV-C nin indüklediği reaktif oksijen türleri, bunların etkileri ve bunlara karşı hücresel savunma mekanizmaları ve reaktif oksijen türlerinin temizlenmesinden sorumlu antioksidan sistemleri hakkında yeterince araştırma yapılmamıştır. Bu amaçla radyotrofik bir fungus olan Alternaria alternata ya inokülasyon işleminden hemen sonra, 9 günlük inkübasyondan sonra ve melanin sentez inhibitörü olan trisiklazol (Tc) fungusiti eklendikten sonra besiyeri içerisinde üretilmiş fungal kültürler belirli sürelerde UV-C ye maruz bırakılarak enzim aktiviteleri ve glutatyon miktarları tesbit edilmiştir. Sonuçta melaninin antioksidan enzimler üzerine sinerjistik etkiye sahip olduğunu saptadık. Melaninin antioksidan özelikleri sayesinde hücrelerdeki süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon s-transferaz (GST) ve glutatyon redüktaz (GR) gibi enzimlerle beraber çalışarak antioksidan savunma sistemine katkıda bulunduğunu belirledik. ANAHTAR KELİMELER: Alternaria alternata, melanin, UV-C radyasyon, trisiklazol, oksidatif stres, katalaz, glutatyon redüktaz, süperoksit dismutaz, glutatyon S-transferaz. ii

7 ABSTRACT MSc Thesis EFFECT OF UV-C ON BIOCHEMICAL MARKERS OF THE RADIOTROPHIC FUNGUS Alternaria alternata Hande TURANCI Inonu University Institute of Science Department of Biology xii pages 2013 Supervisor: Prof. Dr. Dilek ASMA Life on Earth exists within a continuous flow of radiation. As compared to the other living organisms fungi interact with radiation in a different way that allows them to withstand high levels of natural or man-made ultraviolet (UV-C) or ionized radiation. Ten years after 1986 Chernobyl disaster, it was discovered that black fungi could grow on the damaged reactor walls which were highly reactive and the research studies on these extreme organisms started. 37 species and 19 genera have been detected in the micobiota isolated from Chernobyl reactors and Alternaria alternata, that was used in our study, was among this micobiota. A comparison between species within Chernobyl micobiota has revealed that, melanin containing species dominated heavily contaminated sites. Melanin is an enigmatic pigments found in all kingdoms of life has a variety of roles and functions. Melanin protects the organisms from low/ high temperatures, radiation, chemical stress (heavy metal and oxidizing agents) and biochemical stress; bonds with various drugs and chemicals and acts as a camouflage. Besides this, melanin functions as an energy transducer and shows high antioxidant properties. It leads to a decrease in the amount of reactive oxygen species in the cell and this gives resistance to the organisms under extreme environmental conditions. By acting as an electron acceptor, bonding with some enzymes such as peroxidase or prevent hydrolysis of water and using many different mechanisms, melanin inhibits radical formation. Because of all these melanin is the essential component in this research study. Literature does not provide enough research on reactive oxygen species that are induced by UV-C, the effects of UV-C on radiotrophic fungi and its cellular defense mechanisms, and its antioxidant systems that are responsible for reactive oxygen species scavenging. iii

8 Within the study three groups of A. alternata have respectively been exposed to the procedures of an inoculation; nine days of incubation and an addition tricyclazole (Tc) fungicide which is a melanin synthesis inhibitor. After these fungal cultures have been exposed to certain doses of ultraviolet C and their enzymes activation and glutathion level has been observed. As a result of this study, we have determined that the production of melanin has a synergistic effect on antioxidant enzymes. Moreover, it has been found that due to its antioxidant activity in cells, melanin contributes to antioxidant defense system via collaborating with enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione S-transferase (GST) and glutathione reductase (GR). KEYWORDS: Alternaria alternata, melanin, UV-C radiation, trcyclosol, oxidative stress, catalase, glutathione reductase, superoxide dismutase, glutathione S- transferase. iv

9 TEŞEKKÜR Bu çalışmamda benden her türlü yardım, öneri ve desteğini esirgemeden beni yönlendiren, çalışmamın her aşamasında pratik ve teorik bilgilerinden faydalandığım danışman hocam sayın Prof. Dr. Dilek ASMA ya; Tez çalışmamda laboratuvarlarının imkanlarını kullanmamı sağlayan Prof. Dr. Sema ERDEMOĞLU na, Prof. Dr. Özfer YEŞİLADA ya ve Prof. Dr. Hikmet GEÇKİL e; Çalışmamın her aşamasında bana destek olan ve istatistiksel analizlerin yapılmasına katkıda bulunan Arş. Grv. Dr. Özlem DEMİRCİ ye, radyasyon uygulaması için gerekli doz miktarlarının belirlenmesine yardımcı olan Öğrt. Grv. Süreyya NUR a ; Deneysel çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen Doç. Dr. Abbas GÜNGÖRDÜ ye, çalışma süresince hep yanımda olan değerli dostlarım Elif ÖZBEY ve Serkan KÖSTEKCİ ye; Bu araştırmanın yürütülmesinde bütün bölüm imkânlarından faydalanmamı sağlayan Biyoloji Bölüm Başkanlığı na; Ayrıca tüm hayatım boyunca olduğu gibi Yüksek Lisans çalışmalarım süresince de beni destekleyen ve hep yanımda olan değerli aileme; no lu proje ile bu araştırmayı maddi olarak destekleyen İnönü Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi ne; EN İÇTEN DİLEKLERİMLE TEŞEKKÜR EDERİM v

10 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... iiii TEŞEKKÜR... v İÇİNDEKİLER... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... ix ÇİZELGELER DİZİNİ... xi SİMGELER VE KISALTMALAR... xii 1. GİRİŞ Ekstrem Çevre Koşulları Ekstrem Çevre Koşullarına Karşı Mikroorganizma Adaptasyonları Fungusların Genel Özellikleri Fungi Imperfecti (Deuteromycetes) nin Genel Özellikleri Alternaria alternata Melanin ve Melanin Pigmentinin Özellikleri Melanin pigmentinin Kimyasal Yapısı Radyotrofik Fungusların Habitatı Melanin Tipleri ve Melanin Sentez Yolakları Polyketid Sentaz Yolağı ve Trisiklazol Melaninin Hücrelerdeki Yerleşimi Ultraviyole Radyasyon UV-C Radyasyon ile Melanize Fungus Habitatlarının İlişkisi Melaninin reaktif oksijen türleri ve antioksidanlarla ilişkisi Reaktif Oksijen Türleri (ROT) ve Oksidatif Stres Reaktif Oksijen Türlerinin (ROT) Sınıflandırılması Süperoksit Radikali Hidrojen Peroksit vi

11 Hidroksil Radikali Singlet (Tekil ) Oksijen Reaktif Oksijen Türlerinin Kaynağı Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri Antioksidan Savunma Sistemleri Enzimatik Antioksidanlar Süperoksit Dismutaz (SOD: EC ) Katalaz (CAT: EC ) Glutatyon Peroksidaz (GPx; EC ) Glutatyon Redüktaz (GR: EC ) Glutatyon S-Transferaz (GST, EC ) Enzimatik Olmayan Antioksidanlar Glutatyon (GSH, γ-l-glutamil-l-sistein-glisin) KAYNAK ÖZETLERİ MATERYAL VE YÖNTEM Araştırmada Kullanılan besiyerleri Araştırmada Kullanılan Kimyasallar Alternaria alternata Stoklarının Hazırlanması ve Trisiklozol Eklenmesi Fungusların UV-C radyasyona maruz bırakılması Fungusların UV-C Uygulaması Sonrası Alınması: Homojenizasyonu, Sonifikasyonu ve Santrifügasyonu Örneklerin Elde Edilmesi ve Saklanması Enzim Aktivite Tayini Katalaz Aktivitesinin Ölçümü Süperoksit Dismutaz Aktivitesinin Ölçümü Glutatyon S- Transferaz Aktivitesinin Ölçümü Glutatyon Redüktaz Aktivitesinin Ölçümü Glutatyon (GSH) Miktar Tayini vii

12 Total Protein Tayini İstatiki Analizler ARAŞTIRMA BULGULARI UV-C Radyasyona Maruz Bırakılan Alternaria alternata Fungusunun Antioksidan Enzimlerinin Aktiviteleri ve Glutatyon Miktarındaki Değişimler Katalaz Aktivitesi Glutatyon Redüktaz Aktivitesi Glutatyon S-Transferaz aktivitesi Süperoksit Dismutaz Aktivitesi Glutatyon (GSH) Miktar Tayini TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR EKLER ÖZGEÇMİŞ viii

13 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil1.1.Fungusların sınıflandırılması... 6 Şekil1.2. Alternaria alternata nın sınıflandırılması... 7 Şekil günlük A.alternata kültürü... 8 Şekil 1.4. DHN melaninin kimyasal formülü.. 10 Şekil 1.5. Çernobil reaktörlerinin genel görüntüsü. 12 Şekil 1.6. Çernobildeki 4 reaktörden alınan karışık kültürler Şekil 1.7. Ömelanin sentez yolağı Şekil 1.8. Feomelanin sentez yolağı Şekil 1.9.A-Allomelanin sentez yolağı (DHN melanin sentezi)b-tirozinazdan pyomelanin sentezi.. 17 Şekil ,8 DHN melanin üretim basamakları Şekil Fungusit olarak kullanılan trisiklazol polyketide sentez yolağıyla üretilen DHN melanin sentezini iki basamakta inhibe edebilir Şekil Elektromanyetik spektrum Şekil UV-C ışınlarının DNA üzerine etkisi 25 Şekil Negev çölü merkezinde Nahal Nizana bölgesinden alınan örnekler 27 Şekil Melaninin mikroorganizmalarda solunum zinciri sırasında elektron tutucu özelliğinin olası fonksiyonlarının şematik gösterimi 28 Şekil Solunumsal patlama ile reaktif oksijen türlerinin oluşumu.. 37 Şekil Enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanların şeması.. 40 Şekil Glutatyon redüktaz 43 Şekil 3.1. Fungusların UV-C ye maruz bırakılması 52 Şekil 4.1. İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın katalaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 58 Şekil 4.2. Alternaria alternata nın 9 günlük kültürlerinin UV-C uygulaması sonucu CAT aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması Şekil 4.3. Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu CAT aktivite değişimlerinin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05) 60 Şekil 4.4. Alternaria alternata nın üç farklı uygulama grubunun kontrol gruplarındaki katalaz aktivite değişimleri.. 61 Şekil 4.5. Alternaria alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulaması sonrasındaki katalaz aktivite değişimleri 62 Şekil 4.6. İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın glutatyon redüktaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05) Şekil 4.7. Alternaria alternata nın 9 günlük kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon redüktaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması 64 Şekil 4.8. Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon redüktaz aktivite değişimlerinin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05) Şekil 4.9. Alternaria alternata nın üç farklı uygulama grubu içerisindeki kontrol gruplarının GR aktivite değişimleri.. 66 ix

14 Şekil Alternaria alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulaması sonucu GR aktivite değişimleri.. 67 Şekil İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın glutatyon S-transferaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05) Şekil Alternaria alternata nın 9 günlük kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon S-transferaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması 69 Şekil Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon S-transferaz değişimlerinin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05) Şekil A. alternata nın kontrol gruplarının üç farklı uygulama için glutatyon S-transferaz aktivite değişimleri.. 71 Şekil Alternaria alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulanması sonucu glutatyon S-transferaz aktivite değişimleri. 72 Şekil İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın süperoksit dismutaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05).. 73 Şekil Alternaria alternata nın 9 günlük kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu süperoksit dismutaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırması. 74 Şekil Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu süperoksit dismutaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması* (p<0,05) Şekil Alternaria alternata nın üç farklı uygulama grubu içerisindeki kontrol gruplarının süperoksit dismutaz aktivite değişimleri 76 Şekil Alternaria alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulanması sonucu süperoksit dismutaz aktivite değişimleri. 77 Şekil İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın glutatyon miktarındaki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 78 Şekil Alternaria alternata nın 9 günlük kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon miktarındaki değişimlerin kontrol ile karşılaştırması.. 79 Şekil Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon miktarındaki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 80 Şekil Alternaria alternata nın üç farklı uygulama grubu içerisindeki kontrol gruplarının GSH miktarlarının değişimleri Şekil Alternaria alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulanması sonucu GSH miktarlarının değişimi. 82 Şekil Tc eklenmiş (solda) ve eklenmemiş (sağda) PDA daki A.alternata; Tc eklenmiş (solda) ve eklenmemiş (sağda) PDB deki A.alternata 83 x

15 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge1.1.Melanin patojenik fungusları çevresel stres faktörlerine karşı korumaktadır. 9 Çizelge 1.2. Çernobil nükleer güç reaktörlerinin farklı radyasyon seviyelerinde kontamine olmuş 4 farklı reaktörden izole edilen mikrofungusların kontamine alanlarda bulunma sıklığı 14 Çizelge 1.3. Canlılarda radyasyon bozukluklarına yol açan olaylar 25 Çizelge 1.4. Hücresel serbest radikallerin etkilediği moleküller.. 39 Çizelge 3.1. Uygulama süresine bağlı olarak uygulanan doz değerleri Çizelge 1. İnokülasyon sonrası uygulama yapılan Alternaria alternata kültürlerinin her bir zaman diliminde UV-C ye maruz kaldıktan sonraki enzim aktivite değişimleri. 103 Çizelge 2. Her bir zaman diliminde UV-C ye maruz kalan 9 günlük Alternaria alternata kültürlerinin enzim aktivite değişimleri Çizelge 3. Tc eklendikten sonra uygulama yapılan Alternaria alternata kültürlerinin her bir zaman diliminde UV-C ye maruz kaldıktan sonraki enzim aktivite değişimleri xi

16 SİMGELER VE KISALTMALAR Molar( Mol/litre) M Milimolar mm Mikromolar μm Celcius derece Gram Mikrogram Litre Mililitre Mikrolitre Ultraviyole C Watt C g μg L ml μl UV-C W Mikrowatt µw 1,8-dihydroxynaphthalen 1,8 DHN Optik Dansite OD Hidrojen İyon Konsantrasyonunun eksi logaritması ph Tricyclazole Tc Glutatyon GSH Glutatyon redüktaz GSH-R GlutatyonS-transferaz GST Reaktif Oksijen Türleri ROT Süperoksit dismutaz SOD Katalaz CAT Glutatyon peroksidaz GSH-Px Lipid hidroperoksitler ROOH Hidrojen peroksit H 2 O 2 Süperoksit radikali.- O 2 Hidroksil radikali. OH Reaktif oksijen türleri ROT Okside Glutatyon GSSG 1-choloro,2-4 dinitro benzen CDNB 5-5 -ditiyobis (2- nitrobenzoikasit) DTNB Etilendiamin tetra asetik asit EDTA Miliröntgen mr xii

17 1. GİRİŞ 1.1. Ekstrem Çevre Koşulları Mikroorganizmalar doğada çeşitli çevresel streslere maruz kalmaktadırlar. Bunlar ısı, basınç, elektrik akımı, ultrasonik dalgalar, ışık/radyasyon ve ozmotik şok gibi fiziksel stresler, asitler, tuzlar ve oksitleyiciler gibi kimyasal stresler, mikrobiyal metabolitler ve yarışmacı flora gibi biyolojik streslerdir. Canlılar bu koşullarda ya yaşamlarını yitirebilir ya da adaptasyon mekanizmalarına sahiplerse bu stresli çevrelerde yaşamlarını sürdürebilirler. Son yıllarda ekstrem olarak adlandırılan; yüksek veya düşük sıcaklık, ph, yüksek tuzluluk, yüksek basınç veya yüksek iyonize ve iyonize olmayan radyasyon koşullarında yaşayan birçok mikroorganizma çeşitliliği keşfedilmiştir. Bu canlılar, yaşabildiği çevresel parametreye bağlı olarak barofiller, halofiller, termofiller, asidofiller ve radiofiller olmak üzere farklı şekilde sınıflandırılmaktadırlar (Vigh vd., 1998). Teknolojinin gelişmesi, bu gelişmeye bağlı olarak da enerji ihtiyacının artması gibi çeşitli nedenlerle doğadaki radyoaktif kirlilik her geçen gün artmaktadır. Radyoaktif maddelerin yaymış olduğu elektronların toprağa, havaya, suya, bitkilere, doğrudan ya da besin zinciri ile insan ve hayvanlara çok kolay ve hızlı bir şekilde aktarılması, radyoaktif kirlenmenin en tehlikeli özelliği olarak bilinmektedir. Radyoaktif kirleticiler özellikle insan, hayvan ve bitki sağlığını olumsuz yönde etkileyerek çevreyi ve ekolojik dengeyi bozmaktadır. Ayrıca canlıların yapısına giren fazla miktardaki elektronlar, canlı hücrelerdeki elektron dengesini bozmakta bunun sonucunda da hücreler, normal madde değişimi işlevlerini yerine getirememektedirler. Radyasyon tehlikesinin en korkunç yanı, ölümcül etkisinin çok uzun süre sonra ortaya çıkmasıdır. Bunun en çarpıcı örneklerinden biri 26 Nisan 1986 da meydana gelen Çernobil faciası olarak bilinmektedir (Dadachova vd., 2008). Sadece günümüzde değil özellikle yeryüzünde canlılığın ortaya çıkmaya başladığı dönemlerde dünya çok daha yüksek miktarlardaki radyasyon seviyelerine maruz kalmaktaydı. Yüksek radyasyon miktarına karşın, erken yaşam formları canlılığını sürdürebilmek ve bu ekstrem çevre şartlarına rağmen varolabilmek için radyasyon direnç mekanizmasına sahip olmak zorundaydı. Bugün yeryüzündeki 1

18 mevcut radyasyon seviyesi canlılığın ortaya çıkmaya başladığı dönemdeki radyasyon miktarına kıyasla çok daha düşük olmasına rağmen bu mevcut radyasyon ortamında erken yaşam formları hala varolmayı başararak canlılığını devam ettirmektedir (Dadachova ve Casadevall, 2008). Günümüzde insanlar da dahil bütün canlılar hala belirli dozlarda radyasyona maruz kalmaktadır. Örneğin Amerika da yaşayan bir kişi için yıllık radyasyon dozunun % 90 nı kozmik radyasyon ve radyoaktif kayalar gibi doğal kaynaklardan oluşmaktadır (Early ve Sodee, 1984). Doğal kaynakların yanısıra teknolojinin gelişimine de paralel olarak gün içinde maruz kaldığımız radyasyon miktarı ciddi boyutlara ulaşmıştır. Çeşitli kaynaklar nedeniyle maruz kalınan bu iyonize ya da iyonize olmayan radyasyon sadece ekolojik dengeyi ve hücredeki madde alışverişini bozmakla kalmayıp; organizmada yüksek dozlarda oksidatif strese neden olmaktadır. Radyasyonun hücre içerisindeki moleküller ile etkileşimleri doğrudan veya dolaylı olarak ikiye ayrılmaktadır. Radyasyonun direkt etkisinde, radyasyon doğrudan biyolojik hedef moleküllerle etkileşime girip enerjisini direkt olarak transfer etmektedir. Dolaylı etkileşimde ise hücrelerin yüksek oranlarda su molekülü içermesinden dolayı suyun hidroliziyle açığa çıkan (hidroksil ve tekil oksijen) serbest radikaller diğer hücre molekülleriyle reaksiyona girer. Serbest oksijen radikallerinin aşırı üretimi sonucunda hücrelerde reaktif oksijen türleri-antioksidan sistem dengesinin bozulmasına ve hücrenin temel yapılarının oksidasyonuna neden olmaktadır. Hücrede oluşan oksidatif hasara bağlı olarak DNA da; abazik alanlar, tek ve çift zincir kırıkları, baz modifikasyonları, karbonhidrat protein gibi organik molekül hasarları meydana gelebilmektedir (Kılınç vd., 2002). Radyasyonun organizmaları öldürücü birçok etkisine karşın bazı ekstremofil canlılar yüksek radyasyon ile kontamine alanlarda yaşamını sürdürebilmektedir. Örneğin 20. yüzyılın en büyük radyoaktif facialarından biri olan Çernobil faciasından sonra yapılan araştırmalarda hasarlı reaktörlerde yüksek radyasyon dozlarına rağmen yaşayabilen 200 den fazla fungus türü izole edilmiştir (Zhdanova vd., 2000). 2

19 1.2. Ekstrem Çevre Koşullarına Karşı Mikroorganizma Adaptasyonları Ekstremofil mikroorganizmalar bir stres faktörüne maruz kaldığında eğer genetik kodunda bir direnç mekanizması varsa, ilgili proteinleri üreterek korunmaya çalışır. Sentezlenen protein tek bir stres faktörüne karşı etkili olabildiği gibi birden fazla stres faktörüne karşı da etkili olabilmektedir. Membranın protein içeriği, yağ asidi zincirinin uzunluğu veya yağ asitlerindeki cis-trans oranları, sıcak şoku proteinlerinin (HSP) sentezi, soğuk şok proteinlerinin (CSP) sentezi, melanin ya da karotenoid tipi pigmentlerin sentezindeki değişiklikler gibi birçok mekanizmayla sağlanmaktadır (Vigh vd., 1998). Örneğin soğuk şokuna karşı E. coli de sitoplazmik membran, nükleik asitler ve ribozomlar duyarlıdır. Bunlar termosensör olarak görev yaparlar. Moleküler düzeyde inceleyecek olursak, bu olumsuz durumlarda hücrelerde düzenleyici şok proteinler sentezlenmektedir. Böylece bakteri, sentezlenen proteinler ile maruz kaldığı stresle baş edebilecek düzeye ulaşabilmektedir. Sıcaklık, biyolojik membranların kompozisyonu, organizasyonu ve fonksiyonunda çok önemli bir rol oynamaktadır. Membranlar, kendi doymamış yağ asidi kompozisyonlarını çevresel sıcaklıklardaki değişimlere göre uyarlamaktadırlar (Phadtare vd., 1999). Karotenoidler bakteri, alg, fungus ve bitkilerin büyük kısmında bulunmaktadırlar. Çok sayıda Antartik bakterinin membranlarında karotenoid tipi pigmentler içerdikleri bulunmuştur. Bu pigmentlerin membranda yerleşerek membran akışkanlığında tampon rolü oynadıkları ileri sürülmektedir. Çalışmalarda membrandaki stabilitenin polar, akışkanlığın ise non polar karotenoidlerle sağlandığı bulunmuştur. Sphingobacterium antarcticus ve Micrococcus poseus gibi Antartik bakterilerde karotenoid sentezinin üreme sıcaklığına bağlı olduğu, düşük sıcaklıklarda polar karotenoid sentezinin arttığı ve bu nedenle membran stabilitesinde artış meydana gelirken non polar karotenoid sentezinde düşme olduğu saptanmıştır (Jagannatham vd., 2000). Karotenoid pigmentinin aynı zamanda iyonize ve iyonize olmayan radyasyona karşı canlıları koruduğu da bilinmektedir. Radyasyon serbest radikal oluşumunu tetikleyerek organizmada oksidatif stres oluşturmakta ve canlının biyomoleküllerinden genetik materyaline kadar pek çok bileşenine zarar vererek canlılığın sona ermesine doğru giden bir süreci başlatmaktadır. Yapılan çalışmalar fungusların radyasyona karşı verdikleri cevabın diğer organizmalardan farklı olduğunu göstermektedir. Genel olarak funguslar 3

20 özellikle de melaninli funguslar yüksek dozlardaki radyasyon seviyelerine oldukça dirençlidir (Saleh vd., 1988; Mirchink vd., 1972). Melanin sayesinde oluştuğu düşünülen bu direnç pigmentin birbirinden farklı mekanizmalarla reaktif oksijen türlerinin miktarında azalışa neden olmasıyla ilişkilendirilmektedir (Dadachova vd., 2008). Günümüzde artan enerji ihtiyacına yanıt verebilmek için kurulan santraller ve bunların atıkları, nükleer silahlar ya da gün içinde maruz kaldığımız radyasyon sadece teknolojinin gelişmesi sonucu çağımızla ortaya çıkan bir sorun gibi görünse de aslında dünyanın oluşumu sırasında bile canlılar, bugün maruz kalınandan çok daha fazla miktarda radyasyona maruz kalmıştır. Kretase döneminde dünyanın kozmik radyasyona karşı mevcut kalkanının kaybıyla ve yeryüzündeki manyetik alan değişimi sonucunda birçok bitki ve hayvan türünün neslinin tükendiği bilinmektedir. Günümüze kadar geçen süre içerisinde bazı canlılar yok olurken bazılarının ise nasıl canlılığını devam ettirebildiği her zaman merak uyandırmış, bu konuda birçok çalışma yapılmış ve yapılmaya devam etmektedir. Yapılan araştırmalar sonucu geçmişten günümüze ulaşan birçok fungal fosilde melanin miktarının çok yüksek olduğu görülmüştür. Özellikle melanize fungal sporların erken kretase döneminin sediment tabakasında oldukça yaygın olduğu saptanmıştır (Hulot ve Gallet, 2003). Buna ek olarak Nemesis adlı göktaşından yayıldığı düşünülen radyasyonun birçok canlının neslinin tükenmesine neden olduğu rapor edilmiş (Davis vd., 1985) ve kretase döneminin sonundaki bu kitlesel yok olmaya karşı melaninli fungusların canlılıklarını sürdürebildikleri saptanmıştır (Casadevall, 2005). Melaninli funguslar Antartika daki ekstrem çevre koşullarına rağmen de yaşayabilmektedir (Robinson, 2001). Bu bilgilerin ışığında melaninin çok büyük ihtimalle seçilmiş atasal pigmentler olduğu düşünülmektedir. Çünkü geçmişten günümüze varlığını sürdürmüş bu pigment fungusların çok çeşitli çevre koşullarına karşı hayatta kalmasını sağlamaktadır (Dadachova vd., 2007). Araştırmacılar uzun yıllardır ekstrem ortamlarda mikroorganizmaların nasıl yaşadıklarını ve aşırı stresli ortamlarda sonradan ortaya çıkan adaptasyon mekanizmalarını merak etmişlerdir. Melanin pigmenti bu bağlamda araştırmacılar için çok yeni ve dikkat çekici bir çalışma alanıdır. Çünkü doğanın dengesinin bozulmasıyla birlikte dünyamızda oluşan ve tüm canlıların maruz kaldığı ekstrem çevre şartlarına karşı çeşitli organizmaların geliştirdiği direnç mekanizmalarını 4

21 inceleyerek belki de insanoğluna bu koşullara karşı hayatta kalma yada daha sağlıklı bir yaşam sürme imkanı sağlanabilecektir. Melaninin elektron akseptörü olarak görev yapması, peroxidaz gibi bazı enzimlere bağlanarak ya da suyun hidrolizine engel olarak birbirinden farklı pek çok mekanizmayla radikal oluşumunu önlemektedir (Shcherba vd., 2000). Biz de bu amaçla çalışmamızda yüksek miktarda melanin üreten radyotrofik bir fungus olan Alternaria alternata ya farklı sürelerde UV-C uygulayarak radyasyon stresi altında antioksidan enzim ve glutatyon miktarındaki değişimlerini tespit ettik. Ayrıca trisiklazol (Tc) ile melanin üretimini inhibe ederek melaninin fungusun sahip olduğu antioksidan savunma sistemine olan katkılarını test etmeyi amaçladık Fungusların Genel Özellikleri Doğada bilinen tür fungus teşhis edilmesine karşın, bunların 150 türü insan ve hayvanlar için primer patojendir. Fungusların çoğunun tanısı morfolojik yapıya dayanmaktadır. Pek çoğu birbirine benzeyen küflerde, morfolojik tanı her zaman kolay değildir. Ancak, 18S RNA/DNA analizlerinin gelişimi ile fungusların tanımlanmasında büyük kolaylık sağlanmıştır (Mahuku ve Riascos, 2004; Akdağ, 2010). Funguslar ökaryotik hücrelerdir ve ökaryot mikroorganizmalar içerisinde yer almaktadırlar. Fungusların sterolce zengin sitoplazma zarı yapısal olarak insan hücre zarına benzerlik göstermekte ve klorofil içermemeleri ile yüksek bitkilerden ayrılmaktadırlar. Fungus hücre duvarının yapısında bulunan kitin, fungusun bakteri ve yüksek bitkilerden ayrılmasını sağlar. Bakteri hücresindeki peptidoglikana karşılık, fungus hücre duvarında kitin (N-asetil glukozamin [NAG] birimlerinden meydana gelmiştir), mannanlar, glukanlar ve diğer kompleks yapılar mevcuttur (Mutlu vd., 1999). Fungal hücre duvarı genellikle polisakkarit, protein, lipit, polifosfat gibi bileşenlerden oluşmaktadır (Madigan vd., 1997). Fungusların hücre zarındaki iyon alışverişi ve enzim etkinliği gibi metabolizma işlevleri ortamın ph sından etkilenmektedir. Fungusların optimal üreme ph sı 5-6, optimal üreme ısıları ise C dir. Çalışmamızda kullanılan fungus, fungi imperfecti (Deuteromycetes) sınıfına dahil olup aşağıdaki gibi gösterilmektedir (Şekil 1.1). 5

22 FUNGUSLAR Flamentsiz mikrofunguslar (maya ) Flamentli mikrofunguslar (küfler) Makrofunguslar (Şapkalı mantarlar) Zygomycetes Ascomycetes Basidiomycetes Fungi imperfecti (Deuteromycetes) Oomycetes Şekil 1.1. Fungusların sınıflandırılması Fungi Imperfecti (Deuteromycetes) nin Genel Özellikleri Eşeyli üreme evreleri henüz bilinmeyen septalı miselyuma sahip ve konidyoforlar üzerinde konidyumlar meydana getirerek eşeysiz çoğalabilen funguslar bu sınıfta toplanmaktadır. Çoğunlukla konidyumlar aracılığıyla ürerler. Konidyosporlar renksiz veya değişik renklerde; küresel, oval, silindirik, iplik, sarmal, böbrek veya iğ şeklinde olabilmektedir. Büyüklük ve hücre sayısı bakımından da farklılık gösterebilirler. Konidiyosporlar tek hücreli veya çok hücreli olabilirler. Spordan başka konidiyofor özellikleri de cins ve tür tanımlamalarında dikkate alınmaktadır. Bunlar konidiyumları meydana getiren hücrelerin oluşum tarzı, renk, konidiyumların yapısı ve yerleşim tarzı gibi karakterlerine bakılarak yapay bir sınıflandırma metoduyla sınıflandırılırlar. Konidyalar eşeysiz sporlardır ve çoğu zaman pigmentli olup kuraklığa dayanıklıdırlar. Konidyalar fungusların yeni habitatlara yayılışında görev yapmakta ve konidyalar oluştuğu zaman miselyumun beyaz rengi değişerek konidyaların siyah, mavi-yeşil, kırmızı, sarı veya kahverengi renkleri ortaya çıkmaktadır. Bu sporların varlığı misel tabakaya (miselyal mat) oldukça tozlu bir görünüm kazandırmaktadır (Çökmüş, 2010; Akdağ, 2010). Funguslar ince uzun hif adı verilen flamentlerden oluşmaktadırlar. Hifler genelikle bir yüzey boyunca beraber büyüyerek miselyum denen ve mikroskopta kolayca görülebilen kompakt demetler oluştururlar. Tek tek bulunan hiflerin büyüdükçe dallanmalarından miselyumlar ortaya çıkar ve bu dallar bir araya gelerek 6

23 kompakt bir misel tabakası (mat) oluştururlar. Araştırmamıza konu olan Alternaria alternata nın sistematiği şekil 1.2 de gösterildiği gibidir. Alem : Mycota Bölüm : Amastigomycota Alt Bölüm : Deuteromycotina Form Sınıf : Deuteromycetes Form Alt Sınıf: Hyphomycetidae Form Takım : Moniliales Form Aile : Dematiaceae Form Cins : Alternaria Şekil 1.2. Alternaria alternata nın sınıflandırılması Alternaria alternata Alternaria cinsinin kapsadığı türler her yerde bulunan, dünya genelinde çok fazla ekonomik kayıplara neden olan 50 saprofitik ya da bitki patojeni türleriyle iyi bilinen bir genustur. En yaygın türleri ise Alternaria alternata, Alternaria brassicae, Alternaria cucumerina, Alternaria dendritica ve Alternaria soloni dir (Frost 1988). Alternaria alternata nemli yerlerde ve özellikle organik maddeler üzerinde gelişmektedir. Bitkilerde hastalık yapan bu fungus ekonomik önemi olan birçok meyve ve sebzede çürümeye neden olmaktadır (Logriceo vd., 1990; Mitakakis, 1997; Beyoğlu, 2006). Sporları hava yolu ile yayılır (Hjelmroos, 1993). Kolonileri yaygın gri/koyu siyahımsı, kahverengi veya siyah, miselyumları kısmen yüzeysel, hifler kültür süresine bağlı olarak renksiz, zeytinimsi kahverengi veya kahverengidir (Ellis, 1971). 7

24 Alternaria kolonileri genelde koyu kahve veya koyu yeşil yapıdadır ve bu yapıyı saran ince beyaz bir halka bulunur. Mikroskobik olarak incelendiğinde ise koyu renkli ve septalı olan hifleri dikkat çekmektedir. Konidiyoforları septalı, koyu renkli basit ya da demet oluşturmuş yapıdadır. Bir ucu yumru olan sopaya benzer. Genel spor şekli eliptiktir. İnce duvarlı ve bazı türlerde tepe kısmı konik yapıda olup enine ve boyuna septalara sahiptir (Simmons, 1967; Akdağ, 2010). Yaklaşık 50 tür içeren Alternaria cinsi üyeleri türler arasında değişiklik göstermektedir. Boyutları 8-40x (500) μm dir (Frost, 1988; Beyoğlu, 2006 ). Şekil günlük A.alternata kültürü. Alternaria alternata nın çeşitli stres faktörlerine özellikle de radyasyona karşı melanin sayesinde dirençli olduğu birçok çalışmayla kanıtlanmıştır. Melanin pigmenti stres faktörlerine direnç mekanizmasında birincil rol oynamakta hatta bu sayede fungus Çernobil reaktörlerinde yüksek radyoaktif ışınıma rağmen hayatta kalabilmektedir. Bu nedenle melanin üretimi ile fonksiyonları çok sayıda araştırıcı ve mikologlar tarafından oldukça yeni ve popüler bir konu haline gelmiştir (Cunha vd., 2010). Birçok araştırıcı tarafından farklı mikroorganizmalarla yapılan çalışmalar sonucu melaninin çeşitli stres faktörlerine karşı koruyucu etkisi ile ilgili veriler aşağıdaki gibi özetlenmiştir (Çizelge 1.1). 8

25 Stres faktörü Organizma Cryptococcus neoformans (Rosas ve Casadevall, 2001) Enzimatik degradasyon Aspergillus spp. (Bloomfield ve Alexander, 1967; Bull, 1970; Kuo ve Alexander, 1967) Exophiala dermatitidis (Dixon ve Polak, 1991) Alternaria alternata (Kane vd., 1981; Mironenko vd., 2000) C. neoformans (Wang ve Casadevall, 1994; Rosas ve Casadevall, 1997) Radyasyon (UV, solar, gama) Sporothrix schenckii (Romero vd., 2000) E. dermatitidis (Dixon vd., 1991) Cladosporium spp. (Saleh vd., 1988; Zhdanova vd., 1973) Pneumocystis spp.( Icenhour, 2006) Ağır metaller C. neoformans (Garcia-Rivera ve Casadevall, 2001) Termotölerans (sıcak ve soğuk ) C. neoformans (Wang ve Casadevall, 1994; Yang vd., 2002) Çizelge 1.1. Melanin patojenik fungusları çevresel stres faktörlerine karşı korumaktadır (Nosanchuk ve Casadevall, 2006) Melanin ve Melanin Pigmentinin Özellikleri Melaninin omurgalılar, böcekler, bitkiler ve mikrobiyal organizmalarda önemli koruyucu rolleri bulunmaktadır. Melaninler kamuflaj görevi görerek organizmayı çevresel predatörlere karşı, sıcak-soğuk ve kuraklık stresine karşı, metal iyonlarına gösterdiği yüksek bağlanma kapasitesi sayesinde de ağır metallere karşı korumakta ayrıca sexual rol oynamaktadır (Castanet ve Ortonne, 1997). Ortaklaşmamış elektronların varlığından dolayı tipik elektron spin resonans sinyalleri üreten serbest radikallere karşı stabiliteye sahiptir, ayrıca UV ve solar radyasyon gibi fiziksel ajanlara karşı fotoprotektör olarak koruyucu görev üstlenmektedir (Dadachova vd., 2007; Geng vd., 2008). Melaninin bu fonksiyonları 9

26 mikroorganizmaların ekstrem çevre koşullarına karşı hayatta kalma şanslarını arttırmaktadır (Nosanchuk ve Casadevall, 2003; Eisenman vd., 2007). Şekil 1.4. DHN melaninin kimyasal formülü Melanin Pigmentinin Kimyasal Yapısı Melanin Yunanca da siyah anlamına gelen melanos kelimesinden köken almaktadır (Ruth vd., 2007). Melaninler hidrofobik yapıda, yüksek molekül ağırlıklı, negatif yüklü, suda veya organik sıvılarda çözünmeyen, aside dirençli, çeşitli biyolojik fonksiyonları olan, paramagnetik biyopolimerler olarak bilinen hidrofobik pigmentlerdir (Nosanchuk ve Casadevall, 2006). Melaninlerin yapısına ilişkin kısıtlı bilgi bulunmakla birlikte polimerize fenolik ve/veya indolik bileşenlerden oluştuğu düşünülmektedir. Melaninlerin yapısının tanımlanmasındaki sorun, uygulanmakta olan biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemlerin, bu kompleks polimerlerin kimyasal bileşimini ortaya koyamamasından kaynaklanmaktadır. Ancak polimeri oluşturan monomerlerin tanımlanması ve melaninlerin özelliklerine ilişkin önemli bilgiler, çeşitli analitik yöntemlerle sağlanabilmektedir. Elektron paramagnetik rezonans (EPR) spektroskopi özelliklerine göre melanin tanımlanabilmekte ve kısmi kimyasal degredasyonunu takiben yüksek performanslı sıvı kromotografi (High Performance Liquid Chromotoraphy; HPLC) mikroanalizinin uygulanması ile melanin tipleri belirlenebilmektedir (Enochs vd., 2002; Alp, 2010). 10

27 1.5. Radyotrofik Fungusların Habitatı 1986 yılında meydana gelen 20. yüzyılın ilk büyük nükleer kazası Çernobil felaketinden 15 yıl sonra bilim insanları Çernobil Atomik Enerji İstasyonu ve çevresinde araştırmalar yapmaya başlamıştır. Bugün bile oldukça radyoaktif olan Çernobil reaktörüne gönderilen bir robot, hasar görmüş reaktörün duvarında yaşayan, siyah melanince zengin fungus örnekleri ile dönmüştür. Bu durumla ilgilenen Casadevall ve arkadaşları çeşitli funguslar üzerinde çalışmalar yaparak melanin içeren iki türün (Crytococcus neoformans ve Wangiella dermatitidis) standart iyonize radyasyona maruz kaldıklarında belirgin ölçüde hızlı bir şekilde ürediklerini göstermişlerdir. Araştırmada çalışan diğer bir araştırıcı olan Ekaterina Dadachova Nasıl ki yeşil bitkilerdeki klorofil güneş ışığını kullanarak kimyasal enerji üretiyorsa, melanin de elektromanyetik spektrumun diğer bir kısmını kullanarak bunu içeren funguslara enerji sağlamaktadır demiştir. Radyasyon melanin ile etkileşime girerek elektron yapısını değiştirmektedir. Bunun, radyasyonun tutulmasında ve besin yapımında kullanılan farklı bir formdaki enerjiye dönüştürülmesinde gerekli olan basamak olduğuna inanılmaktadır. Daha sonra da yapılan araştırmalar sonucu reaktörler ve çevresinde yüksek radyasyon seviyesine rağmen canlılığını devam ettirebilen 200 tür, 98 cins fungus izole edilmiştir (Zhdanova vd., 2004). Melaninli fungusların habitatı, çok yüksek radyasyon seviyelerinin olduğu çevrelerdir. İnsan aktivitelerinden kaynaklanan yüksek radyasyonlu çevreler arasında iki bölge dikkat çekmektedir ve bu bölgelerde melaninli fungus türleri kolonize olmuştur. Birincisi Çernobil de yüksek dozda radyasyona maruz kalan ve zarar görmüş reaktör duvarı, ikincisi ise soğuk su havuz reaktörleri olarak adlandırılan bölgedir. Bu alanlarda radyasyon seviyeleri öldürücü insan dozu seviyesinden kez daha fazladır (Zhdanova vd., 2000) ve buna rağmen çok sayıda gram negatif ve gram pozitif basil ve kok bakterileri ile fungal türler kolonize olmuştur (Dadachova ve Casadevall, 2008) de keşfedilen bu mikroorganizmalarla daha sonra bilim insanları tarafından çok sayıda çalışmalar yapılmıştır. Bu alanlarda yaşayabilen mikroorganizmaların böylesine yüksek düzeyde radyasyonlu habitatlarda nasıl yaşayabildikleri konusu bilim insanlarınca ilgi odağı olmuştur. Bu ekstrem çevre koşullarına meydan okumanın moleküler ve hücresel boyutta incelenmesi sonucunda, 11

28 dayanıklılığın hücre duvarlarında lokalize olan melanin üretimi ile bağlantılı olduğu tespit edilmiştir (Dadachova vd., 2007). Çernobil kazası sonrası nükleer reaktörler içerisindeki mikrobiyota fungal melanogenesis ve bu fungal organizmaların ekstrem çevre koşullarında hayatta kalmasıyla ilgili çarpıcı ilişkileri göstermektedir (Mironenko et al 2000). Kazadan beri çernobil etrafındaki toprakta siyah fungusların yayılımı çarpıcı bir biçimde artmıştır. Alternaria alternata nın da bulunduğu 37 nin üzerinde fungus türü hasarlı reaktörlerde tanımlanmıştır (Zhdanova vd., 2000). Şekil 1.5. Çernobil reaktörlerinin genel görüntüsü. 1; Nükleer güç santrali: patlamadan hemen sonra 4 birimin helikopterden görüntüsü. 2;Yeniden onarılmış ve korumaya alınmış alanın dıştan görünümü 10 yıl sonra (1996). 3; Santralin iç kısmının genel bir görüntüsü. Sağ taraftaki duvarda fungal büyüme görünmekte. 4; İnceleme ve örnek alma işlemi (Zhdanova vd., 2000). 12

29 Nükleer güç santralinden tanımlanan funguslar radyoaktif kontaminasyon seviyesine ve yayılım sıklığına göre üç gruba ayrılmıştır (Çizelge1.2.); (1) Bütün radyoaktif seviyeler ile kontamine olmuş alanlarda sıklıkla bulunan funguslar: Aspergillus fumigatus, Cladosporium sp., Doratomyces stemonitis, Fusarium oxysporum, F. solani, ve Stachybotrys chartarum ; (2) Sadece çok yüksek radyasyon ile kontamine olmuş alandan izole edilen funguslar (40±220 mr h -1 ): Alternaria alternata, Aspergillus avus, A. fresenii, A. ochraceus, A. ustus, Beauveria bassiana, Geotrichum candidum, Paecilomyces variotii, Penicillium citrinum, ve Phialophora melinii (3) Düşük radyasyon ile kontamine olmuş alandan izole edilen funguslar (1.5±25 mr h 1 ): Chrysosporium pannorum, Fusarium merismoides, Geotrichum sp., Mucor plumbeus, orange sterile mycelium, Penicillium chrysogenum, P. hordei, P. ingelheimense, Sydowia polyspora ve Ulocladium botrytis (Zhdanova vd., 2000). 13

30 Frekans (%) mr h mr h -1 Acremonium strictum ,2 Alternaria alternata Aspergillus avus - 11,1 A. fumigatus 6,7 11,1 A. niger 13,4 22,2 A. ochraceus - 11,1 A. ustus - 11,1 Aureobasidium pullulans 20, A. versicolor 26, Beauveria bassiana - 11,1 Botrytis cinerea 13,4 11,1 Chaetomium globosum 20,1 22,2 Chrysosporium pannorum 6,7 - Cladosporium cladosporioides 26,8 11,1 C. herbarum 20, C. sphaerospermum Cladosporium sp. 6,7 11,1 Doratomyces stemonitis 6,7 11,1 Fusarium merismoides 6,7 - F. oxysporum 6,7 11,1 F. solani 13,4 11,1 Geotrichum candidum - 11,1 Geotrichum sp. 6,7 - Mucor plumbeus 6,7 - Paecilomyces variotii - 11,1 Penicillium chrysogenum 6,7 - P. citrinum - 11,1 P. hirsutum 6, P. hordei 6,7 - P. ingelheimense - Phialophora melinii - 22,2 Stachybotrys chartarum 6,7 11,1 Sydowia polyspora(as the Dothichiza anamorph) 6,7 - Ulocladium botrytis 6,7 - Turuncu steril miseller (orange sterile mycelium) 13,4 - Beyaz steril miseller (white sterile mycelium) 6,7 22,2 Çizelge 1.2. Çernobil nükleer güç reaktörlerinin farklı radyasyon seviyelerinde kontamine olmuş 4 farklı reaktöründen izole edilen mikrofungusların kontamine alanlarda bulunma sıklığı. 14

31 Şekil 1.6. Çernobil deki 4 reaktörden alınan karışık kültürler (Zhdanova vd., 2000). 1. İncelenen lokasyonlarda sıklıkla bulunan funguslar: Acremonium strictum ve Aureobasidium pullulans. 2. Dördüncü reaktörden alınan kültür: Sydowia polyspora. 3. Kablo üzerinden izole edilen kültürler: Penicillium chrysogenum, Stachybotrys chartarum, Chrysosporium pannorum. 4. Düşük radyasyonla kontamine olmuş alandan izole edilmiş funguslar: Penicillium hirsutum, Cladosporium cladosporioides ve Alternaria alternata Melanin Tipleri ve Melanin Sentez Yolakları Melaninler, bütün biyolojik alemlerin içerisindeki türlerde bulunan multifonksiyonel pigmentlerdir (Hill, 1992). Organizmalarda bulunan melanin tür ve sentez yolakları açısından farklılık göstermektedir. Melanin prokaryotlardan ökaryotlara, bakterilerden insana kadar görülebilen canlılar arasında ortak olarak bulunan bir pigmenttir. Ama organizmalarda bulunan melanin tipleri ve sentez yolları birbirinden farklıdır. Melaninler genellikle siyah veya kahverengi pigmentler olarak bilinse de diğer renkler de oluşturabilmektedir. L-DOPA dan (3,4-dihidroksifenilalanin) köken alan pigmentler siyah veya kahverengidir ve ömelanin olarak tanımlanırlar. Sarı veya kırmızımsı melaninler, sistein ile L-DOPA içerirler ve feomelaninler olarak adlandırılırlar. Homojentisik asitten tirozinaz aracılığıyla sentezlenen kahverengimsi 15

32 melaninler piyomelaninler olarak tanımlanır. Allomelaninler, di-hidroksinaftalenin di-(dhn) veya tetrahidroksinaftalenin (DHN) oksidasyonu ve polimerizasyonu ile ortaya çıkmış, melanin polimerlerinin en az incelenmiş ve bilinen en heterojen grubudur. Flaviolin üzerinden DHN melaninlerinin çeşitli renklerdeki polimerleri, homogentisic asit (pyomelaninler), γ-glutaminyl-4-hydroxybenzene, 4- hydroxyphenylacetic asit, katekollerin çeşitli renklerdeki polymerlerinin üretimi pentaketid yolak aracılığıyla sağlanmaktadır (Gibello vd., 1995; Kotob vd., 1995; Espin vd., 1999; Funa vd., 1999; Jacobson, 2000). Asetattan poliketid sentaz yolağı aracılığıyla sentezlenen allomelaninler ise genellikle siyah veya kahverengidir ve dihidroksinaftalen (DHN) melaninler olarak da bilinirler (Alp,2000). Funguslarda bulunan en önemli melanin tipleri 1,8-dihidroksinaftalen (DHN-melanin) ve DOPAmelanindir. Bazı funguslar (ör: Cryptococcus neoformans) ekosistemde varolan DOPA nın oksidatif çapraz bağlarından melanin üretmektedir (Butler ve Day, 1998). Ama ekonomik olarak önemli ve geniş yayılım gösteren Alternaria, Cochliobolus, Colletotrichum, Gaeumannomyces, Magnaporthe ve Verticillium gibi fungus türlerinin de içinde bulunduğu bitki patojenleri 1,8-dihydroxynaphthalene (DHN)'den melanin sentezlerler (Kubo ve Furusawa 1991; Tanabe vd., 1995). İnsan deri mukozlarına neden olan birçok fungus (ör.exophiala dermatitidis, Sporothrix schenckii) da DHN melanin üretmektedir (Dixon vd., 1991; Nosanchuk vd., 1998; Schnitzler vd., 1999). Şekil 1.7. Ömelanin sentez yolağı (Plonka ve Grabacka, 2006). 16

33 Şekil 1.8. Feomelanin sentez yolağı (Plonka ve Grabacka, 2006). Şekil 1.9. A- Allomelanin sentez yolağı (DHN melanin sentezi) B- Tirozinazdan pyomelanin sentezi (Plonka ve Grabacka, 2006). 17

34 Memelilerde melanin sentezi, tirozinaz tarafından katalize edilmekte ve melanin sentez yolağında tirozin veya dihidroksifenilalanin kullanılmaktadır. Mikroorganizmalarda ise melanin, fenoloksidazlar (tirozinaz, lakkaz, katekolaz) ve/veya poliketid sentaz yolağıyla sentezlenmektedir. Tirozinazların aksine lakkazlar tirozini 3,4-dihidroksifenilalanine (L-dopa) dönüştüremez (Nosanchuk ve Casadevall, 2003). Lakkaz ise fenolik substratlardan melanin sentezini katalizlemektedir (Messerschmidth ve Huber,1990). DHN melanin üreten funguslar bu sekonder metaboliti polyketid sentez yolağıyla yaparlar. Funguslarda bu yolla sentezlenen melaninin organizma içerisindeki konumu çok fazla bilinmemesine karşın 1,8 DHN nin sitoplazma içerisinde sentezlendiği ve ardından hücre duvarı içerisine, oradan da lakkaz tarafından katalizlenen son polimerizasyon basamağı sonrasında ekstraselüler matrikse ihraç edildiği düşünülmektedir (Bell ve Wheeler, 1986; Butler ve Day,1998) Polyketid Sentaz Yolağı ve Trisiklazol Fungusların ticari açıdan önemli birçok tarım ürününe zarar verdiğinin anlaşılmasından beri funguslarda pigment biyosentezi ile ilgili birçok çalışma kahverengi ve siyah funguslar üzerine yoğunlaşmıştır. Bilinen bazı insan ve bitki patojenleri polyketid yolağıyla öncüllerden melanin sentezlemektedir. Bunlardan bazıları: Aspergillus nidulans, A. niger, Alternaria alternata, Cladosporium carionii, Exophialajeanselmei, Fonsecaea compacta, F. pedrosoi, Hendersonulatoruloidii, Phaeoannellomyces wernickii, Phialophorarichardsiae, P. verrucosa, Wangiella dermatitidis ve Xylohyphabantiana dır (Taylor vd., 1987; Wheeler,. 1983; Wheeler ve Bell, 1988). 1,8-DHN melanin sentezinde ilk basamakta öncül madde olarak kullanılan asetattan 1,3,6,8-tetrahidroksinaftalen (tetrahydroxynaphthalene) (1,3,6,8-THN) sentezlenmektedir. Ardından sistalon a (syctalona) indirgenir ve syctalonun dehidrasyonu sonucu da 1,3,8-trihydroxynaphthalene (1,3,8-THN) oluşmaktadır. 1,3,8-trihydroxynaphthalene (1,3,8-THN) redüksiyon ve dehidrasyon basamakları sonrası 1,8-dihydroxynaphthalene (1,8-DHN) dönüşmektedir. Sonuç olarak da DHN melaninin polimerizasyonu ile 1,8-DHN melanin oluşumu tamamlanmaktadır (Tsai vd., 1999). 18

35 Şekil ,8 DHN melanin üretim basamakları (Tsai vd., 1999). 19

36 Melanin, patojen mikroorganizmaların virülansında artışa neden olarak bu organizmalarla mücadeleyi güçleştirmektedir. UV-C ve gama radyasyon gibi sterilizasyon için kullanılan ışınların bile melaninli fungusları yok etmede yetersiz kalması, insan patojeni olan pek çok fungusun gitgide antifungal ilaç duyarlılığının azalması sonucu fungusa direçlilik sağlayan melanin pigmentini inhibe ederek mücadele etme yöntemleri önem kazanmıştır. Sentetik melanin ile inkübe edilmiş amfoterisin B ve sentetik melanin ile inkübe edilmiş kaspofungin ile yapılan zamana bağlı letalite çalışmasında C.neoformans için belirlenen sağ kalım oranları, melanin ile işlem görmemiş amfoterisin B ve kaspofungin uygulandığında belirlenen sağ kalım oranlarına göre belirgin olarak daha yüksek bulunmuştur (Nosanchuk ve Casadevall, 2006; Van vd., 2002). Özellikle uzak doğuda önemli bir besin kaynağı olarak prinç bitkileri kullanılmaktadır. Bu bitkilerde ekonomik kayıplara sebebiyet veren rice blast hastalığı etkeni Magnaporthe grisea ya karşı fungusit olarak kullanılan isoprothiolane ve kitazin P (IBP) (phosphatidy choline biyosentezini inhibe eden bir organofosfata (Ou, 1985; Katagiri ve Uesugi, 1977) alternatif olarak trisiklazol (Tricyclazole) kullanılmakta ve başarılı sonuçlar elde edilmektedir (Zhang vd., 2009). DHN melanin sentezi inhibitörü trisiklazol (Tc) sentez sırasındaki iki redüktaz basamağını da inhibe eden bir agrokimyasaldır (Howard ve Valent, 1996). Şekil Fungusit olarak kullanılan trisiklazol (Tc) polyketide sentez yolağı vasıtasıyla üretilen DHN melanin sentezini iki basamakta inhibe edebilir (Howard ve Valent, 1996). 20

37 Trisiklozolün melanin üretimini inhibe etmesi sonucu oluşan turuncu kırmızı ve kahverengi birkaç pigment kimyasal olarak henüz tam anlamıyla belirlenememiştir ama trisiklozol varlığında üretilen fungusta DHN-melaninden salınan 2 -hydroxijuglon, flaviolin gibi bileşiklerin oksidasyon ürünlerinin artış gösterdiği belirtilmektedir (Butler vd., 2009; Okamoto vd., 2001) Melaninin Hücrelerdeki Yerleşimi Melaninin hücrelerdeki yerleşimi organizmalar arası farklılık göstermektedir. Memelilerde melanin, özel vakuoller olan melanozomlarda yer almaktadır (Nosanchuk ve Casadevall, 2003). Mikrobiyal melaninler ise hücre içinde veya hücre dışında bulunabilmektedir. Alternaria spp. de DHN melanin sitoplazmada sentezlenmekte ve hücre duvarına taşınarak burada lakkaz tarafından polimerize edilmektedir (Thomma, 2003). Mikrobiyal melanin en fazla hücre duvarının dış tabakasında bulunmaktadır. Aynı zamanda C. neoformans, Cochliobolus sp. ve Alternaria sp. gibi türlerde ise melanin, konidyalarda da bol miktarda sentezlenmektedir (Takano vd., 1997). Hücre duvarında bulunan melanin, aynı boyutta, çok sayıda farklı granüllerden oluşmakta ve bu granüler yapı çeşitli bileşiklere bağlanmaya olanak tanıyan yüzeyin geniş olmasını sağlamaktadır (Nosanchuk ve Casadeval, 2003). Bitkilerin patojenik fungal parazitleri, geliştirdikleri melanize konidyalar veya appresorya adı verilen özelleşmiş organelleri aracılığıyla, bitki yüzeylerine adezyonunu ve konakçı dokuları içine hiflerin penetrasyonunu kolaylaştırmaktadır (Howard ve Valent, 1996). Ayrıca appresoryumlardaki melanin aracılığıyla gerçekleşen basınç artışı ve bu yüksek basıncın neden olduğu itici güç patojenin konakçı bitki içerisine mekanik penetrasyonunu da sağlamaktadır (Howard ve Ferrari, 1989). Melanin biyosentezinin inhibe edilmesi ile fungus yüksek basınç oluşturamaz ve böylece appresoryalar konakçı dış zarına penetre olamaz (Kubo ve Furusawa, 1991). Melanin çeşitli mekanizmalarla mikroorganizmaların virülansında artışa neden olarak tarımsal ya da tıbbi açıdan patojeniteye neden olan organizmalarla mücadeleyi zorlaştırmaktadır. UV-C, gama radyasyon gibi sterilizasyon için kullanılan ışınların, kaspofungin ve amfoterisin B gibi antifungal 21

38 ilaçların mücadelede yetersiz kalması, melaninin etkili ilaç geliştirilmesinde ideal bir hedef molekül durumuna gelmesine neden olmuştur (Kubo ve Furusawa, 1991) Ultraviyole Radyasyon Elektromanyetik radyasyonun ana kaynağı güneştir. Gama, X, ultraviole ışınları (mor ötesi), görünür ışık, infrared ışınlar, mikrodalgalar ve radyo dalgaları elektromanyetik radyasyonu oluşturmaktadır. Radyasyon iyonize ve iyonize olmayan radyasyon olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. İyonize radyasyon, parçacık olarak adlandırılan belli bir kütleye ve enerjiye sahip çok hızlı hareket eden parçacıklarla (alfa, beta ve nötron), belli bir enerjiye sahip ancak kütlesiz olan dalga tipi radyasyondan (gama ve X ışınları) oluşmaktadır. İyonize olmayan radyasyonun (mikro dalgalar, görünür ışık, kızıl ötesi, radyo dalgaları, UV) ise sadece dalga tipi bulunmaktadır (Bülbül, 2003). Ultraviyole (UV) radyasyon, güneşten gelen ışık enerjisinin bir şeklidir. Güneş elektromanyetik spektrum diye bilinen bir dizi enerji yayar. Enerjinin değişik şekilleri, dalga boylarına göre sınıflandırılmaktadır. En kısa dalga boylu radyasyon en fazla enerjik olandır. UV radyasyonu nm arasında UVA, nm arasında UVB ve nm arasında UV-C olmak üzere üç kategoride sınıflandırabilir (Boğaziçi, 2000). Ultraviyole (UV) radyasyon, yeryüzüne erişen güneş enerjisinin bir parçasıdır. Yeryüzüne ulaşan güneş radyasyonunun yaklaşık % 5' ini oluşturur ve dalga boyları nm arasındadır. Aralığın % 95-98'i UVA, % 2-5'i UVB'dir, UV-C yeryüzüne ulaşmadan stratosferik ozon tabakasında emilmektedir. Eğer normalin üstünde miktarda UV dünyaya ulaşsaydı, en kısa dalga boylu UV radyasyonu (UV-C) canlılar üzerinde çok ciddi boyutlarda biyolojik zarara neden olabilirdi (Karaduman, 1999). UVA, UV radyasyonun en az zararlı şeklidir ve ozon tabakasının içinden doğrudan geçerek dünyaya büyük oranlarda ulaşmaktadır. UVB radyasyon potansiyel olarak çok zararlıdır. Güneşin UVB radyasyonunun çoğu stratosferde ozon tarafından yutulur. UV-C radyasyon ise çok enerjik olduğundan canlılar üzerinde potansiyel olarak bilinenen en zararlı iyonize olmayan ışındır (Berkow, 1997). Stratosferik ozondan başka güneş ışınlarının yeryüzüne eğik veya dik gelmesi, yeryüzüne ulaşan UV radyasyon miktarını etkileyen faktörlerden biridir. Bunun yanında, güneşin gün içerisindeki konum değişikliği de, atmosfer içerisinden 22

39 geçen UV radyasyon miktarını etkilemektedir. Güneş gökyüzünde alçak olduğunda, sabah ve akşam saatlerinde ışınlar atmosfer içerisinde daha uzun bir mesafe kat etmektedir ve su buharı ile diğer atmosferik bileşenler tarafından saçılmaya uğrayabilir ve yutulabilirler. Güneş kendisinin en yüksek noktasında olduğunda (öğlen), yani gün ortası civarında UV'nin daha büyük miktarları dünyaya ulaşır. Ayrıca topoğrafik yükseklik de etkilidir. Bulut dünya yüzeyine erişen UV radyasyonun miktarı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. İnce bulut örtüsünden çok daha fazla UV radyasyon geçişi olur (Boğaziçi, 2000). Yağış koşulları ve hava kirliliği de UV taşınım miktarını azaltmaktadır. Zararlı UVB radyasyonu statosferik ozonun konsantrasyonuna bağlı olarak yer yüzeyine ulaşır. UVB 'nin yer yüzeyine ulaşmasını stratosferik ozon, bulutlar, havada asılı kalan partiküller ve aerosoller engellemektedir. Bulutlar, UV ışınlarını değişik yönlerde absorbe edip dağıtmaktadırlar (Lubin, 2002; Mutlu vd., 2003) yılında Westinghouse UV lambalarının geliştirilmesi ve germisidal etkilerinin kanıtlanması için çalışmalar yapmıştır. Sonuç olarak ultraviole ışınlarının bakteriler, virüsler, funguslar gibi organizmalar üzerinde inaktive edici etkisi olduğu kanıtlanmıştır. UV ışığı, ışık kaynağı olarak kullanılan lambalarda cam tüp içerisindeki düşük basınçlı civa buharının içinden akan elektrik akımı sayesinde üretilir. Elektromanyetik radyasyon mikroorganizmalar için zararlıdır. Gama, X ve UV ışınları gibi düşük dalga boylu, yüksek enerjili elektromanyetik radyasyonlar organizmaya temas ettiğinde enerji hücreler tarafından absorbe edilir ve hücreye zarar vererek hücre ölümüne neden olabilir (Özkütük, 2007). UV ışınları (germisidal) herhangi bir mikroorganizmayı öldürmek için ısıya gereksinim duymazlar bu sebeple mikrobiyal kontrollerde uzun süredir yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Ancak funguslardaki radyasyon dirençliliği melaninli fungusların gıda sterilizasyonu için uygulanan gama radyasyon ya da UV-C gibi ışınlarla yok edilememesine yol açmaktadır (Dadachova ve Casadevall, 2008). 23

40 Şekil Elektromanyetik spektrum (Güler 1991) nm dalga boyu, UV ışınının en etkin olduğu bölgedir. DNA, bu dalga boyunu güçlü bir biçimde absorbe etmektedir. Absorbe edilen UV ışınının enerjisi, bitişik timin bazları arasında kovalent bağ oluşturarak timin dimerlerini meydana getirmektedir. Oluşan timin dimerleri DNA ipliklerinde katlanmalara neden olmakta, böylece DNA nın helikal yapısı bozulmaktadır. Bu durumda hücre bölünmesi öncesi kromozom replikasyonu güçleşir. Kromozom, replikasyonu yapılabilse dahi mutant hücreler meydana gelmektedir. Timin dimerleri, DNA replikasyonunu engellediğinde öldürücü olmaktadır. Bazı organizmalar DNA hasarını onarabilir ve tekrar üreyebileceği aktif bir duruma dönebilir. UV ışın şiddeti yoğun olduğunda hasar büyük olur ve onarım imkansızlaşır (Sizer ve Balasubramaniam, 1999; Guerrero ve Barbosa, 2004; Franz ve ark., 2009; Koutchma, 2009). Aynı zamanda UV ışınları serbest radikaller meydana getirerek hücrelerde oksidatif strese neden olurlar. Oluşan bu serbest radikaller hücrede 24

41 biyomoleküllere hasar vererek, hücrenin bütünlüğünün bozulmasına, yaşlanmasına ve hücre ölümüne neden olabilmektedirler. Şekil UV-C ışınlarının DNA üzerine etkisi (Herring, 2010). UV ışınının ışıma süresi veya şiddeti arttıkça vejetatif hücre ölümü fazlalaşır. Birim alana verilen ultraviole ışınının enerjisinin ölçü birimi mikrowattır. Sistemler genellikle µw/cm µw/cm 2 ışın yoğunluğunu sağlayacak şekilde dizayn edilmektedirler. Başlatıcı reaksiyonlar (Fiziksel Kademe) İyonlaşmalar Uyarılmalar Biyomoleküler bozukluklar (Kimyasal Kademe) Serbest radikaller Nükleik asitler ve proteinlerde hasarlar Biyolojik bozukluklar (Biyoloji Kademe) Hücre ölümü Organizma ölümü Mutasyonlar Kanser oluşumu Çizelge 1.3. Canlılarda radyasyon bozukluklarına yol açan olaylar (Özalpan, 2001) UV Radyasyon ile Melanize Fungus Habitatlarının İlişkisi Melanize funguslar ve sporları yeryüzünde çok geniş dağılım göstermektedir. Atmosfer sıklıkla yüksek oranda (10 4 /m 3 ) fungal spor içermektedir ki bu bakteriyel hücre konsantrasyonlarından çok daha yüksek bir miktardır (Yanagita, 1990). Havada bulunan fungal sporların baskınlığı ve bulunma sıklığı tüm dünyada rapor edilmiştir. Örneğin İspanya da baskın cins olarak Cladosporium, Ustilago, Pleospora (Herrero vd., 2006), İsrail ve Türkiye de sırasıyla Cladosporium, Alternaria (Waisel 25

42 vd., 1997; Sen ve Asan, 2001), Litvanya da Cladosporium, Alternaria, Aspergillus niger (Lugauskas vd., 2003), Brezilya da Cladosporium, Leptosphaeria, Alternaria (Zoppas vd., 2006), Afrika da (Cladosporium, Alternaria, Arthrinium, A. niger (Prospero vd., 2005) funguslarının sıklıkla bulunduğu rapor edilmiştir (Horikoshi, 2011). Hücre duvarlarındaki koruyucu melanin ve melanin benzeri pigmentasyon sayesinde fungal sporlar UV radyasyon hasarına bakteri hücrelerinden daha dirençlidir. Bitki yaprakları çeşitli fungal biyotaların gelişimi için çok uygun bir ortam sağlamaktadır. Bitki yaprağı mikobiyotasındaki melanin içeren fungusların yüzdeleri hesaplandığında (Ellis ve Ellis in Klasik kitabında) Britanya adalarındaki bitkiler üzerinde 4300 tür tanımlanmıştır; bu türler içerisinde melanize türlerin ezici bir çoğunlukta olduğu (% 95) belirlenmiştir (Ellis ve Ellis, 1997). Portekiz in Akdeniz kıyılarındaki bitkilerden elde edilen mikrofungal komünitelerde (Pereira vd., 2002) ise melanin içeren türler (Aureobasidium pullulans, Cladosporium cladosporioides, C. spherospermum, Alternaria alternata) toplam fungal izolatların % 80 ini oluşturmaktadır. Bitki örtüsünden yoksun kayalık yüzeylerde, sıcak ve soğuk çöllerde aynı zamanda yüksek dağlarda görülen karasal yüzeyler, üzerinde yaşayan organizmaya ekstrem ve zorlu bir yaşam ortamı sağlamaktadır (Shilo, 1978). Ama bu ekstrem koşullara rağmen kayalık yüzeyler serbest yaşayan mikroskobik fungusların çok özelleşmiş bir grubu tarafından ısrarla yaşama alanı olarak kullanılmaktadır (Staley vd., 1982; Sterflinger ve Krumbien, 1995; Gorbushina, 2003). Kaya yüzeylerinde yaşayabilen bu funguslar MCF (microcolonial fungi) olarak adlandırılan çok küçük koloniler oluşturmaktadırlar. Mikrokoloniyal funguslar hücre duvarlarında yüksek konsantrasyonda siyah pigment bulundurarak yüksek UV radyasyona rağmen hayatta kalabilmekte hatta büyümeye devam edebilmektedir (Urzi vd., 1995). UV radyasyonun toprağın sadece 100 mikron derinliğine nüfuz edebildiği bilinmektedir (Johnson, 2003). Ama toprağın güneş ışığına maruz kalan üst tabakası ise mikrofungal komineteler için çok önemli bir yaşama ortamıdır. Hemen hemen analiz edilmiş tüm çöl topraklarında da koyu renkli mikrofungusların baskınlığının tesbit edilmesi şaşırtıcı olmamaktadır (Ranzoni, 1968; Christensen, 1981; Halwagy vd., 1982; Skujins, 1984; Abdullah vd., 1986; Hashem, 1991; Ciccarone ve Rambelli, 1998; Mulder ve El-Hendawy 1999, Zak, 2005). İsrail Gazze yakınlarındaki Negev çölünde incelenen mikrofungus türlerinin % 55 i melanin 26

43 içeren mikrofunguslardır ve yayılım sıklığı da çok yüksektir (% farklı lokalitelerde). Bu funguslar Ulocladium atrum, U. botrytis, A. alternata, ve A. chlamydospora olarak belirlenmiştir (Ellis, 1971; Ellis, 1976). Fungusların çok hücreli spor morfolojileri ile birlikte melanin pigmentasyonu, çöldeki yüksek UV radyasyon, ekstrem sıcaklıklar ve kuraklığa rağmen çöl toprak mikobiyotasının yaşayabilmesini sağlamaktadır. A B Alternaria alternata Ulocladium atrum Şekil Negev çölü merkezindeki Nahal Nizana bölgesinden alınan örnekler; A. Toprak yüzeyindeki mikrofungal kominiteler (0-0,2 cm), B. 0,2-5cm lik derinlikten izole edilen mikrofungal kominite (Horikoshi, K., 2011). Çöl toprağının üst tabakasında yüksek sıcaklık ve UV radyasyon maruziyetine rağmen yaşayabilen çok hücreli konidyalı, melanin içeren fungus türleri bulunmakta (U. atrum, A. alternata, Embellisia phragmospora, Stemphyllium, Pleospora tarda) iken tabakanın sadece 0,2 cm altında ise açık renkli fungus türlerinin (Aspergillus, Penicillium, Fusarium ve Mortierella) kolonize olduğu görülmektedir (Horikoshi, K., 2011) Melaninin Reaktif Oksijen Türleri ve Antioksidanlarla İlişkisi Melaninin polimerik yapısı, oksidasyon ve redüksiyon olaylarının eş zamanlı gerçekleşmesini sağlamaktadır. Melanin pigmentinin kinon (quinon) kısımlarının pigmentin bu redoks potansiyelinden sorumlu olan kısımları olduğuna inanılmaktadır (Turick vd., 2011). İyonize ya da iyonize olmayan radyasyon melanin bulunduran fungus türlerinde pigmentin elektron yapısında değişiklikler meydana getirerek 27

44 radyasyonun neden olduğu ortaklaşmamış elektronlara karşı elektron tutucu (elektron akseptörü) olarak görev yapmaktadır (Coates vd., 2002). Melaninin elektron alıcı olarak görev alması serbest elektronların hedef biyomoleküllere enerji aktarımını engelleyerek moleküllerin yapısal olarak bozunmasını da önlemektedir. Melanin, radyasyon maruziyeti sonucu oluşan eşlenmemiş elektronları yakalayarak oksijenin tekil oksijene dönüşmesini de engelleyebilmektedir. Hatta melaninli funguslar radyasyon uygulandığında çok çeşitli ekstraselüler indirgeyiciler de üreterek hücre zarından melanine elektron transferi sırasında devam eden oksidasyon maruziyetine karşı pigmente yeterli redüksiyon gücü bile sağlamaktadır (Turick vd., 2011). Gama radyasyon melaninin dönüşümlü oksidasyonuna neden olarak, melaninin NADH a okside olabilme yeteneğini artırmaktadır (Dadachova vd., 2007). Bu sayede melanin miktarı fazla olan organizmaların ekstrem koşullara karşı dayanıklılığı da artmaktadır. Şekil Melaninin mikroorganizmalarda solunum zinciri sırasındaki elektron tutucu özelliğinin olası fonksiyonlarının şematik gösterimi (Plonka ve Grabacka, 2006). Canlılar ışınlandırıldıklarında radyasyon enerjisinin büyük oranda hücredeki su molekülleri tarafından absorplanması olasılığı çok yüksektir. Radyasyonun etkisi ile su molekülleri iyonlaşırlar ya da uyarılırlar. İyonlaşma ile pozitif yüklü bir iyon ve hızlı bir serbest elektron oluşur (Özalpan, 2001). 28

45 H 2 O H 2 O + + e - Bu olayı izleyen çeşitli sekonder reaksiyonlar ile değişik tipte serbest radikaller meydana gelirler. Yaklaşık sn sonunda serbest elektron birçok sekonder iyonlaşma olayına yol açarak enerjisini kaybeder ve ortamda su molekülleri tarafından sarılarak hidrat elektron (e - aq) haline geçer. Pozitif yüklü iyon ise, bir hidrojen iyonu ile bir hidroksil radikali (. OH) oluşturacak şekilde ayrılır. Bu olaylarla birlikte bir hidroksil radikali de meydana gelebilir (Özalpan, 2001). e - H 2 O + e - aq + H + H. e - aq H + +. OH. OH ve H. radikalleri su moleküllerinin uyarılması ve uyarılmış molekülün ayrılması ile de meydana gelebilir. Ayrıca oluşan bu reaktif türler kendi aralarında reaksiyona girerek hidrojen peroksit gibi çok reaktif bir molekül de oluşturabilirler (Özalpan, 2001). H 2 O H 2 O* H. +. OH H. + H. H 2. OH +. OH H 2 O 2 H. +. OH H 2 O Serbest radikaller diğer su molekülleri ile de reaksiyona girebilir ya da kendi aralarındaki reaksiyonlar sonunda ortaya çıkan ürünlerle de tekrar reaksiyona girebilir (Özalpan, 2001). H 2 O + H. H 2 +. OH H 2 O 2 +. OH H 2 O + HO 2. Sonuç olarak canlılar yaklaşık % oranında su içerdiği için, indirekt etkiler direkt etkilerden daha önemlidir ve radyasyon hasarlarının büyük ölçüde indirekt yoldan olduğu kabul edilmektedir. 29

46 Melanin pigmenti güçlü bir antioksidan özelliğe sahiptir. Antioksidanlar çeşitli nedenlerle oluşan reaktif oksijen türleri (ROT) ile denge sağlayarak, organizmayı oksidatif strese karşı korumaktadır. Bu savunma patojenik mikroorganizmalar için çok daha büyük önem taşımaktadır; çünkü patojenler sadece kendi ürettikleri ROT lara maruz kalmayıp buna ek olarak konakçının savunma için ürettiği ROT lara da maruz kalır. Eğer bir parazit, konakçının dokularına zarar vermek amacıyla reaktif oksijen türlerinin yıkıcı etkisini kullanırsa ROT ların kendi hücrelerine zarar vermesini engellemek için koruyucu mekanizmalarının patojen olmayan organizmalara göre çok daha güçlü olması gerekmektedir (Gessler vd., 2007). Bu yüzden oluşan yüksek radikal miktarına karşı organizmaların antioksidan mekanizmalarına ek olarak pigment oluşumu gibi adaptasyonlar geliştirme zorunluluğu doğmuştur. Melaninin bulunduğu organizmanın patojenitesini arttırması da bu nedenledir. Melaninin peroksidaz aracılığıyla gerçekleşen oksidasyonu, hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ile reaksiyona girerek hidrojen peroksit miktarında azalışa neden olarak veya pigment enzimlere bağlanıp onları inhibe ederek engellemektedir (Shcherba vd., 2000). Yapılan başka bir çalışmada kurbağalarda ortaya çıkarılan bir mekanizmaya göre çeşitli stres koşulları altında melanin SOD un görevlerini üstlenerek süperoksit iyonlarının dismutasyonunu katalizlemektedir (Jacobson vd., 1994). Ayrıca fenol oksidazın melanin üreten bir enzim olduğu ve melaninin süperoksit iyonlarını tükettiği göz önüne alındığında, melanin fizyolojik anlamda fenol oksidazın regülasyonunu sağlamakta ve SOD un tamamlayıcısı olarak görev almaktadır (Geremia vd., 1984; Sichel vd., 1991). Melanin birçok geçiş metaline bağlanabilmektedir (Swartz vd.,1992; Jacobson, 2000). Melaninin metallere bağlanması hücredeki serbest radikallerin konsantrasyonlarının azalmasına neden olmaktadır. Ayrıca melanin pigmenti hücre için gerekli temel metalleri bağladığı için hücrelerde depo olarak görev almaktadır. Örneğin melanin Fe (II) yi ekstraselüler sıvıda depolayabilmektedir. Pigmentin elektronları dönüştürücü rolleri sayesinde metalleri okside ya da redükte edebilir, tekil elektron transferini kolaylaştırır ya da inhibe edebilir. Bu sayede serbest radikal oluşumuna neden olan metalleri de etkili bir şekilde bağlayabilmektedir. Örneğin Fe (II), zayıf şelatör (ADP) varlığında melanine bağlanarak Fe (II) den ve H 2 O 2 den oluşan hidroksil radikali oluşumunu inhibe edebilmektedir. EDTA (Etilendiaminetetraasetik asit) gibi güçlü şelatörler varlığında ise melanin Fe (II) e 30

47 bağlanamaz, Fe (II) ve H 2 O 2 reaksiyona girer böylece hidroksil oluşumu kaçınılmaz olur (Jacobson, 2000). EDTA şelatörü varlığında melanin Fe(III) miktarında da azalışa neden olur ama bunu Fe(III) e bağlanarak yapmaz; Fe (II) nin H 2 O 2 ile reaksiyona girerek hidroksil radikali üretimi nedeniyle Fe (II) nin ortamdan azalışı sonucu gerçekleşmektedir (Pilas vd., 1988; Jacobson, 2000). Fe (II) + melanin ox Fe(III) + melanin red Yapılan bu deneyler ve bilgiler ışığında melaninin antioksidan sisteme yardımcı görev üstlendiği kanıtlanmıştır. Ayrıca radyasyon koruyucu bir molekül olarak radyasyonun oksidasyon etkisine yıpranma olmaksızın ve uzun süreli bir koruma sağlaması belki de pigmentin en önemli özelliklerinden biri olarak gösterilmiştir (Turick vd., 2011). Melanin belirtilen bu mekanizmalarla organizma içerisinde oluşabilecek ROT ları önleyerek hücreleri oksidatif strese karşı korumaktadır. Bu da neden melanize fungusların radyoaktif izotoplarla kontamine topraklarda bol bulunduğunu (Dighton vd., 2008), hatta düşük dozlarda gama radyasyonun melanize fungus büyümesini stimüle ettiğini ve bazı çalışmalarda fungusların radyasyon kaynağına doğru büyüdüğünü de açıklamaktadır (Dadachova vd., 2007) Reaktif Oksijen Türleri (ROT) ve Oksidatif Stres Serbest radikaller, dış atomik orbitallerinde bir veya daha fazla çift oluşturmamış elektron içeren yüksek enerjili, stabil olmayan bileşiklerdir (Halliwell ve Gutteridge, 1990). Başka moleküller ile çok kolayca elektron alışverişine giren bu moleküllere oksidan moleküller veya reaktif oksijen partikülleri de denmektedir. Bu çiftlenmemiş elektron, serbest radikallere büyük bir reaktiflik kazandırarak protein, lipid, DNA, nükleotid ve koenzimler gibi birçok biyolojik materyale zarar vermelerine neden olmaktadır (Koca ve Karadeniz, 2012). Oldukça küçük bir anaerobik bakteri grubu hariç organizmaların çoğu için oksijen hayati bir önem taşımaktadır. Aerobik yaşamın vazgeçilmez elemanı oksijen, temel enerji seviyesindeki moleküler oksijenin (O 2 ) süperoksit radikali (O.- 2 ), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve hidroksil radikaline (HO. ) dönüşümü nedeniyle toksik 31

48 etkilere de sahip olmaktadır (Fridovich,1998). Hücresel antioksidan düzeyinin çeşitli çevresel ya da biyolojik nedenlerle reaktif oksijen miktarlarına karşı yetersiz kalması sonucu toksik bir etkinin başlaması olayına oksidatif stres adı verilmektedir (Altınışık, 2000). Oksidatif stres, günlük yaşamda oksijenli solunumun kaçınılmaz sonuçlarındandır. Mitokondrilerdeki oksijenli solunumda olduğu gibi ksenobiyotik metabolizması, fagositik aktivasyon, çeşitli sentez ve degradasyon reaksiyonları gibi birçok anabolik ve katabolik işlemler sırasındaki endojen reaksiyonlarla moleküler.- düzeyde reaktif oksijen türleri oluşmaktadır. Bunlardan O 2 radikali iyonize radyasyon ve UV radyasyonu gibi hem çevresel etkenler hem de organizmadaki enzimatik ve enzimatik olmayan tepkimelerle kolaylıkla fazla miktarlarda oluşmaktadır. Canlılarda diğer radikallerin oluşumu çoğunlukla O.- 2 'nin birikmesine bağlıdır ve bir kere bu radikaller biriktikten sonra bir seri zincirleme radikal tepkimeler sonucu diğer radikallerin oluşumu da kaçınılmazdır (Kelly ve vd., 1998) Reaktif Oksijen Türlerinin (ROT) Sınıflandırılması Organizmada pek çok türde ROT oluşmaktadır Süperoksit Radikali Canlılarda diğer radikallerin oluşumu çoğunlukla O.-' 2 nin birikmesine bağlıdır ve bir kere bu radikaller biriktikten sonra bir seri zincirleme radikal tepkimeler sonucu diğer radikaller de oluşur (Kelly vd., 1998). Süperoksit radikali (O.- 2 ) neredeyse tüm aerobik hücrelerde moleküler oksijenin (O 2 ) bir elektron alarak indirgenmesi sonucu oluşmaktadır. Süperoksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez. Bu radikalin asıl önemi, hidrojen peroksit kaynağı olması ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Fe O 2 Fe O 2 Cu + + O 2 Cu O 2 Orbitallerin tek elektron alması ile süperoksit anyonu (süperoksit radikali, O 2 - ), iki elektron alması ile de peroksi anyonu (O 2 2- ) oluşmaktadır (Halliwel ve 32

49 Gutteridge, 1990). O.- 2 bir oksitleyici gibi davranıp bir elektron daha aldığı zaman 2- oluşan O 2 ortamdan iki proton alarak H 2 O 2 oluşturabilir veya O.- 2 aldığı elektronu başka bir elektron alıcıya vererek tekrar oksijene oksitlenip indirgeyici gibi.- davranabilir. Ya da iki O 2 birbiri ile etkileşerek biri oksitlenirken diğeri indirgenir, böylece H 2 O 2 ve O 2 meydana gelir (Nordberg ve Arner, 2001). O O H + O 2 + H 2 O 2 O 2.- 'nin ortamdan temizlendiği bu tepkimeye dismutasyon tepkimesi denir. Süperoksit radikali düşük ph değerlerinde daha reaktiftir, oksidan perhidroksi radikali (HO. 2) oluşturmak üzere protonlanır. H + O -. 2 HO. 2 Süperoksit radikali hem oksitleyici hem indirgeyici özelliğe sahiptir. Örneğin ferrisitokrom c ya da nitro blue tetrazolium ile reaksiyonunda indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve moleküler oksijene okside olur (Özbey, 2009). Sit c (Fe 3 + ) + O 2.- O 2 + Sit c ( Fe 2 + ) Süperoksit radikalinin fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO ) ile birleşmesi sonucu bir reaktif oksijen türü olan peroksinitrit (ONOO ) meydana gelmektedir. Peroksinitrit, nitrit (NO 2 ) ve nitrat (NO 3 ) oluşturmak üzere metabolize edilmektedir. Peroksinitrit, azot dioksit (NO 2 ), hidroksil radikali (. OH ), nitronyum iyonu (NO + 2 ) gibi toksik ürünlere dönüşebilmektedir. Bu nedenle de nitrik oksitin (NO ) zararlı etkileri peroksinitritden kaynaklanmaktadır (Kılınç ve Kılınç, 2002) Hidrojen Peroksit H 2 O 2, oksijenin enzimatik olarak iki elektron ile indirgenmesiyle ya da süperoksitlerin enzimatik veya enzimatik olmayan dismutasyonu tepkimeleri sonucu oluşmaktadır. Yapısında paylaşılmamış elektron içermediğinden radikal özellik taşımaz. H 2 O 2 in oksitleyici bir tür olarak bilinmesinin sebebi demir, bakır gibi metal iyonlarının varlığında hidroksil radikalinin öncülü olarak davranmasıdır. H 2 O 2 ve 33

50 Fe 2+ varlığında Fenton reaksiyonu, süperoksitradikali (O 2 ) varlığında da Haber- Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikalini (. OH) oluşturmaktadır (Koca vd., 2012). O e 2H + H 2 O 2 O 2 + 2e + 2H + H 2 O 2 Hidrojen peroksit özellikle proteinlerdeki hem grubunda bulunan demir ile tepkimeye girerek yüksek oksidasyon düzeyindeki reaktif demir formlarını oluşturur. Bu formdaki demir çok güçlü oksitleyici özelliklere sahip olup, hücre zarlarında lipid peroksidasyonu gibi radikal tepkimeleri başlatabilir. Oksitleyici özelliği nedeniyle biyolojik sistemlerde oluşan H 2 O 2 'nin derhal ortamdan uzaklaştırılması gerekmektedir. Bu görevi hücrelerdeki önemli antioksidan enzimler olan katalaz ve peroksidaz enzimleri yerine getirmektedir (Halliwell, 1984). Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksitin asıl üretimi, süperoksit radikalinin (O.- 2 ) dismutasyonu ile olmaktadır. İki süperoksit molekülünün, dismutasyonu reaksiyonuyla iki proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluşturmaktadır (Özbey,2009). 2 O H + H 2 O 2 + O 2 Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana getirdiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinmektedir, ya spontan gerçekleşir ya da süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından katalizlenmektedir Hidroksil Radikali Oksijen radikalleri içinde en reaktif ve toksik etkili olanı. OH dir.. OH, Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten oluşmaktadır. Ayrıca suyun yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalması sonucunda oluşur. O H 2 O 2. OH + OH - + O 2 34

51 Redoks katalizör olarak işlev gören bir geçiş metali, örneğin şelat yapmış demir varlığında Haber-Weiss tepkimesinin biyolojik sistemlerde de çalıştığı ve önemli miktarda. OH üretildiği bilinmektedir (Ahmad, 1995). O - 2 'nin bir kısmı kendiliğinden dismutasyon ile H 2 O 2 oluşturmakta ve biriken H 2 O 2, O - 2 ile etkileşerek. OH yapmaktadır. İn vivoda. OH yapımına neden olabilen önemli tepkimelerden birisi Fenton tepkimesidir: Fe 2+ + H 2 O 2 Fe OH+ OH - In vivoda. OH üretimi bakımından en önemli tepkime Haber-Weiss tepkimesidir. İn vivoda O -' 2 nin H 2 O 2 ile. OH üretmesi, şelat yapmış demir tarafından katalizlenir. Fe 3+.- (şelat) + O 2 Fe 2+ (şelat) + O 2 Fe 2+ (şelat) + H 2 O 2 Fe 3+ (şelat) +. OH + OH -. OH üretildiği yerde hemen her molekül ile tepkimeye girip radikal tepkimelerini başlatabilir.. OH nin yüksek reaktivitesi nedeniyle istenmeyen toksik etkilerinin yanısıra, üretimleri normal biyolojik fonksiyon için de gereklidir. Fagositoz ve pek çok enzimatik katalizin zorunlu bir parçası olarak. OH üretilir ve kataliz olayına doğrudan katılır. Bazı kimyasal bileşikler, canlıda radikal yapımına neden oldukları için toksik etkilidirler. (Halliwell ve Gutteridge, 1990) Singlet (Tekil ) Oksijen Enerji absorpsiyonu ile oksijenin paylaşılmamış dış elektronları spinlerini değiştirebilirler. Oksijenin bu şekilde uyarılmış durumunda dıştaki iki elektron ayrı ayrı veya aynı orbitali işgal edebilirler. Singlet oksijenin delta formununda iki elektron aynı orbitalde bulunur ve spinleri birbirine zıttır, diğer orbital boştur. 1 O 2 in sigma formunda ise iki elektron ayrı ayrı orbitallerdedir ve dönüşümleri birbirine zıttır. Sigma formunun enerjisi daha fazladır, daha fazla stabildir. Delta formunun yarı ömrünün daha uzun olması (2x10-8 s) nedeniyle gözlenen kimyasal reaktivitelerden delta formunun sorumlu olduğu kabul edilmektedir (Ahmad, 1995). 1 O 2 in her iki formu da aldığı enerjiyi ışık enerjisi halinde vererek eski durumlarına dönebilirler (Yılmaz, 2010). 35

52 Haber-Weiss tepkimesi ile 1 O 2 oluşumu metal O H 2 O 2 1 O 2 +. OH+ OH - 1 O 2 ve. OH nin üretimi tümüyle ortamda O 2.- ve H 2 O 2 in birikmesine bağlıdır (Khan ve Kasha, 1994; Yılmaz, 2010) Reaktif Oksijen Türlerinin Kaynağı Reaktif oksijen türleri organizmada eksojen ya da endojen kaynaklı olabilir. Endojen kaynaklı radikal oluşum mekanizmasının başında elektron transport sistemi gelmektedir. Mitokondrial Elektron Transport Zincirinde makromoleküllerin yıkılmasıyla açığa çıkan elektronlar mitokondri iç membranında bulunan elektron taşıyıcıları aracılığıyla moleküler oksijene aktarılıp su oluşturulur. O 2 + 4H + + 4e - 2H 2 O Elektronların elektron transport zincirinden kaçıp moleküler oksijenle direkt olarak reaksiyona girmesi süperoksit radikalini oluşturur. O 2 +e - O 2.- Mitokondriyal solunum zincirinde akan elektronların yaklaşık olarak %1-2 si bu şekilde toksik bir ürün oluşturmak üzere sızıntıya uğrar. Süperoksit radikallerinin üretimi ve salınımı iç mitokondri membranından sitozolik tarafa doğru olur (Kehrer, 1993). Aminoasit oksidaz, sitokrom oksidaz, monoamin oksidazlar, ksantin oksidaz gibi enzimler de endojen radikal üreten kaynaklardandır. Bunlardan özellikle ksantin oksidaz pürin katabolizmasının en son iki reaksiyonunu katalizleyen enzim olarak.- iskemik koşullarda fazla miktarda O 2 üretir (Tortop, 2007). Enzim, hipoksantini ksantine veya ksantini ürik aside oksitler. Bu reaksiyonda elektron alıcısı moleküler oksijendir (Southorn ve Powis, 1988). 36

53 Hipoksantin+ H 2 O+ 2O 2 Ksantin + 2O H Ksantin+ H 2 O+ 2O 2 Ürik asit + 2O H + Solunum patlaması olayı da radikal üreten başka önemli bir endojen kaynaktır. Nötrofiller fagositoz sırasında, membran ve sitoplazmalarında bulundurdukları NADPH oksidaz ve myeloperoksidaz enzimleri ile hem serbest oksijen radikalleri hem de aşırı okside edici HOCI gibi ajanları üreterek karşılaştıkları virus, bakteri, mantar gibi patojenleri yok ederler. Bu işlemler sırasında hem ana hem de ara ürün olarak çok miktarda ROT oluşmaktadır (Babior, 2000; Tortop, 2007). Şekil Solunumsal patlama ile reaktif oksijen türlerinin oluşumu (Altınışık, 2000). Eksojen serbest radikal kaynaklarının başında radyasyon gelmektedir. Radyasyonun indirekt etkisi atoma enerji transferi sonucu serbest radikaller oluşturarak molekülün parçalanmasını kapsamaktadır. Biyolojik sistemlerdeki temel molekül su olduğu için su genellikle radikal formasyonu ve çoğalması için ortam oluştumaktadır. Su molekülü enerjiyi absorblayınca değerlik kabuğunda paylaşılmamış elektron olan tekil oksijen ve biyolojik sistemler için en tehlikeli olan. OH gibi iki serbest radikale (H. ve. OH) ayrışmaktadır (Tortop, 2007). H-O-H H + + OH - (iyonizasyon) H-O-H H. +. OH (serbest radikaller) (Halliwell, 1994) 37

54 Demir, bakır, kadmiyum, nikel, krom, civa, kurşun gibi metal iyonları da serbest radikal oluşumuna neden olmaktadır. Demir fenton reaksiyonu yoluyla en güçlü serbest radikal olan hidroksil radikallerinin (. OH) oluşmasını sağlarken stabil lipit hidroperoksitlerinin peroksi ve alkoksi radikallerine dönüşümünü hızlandırmaktadır (Halliwell, 1994; Suzer vd., 2000). H 2 O 2 + Fe 3+ HO 2. + H + + Fe 2+ H 2 O 2 + Fe 2+. OH+ OH - + Fe 3+ Geçiş metalleri, lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) parçalanmalarını sağlar ve lipid peroksidasyonunun zincir reaksiyonlarını katalizleyerek radikal oluşturmaktadır. Lipit- OOH + Fe +2 (Cu + ) + Fe +2 (Cu +2 ) + OH O Lipit- Lipit- OOH + Fe +2 (Cu +2 ) Lipit- OO + Fe +2 (Cu + ) + H Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri Serbest radikaller hücrelerin lipid, protein, nükleik asitler (DNA), karbohidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine etki ederler. Süperoksit radikali (O.- 2 ) ve hidroksil radikali (. OH) sitoplazma, mitokondri, nükleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatır. Membranlarda lipid peroksidasyonu meydana gelmesi sonucu membran geçirgenliği artar. Serbest radikallerin etkisiyle proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer aminoasit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyal DNA okside olur. Eğer serbest radikaller, radikal yok ediciler tarafından yakalanamazlar ise sitotoksisite ortaya çıkar. 38

55 Etkilenen bileşik Doymamış aminoasitler ve kükürt içeren aminoasitler Nükleik asit bazları Karbonhidratlar Doymamış lipitler Kofaktörler Antioksidanlar Proteinler DNA Sonuçlar Protein denatürasyonu Çapraz bağlanma Enzim inhibitasyonu Organ ve hücre geçirgenliğinde değişmeler Hücre değişiminde gelişmeler Mutasyon Hücre yüzey reseptörlerinde değişim Kolesterol ve yağ asitlerinin oksidasyonu Nikotinamit ve flavin içeren kofaktörlerin aktifliğinde azalma Askorbat ve porfirin oksidasyonu α-tokoferol ve β-karoten gibi antioksidanların aktifliğinin azalması Denatürasyon Peptit zincirinde kırılmalar Baz modifikasyonları Zincirde kırılmalar Çizelge 1.4. Hücresel serbest radikallerin etkilediği moleküller (Akpoyraz ve Durak, 1994) Antioksidan Savunma Sistemleri ROT oluşumu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizması vardır. Bu mekanizmalar antioksidan savunma sistemleri veya kısaca antioksidanlar olarak bilinirler. Antioksidanlar serbest radikalleri nötralize etmek için karşılıklı etkileşim halinde olan endergonik ve ekzergonik kaynaklı, çok çeşitli bileşiklerdir. Bu bileşikler enzimatik olmayan antioksidanlar (C vitamini, E vitamini, karotenoidler, glutatyon (GSH), melatonin, selenyum-çinko gibi mineraller, koenzimq10, kareteneoidler, lutein, zeaksantin, astaksantin, likopen, flavonoller, lipoik asit, gibi), antioksidan enzimler (SOD, katalaz, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz gibi), metal bağlayıcı proteinler (ferritin, albümin, laktoferrin, seruloplasmin gibi) ve bitkilerde yaygın şekilde bulunan çeşitli antioksidan fitonutrientlerdir (İşbilir, 2008). 39

56 Şekil Enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanların şeması (Altınışık, 2000). Antioksidanlar etkilerini iki şekilde gösterirler: 1. Serbest radikal oluşumunun önlenmesi; Başlatıcı reaktif türevleri uzaklaştırıcı etki Oksijeni uzaklaştırıcı veya konsantrasyonu azaltıcı etki Katalitik metal iyonları uzaklaştırıcı etki 2. Oluşan serbest radikallerin etkisiz hale getirilmesi; Toplayıcı (scavenging) etki: Reaktif oksijen türlerini (ROT) etkileyerek onları tutma veya çok daha az reaktif başka bir moleküle dönüştürülmesi (örneğin: Enzimler), Bastırıcı (quencher) etki: Reaktif oksijen türleri (ROT) ile etkileşip onlara bir proton ekleyerek aktivite göstermesi (örneğin: Vitaminler), Onarıcı (repair) etki: Hedef moleküllerin hasar sonrası tamir edilmesi (örneğin: Glutatyon), Zincir kırıcı (chain breaking) etki: Reaktif oksijen türlerini ve zincirleme reaksiyonları başlatacak diğer maddeleri kendilerine bağlayıp (örneğin: Fe şelatörleri) zincirlerini kırarak fonksiyonlarını önleyici etki (Özbey, 2009). 40

57 Enzimatik Antioksidanlar Süperoksit Dismutaz (SOD: EC ) SOD, oksijeni metabolize eden bütün hücrelerde bulunan ve O 2.- nin H 2 O 2 e dismutasyonunu katalizleyen bir metalloenzimdir (Fridovich, 1995). SOD O O H + H 2 O 2 + O 2 Bütün canlılardaki SOD enzimleri, kofaktör olarak içerdiği metal iyonuna göre sınıflandırılmaktadır (Fridovich, 1995; Yılmaz, 2010). İntraselüler olarak; prokaryotlarda matrikste Mn-SOD, periplazmik boşlukta Fe-SOD, ökaryotlarda ise sitozol ve nukleusda Cu-Zn SOD bulunmaktadır (Kılıç, 1985). Cu-Zn SOD en yüksek katalitik aktiviteye sahip dismutazdır ve ökaryotik hücre sitozolüne ek olarak eritrositlerde de bulunmaktadır Katalaz (CAT: EC ) H 2 O 2, O 2.- radikalinin dismutasyon ürünlerinden birisi olup peroksidazlar ya da katalaz tarafından detoksifiye edilmektedir. CAT H 2 O 2 2H 2 O +O 2 Hemen hemen tüm aerobik hücrelerde bulunan CAT, birbirinin aynısı dört alt üniteden oluşan yaklaşık 240 kda ağırlığında tetramerik bir moleküldür. Genellikle peroksizomlarda bulunan katalaz, SOD ve peroksidaz gibi enzimlerle birlikte aerobik hücrelerde süperoksit radikalleri ve hidrojen peroksite karşı savunmadan sorumludur (Sonntag, 1992). Bu yüzden de katalaz hücrelerin savunmasında SOD enzimi ile birlikte çok önemli bir görev yüklenmiştir (Kota ve Misra, 2005). 41

58 Glutatyon Peroksidaz (GPx; EC ) Sitosolik glutatyon peroksidaz sitosolde ve mitokondrial matriksde bulunur ve sitotoksik hidroperoksitlerin uzaklaştırılması için çok önemli bir enzimdir. Omurgalı türlerinde enzimin katalitik aktivitesi için bir hidrojen donörü olan glutatyona (GSH) mutlak gereksinimi vardır. Enzim H 2 O 2 i iki H 2 O molekülüne ve membran peroksitlerini (ROOH/LOOH) H 2 O ve herhangi bir etkisi olmayan bir molekül olan alkole (ROH/LOH) indirgemektedir. H 2 O 2 + 2GSH LOOH + 2GSH GPx GPx 2H 2 O + GSSG H 2 O + LOH + GSSG Enzim aynı inkübasyon koşullarında H 2 O 2, etil hidroperoksit, tertbutilhidroperoksit, kümene hidroperoksit, linoleik asit hidroperoksit ve nükleotid veya steroid türevli hidroperoksitleri birbirlerine yakın değerlerde indirgeyebilir. GPx kda ağırlığında tetramerik bir proteindir. Her bir molekül dört selenyum atomu içermektedir. Selenyum, enzimin katalitik merkezinde ve selenosistein selenolat olarak bulunur. Hidroperoksit reaksiyonlarının katalizlenmesi birkaç basamakta yürümektedir. Önce enzimin katalitik merkezi hidroperoksiti indirger ve enzim yükseltgenir, ikinci basamakta, okside enzim bir molekül GSH ile bir kompleks meydana getirir, üçüncü basamakta, kompleks başka bir molekül GSH ı kullanarak enzim başlangıç durumuna dönüşürken iki molekül GSH, okside glutatyonu (GSSG) oluşturarak okside olmaktadır (Ahmad, 1995; Yılmaz, 2010) Glutatyon Redüktaz (GR: EC ) Glutatyon redüktaz, GPx vasıtasıyla hidroperoksitlerin indirgenmesi sonucu oluşan okside glutatyonun (GSSG) tekrar indirgenmiş glutatyona (GSH) dönüşümünü katalize etmektedir. GR GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + 42

59 GSH, çevredeki oksidan moleküllerin etkisini kendi üzerine çekerek hücrenin fonksiyonel proteinlerinin oksidasyonunu engellemektedir. Aynı zamanda oksijen radikallerinin biyolojik moleküllere saldırması sonucunda meydan gelen peroksitleri ortadan kaldırmak için bazı peroksidaz enzimler tarafından da kofaktör olarak kullanılmaktadır. Bunun sonucunda kendisi oksitlenerek okside glutatyona dönüşmekte ve oluşan bu okside glutatyonun da redükte glutatyon haline dönüşümü GR enzimi tarafından katalizlenmektedir (Özbey,2009). 2O 2.- Süperoksit dismutaz Fe 2+ Fe 3+ H 2 O 2 OH. 2H + O 2 2GSH NADP + H 2 O 2 Glutatyon Glutatyon peroksidaz redüktaz GSSG NADPH + H + 2H 2 O+O 2 2H 2 O Şekil Glutatyon redüktaz Glutatyon S-Transferaz (GST, EC ) Glutatyon S-transferazlar (GST), her biri iki alt birimden oluşmuş bir enzim ailesidir. Glutatyon S-transferazlar (GST), başta araşidonik asit ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere lipid peroksitlerine karşı selenyum-bağımsız GPx aktivitesi göstererek bir antioksidan savunma mekanizması oluştururlar. ROOH + 2GSH GST GSSG + ROH + H 2 O 43

60 Glutatyon S-transferazlar (GST) katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyona sahiptirler. Bunlar hem detoksifikasyon yaparlar hem de hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı rolleri vardır. GST'ler, karaciğerde sitokrom P450 enzim sistemi tarafından reaktif ara ürünlere dönüştürülen yabancı maddelerin daha az reaktif konjugatlara dönüşümünü katalizlerler (Özbey, 2009) Enzimatik Olmayan Antioksidanlar Glutatyon (GSH, γ-l-glutamil-l-sistein-glisin) Tiyol grupları, enzimatik reaksiyonlar aracılığıyla ve serbest radikalleri yakalamak suretiyle görev yapan hücresel antioksidanlardır. Tiyol grubu taşıyan bir tripeptid olan glutatyon, serbest radikallerin yıkıcı etkilerini önleyen veya azaltan transferazlar, peroksidazlar gibi birçok enzimin substratı olarak görev yapmaktadır. Suda çözünebilen bir tiyol olan ve birçok hücrede çok yüksek konsantrasyonlarda bulunan glutatyon, biyolojik membranları lipid peroksidasyonuna karşı korumaktadır (Mascio vd., 1991; Koca ve Karadeniz, 2012). Glutatyon aynı zamanda hücre içinde 1 O 2, O 2 -, OH gibi birçok zararlı oksidanla enzim katalizi olmaksızın da reaksiyona girmektedir. Bu sayede hücreleri oksidatif hasara karşı korumakta aynı zamanda da aminoasitlerin transportunda görev almaktadır (Larson, 1988; Koca ve Karadeniz, 2012). 44

61 2. KAYNAK ÖZETLERİ Jacobson ve arkadaşları 1995 yılında yaptıkları çalışmada, 1,8 DHN melanin üreten A. alternata ve Wangiella dermatitidis funguslarının yabanıl ve albino suşları oksidan ajan olarak permanganat, hipoklorit ve hidrojen peroksite maruz bırakılmıştır. Permanganat ve hipoklorit gibi oksidanları, yabanıl suşun albino suşundan daha fazla nötralize edebildiği ve daha yüksek dozlara dayanabildiği saptanmıştır. Wangiella dermatitidis in yabanıl tipinde ise melaninin H 2 O 2 oksidan ajanına karşı fungusu koruyamadığı belirlenmiştir (Jacobson vd., 1995). Belozerskaya ve arkadaşları 2010 yılında yaptıkları çalışmada A. alternata, Cladosporium cladosporoides, Mucor hiemalis, Paecilomyces lilacinus gibi Çernobil reaktörlerinden izole edilen radyotrofik fungusları, H 2 O 2 ve düşük glukoz içeren besiyeri gibi çeşitli stres faktörlerine maruz bırakmışlardır. Oluşturulan yüksek oksidatif stres sonucu fungusların hifsel büyüme oranları, SOD ve CAT enzim değişimleri belirlenmiştir. Bu ekstermofilik fungusların antioksidan enzim aktivasyonu ve melanin üretiminin arttığı tesbit edilmiş ayrıca SOD, katalaz ve melanin gibi antioksidan savunma sistemi mekanizmalarıyla çeşitli stres faktörlerine karşı çok dirençli oldukları belirlenmiştir (Belozerskaya vd., 2010). Zhdanova ve arkadaşları yılları arasında yaptıkları çalışmada; Çernobil reaktörlerinden A. alternata türünü de içeren 37 tür 19 cins barındıran fungus izole edilmiştir. Funguslar nükleer güç santrallerinde izole edildikleri bölgede maruz kaldıkları radyasyon düzeyine göre kıyaslanmıştır. Radyoaktif kontaminasyonun artışına bağlı olarak ağır kontamine alanlarda melanin bulunduran türlerin biyoçeşitliliğinin ve yayılımının arttığı tesbit edilmiştir (Zhdanova vd., 2000). Braghini ve arkadaşlarının 2009 yılında yaptıkları çalışmaya göre tahıl bitkisi üzerine inoküle edilen A. alternata belirli dozlarda gama radyasyona maruz bırakılmıştır. Dünya sağlık örgütü (WHO) verilerine göre 4-6 kgy gıdalardaki fungus varlığını tamamen inhibe ettiği bilinmektedir, ama yapılan bu çalışmada A. alternata nın 5 kgy lik radyasyon dozunda sadece büyümesi yavaşlamış, ancak 10kGy lik radyasyonda fungal büyüme tamamen inhibe olmuştur (Braghini vd., 2009). 45

62 Shcherba ve arkadaşlarının 1999 yılında yaptıkları çalışmada; makromycetes ve mikromycetes grubu içerisindeki bazı funguslardan melanin izole edilmiştir. O- dianisidine (DA) peroksidaz enzimi ile bakteriyofaj-λ DNA sında hasar oluşturulmuştur. DNA daki bu oksidasyon hasarı nükleik asit moleküllerinin çapraz bağlanma hareketlerinin elektroforetik incelemesiyle saptanmıştır. İndirekt karsinojenlerden olan Benzidine (BD) ve methyl (3,3'-dimethylbenzidine, DMBD ve 3,3',5,5' tetramethylbenzidine, TMBD) türevlerinin de fungal melaninler tarafından inhibe edildiği belirlenmiştir. A. alternata dan izole edilen fungal melaninler tarafından benzidine ve türevlerinin 200 µg/ml sinin neden olduğu hasarı iki kat azaltabildiği gözlemlenmiştir (Shcherba vd., 1999). Geng ve arkadaşlarının 2008 yılında yaptıkları çalışmada; farklı dozlardaki UV radyasyonu sonucu DNA plazmiti üzerinde melaninin koruyucu rolünün belirlenmesi amaçlanmıştır. Florometrik ölçümler melaninin, UVA radyasyonu sonucu ortaya çıkan serbest oksijen radikallerini (SOR) pigment konsantrasyonuyla doğru orantılı olarak nötralize edebildiğini gözlemlemişlerdir. Aynı zamanda melaninin UVB radyasyonu altındaki DNA plazmitinin koruyucu etkisi, melanin tarafından korunmayan DNA ya göre 10 kat daha fazla olduğu saptanmıştır. UV-C radyasyonu sonucu oluşan DNA hasarı (zincir kırıkları), laser-induced fluorescence capillary electrophoresis yöntemi ile belirlenmiştir. UV-C altında melaninin koruyucu etkisi olmadan süperkoil plazmit yapısının bulunma yüzdesi % 80 den % 5'lerin altına düşmüştür. Bütün bu sonuçlar göz önünde bulundurulduğunda bakteriyel melaninin UV radyasyonuna karşı DNA da oluşabilecek hasarları önlediği bu çalışmayla saptanmıştır (Geng vd., 2008). Yehia ve Mahmoud un 2004 yılında yaptıkları çalışmada Alternaria alternata, Fusarium verticillioides ve Aspergillus pulverulents fungusları radyonüklid içeren besiyerlerinde üretilmiştir. Fungusların radyoaktif kobalt (Co-60) ve radyoaktif sezyum (Cs-137) alımları ve funguslardan ekstrakte edilen toplam pigment miktarları ayrıca radyoizotoplarla bağlanma yetenekleri de tesbit edilmiştir. A. alternata nın ürettiği melaninin, eklenen toplam radioaktif madde miktarının % 60 ını bağlamayı başardığı saptanmıştır. Bu çalışmada A.alternata radyoizotop alınımı için diğer iki fungusa göre en etkin tür olarak belirlenmiştir (Yehia ve Mahmoud, 2004). Allam ve Abd El-Zaher in 2012 yılında yaptıkları çalışmada Aspergillus fumigatus un miselleri kademeli olarak UV ye maruz bırakılmış ve transmisyon 46

63 elektron mikroskobu (TEM) ile konidya ve miselyumlar gözlenmiştir. Melanin A. fumigatus u 60 dakikalık UVA maruziyetine karşı hayatta kalmasını sağlamıştır. Çalışmanın ikinci aşamasında Bjerkandera adusta dan izole edilen melaninler Candidasis saptanmış deney farelerine verilmiştir. Sonuçlar melaninin immünojenik olabileceğini, Ig M ye takviyede bulunduğunu, immün sistemi uyarabileceğini ve böylece de enfeksiyon derecesini azaltabileceğini göstermiştir. Bu deneyle melanin yardımıyla candidasisin azaldığı ve enfeksiyona yakalanmış farelerde böbrek faaliyetlerini güçlendirdiği saptanmıştır (Allam ve Abd El-Zaher, 2012). Singaravelan ve arkadaşlarının 2008 yılında yaptıkları bu çalışma, İsraildeki (Carmel dağı) çeşitli zorlu mikroklimatik çevre koşulları altındaki adaptasyonların gözlenmesi ve doğal seleksiyon çalışmalarının yürütülebilmesi için ideal bir ortam olan Evolution Canyon (EC) mikrokozmik evrimsel sisteminde yürütülmüştür. Evolution Canyon iki farklı bölgeye ayrılmıştır; African slope (AS) 200 m'lik uzaklıktaki European slope (ES) a göre % daha yüksek solar radyasyon miktarına sahiptir. Kuzey ve güney bölgelerde bulunan AS ve ES arasında çevresel koşulların ve yükseklik farkından dolayı oluşan bu UV doz farkı Aspergillus niger de farklı melanin miktarları oluşmasına yol açmıştır. Bu çalışmada AS adı verilen bölgede yüksek UV miktarına bağlı olarak A. niger de daha yüksek melanin üretildiği saptanmıştır (Singaravelan vd., 2008). Tseng ve arkadaşlarının 2011 yılında yaptıkları çalışmada; entomopatojenik bir fungus olan Metarhizium anisopliae ye Agrobacterium aracılığıyla A. alternata dan alınan DHN melanin biyosentez geni aktarılmış ve bu sayede M. anisopliae nin melanin üretmesi sağlanmıştır. Uzun yıllardan beri böceklere karşı biyokontrol ajanı olarak kullanılan M. anisopliae nin genetik müdahale sonucu ürettiği melanin sayesinde UV-B radyasyona, ekstrem sıcaklıklara ve su stresine karşı yabanıl tipten daha dayanıklı olduğu ve fungusun virulansında artış meydana getirdiği belirtilmiştir. Gen transferi yapılmış fungusla enfekte olan Plutella xylostella (lahana yaprak güvesi) larvalarının yabanıl tiple enfekte olanlara kıyasla ortalama ölüm süresinin LT 50 düştüğü de saptanmıştır. Fungusun artan anti-stres kapasitesi ve virulansı sayesinde daha etkin bir biyokontrol ajanı olarak kullanılabileceği gösterilmiştir (Tseng vd., 2011). Schweitzer ve arkadaşlarının 2010 yılında yaptıkları çalışmada; radyoimmunoterapi boyunca radyotoksisiteye karşı kemik iliğini korumak amacıyla deney farelerine intravenöz yolla melaninle kaplanmış nanopartiküller aktarılmıştır. 47

64 Farelerin vücudunun tamamına 125 cgy lik radyasyon verilmiş ve sonuçta melaninle kaplanmış nanopartiküller eksternal radyasyon veya radyo immunoterapi sırasında hematolojik toksisiteyi azaltmış, bunun yanı sıra tümör hücrelerinde herhangi bir koruma rolünün olduğu gözlemlenmemiştir (Schweitzer, 2010). Marcel ML Cunha ve arkadaşları (2010) insan patojeni olan melaninli fungus Fonsecaea pedrosoi nin üretildiği besiyerine tricyclazole (Tc) (DHN melanin biyosentez yolağı inhibitörü) ekleyerek melanin üretimi inhibe edilmiş F.pedrosoi ile çalışmışlardır. Bu çalışmada F. pedrosoi ile enfekte olmuş fare makrofajların nitrik oksit (NO) üretimi, oksidatif patlama ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (i-nos) aktivitesinin arasındaki ilişki belirlenmiş ayrıca fungusların H 2 O 2 ve NO dirençlilikleri elektron spin rezonansla tespit edilmiştir. Sonuç olarak melanize F. pedrosoi hücreleri NO ve H 2 O 2 ye karşı Tc ile muamele edilmiş fungustan daha dirençli olduğu gözlenmiştir. Melaninin NO yakalama kapasitesi makrofajların oksidatif patlamasından kaçmak için önemli bir mekanizma ve virülans faktör olduğu belirtilmiştir (Cunha vd., 2010). Bryan ve arkadaşlarının 2011 yılında yaptıkları çalışmada; melanize ve melanize olmayan Cryptococcus neoformans hücrelerinin görünür ışık, UV, gama radyasyon maruziyeti sonucu enerji seviyelerindeki (ATP konsantrasyonu) değişimleri tespit edilmiştir. ATP miktarı lusiferaz ve lusiferinin ATP bağımlı reaksiyonunun yaydığı ışık miktarının ölçülmesiyle saptanmıştır. Tüm radyasyon formlarının melanize C. neoformans hücrelerinde ATP seviyesinin azalmasına neden olduğu gözlenmiştir. Ama melanize olmayan hücrelerde görünür ışık ATP seviyesinin artmasına neden olmuş, gama radyasyonun herhangi bir değişikliğe neden olmamasına karşın, UV nin ATP miktarını arttırdığı saptanmıştır. Bu artışın melanize hücrelerdeki artıştan çok daha küçük miktarlarda olduğu da vurgulanmıştır (Bryan vd., 2011). Jacobson ve arkadaşlarının 1994 yılında yaptıkları çalışmada; Cryptococcus neoformans ın yabanıl tipi ve melanin üretimi genetiği değiştirilerek inhibe edilmiş albino C.neoformans mutantı kullanılmıştır. 37 ºC ve 25 ºC de yabanıl ve albino suşlarının U/mg protein cinsinden SOD aktiviteleri tespit edilmiştir. Yabanıl türlerde SOD un 25 ºC de arttığı, 37 ºC de ise herhangi bir aktivite artışına rastlanmadığı belirtilmiştir. Yabanıl türlerde SOD un sıcaklıkla ters orantılı ve melaninle birbirini tamamlayan bir mekanizma olduğu saptanmış, albino suşta ise SOD un sıcaklıkla 48

65 ilgili bir bağlantısının bulunmadığı gözlemlenmiştir. Böylece melaninin SOD ile karşılaştırılabilecek önemli bir antioksidan olduğu belirtilmiştir (Jacobson vd., 1994). Sharma ve arkadaşlarının 2012 yılında yaptıkları çalışmada; A. alternata, Trichoderma virens ve Curvularia lunata funguslarının ürettiği pigmentlerin tekstil boyası olarak kullanımı amaçlanmıştır. Kültürler PDB (patates dekstroz broth) de 28 ºC de statik koşullar altında inkübe edilerek, her üç fungustan da izole edilen pigmentlerin ayrı ayrı ipek ve yün kumaşları boyayabildiği ayrıca bu pigmentlerle boyanmış kumaşların yıkama ve ovalamaya karşı da dirençli olduğu belirlenmiştir. Pigmentten elde edilen bu boyaların, kumaşların esnekliğine karşı hiçbir yan etkisi gözlemlenmemiştir; ayrıca insan patojeni olan Trichoderma virens ten elde edilen pigmentin insan derisine toksik olmadığı da saptanmıştır. Yapılan bu çalışmayla melaninin de içinde bulunduğu bu pigmentlerin ucuz ve doğaya zararlı olmayan tekstil boyası olarak kullanılabileceği belirtilmiştir (Sharma vd., 2012). 49

66 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışmada yüksek düzeyde melanin üreten bir fungus olarak bilinen A. alternata ve besiyerine trisiklazol eklenerek melanin üretimi inhibe edilmiş A.alternata ya farklı UV dozları uygulanarak, UV-C radyasyonunun fungusun antioksidan enzim aktivite düzeylerinde ve glutatyon miktarlarında meydana getirdiği değişiklikler tespit edilmiştir. Diğer taraftan melanin üretiminin antioksidan savunma sistemi üzerine etkileri tartışılmıştır. 3.1.Araştırmada Kullanılan Besiyerleri Bu çalışmada kullanılan A. alternata yabanıl tipi Ege Üniversitesi Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bölümü, Mikoloji Laboratuvarlarından temin edilmiştir. Mikoloji laboratuvarlarından alınan fungus için besi ortamı olarak potato dextrose agar (PDA), sabouraud dextrose agar (SDA) ve sabouraud dextrose broth (SDB) kullanılmıştır. Bütün besiyerleri inokülasyon işlemi öncesinde 20 dakika 121 C de 1 atm basınç altında otoklavize edilmiştir. Ayrıca tüm inokülasyon işlemleri steril koşullar altında yapılmıştır. 3.2.Araştırmada Kullanılan Kimyasallar Bu çalışmada kullanılan potato dextrose agar (PDA) Lab M firmasından, sabouraud dextrose agar (SDA) ve sabouraud dextrose broth (SDB) besiyerleri Merck firmasından temin edilmiştir. Ksantin, ksantin oksidaz, sitokrom-c, GSH (Redükte Glutatyon), GSSG (Okside Glutatyon), BSA (Bovine Serum Albumin), DTNB (5-5 ditiyobis 2-nitro-benzoik asit), GSSG-redüktaz (Glutatyon Redüktaz), SOD (Süperoksit Dismutaz), NADPH (Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat) ve NaOH (Sodyum Hidroksit) Sigma dan; KH 2 PO 4 (Potasyum dihidrojen fosfat), K 2 HPO 4 (Potasyum Hidrojen Fosfat), NaH 2 PO 4 (sodyum dihidrojen fosfat), EDTA 50

67 (Etilendaimintetraasetik asit) ve H 2 O 2 (Hidrojen peroksit) ise Merck firmasından temin edilmiştir. Ayrıca trisiklazol Sigma Aldrich firmasından temin edilmiştir Alternaria alternata Stoklarının Hazırlanması ve Trisiklozol Eklenmesi Fungus stokları SDA içeren petrilerde üretilmiş ve 5 günlük kültürler +4 ºC de buzdolabında muhafaza edilmiştir. Buzdolabında saklanan fungus steril koşullar altında yatık PDA ya iğne uçlu öze yardımıyla batırma yöntemiyle ekilmiştir. 28 o C de etüvde 5 gün boyunca inkübe edilen yatık agardaki kültürler steril distile su ve öze yardımıyla kazınarak pipetle 1ml/50ml olmak üzere SDB besiyerine ekimleri yapılmıştır. Bu kültürler 28 ºC'de 150 rpm de çalkalanarak 4 gün boyunca inkübe edilmiştir. 4. günün sonunda oluşan peletler (homojenizatör ucu otoklavize edilmiş ) homojenizasyon aşamasının ardından deneyin sonraki aşamalarında kullanılmak için pipetle SDB besiyerlerine belirli miktarlarda fungus ekilmiştir. Trisiklozol eklenecek besiyerlerinin hazırlanması için ise her 50 ml lik sıvı besiyerleri otoklavize edildikten sonra, 0,75 mg trisiklozol / 0,5 ml etanol çözeltisi steril koşullar altında erlenlere eklenmiştir Fungusların UV-C Radyasyona Maruz Bırakılması Deneyin birinci aşamasında, fungal peletler stoktan SDB besiyerine eklenir eklenmez (inokülasyon işleminden hemen sonra) UV-C radyasyona maruz bırakılmıştır. Deneyin ikinci aşamasında, melanin ihhibisyonu için besiyerlerine trisiklazol eklenen funguslar yine inokülasyon işleminden hemen sonra UV-C ye maruz bırakılmıştır. Deneyin üçüncü aşamasında ise 9 günlük üretimleri yapılan yaşlı fungus kültürlerinde (Gopalakrishnan vd., 2010) meydana gelecek enzimatik değişimleri saptamak amacıyla radyasyona maruz bırakılmıştır. Deneyin bu üç aşamasında da kültürler sıvı besiyerinde, statik koşullar altında ve 12, 24, 48 ve 72 saat boyunca UV-C radyasyon uygulanmıştır. Bu çalışmada Philips TUV 15Watt/G15 T8 254 nm dalga boyuna sahip 45 cm boyunda UV-C lambası kullanılmıştır. Örnekler şekil 3.1. deki gibi lambadan 11 cm 51

68 uzaklığa yerleştirilmiştir. Tavana 6 cm mesafe ile yerleştirilmiş UV-C radyasyon kaynağı 45 cm uzunluğunda 254 nm dalga boyundadır. Işınlama için 90x60x70 cm boyutlarındaki alüminyum ile kaplı tahta bir kabin kullanılmıştır. Lamba üst ışınlama mesafesi lambanın yüzeyinden 11 cm uzaklıktadır. Lambanın yüzeyinden 1cm mesafede 15 w lık bir gücünün olduğunu düşünürsek 11 cm mesafede güç değeri 0,124 watttır. 11 cm mesafedeki ışınlama için ise 46x13 cm lik (0,46x0,13 m) bir yüzey alanı ışınlanmıştır. cm 2 başına güç ise 2,07x10-4 watt/cm 2 dir (m 2 başına 2,07 x 10-8 watt/m 2 ). UV ile ışınlama süresi Doz Değeri 12 saat (43200 saniye) 0,248 (µ(wh)*/m 2 ) - 8,9 ((Ws/)*cm 2 ) 24 saat (86400 saniye) 0,497 (µ(wh)*/m 2 ) - 17,9 ((Ws)*/cm 2 ) 48 saat ( saniye) 0,994 (µ(wh)*/m 2 ) - 35,8 ((Ws)*/cm 2 ) 72 saat ( saniye) 1,490 (µ(wh)*/m 2 ) - 53,7 ((Ws)*/cm 2 ) Çizelge 3.1. Uygulama süresine bağlı olarak uygulanan doz değerleri. Şekil 3.1. Fungusların UV-C ye maruz bırakılması Fungusların UV-C Uygulaması Sonrası Alınması: Homojenizasyonu, Sonifikasyonu ve Santrifügasyonu UV-C uygulaması sonrası süresi bitip çıkarılan erlenlere sırasıyla aşağıdaki işlemler uygulanmıştır: Alınan örnekler Whatman filitre kağıdından geçirilerek besiyerinden ayrıldı. Besiyerinden ayrılan örnekler tartılarak ağırlıkları alındı. 52

69 Örnekler homojenizasyon tamponuyla (ph=7,4 PBS) ağırlığının 4 katı kadar sulandırıdı. Buz içerisinde devirde 15 dakika belirli aralıklarla homojenize edildi Homojenat buz içinde 30 sn aralıklarla 4 dakika (SONICS Vibra cell marka sonifikatör) sonifiye edildi devirde/ 15 dk/ +4C de santrifüj edildi. Süpernatan kısmı alınarak enzim aktivite ölçümlerinin yapılması için ependorflara konuldu Örneklerin Elde Edilmesi ve Saklanması UV-C uygulaması sonrasında A.alternata için homojenizasyon, sonifikasyon ve santrifügasyon işlemlerinden sonra ependorflara alınan örnekler enzim tayininde kullanmak üzere -80 ºC de muhafaza edilmiştir Enzim Aktivite Tayini Enzim aktivitesi tayin işlemlerinde spektrofotometre (SHİMADZU UVvisible Spectrophotometer UV-1601) ve protein tayini için mikroplaka okuyucu sistemi (Molecular Devices Corp., Versamax ) kullanılmıştır. Bütün enzimlerin aktiviteleri her uygulama için üç tekrarlı olarak ölçülmüştür Katalaz Aktivitesinin Ölçümü Katalaz aktivitesi Luck (1963) tarafından önerilen spektrofotometrik yöntem ile tayin edilmiştir (Luck, 1963). Enzim aktivitesi 1 dakika boyunca 240 nm dalga boyunda absorbans değişimi (Shimadzu-UV-1601, UV/visible) H 2 O 2 tüketimine bağlı olarak tespit edildi. Bu amaçla 1ml kuvartz küvete ph=7 olan 1/15 M lık Sodyum Potasyum (KH 2 PO 4 NaHPO 4 ) tamponu ve 100 μl süpernatan pipetlenmiştir. Spesifik aktivite µmol/dk/mg protein cinsinden hesaplanmıştır. 53

70 Süperoksit Dismutaz Aktivitesinin Ölçümü Enzim aktivite tayini Mc Cord ve Fridovich (1969) yöntemine göre yapılmıştır (Mc Cord ve Fridovich, 1969). Enzim aktivite tayini için ph= 7,8 lik 50 mm K 2 HPO 4 tamponu, 0,1 mm EDTA içeren fosfat tamponu, 0,2 U/ ml ksantin oksidaz, 10 mm Ksantin ve 1 mm sitokrom-c çözeltileri kullanılarak A ve B çözeltileri hazırlanmıştır. A çözeltisi; 0,76 mg (5 mol) ksantinin 10 ml 0,001 N NaOH daki çözeltisive 24,8 mg (2 mol) sitokrom c nin 100 ml 50 mm ph = 7,8 ve 0,1 mm EDTA içerenfosfat tamponundaki çözeltisi karıştırılmıştır. B çözeltisi için taze olarak hazırlanan ksantin oksidaz (0,2 u/ml) 0,1 mm EDTA içerisinde hazırlanmıştır. Ölçüm ksantin-ksantin oksidaz sisteminde üretilen süperoksit radikallerinin sitokromc yi indirgemesinin SOD tarafından inhibisyonu temeline dayanmaktadır. Bu amaçla 3 ml lik kuvartz küvetine 2,9 ml A çözeltisi ve 50 μl örnek ilave edildikten sonra 50 μl B çözeltisi eklendi. 550 nm de 1 dakikalık absorbans değişikliği okundu. Kör için örnek yerine distile su eklenmiştir. Kalibrasyon grafiği çizmek için saf SOD enzimiyle belli konsantrasyonlardaki ( M) SOD çözeltilerinin 5 μl, 10 μl ve 15 μl deki bilinen değerlerine karşılık elde edilen % inhibisyon değerleri grafiğe geçirildi. Bulunan değerler süpernatanın mililitresindeki miligram proteine bölünerek spesifik aktivite hesaplanmıştır Glutatyon S- Transferaz Aktivitesinin Ölçümü Habig ve arkadaşlarının (1974) yöntemiyle yapılan glutatyon S-transferaz aktivite tayini için Tris-HCI tamponu (ph: 7,4) içerisinde hazırlanmış 0,002 M redükte glutatyon, etanol içerisinde hazırlanmış 0,15 M CDNB (1-chloro,2-4 dinitrobenzen) ve 0,1 M potasyum fosfat tamponu (KH 2 PO 4 - K 2 HPO 4 ) (ph=6,5) kullanılmıştır. Spektrofotometrik yöntemle yapılan enzim aktivitesi tayini için; 1ml lik küvete sırasıyla 400 μl potasyum fosfat tamponu, 400 μl redükte glutatyon, 50 μl süpernatan ve 100 μl CDNB pipetlenmiştir. Daha sonra 344 nm de 1 dakika süresince absorbansları okunmuştur (Habig vd., 1974). Kör olarak ise etanol kullanılmıştır. Örneklerin absorbansları okunduktan sonra mililitredeki enzimin ünite 54

71 sayısı hesaplanmıştır. Daha sonra enzimin ünite sayısı süpernatanın mililitresindeki miligram proteine bölünerek spesifik aktivite hesaplanmıştır Glutatyon Redüktaz Aktivitesinin Ölçümü Glutatyon redüktaz aktivite tayini Carlberg ve Mannervik (1985) yöntemiyle yapılmıştır. Bunun için ph = 7.0 lik 0,2 M potasyum fosfat tamponu (K 2 HPO 4 - KH 2 PO 4 ) (2 mm EDTA içinde) ve enzim aktivitesi ölçülürken taze olarak hazırlanan 2 mm NADPH/Tris HCl (ph =7.0) ve distile su içinde 20 Mm GSSG kullanılmıştır (Carlberg ve Mannervik, 1985). GR enzim aktivitesinin ölçümü için potasyum fosfat tamponu 30 C de inkübe edilmiş, daha sonra kör tüp hazırlamak için 1 ml lik küvete fosfat tamponundan 0,5 ml konulup, üzerine 100 μl NADPH, 100 μl GSSG ve son hacim 1 ml olacak şekilde distile su ilave edilmiştir. Absorbans okunacak küvete ise kör tüpten farklı olarak 200 μl distile su, 100 μl örnek eklenip bir kez karıştırıldıktan sonra 340 nm de 1dakika süresince absorbans okunarak glutatyon redüktaz aktivitesi hesaplanmıştır. Bu değerler süpernatanın mililitresindeki miligram proteine bölünerek spesifik aktivite hesaplanmıştır Glutatyon (GSH) Miktar Tayini Redükte glutatyon miktar tayini, Akerboom ve Sies (1981) yöntemiyle yapılmış. Bunun için 6,3 mm EDTA içeren 125 mm lık sodyum disülfat tamponu (Na 2 HPO 4 - NaH 2 PO 4 ) hazırlanmıştır. Tampon redükte glutatyon tayini yapılacağı zaman mililitresinde 0,248 mg NADPH olacak şekilde taze olarak hazırlanmıştır (ph: 7,5). DTNB de, tamponun mililitresinde 2,378 mg olacak şekilde taze olarak hazırlanmıştır. Taze olarak hazırlanmış NADPH lı tampondan 700 μl ve DTNB den 100 μl olacak şekilde etiketlenmiş deney tüplerine aktarılmıştır. Bu deney tüpleri 30 ºC deki sıcak su banyosunda inkübe edilerek, kör tüp için 200μl, örnek tüpler için de 185 μl distile su eklenmiş ve pastör pipetle iki kez karıştırıldıktan sonra dakika beklenmiştir. Daha sonra 700 μl NADPH, 100 μl DTNB, 180 μl distile su içeren karışım, 1 ml lik spektrofotometre küvetine aktarıldıktan sonra 5 μl glutatyon redüktaz, 20 μl süpernatan eklenerek 412 nm de 1 dakika süresince absorbansları okunmuştur. Daha sonra redükte glutatyon tayini yapmak için çizilen standart 55

72 grafikten süpernatanlardaki toplam glutatyon miktarı dikkate alınarak redükte hesaplamalar yapılmıştır (Akerboom ve Sies, 1981). Bulunan değerler süpernatanın mililitresindeki miligram proteine bölünerek spesifik aktivite hesaplanmıştır Total Protein Tayini Bradford ve arkadaşlarının (1980) yöntemiyle, total protein tayini için 5 μl supernatan mikroplakalara pipetlenip ve üzerine 250 μl Bradfoard reaktifi eklenerek reaksiyon karışımı oda sıcaklığında 15 dakika karanlıkta inkübe edildi. Renk değişimine bağlı olarak 595 nm dalga boyunda mikroplaka okuyucu sistemi kullanılarak absorbansları ölçüldü (Bradford vd., 1980). Protein miktarları saptanırken BSA standart eğrisi değerleri ile karşılaştırma yapılarak örnekteki total protein değerleri hesaplandı İstatiki Analizler Enzim aktivite tayinlerinden elde edilen bulguların istatistiksel olarak değerlendirilmesi amacıyla istatistiksel paket program (MedCalc for Windows ) kullanılmıştır. Uygulama grupları arasında her bir zaman diliminde enzim aktiviteleri arasındaki farklılığın incelenmesi ve her bir uygulama grubundaki zamana bağlı değişimin test edilmesi amacıyla Kruskal Wallis testi kullanılmıştır. Kruskal Wallis testi sonrası ikili karşılaştırmalar Mann-Whitney U testi kullanılarak istatistiksel değerlendirmeler yapılmıştır. Testlerde anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edilmiştir. 56

73 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. UV-C Radyasyona Maruz Bırakılan Alternaria alternata Fungusunun Antioksidan Enzimlerinin Aktiviteleri ve Glutatyon Miktarındaki Değişimler Farklı dozlarda uygulanan UV-C radyasyonun antioksidan enzim aktiviteleri üzerine etkisini belirlemek amacıyla yapılan bu çalışmada, funguslar inokülasyon sonrası, 9 günlük kültürler ve trisiklazol eklenen kültürler ve her birinin kontrolleri olmak üzere UV-C ye maruz bırakılan grupların enzim aktiviteleri ve glutatyon (GSH) miktarlarındaki değişimler saptanmıştır Katalaz Aktivitesi İnokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV-C maruziyetinin katalaz enzimi üzerindeki etkileri incelendiğinde, hem kontrol hemde uygulama grubundaki enzim aktivitesinin zamana bağlı olarak inhibe olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.1). 12 saatlik uygulamada kontrole göre UV-C uygulaması katalaz aktivitesini inhibe ettiği gözlenmiştir (p<0,05). 24. ve 48. saatlerde kontrol ve uygulama grubu arasında istatistiksel anlamda bir fark gözlenmezken, 72. saatte ise uygulama grubunda CAT aktivitesinin kontrol grubuna göre arttığı tesbit edilmiştir (p<0,05). Radyasyon uygulanmış gruptaki en yüksek CAT aktivitesi 12. saatte 9,7 µmol/dk/mg protein iken, en düşük aktivite 72. saatte 4,6 µmol/dk/mg protein olduğu gözlenmiştir. 57

74 CAT aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) Kontrol UV 10 * 8 6 * s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil 4.1. İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın katalaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 9 günlük kültürlerinin farklı sürelerde UV-C ye maruz kalması katalaz enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.2). Uygulama grupları karşılaştırıldığında UV-C ye maruz kalma süresine paralel olarak enzim aktivitesinin arttığı gözlenmiştir. Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında 12 ve 72 saatlik UV- C uygulamasında CAT aktivitesinin kontrole göre arttığı saptanmıştır (p<0,05). 24 saatlik uygulamada ise CAT aktivitesinin kontrole göre inhibe olduğu tesbit edilmiştir (p<0,05). 58

75 CAT aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) 30 Kontrol UV 25 * * * s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil 4.2. A. alternata nın 9 günlük kültürlerine UV-C uygulanması sonucu CAT aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). Besiyerine trisiklazol eklenmiş kültürlerde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın katalaz enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.3.). Kontrol gruplarında 12. ve 24. saatlerdeki aktivitenin 48 ve 72. saatlerdeki aktiviteye göre daha düşük olduğu gözlenmiştir. Uygulama gruplarında 48. saate kadar CAT aktivitesi artarak 11,698 ± 0,5238 µmol/dk/mg protein düzeyine ulaşmış, 72. saatte ise aktivitenin azaldığı saptanmıştır. Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında ise 12 saatlik ve 24 saatlik UV-C uygulamasının CAT aktivitesini inhibe ettiği tesbit edilmiştir (p<0,05). 48. saatte ise kontrole göre önemli düzeyde aktivite artışı görülmüştür (p<0,05). 59

76 CAT aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) * Kontrol UV 10 * * s 24s 48s 72s Zaman(saat) Şekil 4.3. Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu CAT aktivite değişimlerinin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). İnokülasyon işleminden hemen sonra uygulama yapılan, 9 günlük inkübasyondan sonra uygulama yapılan ve Tc eklenen üç grubun kontrollerinin CAT enzim aktiviteleri karşılaştırılmıştır (Şekil 4.4). 24., 48. ve 72. saatlerde 9 günlük kültürlerin enzim aktiviteleri diğer gruplara göre önemli düzeyde yüksektir (p< 0,05). 12. saatte ise gruplar arası katalaz aktivite değeri çok farklı olmamakla birlikte, İnokülasyon işleminden hemen sonra uygulama yapılan grubun CAT aktivitesinin diğer gruplara kıyasla daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Gruplar arası kontrol grupları karşılaştırıldığında en yüksek CAT aktivitesi 9 günlük inkübe edilen grupta 48.saatte 23,209 ± 3,3381 µmol/dk/mg protein düzeyine ulaşmış iken, en düşük 60

77 CAT aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) aktivite inkübasyondan hemen sonra uygulama yapılan grupta 72. saatte 0,370±0,05736 µmol/dk/mg protein olarak belirlenmiştir a 9 GÜNLÜK İNOKÜLASYON SONRASI TC EKLENEN 20 a 15 b b a 10 a b 5 b 0 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil 4.4. A. alternata nın üç farklı uygulama grubunun kontrol gruplarındaki katalaz aktivite değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. İnokülasyon işleminden hemen sonra, 9 günlük inkübasyondan sonra ve Tc eklenen besiyeri içerisinde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV- C uygulama yapılan üç grubun CAT enzim aktiviteleri karşılaştırılmıştır (Şekil 4.5). Bütün uygulama sürelerinde 9 günlük kültürlerin enzim aktivitelerinin diğer gruplara göre yüksek olduğu saptanmıştır (p< 0,05). 61

78 CAT aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) GÜNLÜK İNOKÜLASYON SONRASI TC EKLENEN a a 15 a a b 10 b 5 b 0 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil 4.5. A. alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulaması sonrasındaki katalaz aktivite değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. 62

79 Glutatyon redüktaz aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) Glutatyon Redüktaz Aktivitesi İnokülasyon sonrası farklı sürelerde UV-C uygulamasının glutatyon redüktaz enzimi üzerindeki etkileri incelendiğinde (Şekil 4.6) hem kontrol hemde uygulama grubundaki enzim aktivitesinin zaman bağlı olarak azaldığı gözlenmiştir (p<0,05). UV-C uygulaması yapılmış gruplar arasındaki en yüksek GR aktivitesi 12. saatte 0,496 ± 0,0327 µmol/dakika/mg protein olarak belirlenmiştir. 12, 24, 48 saatlik UV- C uygulanan gruplarda glutatyon redüktaz aktivitesinin kontrole göre inhibe olduğu gözlenmiştir (p<0,05). 72. saatte ise uygulama grubunda glutatyon redüktaz aktivitesinin kontrol grubuna göre arttığı tesbit edilmiştir (p<0,05). 0,8 0,7 Kontrol UV 0,6 0,5 0,4 * * 0,3 0,2 * * 0,1 0,0 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil 4.6. İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın glutatyon redüktaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 63

80 Glutatyon redüktaz aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) 9 günlük kültürlerde farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın glutatyon redüktaz enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.7). Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında 12. ve 72. saatte UV-C uygulaması enzim aktivitesinde artışa neden olurken (p<0,05), 48 saatlik uygulamanın aktiviteyi inhibe ettiği gözlenmiştir (p<0,05). 12 saatlik radyasyon uygulaması sonucunda en yüksek GR enzim aktivitesi 0,335 ± 0,03172 µmol/dakika/mg protein olarak saptanmıştır. 0,40 0,35 * Kontrol UV 0,30 0,25 * 0,20 0,15 * 0,10 0,05 0,00 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil 4.7. A. alternata nın 9 günlük kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon redüktaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 64

81 Glutatyon redüktaz aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) Besiyerine trisiklazol eklenmiş kültürlerde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın glutatyon redüktaz enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.8). Kontrol gruplarında CAT enziminde olduğu gibi 48. saate kadar glutatyon redüktaz aktivitesi düşmüş, 72. saatte ise aktivitenin tekrar arttığı gözlenmiştir (p<0,05). Uygulama gruplarında 12, 24 ve 48. saatler arasında istatistiksel anlamda önemli bir değişim olmazken 72. saatte aktivitenin arttığı tesbit edilmiştir. Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında 12 saatlik ve 24 saatlik UV-C uygulamasının CAT enziminde olduğu gibi glutatyon redüktaz aktivitesini de inhibe ettiği saptanmıştır (p<0,05). 48. ve 72. saatte ise uygulama grubundaki enzim aktivitesinin arttığı gözlenmiştir (p<0,05). 4,0 3,5 Kontrol UV 3,0 * 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 * * * 0,0 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil 4.8. Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon redüktaz aktivite değişimlerinin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 65

82 Glutatyon redüktaz aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) İnokülasyon işleminden hemen sonra uygulama yapılan, 9 günlük inkübasyondan sonra uygulama yapılan ve Tc eklenen üç grubun kontrollerinin GR enzim aktiviteleri karşılaştırılmıştır (Şekil 4.9). 12., 24. ve 72. saatlerde Tc eklenmiş besiyeri içerisinde üretim yapılan grubun enzim aktiviteleri diğer gruplara göre önemli düzeyde yüksek olduğu gözlenmiştir (p< 0,05). Tc eklenmiş besiyeri içerisinde üretim yapılan grubun enzim aktiviteleri 12. saatte 1,248 ± 0,2280 µmol/dakika/mg protein, 24. saatte 0,865 ± 0,1190 µmol/dakika/mg protein, 72. saatte ise 1,153 ± 0,2056 µmol/dakika/mg protein olarak kaydedilmiştir. 2,0 1,8 1,6 1,4 b 9 GÜNLÜK İNOKÜLASYON SONRASI TC EKLENEN b 1,2 1,0 b 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 a a 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil 4.9. A. alternata nın üç farklı uygulama grubu içerisindeki kontrol gruplarının GR aktivite değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. 66

83 Glutatyon redüktaz aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) İnokülasyon işleminden hemen sonra, 9 günlük inkübasyondan sonra ve Tc eklenen besiyeri içerisinde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV- C uygulaması yapılan üç grubun GR enzim aktiviteleri karşılaştırılmıştır (Şekil 4.10). 12., 24., 48. saatler karşılaştırıldığında gruplar arası çok belirgin bir aktivite farkı gözlenmemiştir. 72. saatte ise Tc eklenmiş besiyeri içerisinde uygulama yapılmış grupta 2,554 ± 0,4033 µmol/dakika/mg protein enzim aktivite değeri saptanmış ve enzim aktivitesinin diğer gruplara göre çok belirgin düzeyde indüklendiği tesbit edilmiştir. 4,0 3,5 3,0 9 GÜNLÜK İNOKÜLASYON SONRASI TC EKLENEN b 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 a b b a 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulaması sonucu GR aktivite değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. 67

84 GST aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) Glutatyon S-Transferaz aktivitesi İnokülasyondan hemen sonra farklı sürelerde UV-C ye maruz kalan grupta, UV-C nin glutatyon S-transferaz enzimi üzerindeki etkileri incelendiğinde (Şekil 4.11) 12, 24. ve 72. saatte UV-C uygulaması, kontrole göre enzim aktivitesinde önemli düzeyde artışa neden olurken (p<0,05), uygulamanın 48. saatte kontrole göre önemli bir değişime neden olmadığı gözlenmiştir (p> 0.05) Kontrol UV * * * s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın sonucu glutatyon S-transferaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 68

85 GST aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) 9 günlük kültürlerin farklı sürelerde UV-C ye maruz bırakılmasının, glutatyon S-transferaz enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.12). Uygulama grubu ile kontrol grubu karşılaştırıldığında 12, 24 ve 48 saatlik UV-C uygulamalarının glutatyon S-transferaz enzimini inhibe ettiği saptanmıştır (p<0,05). Kültürlerin 72 saat UV-C ye maruz kalması ise enzim aktivitesinde 236,323 ± 23,5440 µmol/dakika/mg protein değerine ulaşarak önemli düzeyde artışa neden olduğu belirlenmiştir (p<0,05) * Kontrol UV * * * 0 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın 9 günlük kültürlerine UV-C uygulanması sonucu glutatyon S-transferaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 69

86 GST aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) Besiyerine trisiklazol eklenmiş kültürlerde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın glutatyon S-transferaz enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.13). Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında 12 saatlik ve 24 saatlik UV-C uygulamasının enzim aktivitesini inhibe ettiği 48. saatte ise enzim aktivitesini arttırdığı tesbit edilmiştir (p<0,05). Uygulama grupları arasındaki en düşük GST aktivitesi 12. saatte 149,112 ± 2,0768 µmol/dakika/mg protein, en yüksek aktivite ise 72. saatte 296,478 ± 16,6918 µmol/dakika/mg protein olarak belirlenmiştir. 72. saatte ise kontrole göre anlamlı bir fark gözlenmemiştir (p> 0.05) Kontrol UV * * * s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon S-transferaz değişimlerinin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 70

87 GST aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) İnokülasyon işleminden hemen sonra uygulama yapılan, 9 günlük inkübasyondan sonra uygulama yapılan ve Tc eklenen üç grubun kontrollerinin GST enzim aktiviteleri karşılaştırılmıştır (Şekil 4.14). 12., 24. ve 72. saatlerde glutatyon redüktaz enziminde olduğu gibi Tc eklenmiş besiyeri içerisinde üretim yapılan grubun enzim aktiviteleri diğer gruplara göre önemli düzeyde yüksek olduğu gözlenmiştir (p< 0,05). 48. saatte ise 9 günlük inkübasyon sonrası uygulama yapılan grubun kontrolünün enzim aktivitesinin diğer iki gruptan daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir GÜNLÜK 400 b İNOKÜLASYON SONRASI TC EKLENEN b b a a b a s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın kontrol gruplarının üç farklı uygulama için glutatyon S- transferaz aktivite değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. 71

88 GST aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) İnokülasyon işleminden hemen sonra, 9 günlük inkübasyondan sonra ve Tc eklenen besiyeri içerisinde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV- C uygulama yapılan üç grubun GST enzim aktiviteleri karşılaştırılmıştır (Şekil 4.15.). Bütün uygulama sürelerinde Tc eklenmiş besiyeri içerisinde üretim yapılarak radyasyona maruz bırakılan grubun GST aktivitesinin diğer gruplara göre daha yüksek olduğu gözlenmiştir (p> 0.05) GÜNLÜK 400 İNOKÜLASYON SONRASI TC EKLENEN b b a b b a a a 0 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulanması sonucu glutatyon S-transferaz aktivite değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. 72

89 SOD aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) Süperoksit Dismutaz Aktivitesi İnokülasyondan hemen sonra farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın SOD enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.16). Kontroller kendi aralarında karşılaştırıldığında UV-C uygulama süresindeki artışa paralel olarak enzim aktivitesinin azaldığı gözlenmiştir. Uygulama grupları kendi aralarında karşılaştırıldığında 12., 24., 72. saatlere göre 48. saatte enzim aktivitesinde azaldığı belirlenmiştir. Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında 12., 24. ve 48. saatte uygulamanın enzim aktivitesinde inhibisyona neden olduğu, 72. saatte ise enzim aktivitesinin önemli düzeyde arttığı gözlenmiştir (p<0,05) * * * Kontrol UV 200 * s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın süperoksit dismutaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 73

90 SOD aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) 9 günlük kültürlerde farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın SOD enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.17). Uygulama grubu ile kontrol grubu karşılaştırıldığında bütün uygulama sürelerinde UV-C nin SOD aktivitesini indüklediği tesbit edilmiştir (p<0,05). Uygulama grupları arasındaki en yüksek SOD aktivitesi 72. saatte 892,497 ± 4,2897 µmol/dakika/mg protein olarak belirlenmiştir * Kontrol UV * * * s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın 9 günlük kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu süperoksit dismutaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırması * (p<0,05). 74

91 SOD aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) Besiyerine trisiklazol eklenmiş kültürlerde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın SOD enzimi üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.18). Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında 12, 24 ve 72 saatlik UV-C uygulamasının enzim aktivitesini inhibe ettiği 48. saatte ise enzim aktivitesinde artışa neden olduğu tesbit edilmiştir (p<0,05). Radyasyon uygulanmış gruptaki SOD enzim aktivitesi 48. saatte 913,044±24,4917 µmol/dakika/mg protein iken, en düşük aktivitenin 218,745±7,5072 µmol/dakika/mg protein olduğu saptanmıştır * Kontrol UV 800 * 600 * * 0 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu süperoksit dismutaz aktivitesindeki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 75

92 SOD aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) İnokülasyon işleminden hemen sonra uygulama yapılan, 9 günlük inkübasyondan sonra uygulama yapılan ve Tc eklenen üç grubun kontrollerinin SOD enzim aktiviteleri karşılaştırılmıştır (Şekil 4.19.). 12., 24. ve 72. saatlerde glutatyon redüktaz ve GST enzimlerinde olduğu gibi Tc eklenmiş besiyeri içerisinde üretim yapılan grubun SOD enzim aktivitelerinin diğer gruplara göre önemli düzeyde yüksek olduğu, 24. saatte aktivite değerinin 881,048±7,6929 µmol/dakika/mg protein değerine ulaştığı gözlenmiştir (p< 0,05). 48. saatte ise 9 günlük inkübasyon sonrası uygulama yapılan grubun kontrolünün enzim aktivitesinin diğer iki gruptan daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir b 9 GÜNLÜK İNOKÜLASYON SONRASI TC EKLENEN a b 400 b a a a b s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın üç farklı uygulama grubu içerisindeki kontrol gruplarının süperoksit dismutaz aktivite değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. 76

93 SOD aktivitesi (µmol/dakika/mg protein) İnokülasyon işleminden hemen sonra, 9 günlük inkübasyondan sonra ve Tc eklenen besiyeri içerisinde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV- C uygulama yapılan üç grubun SOD enzim aktiviteleri karşılaştırılmıştır (Şekil 4.20.). 9 günlük inkübasyon sonrası UV-C uygulanan grupta 12. ve 72. saatteki enzim aktivitelerinin daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Tc eklenmiş besiyeri içerisinde üretim yapılarak radyasyona maruz bırakılan uygulama gruplarında ise 24. ve 48. saatteki SOD aktivitesinin diğer gruplara göre daha yüksek olduğu tesbit edilmiştir GÜNLÜK İNOKÜLASYON SONRASI TC EKLENEN 1000 b a 800 b a a a b 200 b 0 12s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulanması sonucu süperoksit dismutaz aktivite değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. 77

94 GSH miktarı (µmol/dakika/mg protein) Glutatyon (GSH) Miktar Tayini İnokülasyondan hemen sonra farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın glutatyon miktarı üzerindeki değişimleri incelenmiştir (Şekil 4.21). Uygulama grupları incelendiğinde UV-C nin 48. saate kadar uygulama süresi artışına bağlı olarak GSH miktarını indüklediği gözlenmiştir (p<0,05). Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında ise 12. ve 24. saatlerde uygulamanın GSH miktarında azalışa neden olduğu, 72. saatte ise glutatyon miktarını arttırdığı (p<0,05), 48. saatte ise anlamlı bir fark olmadığı gözlenmiştir (p >0.05) Kontrol UV * * 8 6 * s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil İnokülasyon sonrası UV-C uygulanan A. alternata nın glutatyon miktarındaki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). 78

95 GSH miktarı (µmol/dakika/mg protein) 9 günlük kültürlerde farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın glutatyon miktarı üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.22). Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında 12. ve 72. saatlerde UV-C nin GSH miktarında artışa neden olduğu, 48. saatte ise azalışa neden olduğu gözlenmiştir (p<0,05). 24. saatte ise önemli bir fark gözlenmemiştir (p> 0.05) Kontrol UV * * 8 6 * s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın 9 günlük kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon miktarındaki değişimlerin kontrol ile karşılaştırması * (p<0,05). 79

96 GSH miktarı (µmol/dakika/mg protein) Besiyerine trisiklazol eklenmiş kültürlerde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV-C ye maruz kalmanın GSH miktarı üzerindeki etkileri incelenmiştir (Şekil 4.23). Kontrol ve uygulama grupları karşılaştırıldığında 12. ve 72. saatte UV-C uygulamasının GSH miktarını inhibe ettiği, 24. ve 48. saatte ise GSH miktarını arttırdığı tesbit edilmiştir (p<0,05). Uygulama grupları arasındaki en yüksek GSH miktarı 12,827 ± 0,4603 µmol/dakika/mg protein, en düşük GSH miktarı 4,120±0,5406 µ mol/dakika/mg protein olarak belirlenmiştir * Kontrol UV 10 * * * s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil Besiyerine trisiklazol eklenmiş A. alternata kültürlerinin UV-C uygulanması sonucu glutatyon miktarındaki değişimlerin kontrol ile karşılaştırılması * (p<0,05). İnokülasyon işleminden hemen sonra uygulama yapılan, 9 günlük inkübasyondan sonra uygulama yapılan ve Tc eklenen üç grubun kontrollerinin GSH miktarları karşılaştırılmıştır (Şekil 4.24). 12., 24. ve 72. saatlerde inokülasyon sonrası uygulama yapılan grubun kontrolünün glutatyon miktarının diğer gruplara göre 80

97 GSH miktarı (µmol/dakika/mg protein) önemli düzeyde yüksek olduğu gözlenmiştir (p< 0,05). 48. saatte ise 9 günlük inkübasyondan sonra uygulama yapılan kontrol grubunun GSH miktarının diğer iki gruptan daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir a 9 GÜNLÜK İNOKÜLASYONSONRASI TC EKLENEN b b 10 8 a b a 6 4 a s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın üç farklı uygulama grubu içerisindeki kontrol gruplarının GSH miktarlarının değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. İnokülasyon işleminden hemen sonra, 9 günlük inkübasyondan sonra ve Tc eklenen besiyeri içerisinde inokülasyon işleminden hemen sonra farklı sürelerde UV- C uygulama yapılan üç grubun GSH miktarları karşılaştırılmıştır (Şekil 4.25.). En yüksek GSH miktarının inokülasyon sonrası 48 ve 72 saat UV-C radyasyonuna maruz kalan gruplarda olduğu belirlenmiştir. 81

98 GSH miktarı (µmol/dakika/mg protein) GÜNLÜK İNOKÜLASYON SONRASI TC EKLENEN b a a a b a b s 24s 48s 72s Zaman (saat) Şekil A. alternata nın üç farklı uygulama grubunun UV-C uygulanması sonucu GSH miktarlarının değişimleri. 9 günlük kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) a ; Tc eklenen kültürün inokülasyon sonrası grubundan farkı (p<0,05) b. Tc eklenmiş kültürlerde melanin pigment inhibisyonu gerçekleşmiş ve flavoloin ve benzeri pigmentler sentezlediği için kontrole kıyasla hem katı besiyerindeki hem sıvı besiyerindeki kültürler kırmızımsı renkte görülmüştür. Şekil Tc eklenmiş (solda) ve eklenmemiş (sağda) PDA daki A.alternata; Tc eklenmiş (solda) ve eklenmemiş (sağda) PDB deki A.alternata. 82