Caracterizacin morfolgica de dos ectomicorrizas

asociadas a Coccoloba uvifera L. e identificacin

del micobionte con base en la regin ITS del ADNr,
en una poblacin de la comunidad La Ribera,
Tampico Alto, Veracruz

DIRECTOR DE TESIS:
DR. VICTOR M. BANDALA MUOZ

2012
 NDICE

Resumen.. 2

Introduccin. 3-5

Antecedentes 6-7

Objetivos.. 8

Hiptesis 9

Micorrizas.. 10 - 14

rea de estudio.. 15

Material y mtodo.. 16 - 19

Muestreo de ectomicorrizas (y esporocarpos)..... 16

Limpieza y caracterizacin de ectomicorrizas.... 16 - 17

Obtencin de secuencias de ADN.. 17 - 19
Anlisis filogentico... 19

Resultados.. 20 - 25

Especies comparadas en cladograma...... 21

Descripcin de las ectomicorrizas... 22-25

Discusin. 26 - 28

Conclusiones 29

Bibliografa.. 30 - 35

1
 RESUMEN

La mayora de los registros de especies de hongos ectomicorrizgenos (ECM) se han

reconocido con base en la presencia de esporocarpos sobre el suelo, sin embargo, la
diversidad hipgea representada por las ectomicorrizas est todava poco estudiada. El
presente trabajo hizo dos muestreos en diferentes pocas del ao, tomando suelo bajo plantas
de Coccoloba uvifera L. en la comunidad La Ribera, Tampico Alto. En las muestras de suelo
se encontraron 12 morfotipos diferentes, de los cuales se hicieron las descripciones
morfolgicas y anatmicas usando los protocolos de Agerer y de Ludwin-Maximilians,
adems de documentarlo con fotografas. Tambin se llev a cabo la extraccin de ADN y
secuenciacin de la regin ITS del ADN ribosomal y slo dos muestras pudieron ser
exitosamente completadas las cuales al compararlas usando la herramienta BLAST con las de
la base de GenBank y UNITE con 97% de similitud se relaciona una con Scleroderma
bermudense y otra con 95% a una especie no identificada de Tomentella o de Thelephora. De
ambas se presenta aqu la caracterizacin de sus ectomicorrizas y se discute entorno a su
taxonoma.

2
 INTRODUCCIN

El trmino micorriza, acuado por Albert Bernard Frank en 1885, define la relacin de las
races de una planta con uno o varios hongos, donde los dos obtienen beneficios, de modo que
es una relacin simbitica. El principal beneficio para ambos simbiontes, es el intercambio de
nutrientes: los hongos reciben carbono de las plantas hospederas y las plantas reciben fsforo
y nitrgeno a travs de las hifas asociadas (Trappe, 2005). Actualmente se reconocen siete
tipos de asociaciones de micorrizas: arbuscular, ectomicorriza, ectendomicorriza, arbutoide,
monotropoide, ericoide y orquidioide (Smith y Read, 1997) (ver abajo captulo Micorrizas,
pgs. 10-14). Uno de los tipos de asociaciones micorrzicas, tema del presente trabajo, son las
ectomicorrizas, trmino propuesto por Peyronel et al. (1969). En esta simbiosis el hongo
forma un manto o vaina alrededor de las races, las hifas crecen entre los espacios
intersticiales de las clulas corticales (sin penetrar en ellas) formando un sistema intercelular
llamado red de Hartig; de tal forma que se pueden mencionar tres caractersticas principales:
el manto fngico, la red de Hartig, y el micelio externo vegetativo que emerge de las races
(Trappe, 2005). A la fecha se ha estimado que existen ms de 5000 especies de hongos
ectomicorrizgenos, de los cuales alrededor del 90% son basidiomicetos (Malloch et al.,
1980). Los hongos ectomicorrizgenos (ECM) constituyen un grupo funcional importante en
los ecosistemas al influir en la adquisicin de nutrientes, establecimiento de las plntulas y
desarrollo y resistencia de los rboles contribuyendo con esto a la funcionalidad de los
ecosistemas (Brundrett, 2009; Tedersoo et al., 2010b). Se tiene registrado que
aproximadamente seis mil especies de plantas terrestres tienen una relacin ectomicorrzica,
donde se encuentran involucradas cerca de 20-25 mil especies de hongos (Brundrett, 2009;
Rinaldi et al., 2008).

En Mxico se conocen diferentes taxones que forman parte del grupo de hongos ECM. La
mayora de los estudios ya sean taxonmicos o de tipo taxonmico-ecolgico que han
contribudo al conocimiento de los mismos en el pas, estn basados especialmente en la
ocurrencia de esporocarpos, mayormente de sitios en zonas templadas. Los bosques de
Quercus y conferas son los mejores documentados aunque existen todava sitios poco o nada
explorados, y pocos son los trabajos donde se consideren fitobiontes especficos y sus
ectomicorrizas bajo el suelo. Es conocida la relacin ectomicorrzica de rboles de Coccoloba

3
 P. Browne, un miembro de la familia Polygonaceae Juss. (Smith y Read, 1997). Las
recopilaciones efectuadas por De Roman et al. (2005) y Wang y Qiu (2006) sobre estudios de
ectomicorrizas a nivel mundial, revelan que se ha generado poca informacin sobre la
diversidad de ectomicorrizgenos asociados a Coccoloba uvifera L. considerando tanto
micorrizas (bajo el suelo) cmo esporocarpos (por arriba del suelo). Las plantas de esta
especie en Mxico, tienen importancia antropolgica local (sus frutos son comestibles, su
ltex es usado para curtir y teir pieles, maderable, medicinal, etc.) y estn ligadas a las dunas
de las playas del litoral de la vertiente Atlntica y espordicamente en la costa del Pacfico, se
distribuye en las costas de Campeche, Colima, Chiapas, Guerrero, Michoacn, Nayarit,
Oaxaca, Quintara Roo, Sinaloa, Tabasco, Veracruz y Yucatn a una altura entre 0 a 500 msnm
(Parrota, 1994; www.conabio.gob.mx).

En la regin de La Ribera, Tampico Alto, Veracruz, localizada en la costa norte del estado de
Veracruz, se establecen manchones de Coccoloba uvifera que ocupan extensiones
relativamente grandes como elementos dominates o co-dominates, y considerando su
importancia local, la ecolgica de los hongos ECM en esos ecosistemas, as como la poca
informacin de las especies que conforman su cortejo simbitico, fueron la base para ejecutar
el presente trabajo con el objetivo de generar informacin en esta rea de conocimiento.

Es importante realizar investigacin para documentar cul es el componente de

ectomicorrizgenos asociados y conocer las especies que podran representar los posibles
candidatos al plantear un manejo para su potencial propagacin. Prcticamente se desconocen
las especies de hongos ectmicorrizgenos que se asocian con C. uvifera en Mxico, y an
menos se conocen como son sus micorrizas (De Romn et al. 2005; Bandou et al. 2006). Por
tal motivo el presente trabajo plante contribuir al conocimiento de las micorrizas de C.
uvifera adems de su caracterizacin morfolgica, utilizando la regin ITS del ADN
ribosomal. En esta regin del ADN se encuentra entre las dos subunidades codificadoras para
el ribosoma, que son la subunidad larga (LSU por sus siglas en ingls) y la subunidad
pequea (SSU). Asimismo la regin ITS se divide en dos ya que en medio de sta se
encuentra la secuencia que codifica a la subunidad 5.8S, dando como resultado el siguiente
orden: ITS1, 5.8S e ITS2, concretando as toda la regin ITS. Dentro de la regin ITS, se
encuentran regiones altamente conservadas, ya que se trata de la regin que compartimos
todos los organismos para codificar los ribosomas, sin embargo, esta regin y contiene
mutaciones puntuales (Gardes & Bruns, 1993) que ayudan al reconocimiento de los taxones

4
(Baldwin et al., 1995) y que funciona como herramienta para la interpretacin de las especies
de hongos involucrados en la simbiosis (Baldwin et al., 1995; White et al. 1990; Gardes y
Bruns 1993). Horton y Bruns (2001) proponen usar las secuencias de ITS como una
herramienta efectiva con propsitos de identificacin aunque tambin tiene sus limitaciones.
Esta tesis no slo hace una descripcin taxonmica de las ectomicorrizas estudiadas sino que
tambin hace uso de la biologa molecular como herramienta para identificar las especies de
hongos que se encuentran asociados a Coccoloba uvifera y dar soporte a los conceptos de las
especies involucradas en la simbiosis.

5
 ANTECEDENTES

La revisin bibliogrfica realizada indica que todava se desconoce la diversidad de hongos

ectomicorrizgenos asociados a rboles de Coccoloba y de Mxico son escasos los registros.
En la recopilacin sobre ectomicorrizas de plantas efectuada por De Roman et al. (2005) con
base en trabajos publicados entre 1961 a 2005, no registran contribuciones a nivel mundial
sobre ectomicorrizas de Coccoloba. El atlas de ectomicorrizas de Agerer (1987-2002) no
considera C. uvifera, aunque cabe mencionar que esta publicacin especialmente informa
sobre micorrizas de rboles de zonas templadas del hemisferio norte. Las plantas de
Coccoloba uvifera estn registradas como ectomicorrzicas en la recopilacin de Wang y Qiu
(2006), aunque sin mencionar las especies de hongos que participan en la simbiosis.

Es importante destacar que muchos estudios sobre hongos ECM informan sobre la ocurrencia
de esporocarpos por arriba del suelo, basados en su pertenencia a taxones que son conocidos
que forman simbiosis con los fitobiontes. No obstante, cada vez ms se genera informacin
sobre la diversidad de hongos ECM con base en su presencia por debajo del suelo, para
conocer y caracterizar las micorrizas que producen. Para el caso de C. uvifera y ejemplo de
esto ltimo, slo se tiene el trabajo de Bandou et al. (2006) quienes aprovechando la relacin
simbitica de Scleroderma bermudense Coker con dicha especie efectuaron pruebas de
crecimiento en plntulas micorrizadas. Por el contrario, referente al registro de esporocarpos
de hongos ECM pertenecientes a especies y gneros conocidos que forman micorrizas, se
tienen registros de especies de Amanita, Boletus, Inocybe, Lactarius, Russula entre otros,
como se muestra en la Tabla 1. Tericamente todas las especies incluidas en dicha tabla,
registradas con base en los esporocarpos bajo Coccoloba, forman ectomicorrizas con estas
plantas, pero aun no se han investigado los morfotipos en las races para confirmar la
interaccin.
Es interesante destacar que en Ecuador, Tedersoo et al. (2010a) hace el reconocimiento de
ectomicorrizas asociadas a Coccoloba y con ayuda del espacio interno de transcripcin (ITS,
por sus siglas en ingls, Internal Transcribed Spacer), dichos autores identifican a una
comunidad de hongos algo distinta en gneros a los arriba mencionados, solo Inocybe,
Russula y Lactarius en coincidencia. Reportaron Inocybe sambucina (Fr.) Qul., Russula
brevipes Peck, Lactarius glaucescens Crossl, L. edulis Verbeken & Buyck, Tomentella
stuposa (Link) Stalpers, T. botryoides (Schwein.) Bourdot & Galzin, T. sublilacina (Ellis &

6
Holw.) Wakef, T. ellisii (Sacc.) Jlich & Stalpers Thelephora caryophyllea (Schaeff.) Pers., T.
penicillata (Pers.) Fr. Clavulina cinerea (Bull.) J. Schrt., C. cristata (Holmsk.) J. Schrt,
Sebacina incrustans (Pers.) Tul. & C. Tul. y Tremellodendron pallidum (Schwein.) Burt.

Tabla 1. Especies de hongos ectomicorrizgenos asociados a Coccoloba y otras especies de plantas, registradas
con base en la presencia de esporocarpos.
Especies registradas en
Especies registradas con
Autor Procedencia asociaciones de Coccoloba y
Coccoloba uvifera
otras plantas
Miller et al., Puerto Rico, Mona y Amanita cystdiosa Amanita antillana
2000 las Islas Guana O.K.Mill. & Lodge Dennis 2
Amanita arenicola O.K.Miller Boletus ruborculus T.J.Baroni
5
& Lodge
Amanita microspora Lactarius caribaeus
O.K.Miller Pegler 3
Lactarius coccolobae Lactarius ferrugineus
O.K Millers & Lodge Pegler 4
Lactarius nebulosus Pegler
Russula littoralis Pegler
Guzmn Bahamas, Barbados, Scleroderma stellatum
(1970) Florida, Puerto Rico Berk.
y Malasia Scleroderma bermudense
Kreisel, 1971 Cuba Coker
Reid, 1997 Trinidad y Tobago
Guzmn, 1983, Mxico
1986
Guzmn et al.
2004
Ortiz-Santana Belice y Repblica Boletus cubensis Berk. & Boletus floridanus
et al. 2007 Dominicana Curtis (Singer) Murrill 1
Xerocomus olivaceus B. Xerocomus guadalupae
Ortiz & T.J. Baroni (Singer & Fiard) Pegler 5
Pegler 1983 Cuba Inocybe littoralis Amanita antillana 2,3,6
Pegler Amanita craseoderma
Cantharellus cinnabarinus Bas 3,6
(Schwein.) Schwein Xerocomus cuneipes
Amanita aglutinata Pegler 5
(Berk. & Curt.) Murr. Fistulinella gloeocarpa Pegler
2
Xerocomus hypoxanthus
Singer Lactarius hygrophoroides
Russula metechromatica Berk. & Curt. 3
Singer Russula brevipes
Peck 4
Russula martinica Pegler2,8,9,10
Russula cremeolilacina Pegler
2

Lactarius nebulosus Pegler2,3

Lactarius castaneibadius
Pegler 2,9
Lactarius murinipes
Pegler 5,7
Esporocarpos recolectados cerca de rboles de: 1: Coccoloba belizensis Standley, 2: Coccoloba diversifolia Jacq., 3:
Coccoloba pubescens L., 4: Coccoloba swartzii Moisn., 5: Coccoloba sp., 6: Haematoxylum campechianum L., 7:
Lonchocarpus sp., 8: Slonea dentata L., 9: Tabernaemontana citrifolia L., 10: Torrubia fragans (Dum.-Cours.) Standley.

7
 OBJETIVOS

Objetivo general

Contribuir al conocimiento de las especies hongos ectomicorrizgenos asociados a

Coccoloba uvifera de la comunidad La Ribera, Tampico Alto, Veracruz.

Objetivos particulares

Caracterizar los morfotipos de las ectomicorrizas de Coccoloba uvifera.

Identificar el micobionte con base en la regin ITS ribosomal y su comparacin con
las regiones codificadas disponibles en GenBank.

8
 HIPTESIS

Los rboles de Coccoloba uvifera se asocian simbiticamente con diferentes especies

de hongos ectomicorrizgenos.

La diversidad de especies de hongos ECM expresada con base en la presencia de

esporocarpos, no necesariamente corresponde con las especies identificadas con base
en los morfotipos de las ectomicorrizas.

9
 MICORRIZAS

Frank (1885) descubri que determinados rboles adquieren nutrientes gracias a los micelios
que se encontraban prximos en el suelo y que ese micelio adems se encontraba envolviendo
en forma de manto, parte de las races formando un rgano en donde los dos interactuantes
obtenan nutrientes a su favor, por lo cual lo consider como una interaccin simbitica.
Acu el trmino micorriza para esta relacin entre un hongo y las races de una planta. Ms
recientemente se han hecho estudios fisiolgicos donde se descubre que las plantas son
provistas de nitrgeno y fsforo, y que los hongos protegen a la planta de la desecacin
(Duchesne et al., 1989), de la contaminacin de metales pesados (Leyval et al., 1997; Shaw et
al., 1990), algunas especies de hongos ECM varan la tolerancia de las plantas ante
condiciones adversas (Lanyon & Heald, 1982; Samson & Fortin, 1986) y favorecen el
crecimiento en ambientes extremosos, como los suelos cidos (Senior et al., 1993). Tambin
determinan la diversidad de plantas, su variabilidad y productividad en los ecosistemas
(Koide & Dickie, 2002). Se considera a las asociaciones micorrzicas como cosmopolitas por
su presencia en diversos hbitats naturales terrestres y generalistas por el amplio nmero de
familias de plantas susceptibles de ser micorrizadas (Hernndez-Cuevas, 2003). La presencia
de los hongos micorrizgenos en las plantas es considerada un carcter ancestral, ya que las
evidencias fsiles sealan que estos hongos fueron determinantes para que las plantas
colonizaran el medio terrestre al ayudar a resolver dos problemas: la desecacin y los
sustratos escasos de nutrimentos. Los datos sealan la presencia de hifas y esporas fsiles en
rocas del Ordovcico (hace 46 millones de aos), muy semejantes a los ejemplares actuales
del gnero Glomus que forman micorrizas arbusculares (Pirozynski & Malloch, 1975; Simon
et al., 1993; Redecker et al., 2000).
Smith y Read (1997) reconocen hasta siete diferentes tipos de micorrizas segn su estructura,
forma del manto, entretejido de hifas y clulas de la raz, as como la formacin de
estructuras-accesorios. Un ejemplo de distintas micorrizas se muestran en el esquema de la
Figura 1 y un resumen comparativo de las principales estructuras de cada tipo se presenta en
la Tabla 2. A continuacin se describen brevemente los siete tipos de micorrizas reconocidos
por Smith y Read (1997):

10
Figura 1. Esquema de cinco diferentes tipos de micorrizas vistas en corte transversal. Modificada de Selosse
& Le Tacon, 1998.

11
 Arbuscular

Este tipo de micorriza tambin se conoce como endomicorriza, donde el hongo coloniza la
raz y se introduce entre las clulas epidrmicas por medio del apresorio. En el interior de
la corteza, la hifa ramificada penetra la pared de la clula cortical y se diferencia dentro de
la clula vegetal para formar estructuras terminales altamente ramificadas conocidas como
arbsculos. Los arbsculos son estructuras que no atraviesan las membranas celulares de
la planta sino que la membrana invagina a los arbsculos, formando un nuevo
compartimiento denominado interface arbuscular. (Harrison, 1997). Esta interface es el
sitio de intercambio de carbono y fosfato entre los simbiontes (Harrison, 1999).

Ericoide

Tipo de endomicorriza caracterizada porque el hongo penetra las clulas radicales, pero se
distingue porque la planta involucrada es generalmente del orden Ericales, aunque
tambin se ha observado en algunas briofitas (Andrade-Torres, 2010).

Orquideoide

Tipo de endomicorriza donde el hongo penetra las clulas radicales y forma estructuras
llamadas ovillos. Adems se distingue porque nicamente se presentan en las orqudeas.
En este caso la planta es muy dependiente del hongo, ya que ste estimula la germinacin
de sus semillas y el crecimiento inicial de la plntula. En su fase de plntulas las orqudeas
son aclorfilas y por tanto saprobias, por lo que dependen directamente de las
aportaciones de compuestos de carbono y nutrimentos que proporciona el hongo. Para
algunas especies de orqudeas esta dependencia se observa incluso en etapa adulta
(Andrade-Torres, 2010).

Ectomicorriza

Se caracteriza por tener un manto compuesto de hifas que envuelve la parte apical de la
raz, haciendo ver a la raz ensanchada con diferente ramificacin, textura y/o color. El
manto puede variar extensamente en grosor, color y textura dependiendo de la
combinacin particular del hongo-planta (Halling, 2001). Del manto a veces se desprenden
algunas hifas emergentes que pueden llegar a formar una red, esto es micelio externo que
incluye hifas absorbentes, cordones miceliales y rizomorfos (Brundrett et al., 1996), estos
ltimos presentan una parte interna parecida a tubos que se especializan en transportar
nutrientes y agua desde largas distancias. El manto incrementa el rea de la superficie

12
 absorbente de la raz y con frecuencia afecta la morfologa de las raicillas (Halling, 2001).
Otra caracterstica muy importante es la red de Hartig, que son las hifas que se encuentran
penetrando intercelularmente a la raz y donde se lleva a cabo el intercambio de nutrientes.

Ectendomicorriza

Las ectendomicorrizas comparten caractersticas con las endo- y ectomicorrizas, ya que

presentan manto externo y red de Hartig como las ectomicorrizas, pero tambin penetran
las clulas corticales de la planta como en las endomicorrizas slo que no existen
vesculas ni arbsculos. En algunos casos no se forma el manto, pero siempre la red de
Hartig. (Peterson y Farquhar, 1994). Su distribucin es restringida.

Arbutoide

Las micorrizas arbutoides tienen caractersticas compartidas con las ectendomicorrizas ya

que se observa que simultneamente el hongo penetra las clulas radicales de la planta y
forma la red de Hartig. Generalmente los hongos que forman micorriza arbutoide son
capaces de formar ectomicorriza si interactan con plantas del gnero Pinus (Peterson y
Farquhar, 1994).

Monotropoide

Es otro tipo de ectendomicorriza que se caracteriza por establecer relacin con la familia
Monotropaceae (conformada por 10 gneros), esta familia se caracteriza porque sus
miembros son plantas aclorfilas por lo que dependen en gran medida del hongo asociado
para obtener nutrimentos. Las semillas de las plantas del gnero Monotropa son pequeas
y presentan dificultades para germinar en ausencia de hongos asociados. Se ha observado
que el hongo es capaz de colonizar las races de rboles cercanos (principalmente Pinus y
Picea) y transportar nutrimentos desde el rbol a las plantas aclorfilas (Peterson y
Farquhar, 1994).

13
 Tabla 2. Tabla comparativa de caractersticas morfolgicas de micorrizas (traducido de Smith & Read, 1997).
Micorriza Micorriza
Tipo de Micorriza Ecto- Ectendo- Micorriza Micorriza
Monotro- Orquide-
micorriza Arbuscular micorriza micorriza Arbutoide Ericoide
poide oide
Hifas septadas - + + + + + +
+
Hifas aseptadas - - - - - -
Colonizacin
+ - + + + + +
intracelular
Manto fngico - + +/- +/- + - -
Red de Hartig - + + + + - -
Aclorofilica-
-(+) - - - + - -*
mente
Taxn del Basidio
Basidio
hongo ** Glomero Asco Basidio Basidio Asco Basidio
Asco
(Glomero)
Taxn de la Bryo
planta*** Pterido Gymno Monotro- Ericales
Angio Ericales Orchidales
Gymno Angio poideae Bryo
Angio
*Todas las orqudeas son acloroflicas en la etapa temprana de plntulas. La mayora de las orqudeas son verdes cuando
adultos. ** Los taxones fungcos son las abreviaciones de Glomeromycota, Ascomycota y Basidiomycota. *** Los taxones
de las plantas son Bryophyta, Pteridophyta, Gymnospermae y Angiospermae .

14
 REA DE ESTUDIO

Las colectas se realizaron en La Ribera, municipio Tampico Alto, Veracruz (Fig. 2). En la
zona litoral de esta localidad se encuentra una poblacin de Coccoloba uvifera que cubre una
extensin moderadamente grande siendo un elemento dominante o co-dominante con C.
humboldtii Meissn. en algunas zonas a lo largo de la playa de Tampico Alto, registrando
coordenadas 220636.28N 97460.8.84O a una altitud de 1 m.s.n.m. El municipio limita
al norte con Pueblo Viejo, al este con el Golfo de Mxico, al sur con Ozulama y al oeste con
Pnuco (http://www.altotampico.gob.mx).

La Ribera

Figura 2. Municipio de Tampico Alto y ubicacin del sitio de muestreo. Escala 1: 250 000, modificado de
http://mapserver.inegi.org.mx/mgn2k/

15
 MATERIAL Y MTODO

Muestreo de ectomicorrizas

Se efectuaron 2 visitas al rea de estudio en octubre de 2010 y agosto de 2011, coincidiendo

con la poca de lluvias, llevando a cabo recorridos al azar a lo largo del bosque de Coccoloba
uvifera (muestreo oportunista, O Dell et al., 2004). Con la ayuda de una navaja y/o una pala
de jardn se extrajo 10-15 cm3 de suelo para la obtencin de races con ectomicorrizas
(Agerer, 1991). En total fueron tomadas 7 muestras de suelo para su limpieza, cada una se
envolvi en papel aluminio para su proteccin y trasporte en una hielera con geles
refrigerantes para mantenerlos frescos hasta su llegada al laboratorio.

Limpieza y caracterizacin de ectomicorrizas

Las muestras de suelo en el laboratorio se colocaron dentro de un cristalizador con agua,

eliminando el exceso de tierra y separando las races. Se tomaron porciones de races
colocndolas en cajas Petri con agua destilada, y con la ayuda de un microscopio
estereoscpico se separaron las puntas ectomicorrizadas, es decir, con algn tipo de
hinchamiento, cambio de coloracin o un patrn de crecimiento definido reconocido como
morfotipo (Agerer, 1991). Los morfotipos se agruparon de acuerdo al tipo de ramificacin,
coloracin, textura, estructuras, etc. En una libreta de campo se registraron las caractersticas
distintivas de acuerdo al protocolo de Agerer (1991) y la gua de Ludwin-Maximilians (2004-
2011). Una porcin de micorriza se conserv en alcohol al 70% para su posterior estudio
microscpico, y otra se deshidrat en un deshidratador con flujo de aire a una temperatura
promedio de 35-45C durante 2 a 3 das. No se dej pasar ms de un da para su
herborizacin, ya que esperar ms tiempo para procesar la muestra puede afectar el anlisis
molecular. El estudio microscpico se realiz sobre preparaciones de diferentes cortes de las
puntas micorrizadas y realizar la caracterizacin morfolgica, toma de fotografas de hifas,
manto, red de Hartig etc. (Agerer, 1991; Ludwin-Maximilians, 2004-2011). Los cortes
longitudinales ayudaron a caracterizar la red de Hartig, el manto interno y externo, hifas
emergentes del manto, presencia de cistidios y la penetracin de las hifas en las capas de
clulas de la raz; de los cortes transversales se describe la apariencia del manto, los colores,

16
la red de Hartig, hifas emergentes, la forma de las hifas entre las clulas de la raz, etc.; y el
desprendimiento del manto donde se observa el manto interno y externo, de lo cual se anota la
disposicin de las hifas, la forma de las hifas terminales, cistidios y otros elementos.

Obtencin de secuencias de ADN

La extraccin de ADN de las ectomicorrizas se llev a cabo usando el kit comercial

DNAeasy de Quiagen (Hilden, Alemania), siguiendo el protocolo que indica el kit. Despus
de la extraccin se hicieron varios corrimientos por electroforesis en un gel de agarosa al 1%
para observar el ADN, sin embargo en las ectomicorrizas puede haber tan pequea cantidad
de muestra que no siempre fue abundante la concentracin de material gentico, por lo que
en tales casos se pas directamente a la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Para la
PCR se usaron primers especficos de la regin ITS del ADN ribosomal, para reconocer al
hongo que est participando en la interaccin, en este caso, con las races de Coccoloba
uvifera (Morris et al., 2009; Gao y Yang, 2010; Tedersoo et al., 2010a). Todas las PCRs se
llevaron a cabo en un termociclador BIORAD, con ciclos especficos de la regin ITS, que
se muestran en la tabla 3. Para la PCR se prepar para un volumen de 25 l con
concentraciones de 50mM MgCl2, 5mM de cada dNTP (Life Technologies, Eggestein,
Germany), 10M de cada primer (Biomers, Ulm, Germany), 0.1l de Taq Polimerasa (Life
Techhnologies) y 2.5 l ADN de la extraccin. Para obtener las secuencias se utilizaron los
primers ITS1F-NL4, ITS1F-ITS4, ITS1-ITS4, ITS3-ITS4, todos tienen diferentes
longitudes, aunque se dio preferencia a los fragmentos ms largos, como ITS1F-NL4 e
ITS1F-ITS4. En ocasiones la combinacin de primers no lograban la amplificacin del ADN
de la muestra por lo que se usaban primers de fragmentos ms cortos para completar toda la
regin ITS (ver Figura 3). Los primers que se usaron en esta tesis han sido citados
especficamente para la regin ITS en diversos organismos, tanto procariontes como
eucariontes, pero los primers ITS1F e ITS4 son exclusivos de estudios de hongos,
exceptuando a los Oomycetes (Manter & Vivanco, 2007). Se revisaron los productos de la
PCR en un gel de agarosa al 1% con transiluminador de rayos UV, y a partir de la intensidad
de la fluorescencia de la banda y la distancia que corri, comparada con la escalera-control,
se calcularon los nanogramos por microlitro que se usaran para la reaccin de
secuenciacin. Las bandas que se obtuvieron en el gel, fueron cortadas y separadas en tubos
etiquetados (en algunos casos se us directamente el producto de PCR para la purificacin),

17
 stas fueron purificadas usando el kit de purificacin de ADN Wizard purification system
(USB, USA). La purificacin se hace para eliminar los restos de nucletidos, MgCl2, etc.
usados para la PCR.

Tabla 3. Ciclos especficos del termociclador BIORAD, para la amplificacin de la regin

ITS (Montoya et al., 2010)

El ADN purificado se someti a la reaccin de secuencias con el kit de secuenciacin Big

Dye, en ciclos especficos en el termociclador, para las reacciones de secuencias estndar
(Boreman & Hartin, 2000). De los productos de la purificacin se hicieron varios lavados
con alcohol (isopropanol al 80% y etanol al 75%) hasta deshidratar la muestra y dejarla
totalmente seca. La lectura de las muestras se llev a cabo en un secuenciador Automtico
ABI PRISM 310 de un capilar, con polmero de acrilamida POP4, Applied Biosystems. Las
secuencias fueron estudiadas con ayuda de espectoferogramas del programa FinchTV 1.4.0
y editadas usando el programa Sequencher 4.1.4. Se compararon con las de mayor similitud
en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando la herramienta BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) (Altschul et al. 1997) y con ello reconocer el taxn en estudio.
Tambin se compararon con las depositadas en la base de datos UNITE (http://unite.ut.ee/)
que es exclusiva de secuencias genmicas de hongos. De manera similar se obtuvo la regin
ITS1ITS2 de la raz involucrada en la micorriza para reconocer el fitobionte usando los
primers ITS1 e ITS4.

18
Figura 3. Regin ITS donde se sealan (en color gris) los primers que se utilizaron para la total amplificacin
de la regin espaciadora interna (Figura tomada de Martin & Rygiewicz, 2005). SSU (por sus siglas en ingls
Small SubUnit y que codifica para la regin 18S) y LSU (Large SubUnit, que codifica para la regin 25-28S).

Anlisis filogentico
El anlisis se realiz con las secuencias obtenidas y diversas secuencias tomadas de
GenBank, de los gneros: Amanita, Boletellus, Boletus, Cantharellus, Clavaria, Cortinarius,
Crepidotus, Galerina, Geastrum, Gomphidius, Gomphus, Hydnum, Inocybe, Lactarius,
Lycoperdon, Phaeocollybia, Phellinus, Polyporus, Ramaria, Russula, Sebacina,
Scleroderma y Thelephora, asegurando que se tratara de una secuencia codificadora de la
regin ITS, donde la mayora abarcaba parcialmente a la SSU y LSU. Las secuencias se
analizaron con el programa BioEdit Sequence Aligment Editor 7.0.5.3, se alinearon y se
cre el rbol filogentico con el programa MEGA 5.02. Los parmetros usados para el rbol
filogentico fueron con la herramienta Prueba del rbol de mxima probabilidad (Test
Maximum Likelihood Tree), mtodo Bootstrap replicado 1000 veces, modelo Tamura-Nei.

19
 RESULTADOS

En las siete muestras de suelo analizadas se reconocieron 12 diferentes morfotipos de

ectomicorrizas sobre las races de Coccoloba uvifera. Todos los morfotipos encontrados se
describieron adecuadamente pero slo de dos de ellos se logr obtener completas sus
secuencias y son los morfotipos que se consideraron para describirlos en este trabajo, y son
presentados abajo. En la tabla 4 se resumen los resultados arrojados al efectuar la
comparacin de las secuencias obtenidas con las depositadas en GenBank y UNITE al
utilizar la herramienta BLAST. Antes cabe mencionar, que en el recorrido efectuado en el
bosque de Coccoloba se obtuvieron tres muestras de basidiomas pertenecientes a dos
taxones del gnero Boletus los cuales no se lograron relacionar a una especie por la mala
representacin de los especmenes. Es importante destacarlo ya que de las muestras de suelo
obtenidas alrededor de su estpite, ninguna correspondi con ese gnero. Como se muestra
en la tabla 4 una de ellas registrada como DR6B, con 99% de similitud se puede interpretar
como perteneciente a Scleroderma bermudense, mientras que otra DR1D con un porcentaje
de similitud 95% se agrupa con una micorriza de un taxn no identificado pero relacionado
con los teleforceos. El resultado del anlisis filogentico de las secuencias (Fig. 4) revela
que la ectomicorriza DR1D podra representar una especie de Tomentella o de Thelephora y
se soporta la interpretacin de la ectomicorriza DR6B con Scleroderma bermudense.

Tabla 4. En esta tabla se sintetizan los resultados moleculares obtenidos de la comparacin de las secuencias de
los morfotipos con las bibliotecas genmicas, agregando el porcentaje de similitud con secuencias de especies
depositadas en GenBank y UNITE.
Long. de
ECM (No. Nmero de %> %> C.
secuencia Taxn
de registro) acceso GenBank UNITE uvifera
(pb)
DR1D 447 pb Secuencia de ECM
FN557578 95% 95%
no cultivada
IDEM FN557577 95% 94%
IDEM FN557576 93% 93%
Thelephora aislada GU246993 91% -
Thelephora terrestris
FJ809998 90% -
aislada
Tomentella cf.
AJ889982 90% -
sublilacina
DR6B 471 pb Scleroderma
EU718118 99% -
bermudense
S. polyrhizum FM213349 93% 92%
S. sinnamariense HQ687222 87% 90%

20
Figura 4. rbol filogentico realizado con la prueba Maximum Likelihood, mtodo Bootstrap repeticiones de
1000 veces, modelo Tamurai-Nei. Las secuencias trabajadas se muestran encerradas en color rojo

21
 DESCRIPCIN DE LAS ECTOMICORRIZAS

Tomentella/Thelephora (DR1D) Fig. 5

Ectomicorriza de color negruzco la mayor parte, pices ligeramente decolorados de color

caf parduzcas, textura carbonosa. El aspecto en conjunto de su ramificacin es irregular
pero se ramifica de forma pinada. Sus pices estn adelgazados, presenta hifas emergentes
delgadas, poco frecuentes, laxas. Reaccin negativa al KOH. Manto no traslcido de 15-
20 m y sus hifas tienen de ancho de 4-6 m. Manto externo de un color caf negruzco,
pseudoparenquimatoso con clulas epidermoides a hifas dispuestas en forma perpendicular
a la superficie del manto con algunas hifas emergentes cilndricas de pared delgada,
septadas con fbulas, unas de estas hifas son hialinas mientras que otras presentan un color
caf. Las hifas miden de ancho 1-4 m. Manto interno pseudoparenquimatoso de clulas
epidermoides portando una red de hifas, estas hifas miden 6-12 x 8-10 m. La red de
Hartig penetra en la primera capa de clulas corticales en 2 capas sin llegar a la
endodermis, con hifas redondas entre las clulas, es de tipo palmeada.

22
Figura 5. (A-C) Foto de ectomicorriza vista en microscopio estereoscpico. (D) Corte transversal donde se aprecia el
manto y la red de Hartig de la ECM, (E) Corte longitudinal donde se hace un acercamiento al acomodo del manto, y la
red de Hartig que es palmeada. (F) Clulas epidermoides del manto interno (G) Manto externo (H) Hifas emergentes
del manto externo. Escalas: A= 2 mm, B= 1 mm, C= 0.5 mm, D= 25 m, E-H 10 m

23
 Scleroderma bermudense Coker (DR6B) Fig. 6

Ectomicorriza de color blanquecina-blanca, con aspecto de ramificacin piramidal pero se

ramifica de forma dicotmica, de aspecto fibrilosa-adpresa, con rizomorfos cilndricos-
redondeados y se unen en un punto, con puntas redondeadas. Manto opaco, con
ramificaciones sinuosas, ligeramente tortuosas. Reaccin negativa al KOH. El manto tiene
un color blanco a hialino o traslcido, conformado por 7 a 11 capas de hifas, con un ancho
de 33-55 m, y sus hifas miden de 3-8 m de ancho. Manto externo plectenquimatoso
con hifas dispuestas en una red medianamente laxa, producida por la ramificacin mltiple
de las hifas, de un color blanquecino a hialino. Presenta algunos cistidios ligeramente
clavados y con fbulas, abundantes. Las hifas miden de ancho de 3-6 m. Manto interno
pseudoparenquimatoso con clulas epidermoides, y con algunas zonas plectenquimatosas.
La red de Hartig penetra hasta la segunda capa de clulas corticales, de manera
periepidermal, de forma palmeada, con las hifas entre las clulas redondeadas. Rizomorfo
tiene un color amarillento a hialino, con partes refringentes. Compuesto de hifas cilndricas
de pared delgada, septadas y con fbulas, con hifas terminales redondeadas. Las hifas se
encuentran dispuestas de forma erecta y alargadas muy compactas. Presenta abundantes
cistidios ramificados muy agudos, y otros ms escasos, clavados a ampliamente clavados,
de pared gruesa, lo que da la apariencia de que haya hifas globosas que compongan al
rizomorfo. Las hifas tienen un ancho de 2-5 m.

24
Figura 6. (A-B) Fotos del microscopio estereoscpico donde se muestra ramificacin, textura y color de la ECM.
(C) Corte transversal, se observa el manto. (D) Red de Hartig en un corte longitudinal. (E) Manto interno. (F)
Manto externo con un cistidio clavado. (G) Rizomorfo con dos tipos de cistidios. (H) Acercamiento de los
cistidios ramificados. Escalas: A= 1 mm, B= 0.5 mm, C= 25 m, D-F= 10 m, G= 25 m, H= 10 m.

25
 DISCUSIN

Se habla de que la mayora de las plantas vasculares han desarrollado una dependencia a los
hongos micorrizgenos por todos los beneficios (enzimas, auxinas, vitaminas, citocininas y
compuestos que incrementan el tamao y longevidad de las raicillas, adems de proteccin de
patgenos), que obtienen de su interaccin (Trappe & Fogel, 1977). Tomando en cuenta la
diversidad de las plantas vasculares y que un solo individuo vegetal puede estar relacionado
con varias especies de hongos micorrizgenos, se han realizado estimaciones como la de
Brundret (2009) y Rinaldi et al. (2008) donde calculan que hay 20 a 25 mil especies de
hongos ectomicorrizgenos, de lo cual apenas conocemos la punta del iceberg.

La gran parte de los proyectos enfocados en conocer la diversidad de las ectomicorrizas en

Mxico han sido llevados a cabo en las partes de zonas templadas donde abundan los bosques
de pino-encino, dejando rezagado el conocimiento de los hongos encontrados en zonas
tropicales. Nuestros resultados contribuyen en ese sentido al conocimiento de los micobiontes
asociados con Coccoloba uvifera como un primer intento por informar sobre su cortejo de
ectomicorrizgenos. Al menos dos especies Scleroderma bermudense y un representante de
Tomentella o Thelephora se encuentran en asociacin micorrzica con plantas de Coccoloba
uvifera en la regin de La Ribera, Veracruz. El hbitat de esta planta son los litorales y
presenta una amplia distribucin en las costas del Pacfico, Golfo de Mxico, Mar Caribe y
Ocano Atlntico. Es conveniente explicar que la diversidad hipgea y epgea de los
macrohongos pueden no coincidir en trminos de presencia debido a la propia biologa de
esos organismos. El estudio taxonmico de los hongos en general depende en gran parte de
los esporocarpos que estos producen. Esto es un punto crucial en los estudios de diversidad
fngica, puesto que al tratarse de organismos con produccin de cuerpos fructferos efmeros,
se puede o no encontrar en campo el cuerpo fructfero, adems se depende del estado de
madurez en el que se encuentren, puesto que adicionalmente se pretende lograr colectas de
especmenes bien representados y en buen estado para su posterior estudio y preservacin.
Los micelios la mayora del tiempo estn presente bajo el suelo sin mostrar cuerpo fructfero
y obedecen a cierta temperatura y humedad ambiental que se presenta mayormente en los
meses de junio a septiembre (en Mxico, variando por regiones) y es indispensable conocer la
poca del ao en que cada especie fructifica. Smith & Read (2008) ya mencionaban que los
esporocarpos no siempre estn presentes mientras el hongo est formando ectomicorriza.

26
Lo anterior nos habla de la dificultad que se tiene para obtener las ECM con su cuerpo
fructfero, aunado a lo difcil que resulta trabajar con las secuencias de ADN particularmente
de las ectomicorrizas, muy probablemente por la cantidad del tejido a tratar. En los datos de
Tedersoo et al. (2010a) obtuvieron 105 secuencias exitosas de 111 ECM (94.6%), con la
misma metodologa usada en este trabajo pero disearon primers especficamente para el
grupo Tomenteloide.

Es importante tener en cuenta que puede llegar a haber casos donde la secuencia del hongo
partcipe en la micorriza no se encuentre en GenBank y/o UNITE. Si se llegara a la
determinacin de la especie a partir de la fructificacin y la comparacin de secuencias entre
la ectomicorriza y el esporocarpo teniendo toda la descripcin junto con la de la ECM hay la
posibilidad de registrar una nueva especie de modo que se enriquezca la biblioteca genmica
del NCBI (National Center for Biotechnology Information) y el conocimiento de la
biodiversidad. En los casos en que la secuencia no tiene un gran porcentaje de afinidad con
los bancos genmicos, y no se tiene el cuerpo fructfero, la identificacin se vuelve poco
probable. Y exactamente fue esto lo que pas con los otros 9 morfotipos (sin contar los del
basidiomas de Boletus), no se obtuvo una amplificacin completa o fragmentos de la regin
ITS suficientemente largos como para poder determinar con qu especie de hongo se estaba
tratando. Adems debe tenerse en cuenta que las secuencias encontradas en GenBank no
necesariamente estn correctas y que sera preferible trabajar con secuencias ya publicadas en
revistas cientficas.

Con un porcentaje relativamente alto uno de los morfotipos estudiado, DR1D, se agrup con
el grupo de los teleforceos. De las pruebas que se hicieron con el ADN de este morfotipo, se
logr la amplificacin de la regin ITS consiguiendo una secuencia ya editada con 447 pares
de bases. Al hacer uso del BLAST en GenBank y UNITE, la secuencia se identific con un
porcentaje alto (95%) con hongos ectomicorrizgenos no caracterizados y con un porcentaje
igual o menor a 90% con los gneros Tomentella y Thelephora. Para justificar el parentesco
entre los taxones se llev a cabo el anlisis filogentico, tomando secuencias disponibles en
GenBank de diferentes especies de los gneros Tomentella y Thelephora. El rbol resultante
muestra que el hongo en la ectomicorriza DR1D filogenticamente se relaciona en el clado de
los Thelephoraceae, conformado por miembros de Tomentella y Thelephora, sin embargo,
con la secuencias disponibles, no hay claras evidencias para asignarlo a un gnero o a una
especie. Los cuerpos fructferos del grupo de los teleforceos especialmente de Tomentella,

27
 por su biologa, son inconspicuos entre la hojarasca del suelo y poco probables de ser
encontrados. Resulta atractivo que se trata de micobiontes muy abundantes y diversos tanto en
comunidades de regiones rticas como tropicales (Dahlberg et al., 1997; Trowbridge &
Jumpponen, 2004; Haug et al., 2005). En cuanto al morfotipo aqu estudiado presenta muchas
de las caractersticas morfolgicas y anatmicas tpicas de una ECM perteneciente al gnero
Tomentella (Jakues & Ers-Honti, 2008), como color, textura, hifas emergentes, manto, etc.
lo que sugiere que la micorriza DR 1D pudiera pertenecer a este gnero

Para el caso de la secuencia obtenida de la micorriza DR6B se ubica con un porcentaje de

afinidad de un 99% con la secuencia correspondiente a Scleroderma bermudense (cdigo
EU718118 en GenBank). El anlisis filogentico apoya la identidad con un 91% en las mil
repeticiones del Bootsrap, este resultado junto con el porcentaje del BLAST con GenBank nos
permite interpretar nuestro material como S. bermudense y reconocer su ectomicorriza
asociada a Coccoloba uvifera. En los antecedentes ya se reportaba este hongo como posible
asociado a C. uvifera ya que en Bahamas, Barbados, Florida, Puerto Rico, las Bermudas, Islas
Vrgenes, Malasia y en el Caribe mexicano haban sido encontrados basidiomas cerca de C.
uvifera, sin embargo esta es la primera vez que se describe su ectomicorriza.

28
 CONCLUSIONES

Se reconoci que Coccoloba uvifera se asocia a un hongo ectomicorrizgeno del grupo de los
teleforceos, pero con la informacin molecular no se logr identificar la especie, en parte por
la falta del cuerpo fructfero y porque la secuencia comparada con las bases genmicas
(GenBank y UNITE) no nos arrojan alguna similitud confiable (>97%), por lo que podra
tratarse de una especie de Tomentella o Thelephora no secuenciada hasta el momento, un
registro nuevo para C. uvifera o incluso una especie nueva.

La tesis aporta la descripcin de la ectomicorriza formada por Scleroderma bermudense

asociada a Coccoloba uvifera, la relacin simbitica estaba especulada con base en la
presencia de esporocarpos y aqu por vez primera se documenta su ectomicorriza. La especie
de Scleroderma se registra por primera vez para el estado de Veracruz ya que en Mxico se
conoca de el Mar Caribe, Pennsula de Yucatn y el estado de Guerrero (Guzmn et al.,
2004). Tanto para esta especie como para la de teleforceo se espera en el futuro obtener
material fresco de los basidiomas. Los 10 morfotipos restantes que no se presentaron en esta
tesis a pesar de ya tener su caracterizacin y fotografas, siguen siendo estudiados
molecularmente con diferentes primers de la regin ITS. Incluyendo los basidiomas del
gnero Boletus y sus probables ectomicorrizas.

Un ltimo punto que debera ser considerado es que el tiempo destinado a la elaboracin de
tesis por parte del nuevo sistema educativo (MEIF) es corto y al tratarse de trabajos
recepcionales sobre biologa de organismos hay que recordar que stos no estn a disposicin
de los estudios ni de tiempos impuestos, que de haberlo es probable que se hubieran podido
recuperar en campo fructificaciones y obtenido ms resultados moleculares.

29
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